JP2003261596A - β−セクレターゼ阻害剤の同定のためのアッセイ法およびスクリーニング法 - Google Patents

β−セクレターゼ阻害剤の同定のためのアッセイ法およびスクリーニング法

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JP2003261596A JP2002369209A JP2002369209A JP2003261596A JP 2003261596 A JP2003261596 A JP 2003261596A JP 2002369209 A JP2002369209 A JP 2002369209A JP 2002369209 A JP2002369209 A JP 2002369209A JP 2003261596 A JP2003261596 A JP 2003261596A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、β-セクレターゼ阻害剤の同定の
ためのアッセイ法およびスクリーニング法を提供するこ
とを課題とする。 【解決手段】 本発明は、β-セクレターゼタンパク質
を固体支持体上に固定化する段階、タグ化β-セクレタ
ーゼ阻害剤の存在下でそれを被検化合物と接触させる段
階、および被検化合物がβ-セクレターゼ阻害剤である
か否かを評価するため、被検化合物の存在下と非存在下
でのタグ化β-セクレターゼ阻害剤の結合の程度を比較
する段階を含む、β-セクレターゼ阻害剤を同定するた
めのアッセイ法を提供する。さらに本発明は、β-セク
レターゼ阻害剤のスクリーニング法、新規なβ-セクレ
ターゼ阻害剤、および、β-セクレターゼ阻害剤の同定
のためのタグ化β-セクレターゼ阻害剤としてのそれら
の使用、β-セクレターゼ阻害剤を同定するためのキッ
ト、ならびにアルツハイマー病およびその他の脳血管ア
ミロイドーシスの治療において使用するための新規なβ
-セクレターゼ阻害剤を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、β-セクレターゼ
タンパク質を固体支持体上に固定化する段階、タグ化β
-セクレターゼ阻害剤の存在下でそれを被検化合物と接
触させる段階、および被検化合物がβ-セクレターゼ阻
害剤であるか否かを評価するため、被検化合物の存在下
と非存在下でのタグ化β-セクレターゼ阻害剤の結合の
程度を比較する段階を含む、β-セクレターゼ阻害剤を
同定するためのアッセイ法に関する。さらに本発明は、
β-セクレターゼ阻害剤のスクリーニング法、新規なβ-
セクレターゼ阻害剤、およびβ-セクレターゼ阻害剤の
同定のためのタグ化β-セクレターゼ阻害剤としてのそ
れらの使用、β-セクレターゼ阻害剤を同定するための
キット、ならびにアルツハイマー病およびその他の脳血
管アミロイドーシスの治療において使用するための新規
なβ-セクレターゼ阻害剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】アルツハイマー病（AD）は、記憶、時間
的および空間的な見当識、認知、推理、判断、ならびに
情緒安定性の進行性の喪失を臨床的な特徴とする変性性
（degenerative）脳障害である。ADは、ヒトにおける進
行性痴呆の一般的な原因であり、米国における主要な死
因の一つとなっている。ADは、世界中の全ての人種およ
び民族に観察されており、現在のおよび将来的な、主要
な健康問題である。効果的にADを防止するか、又は臨床
的症状および根底にある病態生理を回復させる、有効な
治療法は、現在存在しない（概説については、非特許文
献１を参照のこと）。
【０００３】影響を受けた個体における剖検又は神経外
科的検体に由来する脳組織の組織病理学的検査によっ
て、そのような患者の脳皮質にはアミロイド斑および神
経原繊維錯綜が発生していることが明らかとなった。類
似の変化が、トリソミー21（ダウン症候群）、およびオ
ランダ型（Dutch-type）アミロイドーシスを伴う遺伝性
脳出血の患者において観察された。
【０００４】神経原繊維錯綜とは、膜と結合していない
異常タンパク質性フィラメントの束であり、生化学的研
究および免疫化学的研究により、それらの主要タンパク
質サブユニットは、変化したリン酸化型タウタンパク質
であることが結論付けられている（概説については非特
許文献２を参照のこと）。
【０００５】生化学的研究および免疫化学的研究によ
り、アミロイド斑の主要タンパク質性成分が、約39アミ
ノ酸〜43アミノ酸からなる、およそ4.2キロダルトン（k
D）のタンパク質であることが明らかとなった。このタ
ンパク質は、A-β-アミロイドペプチドと名付けられて
おり、β/A4と呼ばれることもあるが、本明細書におい
てはA-βと呼ぶ。アミロイド斑におけるA-βの沈着に加
え、A-βは、髄膜および実質の細動脈、小動脈、毛細血
管の壁にも見出され、細静脈壁に見出される場合もあ
る。A-βは1984年に最初に精製され、部分アミノ酸が報
告された（非特許文献３を参照のこと）。最初の28アミ
ノ酸の単離および配列データは、特許文献１に記載され
ている。
【０００６】過去十年間に蓄積された説得力のある証拠
より、A-βが、βアミロイド前駆タンパク質（APP）と
呼ばれる1型膜内在性タンパク質に由来する内部ポリペ
プチドであることが明らかとなった。APPは、通常、様
々な動物およびヒトに由来する多くの細胞によって、イ
ンビボにおいておよび培養細胞中の両方で産生される。
A-βは、集合的にセクレターゼと呼ばれる（1つ又は複
数の）酵素（プロテアーゼ）系によるAPPの切断に由来
する。
【０００７】少なくとも4つのタンパク質分解活性の存
在が推定されている。それらには、A-βのN末端を生成
する（1つ又は複数の）β-セクレターゼ、A-βの16位/1
7位のペプチド結合付近を切断する（1つ又は複数の）α
-セクレターゼ、ならびに38位、39位、40位、42位、お
よび43位で終止するC末端A-β断片を生成するか、又は
前記ポリペプチドへと後に短縮されるC末端伸長前駆体
を生成するγ-セクレターゼが含まれる。
【０００８】証拠のいくつかの道筋によって、A-βの異
常な蓄積が、ADの病原性において中心的な役割を果たし
ていることが示唆されている。第一に、A-βは、アミロ
イド斑において見出される主要なタンパク質である。第
二に、A-βは、神経毒性であり、AD患者において観察さ
れるニューロン死との因果関係を有する（causally rel
ated）可能性がある。第三に、遺伝学的に決定される型
（家族性）のADを有するいくつかの家系において、罹患
したメンバーには、APPの770アイソフォームの717位に
おけるミスセンスDNA変異が見出されうるが、罹患して
いないメンバーには見出されていない。さらに、いくつ
かのその他のAPP変異が、家族性ADにおいて記載されて
いる。第四に、類似の神経病理学的変化が、変異型ヒト
APPを過剰発現しているトランスジェニック動物におい
て観察されている。第五に、ダウン症候群の個体ではAP
P遺伝子量が増加しており、早発性ADを発症する。
【０００９】総合すると、これらの観察から、A-β沈着
がADとの因果関係を有することが強く示唆される。
【００１０】A-βの産生の阻害は、アミロイド斑の形成
の調節、神経毒性の減少、および一般的には、A-β産生
関連病原性の媒介により、神経学的変性を予防しかつ減
少させるであろうという仮説がある。従って、一つの治
療法は、インビボでA-β形成を阻害する薬物に基づくと
考えられる。
【００１１】治療法は、APPのタンパク質分解プロセシ
ングに関与する酵素を介したA-βの形成を標的としう
る。直接的又は間接的にβ-セクレターゼ又はγ-セクレ
ターゼの活性を阻害する化合物は、A-βの産生を調節し
うる。
【００１２】β-セクレターゼは、特許文献２、特許文
献３、特許文献４、特許文献５、特許文献６および特許
文献７を含むいくつかの刊行物に記載されている。
【００１３】BACE（別名はAsp-2、メマプシン（Memapsi
n）-2である）およびBASE-2（別名はAsp-1、メマプシン
-1である）の2つの遺伝子は、膜貫通型アスパラギン酸
プロテアーゼファミリーに属するβ-セクレターゼをコ
ードしている。それらは、AD患者の脳内アミロイド沈着
の原因であるA-βペプチド産生へと至るAPP分解カスケ
ードにおける最初の酵素であると考えられている。概念
的には、β-セクレターゼの阻害は、APP分解のアミロイ
ド生成経路を、APPのα-セクレターゼ切断を介した非ア
ミロイド生成経路へと転向させることにより、ADを防止
するであろう。
【００１４】BACEは、大部分の組織で広範に発現してお
り、脳および膵臓で高レベルに発現しているにも関わら
ず、BACE-/-マウスは生存可能であることが見出された
（非特許文献４を参照のこと）。マウスにおけるBACE欠
損と関連した明らかな有害効果が存在しないという所見
から、ヒトにおけるBACEの阻害が、生命維持に必要なNo
tchシグナル伝達を調節するγ-セクレターゼに関して活
発に討論されている問題である、機構に基づく毒性を有
していないことが示唆される。
【００１５】A-β産生の阻害剤の細胞スクリーニング
法、A-β産生のインビボ抑制の試験法、およびセクレタ
ーゼ活性の検出のための膜又は細胞抽出物を用いたアッ
セイ法は、当技術分野において既知であり、特許文献
８、特許文献９、および特許文献１０（全て、参照とし
て本明細書に組み込まれる）を含む多数の刊行物に開示
されている。
【００１６】β-セクレターゼに関する標準的なアッセ
イ法は、蛍光体（fluorophore）およびクエンサー（que
ncer）を保持しているペプチド基質の切断に基づく蛍光
アッセイ法である。化合物が自己蛍光を示す、もしくは
強く着色しているために、又は溶液から酵素および沈殿
物を吸収するために、スクリーニング目的で使用される
場合、このアッセイ法は「偽陽性ヒット（false positi
ve hit）」を与える傾向がある。従って、阻害剤スクリ
ーニングのための代替的なアッセイ法は、極めて有益で
ある。
【００１７】驚くべきことに、十分に高い放射能でβ-
セクレターゼの遷移状態模倣物（mimetics）を標識する
ことにより、それらが、β-セクレターゼと結合する活
性部位に対する直接的なプローブとして使用されうるこ
とが見出された。
【００１８】
【特許文献１】米国特許第4666829号明細書
【特許文献２】欧州特許出願公開第0855444号明細書
【特許文献３】国際公開第00/17369号パンフレット
【特許文献４】国際公開第00/58479号パンフレット
【特許文献５】国際公開第00/47618号パンフレット
【特許文献６】国際公開第01/00663号パンフレット
【特許文献７】国際公開第01/00665号パンフレット
【特許文献８】国際公開第98/22493号パンフレット
【特許文献９】米国特許第5703129号明細書
【特許文献１０】米国特許第5593846号明細書
【非特許文献１】「Annu Rev Cell Biol.」、1994年、
第10巻、p.373-403
【非特許文献２】「Annu Rev Neurosci.」、1994年、第
17巻、p.489-517
【非特許文献３】「Biochem.Biophys.Res.Commun.」、1
984年、第120巻、p.885-890
【非特許文献４】「Nature Neurosci.」、2001年、第4
巻、p.231-232
【００１９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、β-セクレ
ターゼ阻害剤の同定のためのアッセイ法およびスクリー
ニング法を提供することを課題とする。
【００２０】
【課題を解決するための手段】本発明は、β-セクレタ
ーゼタンパク質を固体支持体上に固定化する段階、タグ
化β-セクレターゼ阻害剤の存在下でそれを被検化合物
と接触させる段階、および被検化合物がβ-セクレター
ゼ阻害剤であるか否かを評価するため、被検化合物の存
在下と非存在下でのタグ化β-セクレターゼ阻害剤の結
合の程度を比較する段階を含む、β-セクレターゼ阻害
剤を同定するためのアッセイ法に関する。さらに本発明
は、β-セクレターゼ阻害剤のスクリーニング法、新規
なβ-セクレターゼ阻害剤、およびβ-セクレターゼ阻害
剤の同定のためのタグ化β-セクレターゼ阻害剤として
のそれらの使用、β-セクレターゼ阻害剤を同定するた
めのキット、ならびにアルツハイマー病およびその他の
脳血管アミロイドーシスの治療において使用するための
新規なβ-セクレターゼ阻害剤に関する。
【００２１】本発明に係るβ-セクレターゼ阻害剤にお
いては、（１）下記式Iのβ-セクレターゼ阻害剤、およ
びそれらの任意の組み合わせであることを特徴とする： Y-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-W 式中、P1はロイスタチン（Leustatin）、チャスタチン
（Chastatin）、又はチルスタチン（Tyrstatin）と定義
され、P2はAsnと定義され、P3はVal、Cpe、Che、又はCh
aと定義され、P4はGluと定義され、P1'はValと定義さ
れ、P2'はAlaと定義され、P3'はGluと定義され、P4'はT
yr、Cha、Phe（I）、又はTyr（I2）と定義され、Yは0
個、1個、又は複数のアミノ酸残基と定義され、かつWは
0個、1個、又は複数のアミノ酸残基と定義される。
【００２２】また、本発明に係るβ-セクレターゼ阻害
剤においては、（２）タグ化（tagged）β-セクレター
ゼ阻害剤の調製のための上記(1)記載のβ-セクレターゼ
阻害剤であることを特徴とする。
【００２３】また、本発明に係るβ-セクレターゼ阻害
剤においては、（３）タグ化されている上記(1)記載の
β-セクレターゼ阻害剤であることを特徴とする。
【００２４】また、本発明に係るβ-セクレターゼ阻害
剤においては、（４）P3位、P1位、又はP4'位のうちの1
つ又は複数で放射性タグ化されている上記(3)記載のβ-
セクレターゼ阻害剤であることを特徴とする。
【００２５】また、本発明に係る使用においては、
（５）β-セクレターゼ阻害化合物の同定のための上記
(3)または(4)記載のタグ化β-セクレターゼ阻害剤の使
用であることを特徴とする。
【００２６】また、本発明に係る使用においては、
（６）タグ化β-セクレターゼ阻害剤がトリチウムタグ
化β-セクレターゼ阻害剤である、上記(5)記載の使用で
あることを特徴とする。
【００２７】また、本発明に係る方法においては、
（７）（a）β-セクレターゼタンパク質を固定化する段
階；（b）被検化合物を添加し、続いてタグ化β-セクレ
ターゼ阻害剤を添加する段階；（c）アッセイ成分をイ
ンキュベートする段階；および（d）結合したタグ化β-
セクレターゼ阻害剤を測定する段階を含む、β-セクレ
ターゼ阻害剤を同定するためのアッセイ法であることを
特徴とする。
【００２８】また、本発明に係る方法においては、
（８）β-セクレターゼが単離されかつ実質的に精製さ
れたβ-セクレターゼである、上記(7)記載のアッセイ法
であることを特徴とする。
【００２９】また、本発明に係る方法においては、
（９）β-セクレターゼが組換え的に作製されかつ精製
されている、上記(7)記載のアッセイ法であることを特
徴とする。
【００３０】また、本発明に係る方法においては、（１
０）β-セクレターゼが全長β-セクレターゼである、上
記(7)から(9)記載のアッセイ法であることを特徴とす
る。
【００３１】また、本発明に係る方法においては、（１
１）β-セクレターゼがBACEおよびBACE-2からなる群よ
り選択される、上記(7)から(10)記載のアッセイ法であ
ることを特徴とする。
【００３２】また、本発明に係る方法においては、（１
２）タグ化β-セクレターゼ阻害剤が放射性タグで標識
されたβ-セクレターゼ阻害剤である、上記(7)から(11)
記載のアッセイ法であることを特徴とする。
【００３３】また、本発明に係る方法においては、（１
３）放射性タグがトリチウムである、上記(12)記載のア
ッセイ法であることを特徴とする。
【００３４】また、本発明に係る方法においては、（１
４）タグ化β-セクレターゼ阻害剤が上記(3)記載のタグ
化β-セクレターゼ阻害剤である、上記(7)から(13)記載
のアッセイ法であることを特徴とする。
【００３５】また、本発明に係る方法においては、（１
５）タグ化β-セクレターゼ阻害剤が約1μM以下の阻害
濃度を有する、上記(7)から(14)記載のアッセイ法であ
ることを特徴とする。
【００３６】また、本発明に係る方法においては、（１
６）アッセイ成分が選択的にBSAを含む結合緩衝液中で
インキュベートされる、上記(7)から(15)記載のアッセ
イ法であることを特徴とする。
【００３７】また、本発明に係る方法においては、（１
７）アッセイ成分が選択的に非イオン性界面活性剤を含
む結合緩衝液中でインキュベートされる、上記(7)から
(16)記載のアッセイ法であることを特徴とする。
【００３８】また、本発明に係る方法においては、（１
８）非イオン性界面活性剤がTween-20である、上記(17)
記載のアッセイ法であることを特徴とする。
【００３９】また、本発明に係る方法においては、（１
９）アッセイ成分が選択的にイオン性界面活性剤を含む
結合緩衝液中でインキュベートされる、上記(7)から(1
6)記載のアッセイ法であることを特徴とする。
【００４０】また、本発明に係る方法においては、（２
０）イオン性界面活性剤が、コール酸およびデオキシコ
ール酸を含む群より選択される、上記(19)記載のアッセ
イ法であることを特徴とする。
【００４１】また、本発明に係るβ-セクレターゼ阻害
剤においては、（２１）上記(7)から(20)記載のアッセ
イ法において使用するための、上記(3)記載のタグ化β-
セクレターゼ阻害剤であることを特徴とする。
【００４２】また、本発明に係る方法においては、（２
２）被検化合物の存在下でのタグ化β-セクレターゼ阻
害剤とβ-セクレターゼとの結合を測定する段階；およ
び被検化合物が活性部位結合に関してタグ化β-セクレ
ターゼ阻害剤と競合できるか否かを判定する段階を含
む、β-セクレターゼ活性を阻害することができる化合
物をスクリーニングする方法であることを特徴とする。
【００４３】また、本発明に係る方法においては、（２
３）β-セクレターゼが単離されかつ実質的に精製され
たβ-セクレターゼである、上記(22)記載の方法である
ことを特徴とする。
【００４４】また、本発明に係る方法においては、（２
４）β-セクレターゼが組換え的に作製されかつ精製さ
れている、上記(22)記載の方法であることを特徴とす
る。
【００４５】また、本発明に係る方法においては、（２
５）β-セクレターゼが全長β-セクレターゼである、上
記(22)から(24)記載の方法であることを特徴とする。
【００４６】また、本発明に係る方法においては、（２
６）β-セクレターゼがBACEおよびBACE-2からなる群よ
り選択される、上記(22)から(25)記載の方法であること
を特徴とする。
【００４７】また、本発明に係る方法においては、（２
７）タグ化β-セクレターゼ阻害剤が、放射性タグで標
識されたβ-セクレターゼ阻害剤である、上記(22)から
(26)記載の方法であることを特徴とする。
【００４８】また、本発明に係る方法においては、（２
８）放射性タグがトリチウムである、上記(27)記載の方
法であることを特徴とする。
【００４９】また、本発明に係る方法においては、（２
９）タグ化β-セクレターゼ阻害剤が上記(3)記載のβ-
セクレターゼ阻害剤である、上記(22)から(28)記載の方
法であることを特徴とする。
【００５０】また、本発明に係るβ-セクレターゼ阻害
剤においては、（３０）上記(22)から(29)記載の方法に
おいて使用するためのタグ化β-セクレターゼ阻害剤で
あることを特徴とする。
【００５１】また、本発明に係るキットにおいては、
（３１）天然の又は組換え的に作製されたβ-セクレタ
ーゼポリペプチド、およびタグ化β-セクレターゼ阻害
剤を含む、β-セクレターゼ阻害剤を同定するためのキ
ットであることを特徴とする。
【００５２】また、本発明に係るキットにおいては、
（３２）タグ化β-セクレターゼ阻害剤が放射性タグを
保持している、上記(31)記載のキットであることを特徴
とする。
【００５３】また、本発明に係るキットにおいては、
（３３）タグ化β-セクレターゼ阻害剤がトリチウムタ
グを保持している、上記(32)記載のキットであることを
特徴とする。
【００５４】また、本発明に係るキットにおいては、
（３４）上記(7)から(20)記載のアッセイ法又は上記(2
2)から(29)記載の方法を実施するために必要な成分を含
むキットであることを特徴とする。
【００５５】また、本発明に係るβ-セクレターゼ阻害
剤においては、（３５）上記(7)から(20)記載のアッセ
イ法又は上記(22)から(29)記載の方法によって同定され
たβ-セクレターゼ阻害剤であることを特徴とする。
【００５６】また、本発明に係るβ-セクレターゼ阻害
剤においては、（３６）薬学的に許容される担体、およ
び治療的有効量の上記(35)記載のβ-セクレターゼ阻害
剤を含む薬学的組成物であることを特徴とする。
【００５７】また、本発明に係る使用においては、（３
７）アルツハイマー病又はその他の脳血管アミロイドー
シスの治療用の医薬品の調製のための、上記(7)から(2
0)記載のアッセイ法又は上記(22)から(29)記載の方法に
よって同定されたβ-セクレターゼ阻害剤の使用である
ことを特徴とする。
【００５８】また、本発明に係る方法においては、（３
８）上記(7)から(20)記載のアッセイ法又は上記(22)か
ら(29)記載の方法によって同定されたβ-セクレターゼ
を阻害するのに効果的な薬学的有効量の化合物を患者へ
投与する段階を含む、アルツハイマー病又はその他の脳
血管アミロイドーシスに罹患しているか、又はその素因
を有する患者を治療する方法であることを特徴とする。
【００５９】また、本発明に係る方法においては、（３
９）添付の実施例に関して具体的に記載された方法と実
質的に同様の方法であることを特徴とする。
【００６０】
【発明の実施の形態】本発明は、β-セクレターゼタン
パク質を固体支持体上に固定化する段階、被検化合物を
添加し、続いてタグ化β-セクレターゼ阻害剤を添加す
る段階、平衡結合のためアッセイ成分をインキュベート
する段階、および結合したタグ化β-セクレターゼ阻害
剤を測定する段階を含む、β-セクレターゼ阻害剤を同
定するためのアッセイ法を提供する。
【００６１】本明細書において使用される「β-セクレ
ターゼ」とは、A-βのN末端を生成するアスパルチル（a
spartyl）プロテアーゼと定義される。好ましいβ-セク
レターゼは、ヒトのBACEおよびBACE-2である。最も好ま
しいのは、それぞれ配列番号：1および配列番号：2に開
示されたヌクレオチド配列によりコードされるヒトのBA
CEおよびBACE-2である。β-セクレターゼは、全長β-セ
クレターゼ、又は少なくとも活性部位を示す短縮型β-
セクレターゼでありうる。好ましくは、β-セクレター
ゼは全長β-セクレターゼである。β-セクレターゼは、
β-セクレターゼ活性を一般的に変化させないものであ
れば、アミノ酸置換を含んでもよい。生物活性を本質的
に変化させないタンパク質およびポリペプチドにおける
アミノ酸置換は、当技術分野において既知であり、H.ノ
イラート（Neurath）およびR.L.ヒル（Hill）により、
「タンパク質（The Proteins）」、アカデミックプレス
（Academic Press）、ニューヨーク（New York）(1979)
に記載されている。前記のように分類されたアミノ酸側
鎖の6つの一般的なクラスには、クラスI（Cys）；クラ
スII（Ser、Thr、Pro、Ala、Gly）；クラスIII（Asn、A
sp、Gln、Glu）；クラスIV（His、Arg、Lys）；クラスV
（Ile、Leu、Val、Met）；およびクラスVI（Phe、Tyr、
Trp）が含まれる。β-セクレターゼは、「リンカー」配
列によりコードされるいくつかのアミノ酸の配列をさら
に含んでもよい。これらの配列は、β-セクレターゼの
組換え発現のために使用される発現ベクターに、結果と
して起因する。本発明のβ-セクレターゼはまた、好ま
しくはアフィニティ担体材料と結合する、N末端又はC末
端に接着した特異的配列を含有してもよい。そのような
配列の例は、少なくとも2個の隣接するヒスチジン残基
を含有する配列である（欧州特許第282042号参照）。そ
のような配列は、ニトリロ三酢酸ニッケルキレート樹脂
と選択的に結合する。従って、そのような特異的配列を
含有するβ-セクレターゼは、残りのポリペプチドから
選択的に分離されるか、又は固定化のための固体支持体
に接着されうる。6個のC末端His残基をコードするβ-セ
クレターゼBACEのcDNA配列は、配列番号：1に示されて
いる。
【００６２】天然の、又は組換え的に作製されたβ-セ
クレターゼが、本アッセイ法において使用されうる。
「組換えタンパク質」とは、宿主細胞においてタンパク
質を発現させるように操作された組換え発現ベクターに
より一過的又は安定的に形質導入又はトランスフェクト
された異種細胞における特徴的発現によって、単離、精
製、又は同定されたタンパク質である。組換えβ-セク
レターゼは、例えば大腸菌などの原核細胞、例えばS.ポ
ンベ（pombe）などの酵母、又は、例えばHEK293、Sf9昆
虫細胞などの真核細胞において作製されてもよい。好ま
しくは、Sf9昆虫細胞が、組換えβ-セクレターゼの高発
現のため使用される。アッセイ法において使用されるβ
-セクレターゼは、精製されてもよい。本明細書におい
て使用される「精製された」という用語は、天然環境又
は組換え作製起源から除去、単離、又は分離され、かつ
例えば膜およびミクロソームなどそれらが天然に会合し
ているその他の成分を少なくとも60％、より好ましくは
少なくとも80％含まないポリペプチドを指すにも関わら
ず、そのような記述により、同一又はさもなくば同種の
試料中に存在するスプライス変異体又はその他のタンパ
ク質変異体（グリコシル化変異体）が同一試料中に存在
することを除外しない。
【００６３】タンパク質又はポリペプチドは一般的に、
それを含有する試料が、クーマシー染色アクリルアミド
電気泳動ゲル上に主要なタンパク質バンドを示す場合
に、「実質的に精製されている」と見なされる。
【００６４】本明細書において使用される「固定化」と
いう用語は、固体支持体へのβ-セクレターゼの直接的
な固定化、又は、接着リンカーを介した、もしくは付加
的なリンカーの使用による、β-セクレターゼの間接的
な固定化でありうる。接着リンカーはヒスチジン残基で
あってよく、又はリンカーは、ストレプトアビジン、も
しくは抗体、好ましくはβ-セクレターゼ指向性抗体で
あってよい。固体支持体は、マイクロプレート又はビー
ズであってよい。好ましくは、本アッセイ法において使
用されるマイクロプレートは、白色又は黒色でありうる
が、白色Optiplate（Optiplate Packard）が好ましい。
コーティング反応は、1μg/ml〜50μg/ml、好ましくは1
0μg/mlのタンパク質濃度で実施される。コーティング
反応のため、緩衝液は、pH3〜pH8の範囲に、好ましくは
pH5〜pH6の範囲に調整されて使用される。pH5.5に調整
されたクエン酸緩衝液が最も好ましい。
【００６５】結合アッセイ法が実施される結合緩衝液
は、pH2.5〜pH6の範囲に調整される緩衝液であってよ
い。好ましくは、緩衝液は、pH3.5〜pH4.5に調整された
クエン酸緩衝液又は酢酸緩衝液である。最も好ましいの
は、pH4.1のクエン酸緩衝液である。結合緩衝液は、そ
れが存在することによって非特異的結合が防止される、
高分子量タンパク質を含んでもよい。好ましくは、その
タンパク質はBSAである（図6Aおよび図6B）。最も好ま
しくは、結合緩衝液中のBSAの濃度は0.1％w/vである。
また結合緩衝液は、非イオン性界面活性剤又はイオン性
界面活性剤を含んでもよい。好ましくは、非イオン性界
面活性剤はTween-20である。好ましくは、イオン性界面
活性剤は、コール酸又はデオキシコール酸である。より
好ましくは、イオン性界面活性剤は、コール酸である。
最も好ましくは、結合緩衝液中の非イオン性界面活性剤
又はイオン性界面活性剤の濃度は0.02％である。結合緩
衝液中のコール酸の存在は、被検物質のIC-50値を、Twe
en-20の存在下と比較して3〜4倍さらに低下させうる
（図7）。アッセイ成分は、室温又は4℃で10分間から24
時間、平衡結合が調整されるまでインキュベートされ
る。好ましくは、アッセイ化合物は室温で1.5時間イン
キュベートされる。
【００６６】本明細書において使用される「β-セクレ
ターゼ阻害剤」とは、β-セクレターゼの活性部位と特
異的に結合し、それにより天然のβ-セクレターゼ基
質、例えばAPPの切断を阻害する任意の化合物を意味す
ることが意図される。本発明は、β-セクレターゼ活性
部位に特異的な阻害剤のスクリーニングのための競合結
合試験に関する。本発明の競合アッセイ法およびFRETア
ッセイ法において被検化合物を用いて得られた結果（図
5Aおよび図5B）を比較すると、タグ化β-セクレターゼ
とβ-セクレターゼとの結合を阻害する被検化合物は、
広い範囲のIC-50値で、A-βの産生をもたらすβ-セクレ
ターゼのタンパク質分解活性もまた阻害することが示さ
れうる。従って、タグ化β-セクレターゼ阻害剤の、単
離されたβ-セクレターゼとの結合は、競合結合アッセ
イ法によるA-β産生の阻害剤の同定において有用であ
る。さらに、標識されたβ-セクレターゼ阻害剤を用い
た競合結合アッセイ法は、他のアッセイ形式において偽
陽性と以前に判定された、強く着色された化合物（コン
ゴレッド）又は「粘着性化合物（sticky compounds）」
に対する傾向を有していないことが示されうる（図
3）。
【００６７】また本発明は、切断不可能な遷移状態模倣
物に基づくペプチド模倣物（peptidomimetic）化合物で
ある新規なβ-セクレターゼ阻害剤にも関する。本発明
のβ-セクレターゼ阻害剤は、式（I）のペプチド模倣
物、およびそれらの任意の組み合わせである： Y-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-W 式中、P1はロイスタチン、チャスタチン、又はチルスタ
チンと定義され、P2はAsnと定義され、P3はVal、Cpe、C
he、又はChaと定義され、P4はGluと定義され、P1'はVal
と定義され、P2'はAlaと定義され、P3'はGluと定義さ
れ、P4'はTyr、Cha、Phe（I）、又はTyr（I2）と定義さ
れ、Yは0個、1個、又は複数のアミノ酸残基と定義さ
れ、かつWは0個、1個、又は複数のアミノ酸残基と定義
される。好ましくは、Yは0個のアミノ酸である。好まし
くは、Wは0個のアミノ酸である。ロイスタチン、チャス
タチン、チルスタチン、Cpe、Che、およびChaの式は、
図1で定義されている。
【００６８】本発明のアッセイ法において使用されるβ
-セクレターゼ阻害剤を、以下の表に示す。式（I）の具
体例は、表の下部に示された化合物A、B、C、およびDで
ある。
【００６９】
【表１】
【００７０】ペプチド内の遷移状態類似体は、互いに上
下に配置されている。Oとは、Science、290、2000、150
-153に定義されている通りである。Hypはヒドロキシプ
ロリンと定義され、Avaはδ-アミノ吉草酸と定義され、
Abuはγ-アミノ酪酸と定義され、Aproはβ-アミノプロ
ピオン酸と定義され、Cmpはカルボキシメチルピペリジ
ンと定義され、TyrOBzstaはチロシル-O-ベンジルスタチ
ンと定義される。
【００７１】ペプチド模倣物β-セクレターゼ阻害剤
は、当技術分野において既知の標準的な方法、好ましく
はメリフィールド（Merrifield）の方法（J Am.Chem.So
c.、1963、85、2149-2154）、およびアサートン（Ather
ton）およびシェパード（Sheppard）、「固相ペプチド
合成：実践アプローチ（Solid Phase Peptide Synthesi
s:A Practical Approach）」（IRL Press Oxford 198
9）の方法のような固相法を使用して、化学合成されう
る。
【００７２】また本発明は、タグ化β-セクレターゼ阻
害剤の調製のための式（I）のβ-セクレターゼ阻害剤、
およびタグ化された式（I）のβ-セクレターゼ阻害剤に
も関する。
【００７３】本明細書において使用される「タグ化β-
セクレターゼ阻害剤」とは、タグ化された「β-セクレ
ターゼ阻害」化合物を意味することが意図される。「タ
グ化された」又は「タグ化β-セクレターゼ阻害剤」と
は、当該阻害化合物が、アッセイ系における、又は哺乳
動物への投与の際の、検出に適したタグを含有すること
を意味する。適切なタグは当業者に既知であり、例えば
放射性同位体、蛍光基、ビオチン（ストレプトアビジン
複合体化と併用）、および光親和性基を含む。適切な放
射性同位体は当業者に既知であり、例えば（塩素、フッ
素、臭素、およびヨウ素のような）ハロゲンの同位体な
らびに、テクネチウムおよびインジウムを含む金属を含
む。好ましい放射性同位体には、3H、11C、18F、32P、
33P、35S、123I、125I、および131Iが含まれる。最も好
ましいのは、3H、125I、および13 1Iである。本発明の放
射標識された化合物は、当業者に周知の標準的な放射標
識法を使用して調製されうる。適切な合成方法論は、以
下に詳細に記載される。本発明のβ-セクレターゼ阻害
剤は、直接的に（即ち、化合物へ直接的に放射標識を組
み込むことにより）、又は間接的に（即ち、化合物に組
み込まれているキレート剤によって放射標識を化合物へ
組み込むことにより）、放射標識されうる。また、放射
標識は、同位体的又は非同位体的でありうる。同位体的
放射標識では、本発明の化合物中の既存の1個の原子又
は原子群が、放射性同位体と置換（交換）される。
【００７４】非同位体的放射標識では、放射性同位体が
既存の基と置換（交換）されることなく、化合物へ付加
される。直接的および間接的に放射標識された化合物、
ならびに同位体的又は非同位体的に放射標識された化合
物が、本発明に関して使用される「放射標識されたβ-
セクレターゼ阻害剤」という用語に含まれる。
【００７５】そのような放射標識はまた、当技術分野に
おいて認識されている標準を適用して、化学的にかつ代
謝的に合理的な安定性を有するべきである。また、本発
明の化合物は多様な種々の放射性同位体により多様な様
式で標識されうるが、当業者が認識すると考えられると
おり、そのような放射標識は、標識されていない、又は
タグ化されていないβ-セクレターゼ阻害剤のβ-セクレ
ターゼへの高い結合親和性および特異性が有意に影響を
受けないような様式で実施されるべきである。有意に影
響を受けないとは、結合親和性および特異性が、約3対
数単位を上回って影響されない、好ましくは約2対数単
位を上回って影響されない、より好ましくは約1対数単
位を上回って影響されない、さらにより好ましくは約50
0％を上回って影響されない、およびよりさらに好まし
くは約250％を上回って影響されないことを意味し、最
も好ましくは結合親和性および特異性が全く影響を受け
ないことを意味する。
【００７６】放射標識されたβ-セクレターゼ阻害剤に
関して、標識はβ-セクレターゼ阻害剤上の任意の位置
に存在することができ、その構造中に1個、2個、又はそ
れ以上の放射性同位体が取り込まれていてもよい。本発
明の好ましい放射標識された化合物は、トリチウムで放
射標識されたβ-セクレターゼ阻害剤である。より好ま
しい本発明の放射標識された化合物は放射標識された式
（I）の化合物であり、ここでその構造中に1個、2個、
又はそれ以上の放射性同位体が組み込まれており、放射
標識が、P1、P3、および/又はP4'に位置する。最も好ま
しいのは、P1、P3、および/又はP4'に存在する放射標識
が3H、又は123I、125I、もしくは131Iである、式（I）
のβ-セクレターゼ阻害剤である。図2は、P1位、P3位、
およびP4'位に組み込まれうるトリチウム化された式
（I）の構築ブロックを示す。
【００７７】実施例4に記載されるように、ヨウ素はパ
ラジウム還元により3Hに交換されうるため、P4'位にジ
ヨードチロシンを有する式（I）のβ-セクレターゼ阻害
剤（化合物A）が、放射標識に関して選択されうる。還
元により、化学的には化合物Aと区別不可能な化合物が
得られる。
【００７８】放射標識されたβ-セクレターゼ阻害剤
は、500mCi/mmol〜60Ci/mmolの範囲内の比活性を有しう
る。好ましくは、それは、55Ci/mmolという比活性を有
する。結合した放射標識されたβ-セクレターゼ阻害剤
は、シンチレーターの添加によって測定されうる。好ま
しくは、シンチレーターはMicroScint20又はMicroScint
40（Packard）である。
【００７９】又は、シンチレーション近接アッセイ法
（Scintillation proximity assay；SPA）が本発明の放
射性リガンド競合結合アッセイ法において利用されうる
ことは周知である。例えば、精製されたタンパク質をSP
A支持体上に固定化し、その後、被検化合物の存在下で
支持体をタグ化β-セクレターゼ阻害剤と共にインキュ
ベートする。SPA支持体は、その構造的性質のため、結
合した放射性化合物の放射性シンチレーションシグナル
を増幅するが、溶液中に遊離している放射活性化合物の
放射性シグナルは増幅しない。従って、遊離のタグ化β
-セクレターゼ阻害剤の存在下でのシンチレーション計
数により、結合したタグ化β-セクレターゼ阻害剤が検
出され定量される。
【００８０】結合したタグ化β-セクレターゼ阻害剤を
遊離のタグ化β-セクレターゼ阻害剤から分離する方法
は、多数の方法で実施されうることが理解される。例え
ば、分離の方法には、これらに限定されないが、洗浄、
濾過、又は遠心分離が含まれる。分離法は、結合したタ
グ化β-セクレターゼ阻害剤の定量化を容易にすること
を意図している。従って、分離法はまた、インサイチュ
ーの遊離のタグ化β-セクレターゼ阻害剤が、結合した
タグ化β-セクレターゼ阻害剤から分離されない、例え
ばSPAなどの均一技術も包含することを意図している。
【００８１】本発明において、前記の放射標識された化
合物が、β-セクレターゼ阻害剤として有用であるこ
と、かつ従って、本発明の放射標識された化合物が、治
療目的、ならびに放射性画像化（radioimaging）（Q J
Nucl.Med.、1997、41(2)、163-169）およびPET画像化
（imaging）（Clin.Geriatr.Med.、2001、17(2)、255-2
79）の目的のためにも利用されうることが発見された。
【００８２】本明細書において使用される「被検化合
物」とは、本明細書に記載された本発明のアッセイ法を
使用して、タグ化β-セクレターゼ阻害剤とβ-セクレタ
ーゼとの結合の阻害、および従ってA-βの産生の阻害に
関してスクリーニングされる任意の化合物を意味するこ
とが意図される。化合物がタグ化されると、本発明のア
ッセイ法においてBACEへの結合の阻害に関する活性を有
する「被検化合物」が、続いて、前記で定義された「タ
グ化β-セクレターゼ阻害剤」として本発明のアッセイ
法において使用されうることが理解される。本発明のア
ッセイ法においてBACEへの結合の阻害に関する活性を有
する「被検化合物」は、続いて、A-β産生を含む変性性
神経学的障害の治療、好ましくはADの治療のための薬学
的組成物において使用されうることも理解される。
【００８３】本明細書において使用される「結合したタ
グ化β-セクレターゼ阻害剤」とは、特異的結合および
非特異的結合を含むタグ化β-セクレターゼ阻害剤の全
ての結合を意味することが意図される。非特異的結合
は、飽和濃度のもう一つの既知のβ-セクレターゼ阻害
剤による競合によって査定される。次いで、タグ化β-
セクレターゼ阻害剤の全ての結合から非特異的結合を差
し引くことにより、タグ化β-セクレターゼ阻害剤の特
異的結合が決定される。
【００８４】本明細書において使用される「阻害濃度」
とは、本発明のアッセイ法においてスクリーニングされ
た「可能性のあるβ-セクレターゼ阻害剤」化合物によ
って、タグ化阻害剤の50％が置換される濃度を意味する
ことが意図される。「阻害濃度」値の例は、IC-50からI
C-90の範囲であり、好ましくは、それぞれタグ化阻害剤
の50％、60％、70％、80％、90％の置換を表すIC-50、I
C-60、IC-70、IC-80、又はIC-90である。より好ましく
は、「阻害濃度」はIC-50値として測定される。IC-50の
意味は最大の半分を阻害する濃度であることが理解され
る。本発明のアッセイ法および方法において使用される
タグ化β-セクレターゼ阻害剤のIC-50は≦5μMでありう
る。より好ましくは、IC-50は≦1μMである。最も好ま
しくは、IC-50は≦0.25μMである。
【００８５】また本発明は、タグ化β-セクレターゼ阻
害剤が式（I）を有する、前記記載のアッセイ法にも関
する。
【００８６】本発明のさらなる態様は、前記記載の本発
明のアッセイ法において使用するための、式（I）のタ
グ化β-セクレターゼ阻害剤である。
【００８７】さらに本発明は、β-セクレターゼの阻害
化合物の同定のためのタグ化β-セクレターゼ阻害剤の
使用に関する。この使用に関して、タグ化β-セクレタ
ーゼ阻害剤は式（I）を有していてもよく、放射性タ
グ、より具体的にはトリチウムタグを含みうる。
【００８８】本発明は、さらに、被検化合物の存在下で
タグ化β-セクレターゼ阻害剤とβ-セクレターゼとの結
合を測定する段階、および被検化合物が活性部位結合に
関してタグ化β-セクレターゼ阻害剤と競合しうるか否
かを判定する段階を含む、β-セクレターゼ活性を阻害
できる化合物のスクリーニング法に関する。
【００８９】また本発明は、タグ化β-セクレターゼ阻
害剤が式（I）を有する、前記記載の方法にも関する。
【００９０】さらに本発明は、前記記載の本発明の方法
において使用するための、タグ化β-セクレターゼ阻害
剤に関する。
【００９１】さらなる態様において、本発明は、天然の
又は組換え的に作製されたβ-セクレターゼポリペプチ
ドおよびタグ化β-セクレターゼ阻害剤を含む、β-セク
レターゼ阻害剤を同定するためのキットに関する。
【００９２】さらなる態様において、本発明は、β-セ
クレターゼタンパク質を固体化するための固体支持体、
β-セクレターゼタンパク質、コーティング緩衝液、タ
グ化β-セクレターゼ阻害剤、および結合緩衝液の群よ
り選択される、本発明のアッセイ法又は方法を実施する
ために必要な成分を含むキットに関する。
【００９３】さらに本発明は、本発明のアッセイ法又は
方法により同定された新規なβ-セクレターゼ阻害剤に
関する。これらは、次いで、新規なβ-セクレターゼ阻
害剤を同定するために使用されうる。
【００９４】本発明はさらに、薬学的に許容される担体
および、本発明のアッセイ法又は方法により同定された
治療的有効量のβ-セクレターゼ阻害剤、ならびに薬学
的に許容されるそれらの塩を含む薬学的組成物を提供す
る。
【００９５】「薬学的に許容される」という用語は、正
常な医学的判断の範囲内で、合理的な利益/リスク比を
有し、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、又はその他
の問題もしくは合併症を示すことのない、ヒトおよび動
物の組織と接触させて使用するのに適した、化合物、材
料、組成物、および/又は剤形を指すために、本明細書
において利用される。
【００９６】本明細書において使用される「薬学的に許
容される塩」とは、親化合物が、その酸性塩又は塩基性
塩を作成することにより修飾されている、開示された化
合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例には、
これらに限定されないが、アミンのような塩基性残基の
無機酸塩又は有機酸塩；カルボン酸のような酸性残基の
アルカリ塩又は有機塩等が含まれる。薬学的に許容され
る塩には、例えば非毒性の無機酸又は有機酸から形成さ
れた親化合物の従来の非毒性の塩又は第四級アンモニウ
ム塩が含まれる。例えば、そのような従来の非毒性の塩
には、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン
酸、硝酸等のような無機酸に由来するもの；ならびに酢
酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリ
ン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビ
ン酸、パモ（pamoic）酸、マレイン酸、ヒドロキシマレ
イン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリ
チル酸、スルファニル酸、2-アセトキシ安息香酸、フマ
ル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、メタ
ンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチ
オン酸等のような有機酸より調製された塩が含まれる。
【００９７】本発明の薬学的に許容される塩は、従来の
化学的方法により、塩基性又は酸性の官能基を含有する
親化合物から合成されうる。一般的に、そのような塩
は、水中もしくは有機溶媒中、又はこの二つ混合物の中
で、遊離の酸性型又は塩基性型のこれらの化合物を、化
学量論的な量の適切な塩基又は酸と反応させることによ
り調製されうる。一般的には、エーテル、酢酸エチル、
エタノール、イソプロパノール、又はアセトニトリルの
ような非水性の媒体が好ましい。適切な塩の一覧は、
「レミントン薬科学（Remington's Pharmaceutical Sci
ences）」、第17版、マック出版社（Mack Publishing C
ompany）、イーストン（Easton）、PA、1985、1418頁
（この開示は参照により本明細書に組み込まれる）に見
出される。
【００９８】「安定な化合物」および「安定な構造」と
は、反応混合物からの有用な純度への単離、および効率
的な治療剤への製剤化に耐えるために十分に丈夫な化合
物を示すものである。
【００９９】さらに本発明は、アルツハイマー病又はそ
の他の脳血管アミロイドーシスの治療用の医薬品の調製
のための、本発明のアッセイ法又は方法によって同定さ
れたβ-セクレターゼ阻害化合物の使用に関する。本発
明の競合結合アッセイ法によって同定されたβ-セクレ
ターゼ阻害剤は、神経学的障害、ならびに、A-β、AP
P、および/又はA-β/APP会合巨大分子、ならびにBACE結
合の活性中心と会合したその他の巨大分子が関与してい
る、その他の障害の治療のため有用であり得る。
【０１００】本発明は、さらに、本発明のアッセイ法又
は方法によって同定された、β-セクレターゼを阻害す
るのに効果的な薬学的有効量の化合物を、患者へ投与す
る段階を含む、アルツハイマー病又はその他の脳血管ア
ミロイドーシスに罹患しているか又はそれらの素因を有
する患者を治療する方法に関する。
【０１０１】以上、本発明を概略的に記載したが、それ
らは、添付の図面と合わせて、特記しない限り、例示の
ためだけに本明細書に含まれており、制限を意図したも
のではない、具体的な実施例を参照することにより、よ
りよく理解されると考えられる。
【０１０２】
【実施例】実施例において言及された市販の試薬は、特
記しない限り、製造業者の指示に従い使用された。
【０１０３】実施例１．BACEのクローニングおよび発現 PCRにより、ヒトアスパルチルプロテアーゼであるBACE
およびBACE-2をコードするcDNAの5'非コード領域を、コ
ザック（Kozack）配列によりリボソーム認識を最適化
し、GCに富むコドンの交換によりクローニング効率を最
適化するため修飾し、3'末端を、組換えタンパク質の迅
速な精製を可能にするため6×His残基をコードする配列
を付加することにより修飾した（それぞれ、配列番号：
1および配列番号：2）。開始ATGは、配列番号：1および
配列番号：2の16位で見出される。組換えバキュロウイ
ルスによるSf9昆虫細胞（Glycoconj.J、1999、16(2)、1
09-123）における発現によって、大腸菌、S.ポンベ（po
mbe）、又はHEK293細胞における発現よりも高い収率が
得られた。従って、cDNAを、昆虫細胞における発現のた
めBamHI×XbaI断片としてpFASTBAC1ベクター（Life Tec
hnologies,Inc）へとクローニングし、PCR産物を配列決
定により確認した。バキュロウイルスゲノムへの組換え
の後、精製されたウイルスDNAを昆虫細胞へと形質転換
した。Sf9細胞を、5％（v/v）ウシ胎仔血清を含むTC100
培地（BioWhittaker）中、27℃で培養した。1.5×109pf
u/mlの力価を有するウイルスストックを生成させた。BA
CEおよびBACE-2の大規模産生のため、24Lの発酵槽中のS
f9細胞を、MOI 1で感染させた。
【０１０４】実施例２．全長BACEの精製 Sf9細胞50g（湿重量）を、750mlのPBS、2％Triton X-10
0に懸濁し、手持ちガラスホモジナイザーでホモジナイ
ズした。ホモジネートを氷上で30分間攪拌し、次いで10
0,000×gで20分間遠心分離した。上清をpH8.0に調整
し、50mMリン酸ナトリウム、10mM Tris、100mM NaCl、
0.1％Triton X-100（pH8.0）で予め平衡化した2.6×2.5
cmのNi2+NTA-セファロースカラム（Qiagen、Germany）
にロードした。続いて、カラムをこの緩衝液で洗浄し、
次いで50mMリン酸ナトリウム（pH7.4）、100mM NaCl、
0.1％Triton X-100で洗浄した。その後、カラムを、50m
Mリン酸ナトリウム（pH7.4）、100mM NaCl、200mMイミ
ダゾール、0.1％Triton X-100（10カラム容量）で溶出
させた。全長BACEを含む画分をプールし、5mlのHiTrapQ
カラム（Pharmacia、Switzerland）に通し、未結合の材
料を回収した。次いで、この材料を、50mM TrisHCl（pH
7.4）、10mM NaCl、0.1％Tritonで10倍希釈し、50mM Tr
isHCl（pH7.4）、10mM NaCl、0.1％Triton X-100で予め
平衡化した第二の5mlのHiTrap Qカラムに再びロードし
た。カラムをこの緩衝液で洗浄し、50mM TrisHCl（pH7.
4）、1M NaCl、0.1％Triton X-100（20カラム容量）の
勾配により溶出させた。BACEを含む画分をプールし、50
mM TrisHCl（pH8.0）、0.1％Triton X-100に対して透析
し、Mono S HR5/5カラム（Pharmacia、Switzerland）に
ロードした。BACEを含む未結合の材料をプールし、4℃
で保存した。
【０１０５】実施例３．ペプチド化合物Aの合成 アサートン（Atherton）およびシェパード（Sheppar
d）、「固相ペプチド合成：実践アプローチ（Solid Pha
se Peptide Synthesis:A Practical Approach）」（IRL
Press Oxford 1989)により記載された方法に従い、Ten
ta Gel S RAM樹脂（0.25mmol/g（Rapp Polymere GmbH、
Tubingen、Germany）から出発する、Pioneer（商標）ペ
プチド合成システム（Peptide Synthesis System）で、
連続流固相合成を実施した。塩基に対して不安定なFmoc
基を、α-アミノ保護に使用した。側鎖を、保護基であ
る-Asn(Trt)およびGlu（OtBu）で保護した。市販のFmoc
-スタチン（Neosystem）およびFmoc-3,5-ジヨード-L-チ
ロシン（Fluka）を、合成において使用した。Fmoc-アミ
ノ酸（2.5当量）を、当量のO-(1,2-ジヒドロ-2-オキゾ
ピリド-1-イル)-N,N,N',N'-テトラメチルウロニウムテ
トラフルオロボレート（O-(1,2-dihydro-2-oxopyrid-1-
yl)-N,N,N',N'-tetramethyluronium tetrafluoroborat
e；TPTU）およびN,N-ジイソプロピルエチルアミン（Hun
ig's base）で活性化した。Fmoc脱保護（deprotectio
n）を、20％ピペリジンを含むDMFを用いて達成した。Gl
u(OBut)-Val-Asn(Trt)-スタチン-Val-Ala-Glu(OtBu)-Ty
r(I2)-アミドTenta Gel S樹脂（0.200g）を、95％TFA、
2.5％H2O、2.5％トリイソプロピルシランの混合物（5m
l）で5時間処理した。反応混合物を濃縮し、ジエチルエ
ーテルに注入し、沈殿物を濾過により水から収集し、凍
結乾燥させた。粗ペプチドを、調製用RP-HPLCにより精
製した。均一なGlu-Val-Asn-スタチン-Val-Ala-Glu-Tyr
(I2)-NH2（化合物A；12mg、MH+＝1231.3）が得られた。
その他のβ-セクレターゼ阻害剤が類似の方法で合成さ
れた。
【０１０６】実施例４．化合物Aのトリチウム化
【化１】 9.3mg（0.0069mmol）の化合物Aを、1mlのメタノール（M
erck＃1.06009.1000）および6滴の水に溶解させた。7μ
lのトリエチルアミン（Fluka puriss＃90335）および4m
gの10％パラジウムを有する木炭（10％ palladium on c
harcoal）（Degussa Typ101ND）の添加後、懸濁液をト
リチウムガス雰囲気下で1時間攪拌した。RCトリテック
（Tritec）AG製のトリチウム化装置である9053 Teufen
を使用した（Helv.Chim.Acta、1985、68、1880）。揮発
性トリチウム成分の除去後、残渣をメタノール-水（9：
1）に懸濁した。短時間の超音波処理の後、懸濁液をMil
lex-HV 0.45μm（カタログ番号SL HV013 NL）で濾過し
た。濾液を100mlメタノール-水（9：1）に希釈した。全
3H活性は108.54mCiであり、放射化学的純度は、HPLC
（カラムVydac 5μ 4.6×250mm、流速1ml/分、溶媒A：9
5％水-5％アセトニトリル-1％TFA；溶媒B：10mM TFA水
溶液-アセトニトリル3/1；勾配B：0％〜40％で30分間、
保持時間：23.27分；λ＝254nm）によると84％であっ
た。質量分析により決定された比活性は、55Ci/mmolで
あった。Millex-HVフィルターを水-メタノール（9：1）
で数回洗浄し、66mCiのペプチドのもう一つのバッチを
得た。このバッチをHPLCにより精製したところ、HPLCに
よると100％の純度を有する43.4mCiのトリチウム化化合
物Aが得られた。3H-NMRにより7ppm付近に単一ピークが
示されたため、任意の不安定なトリチウムの存在は排除
された。
【０１０７】実施例５．新規なβ-セクレターゼ阻害剤
の特徴決定のためのFRETアッセイ法 全ての酵素アッセイ法を、96穴マイクロタイタープレー
ト（DYNEX Microfluor2、Chantilly、VA、USA）を使用
して、FLUOstar（BMG Lab Technologies、D-77656 Offe
nburg）上で20℃で実施した。アッセイ容量は100μlで
あった。典型的には、ジメチルスルホキシドに溶解させ
た阻害剤を、種々の濃度でウェルに添加し、続いて緩衝
液および酵素を添加した。ジメチルスルホキシドの濃度
を4％未満に維持した。基質を添加することにより、酵
素反応を開始させた。実験を実施する際のpHおよび緩衝
液の条件は、図および表の説明に示されている。励起波
長（λexcitztion）＝430nmでの蛍光励起により、放射
波長（λemission）＝520nmで蛍光増加の進行を測定し
た。様々な基質濃度で30分間定期的に反応動力学（kine
tic）を追跡した。検出されたシグナルを、1秒間に加水
分解された基質のモル数へと変換した。動力学データ
を、ラインウィーバーバーク（Lineweaver-Burke）プロ
ットからグラフ的に決定した。基質濃度を変動させるこ
とにより得られたデータは、本明細書で使用された全て
のFRET基質に典型的である過剰な消光能の効果に関して
補正されなければならない。
【０１０８】生成物形成の直線的な進行が保証される酵
素濃度で、アッセイ法を実施した。
【０１０９】実施例６．競合的放射性リガンド結合アッ
セイ法（RLBA） pH5.5に調整された30mMクエン酸ナトリウム緩衝液中1μ
g/mlの濃度を使用して、96穴マイクロプレート（Optipl
ate Packard）を、精製BACEタンパク質でコーティング
する。コーティングは、4℃で1日間〜3日間、100μl/ウ
ェルをインキュベートすることにより達成される。次い
で、プレートを300μl/ウェルの10mMクエン酸（pH4.1）
で2回洗浄する。各ウェルに、100μlの結合緩衝液（30m
Mクエン酸、100mM NaCl、0.1％BSA（pH4.1)）を分注す
る。DMSOストック溶液又は適切な希釈液5μlに被検化合
物（図4Aおよび図4BにおけるペプチドH-4848）を添加す
る。これに、10μCi/mlストック溶液を含む結合緩衝液
から、10μl/ウェルのトレーサー（トリチウム化化合物
A）を添加する。室温で湿潤チャンバー内で1.5時間〜2
時間インキュベートした後、300μl/ウェルの水でプレ
ートを2回洗浄し、ドライタオル上に裏返す。50μl/ウ
ェルのMicroScint20（Packard）の添加後、プレートを
密封し、5秒間振とうする。結合した放射能をTopcount
（Packard）で計数する。全結合は、BACEタンパク質の
純度および濃度に主に依存して、典型的には、2000cpm/
ウェル〜10000cpm/ウェルである。＞1μMペプチドH-484
8（Bachem＃H-4848）を用いた競合により査定される非
特異的結合は、典型的には30cpm/ウェル〜300cpm/ウェ
ルである。IC-50値はマイクロソフトエクセル（Microso
ft Excel）FITにより計算される。
【０１１０】
【発明の効果】本発明により、β-セクレターゼタンパ
ク質を固体支持体上に固定化する段階、タグ化β-セク
レターゼ阻害剤の存在下でそれを被検化合物と接触させ
る段階、および被検化合物がβ-セクレターゼ阻害剤で
あるか否かを評価するため、被検化合物の存在下と非存
在下でのタグ化β-セクレターゼ阻害剤の結合の程度を
比較する段階を含む、β-セクレターゼ阻害剤を同定す
るためのアッセイ法が提供された。さらに本発明によ
り、β-セクレターゼ阻害剤のスクリーニング法、新規
なβ-セクレターゼ阻害剤、および、β-セクレターゼ阻
害剤の同定のためのタグ化β-セクレターゼ阻害剤とし
てのそれらの使用、β-セクレターゼ阻害剤を同定する
ためのキット、ならびにアルツハイマー病およびその他
の脳血管アミロイドーシスの治療において使用するため
の新規なβ-セクレターゼ阻害剤が提供された。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> F. Hoffmann-La Roche AG <120> Assay and screening method for identification of inhibitors of be ta-secretases <130> Case 21066 <150> EP01130282.5 <151> 2001-12-20 <160> 2 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1542 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggatccgccg ccactatggc ccaagccctg ccctggctcc tgctgtggat gggcgcggga 60 gtgctgcctg cccacggcac ccagcacggc atccgactgc cactgcgcag cggactggga 120 ggtgcacctc tgggactgcg gctgccccgg gagaccgacg aagagcccga ggagcccggc 180 cggaggggca gctttgtgga gatggtggac aacctgaggg gcaagtcggg gcagggctac 240 tacgtggaga tgaccgtggg cagccccccg cagacgctca acatcctggt ggatacaggc 300 agcagtaact ttgcagtggg tgctgccccc caccccttcc tgcatcgcta ctaccagagg 360 cagctgtcca gcacataccg ggacctccgg aagggtgtgt atgtgcccta cacccagggc 420 aagtgggaag gggagctggg caccgacctg gtaagcatcc cccatggccc caacgtcact 480 gtgcgtgcca acattgctgc catcactgaa tcagacaagt tcttcatcaa cggctccaac 540 tgggaaggca tcctggggct ggcctatgct gagattgcca ggcctgacga ctccctggag 600 cctttctttg actctctggt aaagcagacc cacgttccca acctcttctc cctgcagctt 660 tgtggtgctg gcttccccct caaccagtct gaagtgctgg cctctgtcgg agggagcatg 720 atcattggag gtatcgacca ctcgctgtac acaggcagtc tctggtatac acccatccgg 780 cgggagtggt attatgaggt gatcattgtg cgggtggaga tcaatggaca ggatctgaaa 840 atggactgca aggagtacaa ctatgacaag agcattgtgg acagtggcac caccaacctt 900 cgtttgccca agaaagtgtt tgaagctgca gtcaaatcca tcaaggcagc ctcctccacg 960 gagaagttcc ctgatggttt ctggctagga gagcagctgg tgtgctggca agcaggcacc 1020 accccttgga acattttccc agtcatctca ctctacctaa tgggtgaggt taccaaccag 1080 tccttccgca tcaccatcct tccgcagcaa tacctgcggc cagtggaaga tgtggccacg 1140 tcccaagacg actgttacaa gtttgccatc tcacagtcat ccacgggcac tgttatggga 1200 gctgttatca tggagggctt ctacgttgtc tttgatcggg cccgaaaacg aattggcttt 1260 gctgtcagcg cttgccatgt gcacgatgag ttcaggacgg cagcggtgga aggccctttt 1320 gtcaccttgg acatggaaga ctgtggctac aacattccac agacagatga gtcaaccctc 1380 atgaccatag cctatgtcat ggctgccatc tgcgccctct tcatgctgcc actctgcctc 1440 atggtgtgtc agtggcgctg cctccgctgc ctgcgccagc agcatgatga ctttgctgat 1500 gacatctccc tgctgaagca tcaccatcac catcactgat aa 1542 <210> 2 <211> 1628 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ggatccgccg ccactatggg cgcactggca cgagcactgc tgctgcctct gctggcacag 60 tggctacttc gagcagctcc agagctagct ccagctccat tcacgctgcc actccgagta 120 gctgctgcaa cgaaccgcgt agttgcgccc accccgggac ccgggactcc tgccgagcgc 180 cacgccgacg gcttggcgct cgccctggag cctgccctgg cgtcccccgc gggcgccgcc 240 aacttcttgg ccatggtaga caacctgcag ggggactctg gccgcggcta ctacctggag 300 atgctgatcg ggaccccccc gcagaagcta cagattctcg ttgacactgg aagcagtaac 360 tttgccgtgg caggaacccc gcactcctac atagacacgt actttgacac agagaggtct 420 agcacatacc gctccaaggg ctttgacgtc acagtgaagt acacacaagg aagctggacg 480 ggcttcgttg gggaagacct cgtcaccatc cccaaaggct tcaatacttc ttttcttgtc 540 aacattgcca ctatttttga atcagagaat ttctttttgc ctgggattaa atggaatgga 600 atacttggcc tagcttatgc cacacttgcc aagccatcaa gttctctgga gaccttcttc 660 gactccctgg tgacacaagc aaacatcccc aacgttttct ccatgcagat gtgtggagcc 720 ggcttgcccg ttgctggatc tgggaccaac ggaggtagtc ttgtcttggg tggaattgaa 780 ccaagtttgt ataaaggaga catctggtat acccctatta aggaagagtg gtactaccag 840 atagaaattc tgaaattgga aattggaggc caaagcctta atctggactg cagagagtat 900 aacgcagaca aggccatcgt ggacagtggc accacgctgc tgcgcctgcc ccagaaggtg 960 tttgatgcgg tggtggaagc tgtggcccgc gcatctctga ttccagaatt ctctgatggt 1020 ttctggactg ggtcccagct ggcgtgctgg acgaattcgg aaacaccttg gtcttacttc 1080 cctaaaatct ccatctacct gagagatgag aactccagca ggtcattccg tatcacaatc 1140 ctgcctcagc tttacattca gcccatgatg ggggccggcc tgaattatga atgttaccga 1200 ttcggcattt ccccatccac aaatgcgctg gtgatcggtg ccacggtgat ggagggcttc 1260 tacgtcatct tcgacagagc ccagaagagg gtgggcttcg cagcgagccc ctgtgcagaa 1320 attgcaggtg ctgcagtgtc tgaaatttcc gggcctttct caacagagga tgtagccagc 1380 aactgtgtcc ccgctcagtc tttgagcgag cccattttgt ggattgtgtc ctatgcgctc 1440 atgagcgtct gtggagccat cctccttgtc ttaatcgtcc tgctgctgct gccgttccgg 1500 tgtcagcgtc gcccccgtga ccctgaggtc gtcaatgatg agtcctctct ggtcagacat 1560 cgctggaaat gataactcga ggcatgcggt accaagcttg tcgagaagta ctagaggatc 1620 ataatcag 1628
【図面の簡単な説明】
【図１】 式（I）の構築ブロックの式を示す図であ
る。
【図２】 トリチウムがTとして示されている、トリチ
ウム化された式（I）の構築ブロックの式を示す図であ
る。
【図３】 公開されているペプチド模倣物阻害剤（Natu
re、1999、402、537に記載されたペプチドH-4848（Bach
em）およびJ.Am.Chem.Soc.、2000、122、3522に記載さ
れたペプチドH-5108（Bachem)）およびその他の活性部
位指向性阻害剤により作製された阻害曲線を示すグラフ
である。アッセイ法が、FRETアッセイ法において偽陽性
と判定された強く着色している化合物（コンゴレッド）
又は「粘着化合物」に対する傾向を有さないこともまた
示される。
【図４Ａ】 実施例6に記載されたトリチウム化化合物A
の精製BACEへの平衡結合を示す図である。
【図４Ｂ】 スキャッチャード分析により、単一結合部
位の等温線およびペプチドH-4848による競合阻害を示す
図である。
【図５Ａ】 広い範囲のIC-50値における、本発明のア
ッセイ法における、β-セクレターゼ阻害剤としてのペ
プチド模倣化合物の評価を示す図である。
【図５Ｂ】 FRETアッセイ法および競合的放射性リガン
ド結合アッセイ法により得られた19個のペプチド模倣物
BACE阻害剤に関するIC-50値の相関を示す図である。
【図６Ａ】 分散プロットにおいて図示された結合阻害
に対するBSAの効果（カクテルプレートをプールしてい
るプレート（P）およびカラム（C）の対照dpmに対する
割合（％）（3200データポイント)）を示す図である。
結果は、結合緩衝液中にBSAが存在しない場合に観察さ
れた結合阻害の不均一性を図示している。理想的には、
1個のドットで表される各化合物は、カラムプールおよ
びプレートプールにおいて同一の阻害を与え、かつ対角
線に沿って分散されなければならない。
【図６Ｂ】 分散プロットにおいて示されたBSA非存在
下での結合阻害（カクテルプレートをプールしているプ
レート（P）およびカラム（C）の対照dpmに対する割合
（％）（3200データポイント)）を示す図である。この
結果は、結合緩衝液中にBSAが存在する場合に観察され
た結合阻害の均一性を示す。
【図７】 0.02％コール酸（黒丸）、0.02％Tween20
（白丸）、および0.1％ウシ血清アルブミン（BSA、黒三
角）の影響下での化合物H-4848（Bachem、Nature、199
9、402、537に記載）による放射性リガンド結合の用量
依存的阻害を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ０７Ｋ 14/00 ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｎ 9/99 Ｃ１２Ｎ 9/99 11/08 11/08 Ｃ１２Ｑ 1/37 ＺＮＡ Ｃ１２Ｑ 1/37 ＺＮＡ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ 33/50 33/50 Ｚ // Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｎ 9/64 (72)発明者 ハインツ ドーベリー スイス連邦共和国 ツィーフェン ラップ シンガーストラッセ 22 (72)発明者 フィオナ グリューニンガー スイス連邦共和国 アルレスハイム ボー デンウェグ 49 (72)発明者 フィリップ ヒューゲニン スイス連邦共和国 リースタル シターン ストラッセ 41 (72)発明者 エリック アルギリオス カイタス スイス連邦共和国 アイス エイヒベルグ ウェグ ４ (72)発明者 ペーター ネルボーク−ホクステテル スイス連邦共和国 バーゼル マルスシャ ルケンストラッセ 67 Ｆターム(参考） 2G045 AA35 BB05 BB14 BB41 BB51 CB01 DA13 FB01 FB07 FB08 JA01 4B033 NA01 NA26 NB34 NB63 NC04 ND05 NF02 4B050 CC03 DD11 FF14E GG10 LL03 4B063 QA01 QA18 QQ20 QR16 QR41 QR48 QR52 QR58 QR66 QR84 QS12 QS20 QS28 QS36 QX02 QX07 4C084 AA02 AA07 AA17 BA44 CA62 NA14 ZA152 ZA162 ZA362 ZC202 4H045 AA10 AA30 BA15 BA16 BA17 BA18 BA19 BA20 BA21 DA56 EA20 FA34 FA58 FA61 GA25

Claims (39)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記式Iのβ-セクレターゼ阻害剤、およ
    びそれらの任意の組み合わせ： Y-P4-P3-P2-P1-P1'-P2'-P3'-P4'-W 式中、P1はロイスタチン（Leustatin）、チャスタチン
    （Chastatin）、又はチルスタチン（Tyrstatin）と定義
    され、P2はAsnと定義され、P3はVal、Cpe、Che、又はCh
    aと定義され、P4はGluと定義され、P1'はValと定義さ
    れ、P2'はAlaと定義され、P3'はGluと定義され、P4'はT
    yr、Cha、Phe（I）、又はTyr（I2）と定義され、Yは0
    個、1個、又は複数のアミノ酸残基と定義され、かつWは
    0個、1個、又は複数のアミノ酸残基と定義される。
  2. 【請求項２】 タグ化（tagged）β-セクレターゼ阻害
    剤の調製のための、請求項1記載のβ-セクレターゼ阻害
    剤。
  3. 【請求項３】 タグ化されている、請求項1記載のβ-セ
    クレターゼ阻害剤。
  4. 【請求項４】 P3位、P1位、又はP4'位のうちの1つ又は
    複数で放射性タグ化されている、請求項3記載のβ-セク
    レターゼ阻害剤。
  5. 【請求項５】 β-セクレターゼ阻害化合物の同定のた
    めの、請求項3または4記載のタグ化β-セクレターゼ阻
    害剤の使用。
  6. 【請求項６】 タグ化β-セクレターゼ阻害剤がトリチ
    ウムタグ化β-セクレターゼ阻害剤である、請求項5記載
    の使用。
  7. 【請求項７】 （a）β-セクレターゼタンパク質を固定
    化する段階；（b）被検化合物を添加し、続いてタグ化
    β-セクレターゼ阻害剤を添加する段階；（c）アッセイ
    成分をインキュベートする段階；および（d）結合した
    タグ化β-セクレターゼ阻害剤を測定する段階を含む、
    β-セクレターゼ阻害剤を同定するためのアッセイ法。
  8. 【請求項８】 β-セクレターゼが単離されかつ実質的
    に精製されたβ-セクレターゼである、請求項7記載のア
    ッセイ法。
  9. 【請求項９】 β-セクレターゼが組換え的に作製され
    かつ精製されている、請求項7記載のアッセイ法。
  10. 【請求項１０】 β-セクレターゼが全長β-セクレター
    ゼである、請求項7から9記載のアッセイ法。
  11. 【請求項１１】 β-セクレターゼがBACEおよびBACE-2
    からなる群より選択される、請求項7から10記載のアッ
    セイ法。
  12. 【請求項１２】 タグ化β-セクレターゼ阻害剤が、放
    射性タグで標識されたβ-セクレターゼ阻害剤である、
    請求項7から11記載のアッセイ法。
  13. 【請求項１３】 放射性タグがトリチウムである、請求
    項12記載のアッセイ法。
  14. 【請求項１４】 タグ化β-セクレターゼ阻害剤が、請
    求項3記載のタグ化β-セクレターゼ阻害剤である、請求
    項7から13記載のアッセイ法。
  15. 【請求項１５】 タグ化β-セクレターゼ阻害剤が、約1
    μM以下の阻害濃度を有する、請求項7から14記載のアッ
    セイ法。
  16. 【請求項１６】 アッセイ成分が選択的にBSAを含む結
    合緩衝液中でインキュベートされる、請求項7から15記
    載のアッセイ法。
  17. 【請求項１７】 アッセイ成分が選択的に非イオン性界
    面活性剤を含む結合緩衝液中でインキュベートされる、
    請求項7から16記載のアッセイ法。
  18. 【請求項１８】 非イオン性界面活性剤がTween-20であ
    る、請求項17記載のアッセイ法。
  19. 【請求項１９】 アッセイ成分が選択的にイオン性界面
    活性剤を含む結合緩衝液中でインキュベートされる、請
    求項7から16記載のアッセイ法。
  20. 【請求項２０】 イオン性界面活性剤がコール酸および
    デオキシコール酸を含む群より選択される、請求項19記
    載のアッセイ法。
  21. 【請求項２１】 請求項7から20記載のアッセイ法にお
    いて使用するための、請求項3記載のタグ化β-セクレタ
    ーゼ阻害剤。
  22. 【請求項２２】 被検化合物の存在下でのタグ化β-セ
    クレターゼ阻害剤とβ-セクレターゼとの結合を測定す
    る段階；および被検化合物が活性部位結合に関してタグ
    化β-セクレターゼ阻害剤と競合できるか否かを判定す
    る段階を含む、β-セクレターゼ活性を阻害することが
    できる化合物をスクリーニングする方法。
  23. 【請求項２３】 β-セクレターゼが単離されかつ実質
    的に精製されたβ-セクレターゼである、請求項22記載
    の方法。
  24. 【請求項２４】 β-セクレターゼが組換え的に作製さ
    れかつ精製されている、請求項22記載の方法。
  25. 【請求項２５】 β-セクレターゼが全長β-セクレター
    ゼである、請求項22から24記載の方法。
  26. 【請求項２６】 β-セクレターゼがBACEおよびBACE-2
    からなる群より選択される、請求項22から25記載の方
    法。
  27. 【請求項２７】 タグ化β-セクレターゼ阻害剤が、放
    射性タグで標識されたβ-セクレターゼ阻害剤である、
    請求項22から26記載の方法。
  28. 【請求項２８】 放射性タグがトリチウムである、請求
    項27記載の方法。
  29. 【請求項２９】 タグ化β-セクレターゼ阻害剤が、請
    求項3記載のβ-セクレターゼ阻害剤である、請求項22か
    ら28記載の方法。
  30. 【請求項３０】 請求項22から29記載の方法において使
    用するためのタグ化β-セクレターゼ阻害剤。
  31. 【請求項３１】 天然の又は組換え的に作製されたβ-
    セクレターゼポリペプチド、およびタグ化β-セクレタ
    ーゼ阻害剤を含む、β-セクレターゼ阻害剤を同定する
    ためのキット。
  32. 【請求項３２】 タグ化β-セクレターゼ阻害剤が放射
    性タグを保持している、請求項31記載のキット。
  33. 【請求項３３】 タグ化β-セクレターゼ阻害剤がトリ
    チウムタグを保持している、請求項32記載のキット。
  34. 【請求項３４】 請求項7から20記載のアッセイ法又は
    請求項22から29記載の方法を実施するために必要な成分
    を含むキット。
  35. 【請求項３５】 請求項7から20記載のアッセイ法又は
    請求項22から29記載の方法によって同定されたβ-セク
    レターゼ阻害剤。
  36. 【請求項３６】 薬学的に許容される担体、および治療
    的有効量の請求項35記載のβ-セクレターゼ阻害剤を含
    む薬学的組成物。
  37. 【請求項３７】 アルツハイマー病又はその他の脳血管
    アミロイドーシスの治療用の医薬品の調製のための、請
    求項7から20記載のアッセイ法又は請求項22から29記載
    の方法によって同定されたβ-セクレターゼ阻害剤の使
    用。
  38. 【請求項３８】 請求項7から20記載のアッセイ法又は
    請求項22から29記載の方法によって同定されたβ-セク
    レターゼを阻害するのに効果的な薬学的有効量の化合物
    を患者へ投与する段階を含む、アルツハイマー病又はそ
    の他の脳血管アミロイドーシスに罹患しているか、又は
    その素因を有する患者を治療する方法。
  39. 【請求項３９】 添付の実施例に関して具体的に記載さ
    れた方法と実質的に同様の方法。
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