JP2002517166A - 新規な受容体チロシンキナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 新規なファミリの筋受容体チロシンキナーゼが開示される。それらをコードする核酸分子（図１）とこれらの利用方法とが開示される本発明の特徴である。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な受容体チロシンキナーゼ発明の分野 本発明は、チロシンキナーゼ活性を有する新規な筋タンパク質、このタンパク 質をコードするＤＮＡ、及びその利用方法に関する。背景及び先行技術 脊椎動物の骨格筋の形成には、我々の発生生物学の理解に対して基本的な数多 くのプロセスが関係している。これには、細胞間シグナリング、分化、及び形態 形成が含まれる。それぞれの骨格筋は、エネルギー代謝、収縮速度、及び耐疲労 抵抗に於いて異なる様々な筋繊維組成を有している。この多様性は、異なった集 団の前駆体筋芽細胞を反映するものであると考えられている。筋肉の発達中にお いて、様々な筋芽細胞タイプの重複する波を観察することができる。 筋芽細胞は、細胞融合を含むプロセスによって、筋管を形成し、最終分化する 。筋芽細胞は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）等の成長因子の存在下に於いてイ ンヴィトロで培養することができる。このような因子の投与中止（ｗｉｔｈｄｒ ａｗａｌ）、あるいは、血清の不在に よって、細胞はその細胞周期から外れて、その結果最終分化が起こる。分化中に おいて、特有のセットの筋特異的タンパク質が発現される。更に、特定の受容体 チロシンキナーゼ（ＲＴＫｓ）の発現が無くなる。しかし、いかに環境シグナル が筋芽細胞の分化を阻害するかについての理解が進んでいるにもかかわらず、筋 形成の原因となるシグナル経路についてはそれほど理解されていない。分裂が終 了した筋管の維持と生存とに関連するシグナリング分子についてはほとんど知ら れていない。 従って、分裂終了後の状態を規制するシグナリング分子を同定し理解する必要 が残っている。このような分子の役割は、退化性疾患（例えば、筋ジストロフィ ）及び癌、特に肉腫、等の多種多様なヒトの病気において潜在的に重要である。 ウィルクス（Ｗｉｌｋｓ）他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１ ９８９）８６：１６０３−１６０７）は、ディジェネレートオリゴヌクレオチド プライマーを使用して、タンパク質チロシンキナーゼ遺伝子をクローン化する一 般的な方法を記載している。このアプローチを改造したものを使用して、チロシ ンキナーゼドメインを含む遺伝子が同定された。当初、Ｍｓｎ−２と呼称されて いたこの遺伝子は、電気エイＴｏｒｐｅｄｏ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａの電気器官からクローン化された受容体チロシンキナー ゼに対して相同性を有している（ジェニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）他、Ｐｒｏ ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９３）９０：２８９５−２８９９）。 いまここで、この遺伝子をＮｓｋ２と称する。 本発明は、新規な筋ＲＴＫを提供する。又、驚くべきことに、前記Ｎｓｋ２遺 伝子は別の方法で（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ）スプライシングされること によって、少なくとも１１種類の遺伝子産物が作り出されることが判った。本発 明の別の態様において、Ｎｓｋ１と称される関連ＲＴＫが提供される。その部分 ヌクレオチド配列と翻訳産物とが図９に示されている。 従って、本発明は、その相補配列が、図１，３ｂ，４ａ，５ａ，６ａ又は９の ヌクレオチド配列のいずれか一つに選択的にハイブリダイズ可能な単離核酸分子 、及び、前記配列又はその相補配列に選択的にハイブリダイズ可能なそのフラグ メントとを提供する。望ましくは、前記ヌクレオチド配列は、図１，４ａ，５ａ ，６ａ又は９の配列、又は、これら配列に選択的にハイブリダイズ可能なそのフ ラグメントである。 本発明は、又、図１ａ，３ｂ，４ａ，５ａ，６ａ又は ９の配列のヒトホモログを含むほ乳類ホモログであり、実質的に単離された状態 の核酸分子と前記配列に選択的にハイブリダイズ可能なそのフラグメントを提供 する。 本発明は、更に、オプションとしてその５’及び３’非翻訳領域を備え、Ｎｓ ｋ１の前記全長コード化配列をコードする単離核酸分子と、更に、これらの核酸 分子のフラグメントとを提供する。これらの核酸分子は、図９に開示される配列 に基づくプローブから開始して、当該技術における慣用技術によって得ることが できる。このような方法には、Ｎｓｋ１を発現する細胞からｃＤＮＡライブラリ ーを作成し、図９の配列の全部又はその一部を有する核酸によってこのライブラ リーをプローブする方法が含まれる。前記ライブラリーの適当なクローンを濃厚 にするために、このライブラリーを、図９の配列の一部に由来するプライマーを 用いて調製することが出来る。ｃＤＮＡライブラリー等の調製方法の詳細は、例 えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他、１９８７等の標準参考書籍に開示 されている。 本発明は、更に、図２，３，４ｂ，４ｃ，５ｂ，６ｂ又は９に示す配列の一つ を有する単離タンパク質を提供する。図２に記載のタンパク質（配列認識番号２ ）は、別の異型（ｖａｒｉａｎｔ）として提供することができ、 ここで、図３ｂの２０のアミノ酸が、図２の残基２０９と２１０との間に挿入さ れている。本発明は、又、少なくとも一つの抗原決定基をコードする前記タンパ ク質のフラグメントを提供する。好ましくは、前記抗原決定基は、Ｎｓｋ２又は Ｎｓｋ１に対して特異的である。更に、本発明には、図２，３，４ｂ，４ｃ，５ ｂ，６ｂ又は９のタンパク質の、ほ乳類ホモログ、好ましくは、ヒトホモログ、 と、Ｎｓｋ１又はＮｓｋ２ホモログに対して特異的な抗原決定基をコードするそ のフラグメントとが含まれる。 本発明は、又、前記全長Ｎｓｋ１遺伝子によってコードされるポリペプチド及 びそのフラグメントを提供する。このようなポリペプチドの配列は、上述したよ うに決定可能な前記遺伝子のコード化配列を翻訳することによって、決定するこ とができる。 本発明は、又、本発明の前記キナーゼ又はそのフラグメントに結合可能な抗体 又はそのフラグメントを提供する。前記抗体は、ポリクローナルとモノクローナ ルとのいずれでもよい。 本発明には、更に、本発明のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列と （図２のものと、この図２のものを、図３ｂの６０個のヌクレオチドを含むよう に改変 したもの，３ａ，４ｂ，４ｃ，５ｂ，６ｂ又は９とを含む）そのフラグメント、 そして、前記ヌクレオチド配列を含むベクターとが含まれる。望ましくは、前記 ベクターは、前記ヌクレオチド配列に作動リンクされた宿主細胞に適合するプロ モーターを含む発現ベクターである。望ましくは、前記ヌクレオチド配列は、図 １，３ｂ，４ａ，５ａ，６ａ又は９の配列、あるいは、そのフラグメント又はホ モログである。 更に別の態様に於いて、本発明は、本発明に依るポリペプチド又はそのフラグ メントを調製する方法を提供し、その方法は、本発明に依るベクターを担持する 宿主細胞を前記ポリペプチド又はそのフラグメントの発現に適した条件下に於い て培養する工程と、前記ポリペプチド又はそのフラグメントを前記培地から回収 する工程とを含む。図面の簡単な説明 図１は、Ｎｓｋ２受容体チロシンキナーゼの完全なコード化ヌクレオチド及び 予想アミノ酸配列を示している（配列認識番号１）。 図２は、前記全長Ｎｓｋ２受容体チロシンキナーゼを、その様々なドメインと 共に示している（配列認識番号２）。 図３ａは、その細胞外ドメイン内に置換部位を有する、別の方法でスプライシ ングされたＮｓｋ２受容体チロシンキナーゼイソ型タンパク質を示している（配 列認識番号３）。 図３ｂは、本発明の前記分子の更に別の方法でスプライシングされた異型（ｖ ａｒｉａｎｔ）を示している。スプライシングは、細胞外ドメイン内に於けるも のである。この異型に於いて、新規な２０個のアミノ酸を提供する６０個のヌク レオチドの配列が、配列認識番号１の配列のヌクレオチド６７３と６７４との間 にスプライシングされている。上線は、潜在的グリコシル化の部位を示している （配列認識番号４）。 図４ａは、前記Ｎｓｋ２受容体チロシンキナーゼの別の方法でスプライシング されたカルボキシ末端ドメインのヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列とを示し ている（配列認識番号５）。 図４ｂは、図４ａの別スプライシングカルボキシ末端を有する前記全長Ｎｓｋ ２ＲＴＫイソ型タンパク質のアミノ酸配列を示している（配列認識番号６）。 図４ｃは、図３の細胞外ドメインに於ける置換部位と、図４ａの別スプライシ ングカルボキシ末端との両方を有するＮｓｋ２ＲＴＫイソ型タンパク質のアミノ 酸配列を 示している（配列認識番号７）。 図５ａは、推定可溶性細胞外ドメインをコードする、別の方法でスプライシン グされ、短くなったＮｓｋ２ｃＤＮＡの部分的ヌクレオチドと予想アミノ酸配列 とを示している（配列認識番号８）。 図５ｂは、図５ａの端が短くなったＮｓｋ２イソ型タンパク質のアミノ酸配列 を示し、その様々なドメインと新規なＣ−末端を示している（配列認識番号９） 。 図６ａは、更に別の方法でスプライシングされ、短くなったＮｓｋ２ｃＤＮＡ の部分的ヌクレオチドと予想アミノ酸配列とを示している（配列認識番号１０） 。 図６ｂは、図６ａの端が短くなったＮｓｋ２イソ型タンパク質のアミノ酸配列 を示し、その様々なドメインと新規なＣ−末端を示している（配列認識番号１１ ）。 図７は、Ｎｓｋ２のイソ型タンパク質を作り出す前記選択的スプライシングの 要約を提供している。 図８は、Ｎｓｋ２の前記アミノ酸配列と、ジェニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ） 他（前出）のＴｏｒｐｅｄｏＲＴＫのアミノ酸配列との比較を提供している（配 列認識番号１２）。 図９は、Ｎｓｋ１の部分的ヌクレオチドとアミノ酸配列とを示している（配列 認識番号１３）。 図１０は以下を示している。 Ａ：マウスの骨格筋筋管ｃＤＮＡクローンの分析から同定された４種類のＮｓ ｋ２ ＲＴＫイソ型タンパク質の構造。 Ｂ：マウスの骨格筋筋管ｃＤＮＡクローンの分析から同定されたここで２Ｉｇ と４Ｉｇと称する２種類の短いＮｓｋ２イソ型タンパク質の構造。 Ｃ：マウスの骨格筋筋管から調製された全細胞溶解物を、Ｎｓｋ２ ＲＴＫの 細胞外配列（図２のａａ３４１−３５２）を示すＰＰＤ−結合合成ペプチドとに よって免疫化したラビットの免疫前（ｐｒｅ−ｉｍｍｕｎｅ）血清（ＰＩ）と免 疫血清（Ｉ）とのいずれかで免疫沈降した。免疫沈降物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの 前にγ³²Ｐ−ＡＴＰの存在下でのインヴィトロキナーゼアッセイし、実質的にリ ート（Ｒｅｉｔｈ）他（１９９１；ＥＭＢＯＪ．９，２４５１−２４５９）に記 載されているオートラジオグラフィにかけた。 Ｄ：マウスの骨格筋筋管の全細胞溶解物を調製し、これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥ にかけ、実質的に前述の方法（リート（Ｒｅｉｔｈ）他、１９９１前出）でニト ロセルロースに移した。フィルタを、前記４Ｉｇ Ｎｓｋ２イソ型タンパク質（ 図５ｂのａａ４５７−４６７）の前 記新規カルボキシ末端におけるアミノ酸配列を示すＰＰＤ−結合合成ペプチドで 免疫化したラピットからの、免疫前血清（ＰＩ）又は免疫血清（Ｉ）のいずれか でプローブした。更に別のコントロールとして、第３のフィルタ（ＩＣ）を、免 疫処理用に使用される遊離ペプチド（ｆｒｅｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ）で予めインキ ュベートしておいた免疫血清でプローブした。¹²⁵Ｉ−接合タンパク質Ａとオー トラジオグラフィとで抗体結合が検出された。 Ｅ：マウスの骨格筋筋管の全細胞溶解物を調製し、これらをＳＤＳ−ＰＡＧＥ にかけ、実質的に前述の方法（リート（Ｒｅｉｔｈ）他、１９９１前出）でニト ロセルロースに移した。フィルタを、前記２Ｉｇ Ｎｓｋ２イソ型タンパク質（ 図６ｂのａａ２２４−２３５）の前記新規カルボキシ末端におけるアミノ酸配列 を示すＰＰＤ−結合合成ペプチドで免疫化したラビットからの、免疫前血清（Ｐ Ｉ）又は免疫血清（Ｉ）のいずれかでプローブした。更に別のコントロールとし て、第３のフィルタ（ＩＣ）を、免疫処理用に使用される遊離ペプチド（ｆｒｅ ｅ−ｐｅｐｔｉｄｅ）で予めインキュベートしておいた免疫血清でプローブした 。¹²⁵Ｉ−接合タンパク質Ａとオートラジオグラフィとで抗体結合が検出された 。 図１１は、筋芽細胞中に於ける前記２３ｋＤａ ２Ｉｇ異型と５２ｋＤａ ４ Ｉｇ異型との発現レベルを測定した時に得られた結果を示している。 図１２は、マウスの全長Ｎｓｋ ｃＤＮＡをインヴィトロシステム中で発現さ せた時に得られた結果を示している。 図１３は、ここに記載の前記Ｎｓｋ２分子の１１種類の可能な同質異性異型（ ｉｓｏｍｅｒｉｃ ｖａｒｉａｎｔ）の要約である。好適実施例の詳細な説明 本発明のヌクレオチド配列は、ＲＮＡであってもよいが、好ましくはＤＮＡ配 列である。更に、合成可能な程度に十分に小さな前記ヌクレオチド配列のフラグ メントに、（１）ＤＮａｓｅｓによる分解に対する抵抗性を達成し、（２）前記 分子の効果を増強し、そして（３）前記ヌクレオチドにの細胞による摂取を促進 させる、のに適した修飾を含ませることができる。現在、治療用に、十分な量の 修飾オリゴヌクレオチドを作り出す技術が存在している（例えば、Ｂｉｏｓｙｓ ｔｅｍｓ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ １９９１）。多数種のヌクレオチドの修飾が当該 技術において知られている。これらには、 ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａ ｔｅ ｂａｃｋｂｏｎｅｓ，前記分子の３’及び／または５’末端に於けるアク リジン又はポリリジン鎖の追加が含まれる。本発明の目的の為には、ここに記載 されるヌクレオチドは、そのインヴィヴォ活性の向上又は寿命の延長のために当 該技術において利用可能などのような方法によっても修飾可能であるものと理解 される。 このような修飾は、アンチセンスヌクレオチドフラグメントの開発において特 に注目される。このようなアンチセンスフラグメントは、インヴィトロ又はイン ヴィヴォに於けるＮｓｋ２又はＮｓｋ１遺伝子の転写又は翻訳を阻害するのに利 用可能である。この使用は、例えば、Ｎｓｋ２又はＮｓｋ１遺伝子産物の発現が 、Ｎｓｋ２を発現する細胞へ有効量のアンチセンスヌクレオチドフラグメントを 導入することによって選択的に阻害される条件下での筋形成の研究に適用される 。 本発明のヌクレオチドフラグメントは、通常、１０ないし２０００、塩基長で あり、例えば、１０ないし１，０００、例えば、１５−５００、具体的には、１ ６，１７，１８，２０，２５，５０，１００又は２００個のヌクレオチドの長さ である。 本発明のヌクレオチド配列は、１本鎖でも２本鎖でもよい。本発明の好適フラ グメントには、前記配列認識番号２の以下のアミノ酸領域：ａａ１−２１，ａａ ２２−４９６（ａａ４９−９８，ａａ１４２−１９０，ａａ２３３−２８２，及 びａａ４０１−４５０を含む）、ａａ４９７−５１７，ａａ５１８−８７１，ａ ａ５１８−５７６，ａａ５７７−８５８，ａａ６７４−６９３及びａａ８５９− ８７１、をコードするものが含まれる。 ヌクレオチド配列又はそのフラグメントは、ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎｔな 条件、即ち前記配列又はそのフラグメントがＮｓｋ２又はＮｓｋ１に関連して通 常見られる遺伝子にハイブリダイズしない条件下において、Ｎｓｋ２又はＮｓｋ １とその相補鎖に選択的にハイブリダイズできる。ｈｉｇｈ ｓｔｒｉｎｇｅｎ ｔな条件は、そのフラグメントの大きさによって変わる。約５０個のヌクレオチ ド以上の大きさのフラグメントの場合、高緊縮条件は、通常、０．２Ｘ ＳＳＣ で約６０度、好ましくは、０．１ Ｘ ＳＳＣで６０度、更に好ましくは、０． １ Ｘ ＳＳＣで６５度である。もっと小さいオリゴヌクレオチドフラングメン トの場合、ハイブリダイゼーション条件は、ここに参考文献として合体されるマ インコート（Ｍｅｉｎｋｏｔｈ）及びヴァール（Ｗａｈｌ）， （Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３２；２６７−２８４（１９８４））を参照す ることによって決定することができる。ＳＳＣは、ｐＨ７．５の、０．１５Ｍの 塩化ナトリウムと０．１５Ｍのクエン酸ナトリウムであると定義される。 一般に、図１，３ｂ，４ａ，５ａ，６ａ又は９の配列に選択的にハイブリダイ ズ可能なヌクレオチド配列又はそのフラグメントは、配列認識番号１の配列に対 して、少なくとも２０、好ましくは、最低３０、例えば、４０，６０又は１００ あるいはそれ以上の隣接するヌクレオチドの領域に渡って、少なくとも８０また は９０％、好ましくは、最低９５％の相同性を有する。 本発明の前記配列のホモログは、図１，３ｂ，４ａ，５ａ，６ａ又は９のヌク レオチド配列またはそのフラグメントを、例えば、分化筋細胞、筋芽細胞、又は 胚芽細胞から調製されたほ乳類ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーに対する プローブとして使用することによって得られる。前記ｃＤＮＡライブラリーは、 λｇｔ１１等の発現ベクター中で作り、Ｎｓｋ２又はＮｓｋ１に対する抗体を含 む抗血清でスクリーニングすることが出来る。前記ヌクレオチド配列のフラング メントは、前記ホモログ及びＰＣＲによって得られたホモログの対応する領域 に対するＰＣＲプライマーとして使用することができる。このようなライブラリ ーの作成と、適当なプローブ条件とは、当業者において、サムブルック（Ｓａｍ ｂｒｏｏｋ）他（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，１９８７）等の標準 テクストを参照することによって決定することができる。 実質的に単離状態としての本発明のポリペプチドは、一般に、その調合物中の ９０％以上、例えば、９５％、９８％又は９９％のポリペプチドが、前記特定配 列のポリペプチドである調合物中の特定配列のポリペプチドである。同様に、実 質的に単離状態としてのヌクレオチド配列は、その調合物中の９０％以上、例え ば、９５％、９８％又は９９％のヌクレオチドが、前記特定配列のヌクレオチド である調合物中の配列である。 一般に、本発明に依るポリペプチドのフラグメントは、最低１０、好ましくは 最低１５、例えば、２０，２５，３０，４０，５０又は６０個のアミノ酸長であ る。このようなフラグメントは、オプションとして適当なキャリアに固定された 状態で、ほ乳類に投入された時に、抗体の産生を刺激することが可能な抗原決定 基をコードする。前記ほ乳類は、前記ポリペプチド配列の由来するほ乳類とは異 なったものである。前記抗原決定基は、好ましく は、Ｎｓｋ２又はＮｓｋ１に対して特異的である。これは、Ｎｓｋ２又はＮｓｋ １の配列を、ＴｏｒｐｅｄｏＲＴＫを含む他のＲＴＫｓと比較することによって 判定可能である。前記ポリペプチドの特異性は、下記に記載するような方法で、 そのポリペプチドに対する抗体の特異性をテストすることによって判定可能であ る。即ち、Ｎｓｋ２又はＮｓｋ１に対して特異的な抗体、即ち、他のＲＴＫと比 較してＮｓｋ２またはＮｓｋ１に対して高い親和性を有する抗体、の産生を誘発 することが可能な抗原決定基を有するすべてのポリペプチドが、本発明のポリペ プチドとなる。Ｎｓｋ２特異的抗原決定基を含む適当な領域として、図２のａａ ６７４−６９３とａａ８５９−８７１、更に、細胞外の領域がある。 図４ｂ及び４ｃの受容体チロシンキナーゼの別のカルボキシ末端ドメイン、図 ５ｂ及び６ｂの可溶性の短いＮｓｋ２イソ型タンパク質のカルボキシ末端と、更 に、別スプライシング配列ＤＹＫＫＥＮＩＴＴ（配列認識番号１４）も、それに 対してＮｓｋ２特異的抗体を作ることが可能な対象領域である。 本発明に依るモノクローナル抗体は、前記タンパク質又はそのペプチドフラグ メントを免疫原として使用して従来のハイブリドーマ技術によって調製すること ができ る。ポリクローナル抗体も、宿主動物、例えば、ラット又はラビットに、本発明 のペプチドを接種して、免疫血清を回収する従来手段によって調製することがで きる。本発明のタンパク質又はペプチドは、免疫原として使用するために、バク テリア又はバキュロウィルス又はほ乳類（例えば、ＣＨＯ由来）融合タンパク質 として提供することができる。 Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ₂）’又はＦｖフラグメント等の、その抗原結合活性 を保持している本発明のモノクローナル抗体のフラグメントは、本発明の更に別 の態様を構成するものである。更に、本発明に依るモノクローナル抗体を分析し て（例えば、そのような抗体を発現する遺伝子のＤＮＡ配列分析により）、本発 明に依る抗体の相補性決定領域を有するヒト化抗体を、例えば、参考文献として 合体される、ＥＰ−Ａ−０２３９４００（ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ））、又は そのアメリカ対応特許に開示の方法によって、作ることができる。 抗体又はそのフラグメントは、望ましくは、他のＲＴＫｓに対する親和性より も高い親和性で、Ｎｓｋ２ポリペプチド又はそのフラグメントに結合可能である 。好ましくは、他のＲＫＴｓに対する親和性は、Ｎｓｋ２に対する親和性の１／ １０以下である。抗体の親和性は、 当該技術に於て利用可能な技術によって測定可能である。同様に、Ｎｓｋ１ポリ ペプチド又はそのフラグメントに結合可能な抗体又はそのフラグメントは、他の ＲＴＫｓに対してよりも、Ｎｓｋ１ポリペプチドに対しての方が１０倍以上の親 和性を有している。本発明の別の抗体を、Ｎｓｋ２とＮｓｋ１とに共通するポリ ペプチド配列をベースにして作り出すことができる。このような抗体は、両方の 標的を同定することができる。好ましくは、そのような抗体又はそのフラグメン トは、他のＲＴＫｓに対してよりも、Ｎｓｋ２とＮｓｋ１とに対して１０倍の親 和性を有する。 本発明に依る核酸分子を含む発現ベクターに、更に、該ベクターがその中で複 製される宿主細胞に適合する複製源を含ませることができる。適当な宿主細胞に は、バクテリア（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、イースト、昆虫、及びほ乳類（例え ば、チャイニーズハムスタ卵巣細胞）等の原核細胞又は真核細胞が含まれる。 前記ベクターが、発現ベクターである場合、これは、更に、前記ヌクレオチド 配列に作動リンクされた宿主細胞に適合するプロモーターを含む。「作動リンク 」とは、プロモーターとヌクレオチド担持配列とが、そのプロモーターの制御下 に於てコード化配列の発現を許容する関 係にある並列状態のことをいう。前記プロモーターとコード化配列との間には、 ５’非コード化配列等のエレメントが介在してもよい。前記５’非コード化配列 は、前記プロモータ及び／又はコード化配列に対して、非相同的であっても、相 同的であってもよい。前記発現は、望ましくは、更に、前記コード化配列に作動 リンクされた３’非コード化配列を含む。前記発現ベクターが真核発現ベクター である場合、それは、前記コード化配列と、３’非コード化配列の３’側にポリ アデニル化シグナルを含む。 前記プロモーターは、当該技術に於て入手可能な如何なる適当なプロモーター であっもよい。これは、調節可能なプロモーターを含む。適当なプロモーターの 具体例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ β−ラクタマーゼプロモーター、イーストＡＤ Ｈ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ほ乳類メタロチオネインプロ モータ、及び、ＳＶ４０Ｔ抗原プロモーター又はレトロウィルスＬＴＲプロモー ター等のウィルスプロモーターがある。 本発明に依る核酸分子は、当該技術に於て公知で、以下の例に示される合成又は 組換え手段によって作ることができる。例えば、前記マウスＮｓｋ２ヌクレオチ ド配列は、Ｎｓｋ２遺伝子の領域に対して特異的なＰＣＲプ ライマーを使用することによって得られる。前記プライマーは、ゲノムＤＮＡラ イブラリーからのＮｓｋ２ゲノムＤＮＡ、又は、その中で前記遺伝子が発現され る細胞由来のｃＤＮＡライブラリーからのＮｓｋ２ｃＤＮＡの増幅及びクローン 化に使用することができる。ほ乳類ホモログは、類似の手続きを使用して得るこ とができる。類似及び同等の手続きを使用して、図９の情報から始めで、Ｎｓｋ １のマウス及びその他のほ乳類ホモログを得ることができる。 図１，３ｂ，４ａ，５ａ，６ａ又は９のヌクレオチド配列に選択的にハイブリ ダイズ可能な配列は、当該技術に於て利用可能ないずれの適当な技術を使用して も作り出すことが可能である。例えば、図１，３ｂ，４ａ，５ａ，６ａ又は９の 配列は、マウスのゲノムＤＮＡライブラリー又は適当なｃＤＮＡライブラリーか らクローン化することができる。そのような配列の領域は、部位特異的突然変位 誘発によって修飾することができる。所望の変化を含む修飾されるべき配列の領 域に対応するプライマーを作ることができる。前記プライマーを、単数又は複数 の他のプライマーと併用して、元の図１，３ｂ，４ａ，５ａ，６ａ又は９の配列 に対してＰＣＲを行うことができる。これによって、元の配列に選択的にハイブ リダイズ可能な所望のヌクレオチド変化を含む新しい配列が提供される。 図１，３ｂ，４ａ，５ａ，６ａ又は９の配列のフラグメントは、合成、又は、 制限切断や、前記所望のフラグメントの３’及び５’末端に対応するプライマー を使用したＰＣＲ等の組換えによって作ることができる。 本発明に依るポリペプチド及びそのフラグメントは、本発明の発現ベクターを 使用した組換えの手法、又は、合成によって作ることができる。組換えによる生 産には、本発明の発現ベクターを有する宿主細胞の培養が含まれる。前記ベクタ ーは、細胞に対して適当な、いかなる物理的又は生物学的手段、例えば、移入（ ｔｒａｎｓ−ｆｅｃｔｉｏｎ）、又は形質転換（ｔｒａｎｓ−ｆｏｒｍａｔｉｏ ｎ）、等、によって細胞に導入させてもよい。前記細胞は、細胞の成長とタンパ ク質又はポリペプチドの発現にとって適当な、それ自身公知の条件下に於て培養 することができる。前記ポリペプチドは、この培養から回収することができる。 これは、その培養物が生育した培地から、又は、前記培養中の細胞からの、前記 ポリペプチドの回収を含む。後者のプロセスにおいては、化学的又は物理的手段 によって細胞を分解してもよい。前記ポリペプチドの実質的に単離状態での回収 に は、クロマトグラフィ（ＨＰＬＣを含む）、適当なゲル又はカラム上でのサイズ 分画、回収されるポリペプチド上に存在するエピトープに選択的に結合可能な抗 体を使用したアフィニティ（親和）精製等の当該技術においてそれ自身公知の適 当な精製手段が含まれる。 ポリペプチドとそのフラグメント及び、このポリペプチドに結合可能な抗体と そのフラグメントとは、ほ乳類の骨格筋筋管の成長と分化とに於けるＮｓｋ２の 役割の研究に利用することができる。これらは、細胞中に於けるＮｓｋ２又はＮ ｓｋ１のキナーゼ活性を増強、又は、その活性を阻害するために、Ｎｓｋ２又は Ｎｓｋ１のアゴニスト又はアンタゴニストとして使用することができる。これは 、本発明のポリペプチド又はそのフラグメントを、インヴィトロ又はインヴィヴ ォで、細胞の環境に導入することによって達成できる。前記細胞は、通常分化し て、血清の投与中止（ｗｉｔｈｄｒａｗａｌ）等の適当な条件下に於て筋管を形 成することが可能な未分化筋芽細胞とすることができる。前記筋芽細胞を、本発 明のペプチドの存在下でそのような条件に晒し、その分化に対する効果を観察す ることができる。 組換えＮｓｋ２又はＮｓｋ１ポリペプチド、ペプチド、抗体又はそのフラグメ ントは、更に、Ｎｓｋ２または Ｎｓｋ１シグナル経路の他の要素を同定するための計画（ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ）にも利用可能である。例えば、Ｎｓｋ２の可溶性細胞外ドメインイソ型タンパ ク質の前記新規なカルボキシ末端に対して特異的な抗血清を使用して、組換え細 胞外ドメインを、堅固な担体（ｓｏｌｉｄｓｕｐｐｏｒｔ）に固定して結合タン パク質を精製するアフィニティーカラムを作ることができる。類似の手段を用い てｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングすることができる。Ｎｓｋ２又は Ｎｓｋ１抗体が必要とされる類似の親和（ａｆｆｉｎｉｔｙ）方法を使用して、 活性化Ｎｓｋ２又はＮｓｋ１受容体の基質を精製することができる。 筋芽細胞のインヴィトロ培養において、本発明のアゴニスト又はアンタゴニス トの適当な濃度は、約０．１ｎＭないし約１０μＭ、例えば、約１０ｎｍないし １μＭである。 Ｎｓｋ２の好適なフラグメントには、図２において番号付けされている以下の アミノ酸フラグメントが含まれる。即ち、ａａ１−２１，ａａ２２−４９６（ａ ａ４９−９８，ａａ１４２−１９０，ａａ２３３−２８２及びａａ４０１−４５ ０を含む）、ａａ４９７−５１７，ａａ５１８−８７１，ａａ５１８−５７６， ａａ５７７− ８５８，ａａ６７４−６９３及びａａ８５９−８７１、更に、図４ｂ，４ｃ，５ ｂ及び６ｂに示されるＮｓｋ２の別のイソ型タンパク質の新規なカルボキシ末端 領域、そして、図３ｂに示される新規な細胞外ドメイン領域。Ｎｓｋ１の相同領 域も好適である。 ポリペプチドとそのフラグメント及び抗体とそのフラグメントは、薬用製剤と して調製可能である。このような製剤には、前記ポリペプチド、抗体又はフラグ メントを、単数又は複数種の薬用として許容可能なキャリア又は希釈液とともに 含む。薬用として許容可能なキャリア又は希釈液には、経口又は非経口（例えば 、筋内又は静脈中）投与用として適当な製剤に使用されているものが含まれる。 これらの製剤は、便宜、単位投与形状として提供可能で、薬学技術において周知 のいずれの方法を使用することによっても調製可能である。このような方法には 、前記活性成分を、単数又は複数の付随的成分を構成するキャリアと作用させる 工程を含む。一般に、前記製剤は、活性成分を、液体キャリア又は細かく砕かれ た固体キャリアのいずれか一方又は両方と均一及び緊密に作用させて、その後、 必要な場合には、その製品を成形することによって作られる。 例えば、非経口投与に適した製剤には、酸化防止剤、 バッファー、靜菌及び、前記製剤を、目的の受容者の血液に対して等浸透圧にす るための溶質とを含ませることができる水性又は非水性殺菌注射溶液、懸濁剤及 び増粘剤を含ませることが可能な水性及び非水性殺菌懸濁液、及び、前記ポリペ プチドを、血液成分又は単数又は複数の器官に対して標的化するように構成され たリポソーム又はその他の微小粒子システムが含まれる。 受容体様タンパク質型チロンシキナーゼ（ＲＴＫｓ）のスーパーファミリのプ ロトタイプメンバの分析によって、これらの膜貫通分子が、正常なほ乳類の成長 に必要な細胞間シグナル経路において重要な調節機能を果たし、更に、これらが しばしば形質転換細胞中の破壊の標的であるということが明らかになった。最近 、触媒モチーフの保存される性質を、ＰＣＲ ｃＤＮＡクローン化方法の適用と 組合せることによって、ＲＴＫｓの同定が非常に容易になった。そこで、我々は 、初期のマウスの胚からのＮｓｋ１の部分ｃＤＮＡのクローン化にこの方法を採 用した。マウスのゲノムライブラリのスクリーニングにおいてＮｓｋ１とクロス ハイブリダイズする、Ｎｓｋ２の前記全長コード化配列、イソ型タンパク質異型 及び染色体位置が同定され、これらは本発明の一部を構成する。 成長因子シグナル経路の維持と破壊とが、多種類のが ん遺伝子による細胞の形質転換のために必要とされ、これが恐らく、自然なアポ トーシス経路の実行を妨げるなんらかの手段を反映したものであるということが よく知られている。従って、Ｎｓｋ２及びＮｓｋ１等の筋ＲＴＫｓに関連するシ グナル経路を阻害すれば、腫瘍の成長を阻害することになると予想される。従っ て、本発明の一態様は、筋ＲＴＫシグナリングの阻害である。これは、例えば、 活性化に関連する筋ＲＴＫエピトープに対する抗体、アンチセンス核酸分子、ド ミナントネガティブＲＴＫ受容体の発現、及び、問題の標的部位への可溶化ＲＴ Ｋ受容体の投与、によって達成することができる。 本発明のＲＴＫｓは、インヴィトロで最終分化骨格筋管中に於て、更に、イン ヴィヴォで 成人骨格筋中に於て発現される。公知のＲＴＫｓのシグナル特性を類 比推測することによって、Ｎｓｋ２及びＮｓｋ１等の前記筋ＲＴＫｓは、正常な 骨格筋に於ける細胞生存経路を仲介している可能性があると結論することができ る。このような経路一般の刺激、維持又は調節によって、神経傷害後の長引く神 経麻痺状態の効果を軽減し、これによって、神経再生中の筋組織の生存を容易に することが出来ると予想される。 これらの経路の必要な調節は、例えば、前記キナーゼ に効果的に触媒作用を与えるＲＴＫｓに対するアゴニスト的抗体を使用すること によって達成される。同様に、Ｎｓｋ２リガンド等のリガンドの局所適用によっ てもこれを達成することができる。前述の目的を達成するその他の手段は、当業 者にとって明らかであろう。従って、ここで繰り返す必要はない。 これまでの研究によって、Ｎｓｋ２等のＲＴＫｓは、泌乳乳腺の上皮と、新生 児精巣の輸精管とに発現されることが示された。ＲＫＴ発現の異常なレベル、特 に、これらの組織に於けるＮｓｋ２の発現の異常なレベルの測定によって障害を 診断することができる。ハイブリダイゼーション、増幅（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔ ｉｏｎ）、イムノアッセイは、ここで使用可能なタイプのアッセイの具体例であ る。これらのアッセイ及びどのようにそれらを実施するかについては当業者によ って明らかであり、ここでのベル必要はない。更に、以上の開示から、本発明の ＲＴＫｓを修飾するのに「筋」を使用してはいるが、問題の遺伝子は、筋細胞以 外の細胞に発現することが明らかである。例えば、乳腺上皮と神経細胞は問題の 遺伝子を発現する。その他の細胞もこれらの遺伝子を発現する。 ここに参考文献として合体されるＯｎｃｏｇｅｎｅ １１：２８１−２９０に報告されているように、マウスのＮｓｋ２は、マウスの 第１３染色体の末端部分に位置することが示された。この位置には、ヒトの染色 体５ｑと同一染色体に位置する部位が含まれている。例えば、ＨＭＧＣＲは５ｑ １３−ｑ１４に位置し、ＩＬ９は５ｑ１５−２１に位置する。これらの部位中に 於てミューテーションがマッピングされ、これは、ＬＧＭＤＩＡとして知られて いる一種の肢帯（ｌｉｍｂ ｇｉｒｄｌｅ）筋ジストロフィと相関可能である。 このマップ位置は、Ｎｓｋ２の発現パターンとともに、筋ジストロフィに於ける 関与を示唆している。従って、Ｎｓｋ２等のＲＴＫｓを測定することによって、 筋ジストロフィを予見、又は診断することになるかもしれない。 Ｎｓｋ２の全長イソ型タンパク質は、膜貫通受容体チロシンキナーゼに特有の すべての構造モチーフを有しており、これは、細胞間シグナリングに於ける機能 の可能性を示唆している。更に、マウス成長中に於けるＮｓｋ２転写産物の分布 は、骨格筋形成、神経成長及び胎児器官形成中の間充織−上皮相互作用に於ける この新規なＲＴＫの機能に関連している。染色体マッピングと、ヌクレオチド配 列の比較との両方が、Ｎｓｋ１（第４染色体）とＮｓｋ２（第１３染色体）とが 互いに異なる遺伝子であ ることを示している。 Ｎｓｋ２細胞外ドメインの構造組織は、公開されているＲＴＫｓの中でユニー クなものであると考えられ、これは、Ｎｓｋ２がこのタンパク質スーパーファミ リー中の新規なサブクラスを表すものであることを示している。最も高い相同性 は、Ｔｏｒｐｅｄｏ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ（ジェニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇ ｓ）他、１９９３）、ＰＮＡＳ ９０ ２８９５−２８９９）の電気器官からク ローン化されたＴｏｒｐｅｄｏ ＲＴＫとにおいて見られ、この事実と、骨格筋 に於ける両者の優先的発現とは、これらのタンパク質の間に近い進化上の関係が あることを示唆している。しかしながら、Ｎｓｋ２とＴｒｏｐｅｄｏ ＲＴＫと の両方の推定リガンド結合ドメインが、類似の組織的構造を有する４つのＩｇ様 ループを含んではいるものの、Ｔｏｒｐｅｄｏ ＲＴＫ（ジェニングス（Ｊｅｎ ｎｉｎｇｓ）他、１９９３）を特徴づけているｋｒｉｎｇｌｅ様タンパク質結合 ドメインは、Ｎｓｋ２には存在しない。このＮｓｋ２とＴｏｒｐｅｄｏＲＴＫ細 胞外ドメインの間の明白な相違は、エキソンのシャフリングを受ける分子単位と してのｋｒｉｎｇｌｅモチーフについて提案されているモデルと一致している。 これと合致して、Ｎｓｋ２とＴｏｒｐｅｄｏ ＲＴＫ細 胞外ドメインとの間の非相同の領域の境界は、Ｎｓｋ２転写ユニット中に於ける 、エキソン−イントロン結合部と選択的スプライシングの部位である。Ｔｏｒｐ ｅｄｏＲＴＫとＮｓｋ２の細胞内ドメインも、高度に保存されたチロシンキナー ゼドメインと小さなキナーゼインサートと、同じサイズのカルボキシ末端領域と を含む、構造的類似性を示している。しかし、これらのモチーフ間において一次 配列相同性はほとんど無く、これは、Ｎｓｋ２は、Ｔｏｒｐｅｄｏ ＲＴＫの真 のほ乳類ホモログではないという結論を更に裏付けるものである。ほ乳類ＲＴＫ ｓにおいては、Ｎｓｋ２細胞内ドメイン中に於ける、小さなキナーゼインサート と、短いカルボキシ末尾との発生は、Ｎｓｋ２細胞内ドメインのアミノ酸配列と ２番目に最も相同性の高いニューロトロフィン受容体のｔｒｋファミリーにおい て見られるものと類似している。 ノザンブロット解析によって、骨格筋細胞タイプと、１２．５日目の懐胎胚の 全ＲＮＡとにおいて共に発現される２種類のＮｓｋ２転写産物が同定された。こ れらのｍＲＮＡ種間の正確な関係は、現在のところまだ完全には理解されていな いが、類似の発見が電気エイのＴｏｒｐｅｄｏ ＲＴＫに関して報告されている （ジェニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）他、１９９３）ことは興 味深い。Ｎｓｋ２関連ＲＴＫに対するクロスハイブリダイゼーションの可能性は 低いと考えられる。というのは、Ｎｓｋ２ ＲＴＫイソ型タンパク質の細胞外及 び細胞内又は３’非翻訳領域に対応するｃＤＮＡプローブによって、ノザンブロ ット解析で、筋管中で両方の転写産物が同定されたからである。更に、同じｃＤ ＮＡプローブを使用した筋管ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングによっては 、Ｎｓｋ２クローンのみが同定された。骨格筋管中に発現された前記４つのＮｓ ｋ２ＲＴＫイソ型タンパク質のそれぞれのクローン化されたｃＤＮＡ配列が、約 ３．３ｋｂのｍＲＮＡのもととなり、これは、ポリアデニレート化シグナルを含 んでいるが、完全な５’非翻訳領域がこれらのクローン中に表されている可能性 は低い。別の転写開始位置又は、更に別にプロセシングされたｖａｒｉａｎｔを 利用することによって、Ｎｓｋ２発現細胞及び組織中に於て検出された前記二つ の転写産物を説明出来る。インヴィヴォでの骨格筋形成中に於て、Ｎｓｋ２転写 産物は、ｄｅｒｍａｍｙｏｔｏｍｅの出現と同じ程度の初期にＲＮＡインサイチ ュハイブリダイゼーションによって検出され、これは、胎児の骨格筋繊維中に横 紋状の分布を示した。ノザンブロット解析によって、発現が成人マウスからの骨 格筋において存続してい ることが示された。更に、インヴィトロでのｃｏｍｍｉｔｔｅｄ骨格筋芽細胞の 最終分化の際に観察されるＮｓｋ２転写産物の増加した定常状態レベルは、この 新規なＲＴＫが骨格筋管の形成及び／又は機能に関連していることを示す。この 点に関して、Ｎｓｋ２の発現プロファイルは、ＲＴＫは筋芽細胞増殖を促進し、 筋管形成によってダウンレギュレートされるというＲＴＫに対する以前に定義さ れた発現プロファイルと対照をなす。筋芽細胞の分化中に於いてインスリン様成 長因子とその受容体との発現が増加することから、ＩＧＦ−仲介シグナリングが 、自己分泌的な筋芽細胞の分化の促進を助けているのかもしれないということが 提案されている。Ｎｓｋ２の異なった発現は、この新規なＲＴＫの筋芽細胞分化 の正のｍｅｄｉａｔｏｒとしての役割を反映しているかもしれない。更に、最終 分化筋管中に於てＮｓｋ２が優先的に発現されることと、細胞の生存のｍｅｄｉ ａｔｏｒとしてのプロトタイプＲＴＫｓの公知の性質とによって、Ｎｓｋ２ Ｒ ＴＫは、分裂後の筋管の生存の為に必要なシグナルを伝達しているのかもしれな いという興味深い可能性がもちあがる。これらの点に関して、筋形成細胞に於け るＮｓｋ２シグナル経路の生物学的特性と細胞内成分を更に分析することが、細 胞内シグナル経路が筋芽 細胞増殖を促進し、筋−特異的転写因子の活性を抑制する分子メカニズムに対す る関係において大いに興味がもたれる。 骨格筋組織化ら生じた系統に於ける発現がＮｓｋ２ＲＴＫの主要な特徴ではあ るが、胚成長中に於けるＮｓｋ２発現の更に別の部位がＲＮＡインサイチュハイ ブリダイゼーションによって同定された。硬化中の骨の骨膜層に於ける発現は、 Ｎｓｋ２の筋−骨成長に於ける別の機能を示唆し、これに対して、幹の後根神経 節の細胞、内蔵の頭側神経節及び腸管神経節の細胞に於ける転写産物の検出は、 末梢神経システムの主要ブランチに於けるこの新規なＲＴＫの関与を示している 。Ｎｓｋ２転写産物の別の分布が、腎臓、肺及び内蔵のものを含む種々の成長中 の器官の上皮成分中にも見られた。適当な上皮−間充織相互作用による誘発が、 器官の正常な成長に必須であることは古くから知られており、ＲＴＫシグナル経 路が、しばしば、受容体チロシンキナーゼとその関連成長因子リガンドとがそれ ぞれ上皮及び間充織細胞中に於て発現されるパラ分泌メカニズムによって、誘発 相互作用を仲介することが出来ることが明らかになりつつある。胚器官上皮細胞 中に於いてＮｓｋ２転写産物が別の分布をすることは、上皮細胞−成長の調節に 於ける Ｎｓｋ２シグナリングの役割を示唆するだけでなく、更に、このような胚組織の 間充織成分が、この新規なＲＴＫのための生理学的リガンド（単数又は複数）の 源を提供するものであるかもしれないという可能性をもたらすものである。Ｎｓ ｋ２シグナリングを分析し操作するための生理学的に関連するインヴィトロ培養 システムが利用可能になれば、このようなリガンドの同定と、細胞の成長と分化 の調節に於けるＮｓｋ２シグナリングの生物学的特性の解明が容易になるであろ う。 以下の例によって本発明を説明する。 例 Ｎｓｋ２の同定と分析に於て使用されるクローニング、プロービング、シーク エンスその他の方法は、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他（前出）によって 記載されている一般技術に基づくものである。例１ Ｎｓｋ２の同定 Ｎｓｋ２を、ウィルクス（Ｗｉｌｋｓ）他（前出）によって記載されている方 法を改変した方法によってクロ ーン化した。チロシンキナーゼの保存ドメインに対応するディジェネレートオリ ゴヌクレオチドを使用して、遺伝子フラグメントを入手し、これを使用して、バ クテリオファージラムダベクターＬａｍｂｄａＤａｓｈ内に構成されたマウスゲ ノムライブラリーをスクリーニングした。スクリーニングは、０．１ｘＳＳＣ， ０．１％ＳＤＳ、６０℃で行った。それぞれλＧ１３とλＧ２３とする二つのゲ ノムクローンがＮｓｋ２遺伝子を有していた。完全Ｎｓｋ２受容体チロシンキナ ーゼイソ型タンパク質コード化配列 Ｎｓｋ２の完全なコード化配列を、λＧ１３とλＧ２３ゲノムサブクローンと 、条件不死化したマウス胎児筋芽細胞系由来のｃＤＮＡクローン（モーガン（Ｍ ｏｒｇａｎ）他、（１９９４）Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．１６２：４８６−４９８）と の重複から決定した。 前記全長Ｎｓｋ２受容体様チロシンキナーゼの完全コード化ヌクレオチド及び 予想アミノ酸配列が図１に示されている。全長タンパク質の以下の特徴が明らか である（図２）： ａａ１−２１．．．β−チューブリンｍＲＮＡオートレギュレーションシグナル を有するシグナルペプチド ａａ２２−４９６：以下を含む細胞外領域 ．．ａａ４９−９８．．イムノグロブリン様ドメイン ．．ａａ１４２−１９０：イムノグロブリン様ドメイン ．．ａａ２３３−２８２：イムノグロブリン様ドメイン ．．ａａ４０１−４５０：イムノグロブリン様ドメイン ．．ａａ２２２−２２４：潜在的Ｎ−結合グリコシレート化部位 ．．ａａ４６２−４６４：潜在的Ｎ−結合グリコシレート化部位 ａａ４９７−５１７：膜貫通ドメイン ａａ５１８−８７１：以下を含む細胞内領域 ．．ａａ５１８−５７６：傍膜ドメイン ．．ａａ５７７−８５８：チロシンキナーゼドメイン ．．ａａ６７４−６９３：キナーゼインサートドメイン ．．ａａ８５９−８７１：カルボキシ末端ドメイン２４のヌクレオチド（１４１ ５−１４３８）の欠失によって、ａａ４５７−４６５が一つのアラニン（Ａ）残 基と置き変わったＮｓｋ２受容体チロシンキナーゼの別のイソ型タンパク質も同 定された（配列認識番号３）。 両方のＮｓｋ２イソ型タンパク質が、胎児筋芽細胞と派生筋管中で発現された。 胎児筋由来ｃＤＮＡクローンの中から別のＮＳＫ２受容体モロシンキナーゼイ ソ型タンパクが同定され、それは拡散配列アイデンティティーがヌクレオチド２ ６４９（ａａ８６８）までみられ、その後新規な４８３ヌクレオチドが同定され た（配列識別Ｎｏ：４）。これは、さらに１３個のアミノ酸と、停止コドンと、 ３’非翻訳領域とをコードした。前記細胞外ドメイン別スプライシング（図２及 び３ａ）との関係において、この新規なカルボキシ末端は、Ｎｓｋ２受容体チロ シンキナーゼの更に別の二つのイソ型タンパク質を予告するものである（図４ｂ 及び４ｃ）。 推定可溶性細胞外ドメインをコードする第５のＮｓｋ２イソ型タンパク質 胎児筋管ｃＤＮＡライブラリーから単離されたいくつかのｃＤＮＡクローンの ヌクレオチド配列は、図１に示された全長受容体イソ型タンパク質の配列から更 に離れたものであった。核酸配列アイデンティティはヌクレオ チド１４１４（ａａ４５６）まで見られ、その後、新規な２５８ヌクレオチドス パンが同定された。これは、さらに１１個のアミノ酸と、停止コドンと、３’非 翻訳領域と、ポリアデニレート化シグナルと、ポリＡ ｔａｉｌとをコードした （配列認識番号８）。従って、これらのｃＤＮＡクローンは、一つだけの（ａａ ２２２−２２４）推定Ｎ−結合グリコシレート化部位を有するＮｓｋ２の可溶性 細胞外ドメインをコードすることが予想される第５番目のＮｓｋ２イソ型タンパ ク質（配列認識番号９）を予告するものである。 短いＮｓｋ２をコードする第６のイソ型タンパク質 更に、図１の配列認識番号のヌクレオチド６７３でのスプライシングに起因す る別のイソ型タンパク質が同定された。前記全長配列の最初の６７３個のヌクレ オチドが、その後に３’非翻訳領域とポリアデニレート化シグナルとが続く、３ ６アミノ酸Ｃ−末端尾をコードする５３２ヌクレオチド配列につながるようにス プライシングされた。これは、それぞれ、配列認識番号１０及び１１に示されて いる。 この推定可溶性細胞外ドメインイソ型タンパク質は、前記全長受容体の最初の 二つのＩｇ−様ループのみをコ ードすることが予想されるのに対して、一方、図５ｂのものは、前記全長Ｎｓｋ ２細胞外ドメインを特徴付ける４つのＩｇ−様ループの全部と、一つの推定Ｎ− 結合グリコシレート化部位とをコードすることにおいて、配列認識番号９のそれ と識別可能である。 Ｎｓｋ２転写ユニットの別のスプライシグから得られるＮｓｋ２イソ型タンパク 質 Ｎｓｋ２ゲノムクローンの配列分析によって、ここに記載した６つのＮｓｋ２ イソ型タンパク質の内の５つが、図７に概略を示すようなＮｓｋ２転写ユニット の別のスプライシングから得られることが確認された。少なくとも５つのイソ型 タンパク質に共通する５’エキソンは、ヌクレオチド１４１４で終わっている。 発生するイソ型タンパク質は次の通りである。 ａ）可溶性細胞外ドメイン（図５ａ，５ｂ）：スプライシングは起こらず、ポリ Ａシグナルによって転写の終了とポリアデニレート化とが起こる。 ｂ）全長受容体タンパク質型チロシンキナーゼ（配列認識番号２）：単数又は複 数のエキソンをコード化するヌクレオチド１４１５−１４３８への１４１４ｎ部 位でスプライシングが起こる。その後、次のエキソン コード化ヌクレオチド１４３９−１６３７までに更に別のスプライシングが起こ る。 カルボキシ末端が、ヌクレオチド２６４９と２６５０との間にスブライシングが 起こらない結果として生じる。ヌクレオチド２６９２−３２５０のゲノム組織は 知られていない。 ｃ）欠失を受けた受容体タンパク質チロシンキナーゼイソ型タンパク質（図３） ：前記１４１４ｎスプライシング部位から前記エキソンコード化ヌクレオチド１ ４３９−１６３７にかけて直接にスプライシングが起こる。 ｄ）別のカルボキシ末端受容体チロシンキナーゼイソ型タンパク質（図４ｂ）が 、このイソ型タンパク質に固有の別の単数又は複数のエキソンをコードする配列 までの２６４９ｎ部位に於けるスプライシングによって起こる。 ｅ）ｃ及びｄに概略説明した別スプライシングの組合せによって、第４番目の受 容体チロシンキナーゼイソ型タンパク質が発生する（図４ｃ）。 Ｎｓｋ２はＴｏｒｐｅｄｏ ＲＴＫに対して或る程度の相同性を有する Ｎｓｋ２ヌクレオチド及び予想アミノ酸配列を、ＧｅｎＥＭＢＬとＳｗｉｓｓ ｐｏｒｔデータベースと比較することによって、電気エイ Ｔｏｒｐｅｄｏｃａ ｌｉｆｏｒｎｉｃａ（ジェニングス（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）他、前出）の電気器官 からクローン化された前に公開された受容体チロシンキナーゼ、との最も高い相 同性が明らかである。図８は、Ｎｓｋ２とＴｏｒｐｅｄｏ ＲＴＫとのアミノ酸 配列の最適配置比較を示している。アミノ酸配列同一性（６４％）及び相同性（ ７８％）は、このように遠い関係にある種間の遺伝子に於てはきわめて高いもの である。しかしながら、数多くの特徴が、Ｎｓｋ２はＴｏｒｐｅｄｏ ＲＴＫ（ 図８）の単なるほ乳類ホモログではないということを示唆している。即ち、．． ｉ）Ｎｓｋ２には、Ｔｏｐｅｄｏ ＲＴＫの特徴である細胞外領域中のｋｒｉｎ ｇｌｅドメインが欠如している、 ．．ｉｉ）キナーゼインサートドメインが保存されていない（１５％のアミノ酸 配列同一性）、そして、 ．．ｉｉｉ）カルボキシ末端ドメインは、ほとんど保存を示していない（３０％ のアミノ酸配列同一性）。 更に、Ｎｓｋ２に於てｋｒｉｎｇｌｅドメインが特異的に不在であるというこ とは、Ｎｓｋ２とＴｏｒｐｅｄｏＲＴＫとの間の相同性が、進化中に於けるシャ フリングによるエキソン配列の保存を示すものであるという考え方と一致してい る（即ち、Ｔｏｒｐｅｄｏ ＲＴＫタンパク質の直接的なほ乳類ホモログは存在 しないかもしれない）。 Ｎｓｋ２は、骨格筋中において優先的に発現される ノザンブロット解析によって、１２．５日齢の全胚及び成人骨格筋のサンプル 中において約６．６ｋｂと３．６ｋｂの特異的Ｎｓｋ２転写産物が同定されたが 、心臓、牌臓、脳、精巣、あるいは肝臓ＲＮＡサンプル中においては同定されな かった。胎児筋芽細胞及び成人筋芽細胞系の両方が高いレベルのＮｓｋ２ ｍＲ ＮＡを発現し、その量は分裂後筋管への最終分化において顕著に増加する。前記 ６．６ｋｂ ｍＲＮＡ種は、前記別スプライシングカルボキシ末端受容体チロシ ンキナーゼイソ型タンパク質に対応している（図４ａ）。筋管ＲＮＡ中の約２ｋ ｂのｍＲＮＡ種が、前記可溶性細胞外ドメインＮｓｋ２イソ型タンパク質ｃＤＮ Ａクローンに対応し（図５ａ）、これに対して、約１．３ｋｂのｍＲＮＡ種 が前記の短い細胞外ドメインイソ型タンパク質ｃＤＮＡに対応している（図６ａ ）。Ｅ１０−５ないしＥ１７．５マウス胚のＲＮＡインサイチュハイブリダイゼ ーション分析によって、幹及び四肢の発生筋節及び派生筋組織中に於けるＮｓｋ ２受容体チロシンキナーゼ転写産物が明らかになった。肺及び腎臓の上非細胞及 び末梢神経系の後根神経節を含む神経細胞タイプに更に別の発現部位が見られる 。 Ｎｓｋ２シグナル経路の機能 前記Ｎｓｋ２の全長イソ型タンパク質は、これら受容体を発現する細胞の増殖 、生存及び／又は分化に必要な細胞間シグナル経路の一部として機能する分子に 典型的な、膜貫通型受容体チロシンキナーゼに特徴的な構造モチーフの全部を有 している。骨格筋に於ける優先的発現と、筋芽細胞、更に、神経細胞中に於ける 、最終分化の際の別発現とは、前記Ｎｓｋ２シグナル経路が、ほ乳類骨格筋筋管 の形成又は生存、及び、神経細胞の形成及び生存に於て機能していることを示唆 している。プロトタイプ受容体チロシンキナーゼとの類比によって、Ｎｓｋ２シ グナリング活性を、特異的成長因子（単数又は複数）を膜貫通イソ型タンパク質 の細胞外ドメインに結合させ ることによって誘導することができる。前記推定可溶性細胞外ドメインイソ型タ ンパク質は、又、Ｎｓｋ２受容体の生理的リガンド（単数又は複数）にも結合す ることができる。このようなリガンドは、ここに提供されるアミノ酸配列を使用 することによって更に限定することができる。例２ Ｎｓｋ２は、マウス第１３染色体に位置する マウスゲノム中に於けるＮｓｋ２部位の染色体位置を決定するするために、Ｎ ｓｋ２と組換え近交系（ＲＩ）マウス株中に位置決めされた他の部位との間の相 関関係を求めた。Ｎｓｋ２転写ユニットの細胞内及び３’非翻訳領域を含む１９ ５０ｂｐゲノムＤＮＡフラグメントが、ゲノムサザンブロット解析によって、Ｎ ｓｋ２を一つのコピーの遺伝子として同定した。次に、このプローブによって、 Ｃ５７ｂ１／６とＤＢＡ２／Ｊ近交系マウス株との間に検出されたＥｃｏＲＶ制 限断片長多型（ＲＦＬＰ）を使用して、ＢｘＤシリーズのＲＩマウス中のＮｓｋ ２部位の株分布パターン（ＳＤＰ）を決定した。このＳＤＰと、前記ＢｘＤシリ ーズ中において位置決めされた他のものとの比較によって、Ｎｓｋ２と第１３染 色体の遠端 部に見られる公知の部位との間の関係が同定された。Ｎｓｋ２部位は、Ｄ１３Ｂ ｉｒ１とＴｅｌ １３との間のｉｎｃｌｕｓｉｖｅ ｉｎｔｅｒｖａｌに位置決 めすることができる。例３ Ｎｓｋ２は、骨格筋に優先的に発現される Ｎｓｋ２受容帯チロシンキナーゼの生理学的機能の分析を始めるために、我々 は、成人マウス組織と胚とから単離された全細胞ＲＮＡにノザンブロット解析を 行った。約６．６ｋｂと３．６ｋｂの二つのＮｓｋ２−特異的転写産物が、１２ ．５日齢の懐胎全胚ＲＮＡ中に容易に同定された。成人マウス組織の内で、成人 骨格筋においてはＮｓｋ２転写産物が検出されたが、心臓、脳、精巣、肺、小腸 、腎臓、脊髄、小脳、新生胸腺には検出されなかった。骨格筋に於けるＮｓｋ２ の優先的発現を更に詳しく調べるために、我々は次に、既に確立されている骨格 筋芽細胞系を分析し、派生筋管培養地が分析された。新生児Ｈ−２Ｋ^b−ｔｓＡ ５８トランスジェニックマウスから誘導された骨格筋芽細胞は、前記熱不安定性 、インターフェロン−誘導可能ＳＶ４０Ｔ抗原ｔｒａｎｓｇｅｎｅの作用を許容 する条件下に於て培養された時に増殖する。 非不死化条件下において生育した時には、これらの細胞は、最終分化して横紋状 多核化筋管を形成する。６．６ｋｂと３．６ｋｂとの両方のＮｓｋ２転写産物を 、このような条件不死化された筋芽細胞系から調製された全細胞ＲＮＡ中で容易 に検出することができた。更に、これらの細胞系がＩＦＮγの不在下で、ＳＶ４ ０Ｔ抗原に対して非許容的な温度の培養によって誘発されて筋管を形成する時に 、Ｎｓｋ２転写産物の定常状態レベルの増加が見られた。同じトランスジェニッ クマウス株から由来の他の条件不死化細胞系のノザンブロット解析は、Ｎｓｋ２ の前記別発現は、ＳＶ４０Ｔ抗原の損失又はインターフェロンの除去に対する一 般的な応答ではないということを示した。これとよく一致して、自発的不死化筋 原性の細胞系Ｃ２Ｃ１２のインヴィトロ分化においても類似の別発現プロファイ ルが観察された。総合すると、これらのデータは、Ｎｓｋ２ｍＲＮＡの増加した 定常状態レベルが骨格筋芽細胞の分化の真の特異的な特徴であるということを示 している。例４ 複数のＮｓｋ２ ＲＴＫイソ型タンパク質が骨格筋芽細胞中で発現される インヴィトロ筋管培養物中での前述した比較的高いレベルのＮｓｋ２の発現に よって、Ｎｓｋ２ ＲＴＫの全コード化配列を含むｃＤＮＡクローンの単離が容 易になった。この分析中に於て、前記全長Ｎｓｋ２ ＲＴＫの多型異型体が骨格 筋管中において同定された。いくらかのｃＤＮＡは、２４個のヌクレオチド（１ ４１５−１４３８）のインフレーム欠失を有し、その結果、アミノ酸４５７−４ ６５が、前記細胞外ドメインの第４Ｉｇ様ループへの一つのアラニン残基Ｃ−末 端と置き換わっていた。その結果、前記Ｎｓｋ２細胞外ドメイン中のＮ−結合グ リコシレート化の二つの推定部位の内の一つがこのイソ型タンパク質中において 欠失していた。いくつかのＮｓｋ２ ｃＤＮＡクローンのカルボキシ末端ドメイ ンコード化領域において第２の多型性（Ｎｓｋ２△Ｃ）が同定された。ヌクレオ チド配列同一性が、前記全長Ｎｓｋ２受容体の残基２６４９まで観察され、その 後に、新規な４８３のヌクレオチドが存在していた。その結果、前記全長Ｎｓｋ ２ ＲＴＫの前記３つのＣ−末端アミノ酸残基が、新規な１３のアミノ酸と、停 止コドンと、ポリアデニレート化シグナルとポリＡｔａｉｌとの両方を含む４１ ７ヌクレオチド（ｎ）新規３’非翻訳領域によって置換されていた。これらを総 合すると、Ｎｓｋ２△Ｎ とＮｓｋ２△Ｃ多型との両方の存在は、Ｎｋｓ２受容体チロシンキナーゼの４種 類ものイソ型タンパク質がほ乳類骨格筋管中に発現するということを示している 。例５ マウスの胚形成中のＮｓｋ２発現 骨格筋の成長中のＮｓｋ２の発現をインヴィヴォでより詳しく調べ、かつ、マ ウスの成長中に於けるＮｓｋ２作用の更に別の可能な部位を明らかにするために 、懐胎８．５ないし１７．５日の間に単離された胚にＲＮＡインサイチュハイブ リダイゼーションを行った。下記のデータは、前記全長Ｎｓｋ２ ＲＴＫの全細 胞内ドメインといくつかの３’非翻訳配列（１６７５ｎ−２６６８ｎ）とを含む プローブによって得られた。細胞外、膜貫通及び傍膜領域（１２６１ｎ−１６８ ０ｎ）に対応する第２プローブによっても同じハイブリダイゼーションパターン が得られた。すべてのケースに於て、対応のセンスコントロールプローブは、特 異的ハイブリダイゼーションを示さなかった。 ノザンブロット解析と一致して、成長マウス胚中に於けるＮｓｋ２発現の主要 部位は、骨格筋原性細胞系中に あった。Ｅ．８．５胚中の新規に形成された体節には発現は観察されなかったが 、分化体節のｄｅｒｍａｍｙｏｔｏｍｅ成分中の後期においてＮｓｋ２特異的ハ イブリダイゼーションが明白に見られた。その後、胎児の中軸骨格と四肢骨格と の両方の筋に於て発現が維持された。更に、これら成長筋組織を、その断面に於 てサジタル平面と横軸方向平面との両方において更に拡大したところ、筋繊維に 関連するハイブリダイゼーションの横紋状パターンが見られた。Ｎｓｋ２ハイブ リダイゼーションは、更に、前記成長中軸及び四肢骨格中にも観察された。発現 は、助骨原基と上腕骨とを含む成長骨の骨膜層に於ける骨化部位に限られ、この 成長の段階においてまだ骨化が始まっていない脊髄においては見られなかった。 発達中の筋−骨格システム中におけるＮｓｋ２転写産物の分布と異なり、心筋に おいては分析したいずれの段階においても発現は検出されなかった。 ＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション分析によって、更に、成長マウス 胚中の多数のその他の組織においてもＮｓｋ２転写産物の独立した分布も明らか となった。中枢神経システムにおいて、Ｎｓｋ２転写産物は、脊髄と脈絡膜叢の 皮質及び上衣層にも明らかであった。成長末梢神経システムに於ては、Ｎｓｋ２ 特異的ハイブ リダイゼーションは、Ｅ１２．５からの後根神経節及び面神経節、及び、内臓の 腸神経節からの細胞中に観察された。はっきりと異なるＮｓｋ２転写産物の分布 は、胎児胚形成中の多数の成長器官の上皮成分と間葉成分との間にも検出された 。例えば、腎臓の皮質中の初期糸球の上皮細胞、気管上皮細胞、肺の分節気管支 及び終末細気管支、内臓の粘膜内層中の分泌上皮細胞、膵臓小島、胸腺原基痕跡 、及び真皮に特異的に観察された。例６ Ｎｓｋ１の同定 Ｎｓｋ１を同定するために、ｃＤＮＡのＰＣＲクローン化を行った。この目的 のために、８．５日齢懐胎Ｃ５７ｂ１／６Ｘ Ｃ５７ｂ１／６マウス胚を、リン 酸バッファ塩溶液（ＰＢＳ）中で解剖し、その胚の中間の第３の組織フラグメン ト（神経ひだと体節）を５マイクロリットルのＴｒｉｓ塩溶液中で０．５ｍｌの エッペンドルフチューブに移し、ドライアイス上で６０分間インキュベートし、 解凍した。次に、保存ＲＴＫ触媒性サブドメインＩＸのＤＶＷＳＦアミノ酸モチ ーフに対応する完全なディジェネレートオリゴヌクレオチドを使用して、前記冷 凍−解凍溶解物上に於てｃＤＮＡ合成を直接に開 始した。第１鎖ｃＤＮＡ産生物に対して、同じセットのディジェネレートオリゴ ヌクレオチドを、保存ＲＴＫ触媒性サブドメインＶ１ｂのアミノ酸モチーフであ るＨＲＤＬに対する別のセットとともに、９３℃で１．５分間と、４５℃で１分 間と６３℃で４分間との３０のサイクルの、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産生物を電 気泳動にかけ、約２１０個のヌクレオチドのＤＮＡフラグメントを取り出し、プ ラスミドｐＫＳ＋中にクローニングし、クローンのヌクレオチド配列を決定した 。 Ｎｓｋ１（神経ひだ／体節キナーゼ・ワン（１））と名付ける新規なヌクレオ チド配列の遺伝子が得られた。前記Ｎｓｋ１部分ｃＤＮＡのヌクレオチド及び予 想アミノ酸配列は、図９に示されている。それによってクローン化を行った前記 保存触媒ドメインモチーフ配列Ｖ１ｂ及びＩＸの他に、Ｎｓｋｌは、ＰＴＫ触媒 的モチーフＶＩＩとＶＩＩＩとを構成するすべての残基を有している（図９）。 更に、Ｎｓｋ１のサブドメインＶＩＩＩは、受容体様チロシナキナーゼの特徴で あるＷＭＰＰＥモチーフを含んでいる。これと一致して、Ｎｓｋ１ヌクレオチド 及び予想アミノ酸配列を、ＧｅｎＥＭＢＬ及びＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベース と比較したところ、電気エイ Ｔｏｒｐｅｄｏ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａからク ロ ーン化された受容体チロシンキナーゼ、ＴｏｒｐｅｄｏＲＴＫ（ジェニングス（ Ｊｅｎｎｉｎｇｓ）他、１９９３）との最も高い相同性が示された（図９Ｂ）。 マウスゲノム中に於けるＮｓｋ１の染色体位置を決定するために、組換え近交系 （ＲＩ）マウス株中においてリンケージ関係を調べた。前記Ｎｓｋ１ ｃＤＮＡ プローブを用いて、high stringentなハイブリダイゼーション条件（５０％ホル ムアミド、４２℃）下でhigh stringentな洗浄（０．１ｘＳＳＣ，６５℃）のも とで行ったゲノムサザンブロット解析によって、Ｎｓｋ１が一つのコピー遺伝子 であることが定義され、Ｃ５７ｂｌ／６とＤＢＡ２Ｊマウス株の間でのＸｂａ１ 制限断片長多型（ＲＦＬＰ）のＮｓｋ１部位での同定が容易となった。次に、こ のＲＦＬＰを使用して、ＲＩマウスのＢｘＤシリーズ中に於けるＮｓｋ１の株分 布パターン（ＳＤＰ）を決定した。このＳＤＰを、前記ＢｘＤシリーズにおける 他のもののＳＤＰと比較することによって、Ｎｓｋ１とＬｙｂ２（２／２４，ｒ ＝０．０２４）、Ｍｕｐｌ（０／２５，ｒ＝０）とｂ（５／２５，ｒ＝０．０７ ２）部位間においてリンケージが確定された。従って、前記Ｎｓｋ１部位は、確 実に、マウス第４染色体上のＬｙｂ２とｂとの間のｉｎｃｌｕｓｉｖｅ ｉｎｔ ｅｒｖａｌ中 に位置している。 前記ＰＴＫ触媒ドメインモチーフが保存されるということと、ＰＣＲ−仲介ｃ ＤＮＡクローン化技術を利用して、過去数年間に渡って前記タンパク質チロシン キナーゼのスーパーファミリーのクローンメンバーの同定が急速に増加した。こ こに提供されるデータは、このアプローチを、解剖組織フラグメントから調製さ れたそのままの粗溶解物に直接に適用することが出来ることを例示するものであ り、これは、胚形成のこの段階において発現することが知られているＰＴＫｓの クローン化によって確認される。成長神経管中にはｃ−ｋｉｔ転写産物が観察さ れたが、Ｅ８．５における体節中には観察されなかった。そして、高いレベルの ＦＧＦＲ１発現が、前体節中胚葉とＥ８．０−８．５における新規に形成された 体節の「くちばし」側の半分において検出された。同様に、ｆｙｎ部位は、Ｅ８ ．５胚の神経ひだと脊索の感覚上皮中において転写が活性に行われることが知ら れている。これらの特徴から、Ｎｓｋ１は、更に、マウスの胚形成のこの段階に おいて細胞間シグナリングのある側面においても機能しているものと予想される 。Ｎｓｋ１は、この成長段階において低量のｍＲＮＡをコードする。というのは 、ここに記載のＰＣＲスクリーニングによって発 現を検出ことができるが、全Ｅ．８．５マウス胚から調製されたＲＮＡのノザン ブロット解析によっては転写産物は容易に見られないからである。前記高度に保 存されたチロシンキナーゼドメインモチーフを除いたＮｓｋ１プローブを使用し たＲＮＡインサイチュハイブリダイゼーション研究によって、マウス胚形成中に おけるこのＲＴＫの発現の部位の同定が容易になるであろう。 Ｎｓｋ１とＴｏｒｐｅｄｏ ＲＴＫとの触媒ドメイン配列の間の高い相同性は 、これら二つの推定受容体間の近い進化関係を示唆している。ＲＫＴｓは、細胞 外ドメインモチーフとカルボキシ末端の比較可能な性質及び／又はキナーゼイン サートドメイン配列とに基づいて定義される。従って、これらのタンパク質間の 関係に関するより深い理解のためには、Ｎｓｋ１転写ユニットの完全なコード化 配列の決定が待たれる。しかし、下等脊椎動物からクローン化された他のＲＴＫ ｓと同様に、Ｎｓｋ１がＴｏｒｐｅｄｏ ＲＴＫの真のほ乳類ホモログであるか どうかを確信的に知ることは困難であろう。この点に関して、Ｎｓｋ２が、触媒 ドメインＶ１ｂ−ＩＸにおいでＴｏｒｐｅｄｏ ＲＴＫとＮｓｋ１との両方に対 して高度に類似したアミノ酸保存を示すが、その他様々な特徴においては、明ら かにＴｏｒｐｄｅｏ ＲＴＫとは異 なるサブクラスの受容体チロシンキナーゼをコードするということは興味深い。 これは、Ｎｓｋ１とＮｓｋ２とが、恐らく胚成長における機能を有する、ほ乳類 受容体チロシンキナーゼの新規なサブファミリーであるということを示唆してい る。例７ Ｎｓｋ２に対する抗体 Ａ：ペプチドＣＧＮＫＥＶＰＰＤＦＧＳ（配列認識番号１５）、即ち、Ｎｓｋ２ の前記推定可溶性細胞外ドメインの新規なＣ末端のアミノ酸残基４５７−４６７ であるペプチドにたいして作成したラビットポリクローナル抗血清は、予想オー プンリーディングフレームと一致して、マウス骨格筋管溶解物のウェスタンブロ ット分析で、約５２ｋＤａのポリペプチド（図１０Ｄ）を同定する。 Ｂ：前記ペプチドＣＴＬＤＧＥＲＹＤＶＧＳ（配列認識番号１６）、即ち、Ｎｓ ｋ２の前記の短い推定可溶性細胞外ドメインの新規なＣ末端のアミノ酸残基２２ ４−２３５であるペプチドにたいして作成したラビットポリクローナル抗血清は 、予想オープンリーディングフレームと一致して、マウス骨格筋管溶解物のウェ スタンブロット分析で、約２３ｋＤａのポリペプチド（図１０Ｅ） を同定する。 Ｃ：ペプチドＣＴＴＳＨＲＤＰＥＤＡＱＥ（配列認識番号１７）、即ち、全長Ｎ ｓｋ２ ＲＴＫ、別スプライシングＮｓｋ２ ＲＴＫイソ型タンパク質、別スプ ライシングＣ末端ＲＴＫイソ型タンパク質及び推定可溶性細胞外ドメインイソ型 タンパク質のアミノ酸残基３４１−３５２、であるペプチドに対して作成したラ ビットポリクローナル抗血清は、マウス骨格筋管溶解物のウェスタンブロット解 析により、約５２ｋＤａのポリペプチド（推定可溶性細胞外ドメインイソ型タン パク質）、及び約１０５ｋＤのポリペプチド（前記全長Ｎｓｋ２ＲＴＫＳの予想 一次配列と良く一致している）を同定する。更に、これらの抗血清は、インヴィ トロで成長されたマウス骨格筋管の溶解物からの免疫沈降後、インヴィトロでチ ロシン残基上で自己リン酸化する内在能力を備えた約１３０ｋＤａのタンパク質 を同定する（図１０Ｃ）。この結果は、前記Ｎｓｋ２ ＲＴＫイソ型タンパク質 の予想触媒性モチーフと一致している。前記一次Ｎｓｋ２ＲＴＫ配列（約１０５ ｋＤａ）と前記１３０ｋＤａの自己リン酸化バンドとの間のサイズの相違は、翻 訳後グリコシレート化現象（前記予想アミノ酸配列によって示唆されるように） 及び／又は他のポリペプチド（恐らく、 前記２３ｋＤａの短いＮｓｋ２細胞外ドメインイソ型タンパク質（前記Ｂを参照 ）との共有結合関係を表しているかもしれない。 （Ａ）及び（Ｃ）で調製されたペプチドのＮ−末端Ｃは添加合成残基である。例８ Ｎｓｋ２ ＲＴＫは、ほ乳類ＲＴＫのファミリー中で、膜貫通型受容体キナー ゼ（ｔｒｋ）受容体と最も高い相同性を有している。更に、ｔｒｋシグナリング にとって機能的に重要であることが知られている二つのチロシン含有ペプチドモ チーフが、Ｎｓｋ２ ＲＴＫ中で保存される。即ち、両方のＲＴＫｓの傍膜ドメ イン内で、ｉ）．．Ｔｒｋ．ＩＥＮＰＱＹ ⁴⁹⁰ＦＳＤＡ（配列認識番号１８） ．．Ｎｓｋ２ ＨＰＮＰＭＹ ⁵⁵⁶ＱＲＭＰ（配列認識番号１９）が保存され る。ｔｒｋのＹ⁴⁹⁰が、自己リン酸化部位であり、ＳＨＣとの仲介関係にあるこ とが示された。この関係は、ｔｒｋの生物学的シグナリング特性に寄与している （ＥＮＩＢＯ Ｊ．１３，１５８５−１５９０（１９９４）；Ｎｅｕｒｏｎ １ ２，６９１−７０５（１９９４））。 ｉ）．．Ｔｒｋ ＰＥＶＹ ⁷⁵¹ＡＩＭＲＧ（配列認識番号２0) ．．Ｎｓｋ２．．．ＬＥＬＹ ⁸³⁴ＮＬＭＲＬ（配列認識番号２１）が両方の ｔｒｋとＮｓｋ２との両方のＸとＸＩの触媒性チーフドメインの間で保存される 。ｔｒｋのＹ⁸³⁴が、自己リン酸化部位であり、ＰＩ−３キナーゼのｐ８５サブ ユニットと仲介関係にあることが示された。この関係は、ｔｒｋの生物学的シグ ナリング特性に必須であるとは思われない（ＥＭＢＯ Ｊ．１３，１５８５−１ ５９０（１９９４）；Ｎｅｕｒｏｎ １２，６９１−７０５（１９９４））。 ｒｔｋ受容体によって利用されるモチーフの前記保存は、明らかに、Ｎｓｋ２ の上記領域が自己リン酸化に関連し、かつ、潜在的に関連基質分子と関係してい る、ということを示唆するものである。従って、Ｎｓｋ２ポリペプチドの好適フ ラグメントは、Ｙ⁵⁵⁶とＹ⁸³⁴とを含むものである。例えば、これらの前記の一方 又は他方を含む、５ないし１０、２０，３０，４０又は５０個のアミノ酸のサイ ズのペプチドが好適である。このようなペプチドに結合可能な抗体も好ましい。例９ この例では、様々な細胞タイプ中に於ける本発明のタンパク質の発現パターン を調べた。 ここに参考文献として合体されるＯｎｃｏｇｅｎｅ１１：２８１−２９０（１ ９９５）に従って、マウスＣｓＣ１２筋芽細胞と、更に、派生筋管細胞との全細 胞溶解物を調製した。この文献は、細胞培養の詳細を提供するものである。同様 に、ＣＯＳとＣＨＯ細胞の溶解物を調製した。これら溶解物中のタンパク質含有 量を定量化し、次に、全タンパク質のうち等量ずつを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ 、ウエスタンブロット解析を行った。ブロッティングは、それぞれ、前記２Ｉｇ と４Ｉｇのイソ型タンパク質のカルボキシ末端領域に対して作成しておいた親和 性精製抗血清を用いて行った。検出は、周知のＥＣＬシステムによって行った。 前記２３ｋＤａ ２Ｉｇ異型(variant)と５２ｋＤａ４Ｉｇ異型(variant)とは 筋芽細胞中に発現され、両方の定常状態レベルが前述した筋管中において増加す ることが観察された。ＣＯＳやＣＨＯ細胞には発現は観察されなかった。これら の結果を図１１に示す。例１０ 全長マウスＮｓｋ２の発現を行った。図１１の領域Ｉ， ＩＩ及びＩＩＩを含むＮｓｋ２ ＲＴＫイソ型タンパク質を、市販（Ｐｒｏｍｅ ｇａ）のＳＰ６４ベースの発現ベクターにクローン化し、その結果得られた発現 ベクターを、製造業者の指示に従って、一体型転写／翻訳コムギ胚芽抽出システ ム中でインヴィトロ翻訳にかけた。前記転写／翻訳は、³⁵Ｓメチオニンの存在下 で行った。次に、産生物のアリコットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、その後、オ ートラジオグラフィにかけた。これらを図１に示す。 その結果は、前記ｃＤＮＡが約１００ＫＤａのタンパク質をコードしたことを 示し、これは、前記全配列情報から予想されたものと一致している。プラミドＤ ＮＡの不在下においては、³⁵Ｓメチオニンラベル化タンパク質は観察されなかっ た。例１１ 前記例１に記載の作業を、そこに記載したものと同じｃＤＮＡライブラリーと 同じ技術を使用して継続した。 全部で１１のスプライス異型(variant)又はイソ型タンパク質が見つかり、こ れは図１３に示されている。これらの分析により、前記全長分子の三種類の部位 で選択的スプライシングが起こるという結論が導かれた。前 記第１variant領域は、前記全長分子中のヌクレオチド６７３と６７４との間に 挿入されている。その結果はｉｎ ｆｒａｍｅであり、２０個のアミノ酸の別領 域が生じ、これは、前記全長分子の残基２０９と２１０との間に位置する二つの 潜在的Ｎ−結合グリコシレート化部位を有している。 第２のvariantにおいて、別のスプライシングの結果、前記全配列のヌクレオ チド１４１５−１４３８が欠失する。その結果、前記全長分子のアミノ酸４５７ −４６５が、一つのアラニン残基によって置換され、潜在的Ｎ−グリコシレート 化部位が損失している。 図４，５及び６に記載の次の三つのvariantは、別のカルボキシ末端領域に関 するものである。図５と６とに示されるものが、可溶性細胞外ドメインイソ型タ ンパク質を生成するものと考えられる。 これらを総合すると、前記別領域によって、前記膜貫通型イソ型タンパク質の ８までのイソ型variantと、前記可溶性細胞外ドメインの二つのイソ型variantと 、一つの短い細胞外ドメインとが産生可能である。前記図面において、”Ｉ”は 、ヌクレオチド６７３と６７４との間のインサートを示し、”ＩＩ”は前記全長 分子を示す。図１３にこれらのvariantの全部を要約している。例１２ 本発明に依る筋ＲＴＫｓを単離し配列決定するために更に別の作業を行った。 これを行うに当たって、６種類の別構造が見つかった。即ち、 （Ｉ）図２中のヌクレオチド６７８は、示されたＧではなくＴであってもよい。 従って、配列認識番号１において、このヌクレオチドはＫとして示されている。 （ＩＩ）図２中のヌクレオチド６８０は、Ｇであり、これはＣであってもよい。 従って、配列認識番号１において、このヌクレオチドはＳとして示されている。 （ＩＩＩ）図２中のヌクレオチド１１９３は、Ｔであり、これはＡであってもよ い。従って、配列認識番号１において、このヌクレオチドはＷとして示されてい る。 （ＩＶ）図２中のＡであるヌクレオチド１３５９はＣであってもよい。従って、 配列認識番号１において、このヌクレオチドはＭとして示されている。 （Ｖ）図２中のＧであるヌクレオチド１５６３はＴであってもよい。従って、配 列認識番号１において、このヌクレオチドはＫとして示されている。 （ＶＩ）図２中のＴであるヌクレオチド１５８９はＣであってもよい。従って、 配列認識番号１において、 このヌクレオチドはＹとして示されている。 これらのヌクレオチドの別構造によって、アミノ酸配列に変化が生じる。従っ て、次のアミノ酸位置を参照 （Ｉ）２１１：Ｌｅｕ又はＰｈｅ （ＩＩ）２１２：Ｇｌｙ又はＡｌａ （ＩＩＩ）３８３：Ｌｅｕ又はＧｌｎ （ＩＶ）４３９：Ａｒｇ又はＳｅｒ （Ｖ）５０６：Ｌｅｕ又はＰｈｅ （ＶＩ）５１５：Ｖａｌ又はＡｌａ 各ケースに於て、”Ｘａａ”を使用してこれらの別構造を示す。便宜上、以上 の情報によって当業者はなにが含まれているかが理解するであろうと予想される ことから、すべてのvariantを提示するためにこれらの図面を２度提示すること は避ける。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 9/12 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 9/12 37/52 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｐ 21/08 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＦＩ，ＪＰ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＵＳ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． その相補配列が、Stringentな条件下において、 以下のヌクレオチド配列の内の少なくとも一つとハイブリダイズする、筋受容 体チロシンキナーゼタンパク質をコードする単離核酸分子、 配列認識番号１； 配列認識番号６； 配列認識番号８； 配列認識番号１０；及び 配列認識番号１３。 ２． 請求項１による単離核酸分子であって、以下から成るグループから選択さ れるもの、 （ｉ）配列認識番号１のヌクレオチド配列から成る核酸分子； （ｉｉ）配列認識番号６のヌクレオチド配列から成る核酸分子； （ｉｉｉ）配列認識番号８のヌクレオチド配列から成る核酸分子； （ｉｖ）配列認識番号１０のヌクレオチド配列から成る核酸分子；そして （ｖ）配列認識番号１３のヌクレオチド配列から成る核酸分子。 ３． プロモーターに作動リンクされた請求項１の単離核酸分子を有する発現ベ クター。 ４． 請求項１の単離核酸分子によってトランスフォーメーション（形質転換） 又は、トランスフェクション（形質導入）された形質転換又は形質導入細胞。 ５． 請求項３の発現ベクターでトランスフォーメーション（形質転換）又は、 トランスフェクション（形質導入）された形質転換又は形質導入細胞。 ６． その相補ヌクレオチド配列が、stringentな条件下において、以下のヌク レオチド配列の内の少なくとも一つとハイブリダイズする、単離核酸分子によっ てコードされる単離筋受容体チロシンキナーゼ、 配列認識番号１； 配列認識番号６； 配列認識番号８； 配列認識番号１０；及び 配列認識番号１３。 ７． 以下のアミノ酸配列から成る、請求項６の単離筋受容体チロシンキナーゼ 、 配列認識番号２， 配列認識番号３， 配列認識番号４， 配列認識番号５， 配列認識番号６， 配列認識番号７， 配列認識番号８， 配列認識番号９， 配列認識番号１０，及び 配列認識番号１１。 ８． 以下から成る単離ポリペプチド、 配列認識番号２のアミノ酸１−２１， 配列認識番号２のアミノ酸２２−４９６， 配列認識番号２のアミノ酸４９−９８， 配列認識番号２のアミノ酸１４２−１９０， 配列認識番号２のアミノ酸２３３−２８２， 配列認識番号２のアミノ酸４０１−４５０， 配列認識番号２のアミノ酸４９７−５１７， 配列認識番号２のアミノ酸５１８−５７６， 配列認識番号２のアミノ酸５１８−８７１， 配列認識番号２のアミノ酸５７７−８５８， 配列認識番号２のアミノ酸６７４−６９３，そして 配列認識番号２のアミノ酸８５９−８７１。 ９． 配列認識番号１４、配列認識番号１５、配列認識番号１６、及び配列認識 番号１７のアミノ酸配列から 成る単離ポリペプチド。 １０．請求項９の単離ポリペプチドと免疫源キャリアとを有する免疫原性組成物 。 １１．筋受容体チロシンキナーゼに特異的に結合する抗体。 １２．請求項１１の抗体であって、前記抗体はモノクローナル抗体である。