WO2006038684A1 - 膜貫通型酵素阻害物質のスクリーニング方法 - Google Patents

膜貫通型酵素阻害物質のスクリーニング方法 Download PDF

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WO2006038684A1
WO2006038684A1 PCT/JP2005/018587 JP2005018587W WO2006038684A1 WO 2006038684 A1 WO2006038684 A1 WO 2006038684A1 JP 2005018587 W JP2005018587 W JP 2005018587W WO 2006038684 A1 WO2006038684 A1 WO 2006038684A1
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Naoki Tarui
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Takeda Pharmaceutical Company Limited
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    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
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    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening an enzyme inhibitor that specifically binds to a transmembrane region of a transmembrane enzyme.
  • Alzheimer's disease is a neurodegenerative disease characterized by senile plaque formation and neurofibrillary tangles with neuronal degeneration.
  • the most characteristic senile plaques in Alzheimer's disease are those consisting of 3) amyloid protein (hereinafter sometimes abbreviated as A / 3), and biological components deposited in the brain.
  • a J3 consisting of 40 or 42 amino acids (hereinafter abbreviated as A] 3 1-40 and A 1-42) is known to be toxic to neurons. Therefore, drugs that inhibit the production and secretion of A are effective in preventing and treating diseases caused by A J3 (eg, Alzheimer's disease, Down's syndrome, etc.).
  • a j3 1—40 and A j3 1—4 2 are produced by excising from its precursor protein APP (Amyloid Precursor Protein) with secretase and ⁇ -secretase.
  • Drugs that inhibit these enzymes inhibit the production and secretion of A] 3, especially diseases that are genetically caused by A] 3, such as familial Alzheimer's disease (F AD) (eg, Alzheimer's disease (AD) Basic prevention / treatment effects for patients with high protein in the brain, such as those who are highly likely to suffer from Down syndrome, etc., and patients who have increased protein in the brain due to trauma, etc. It is thought that can be demonstrated.
  • F AD familial Alzheimer's disease
  • Basic prevention / treatment effects for patients with high protein in the brain such as those who are highly likely to suffer from Down syndrome, etc., and patients who have increased protein in the brain due to trauma, etc. It is thought that can be demonstrated.
  • BACE 1 is a one-time transmembrane protein consisting of 501 amino acids, typical of two aspartic acids active outside the cell (the lumen side in the endoplasmic reticulum 'Golgi'). Aspartic protease. Later, it was proved that BACE 1 knockout mice had completely lost ⁇ ] 3 production, indicating that BACE 1 is a / 3 secretase itself.
  • a secretase inhibitor is a ⁇ -secretase inhibitor (y-secretase is an immune agent other than APP).
  • y-secretase is an immune agent other than APP.
  • Notch 1 involved in cell differentiation is also cleaved, but it is known that immune disorder will occur if inhibition of Notch 1 is inhibited.) Expected to be a safer AD treatment with fewer side effects Is done.
  • Non-Patent Document 1 Since secretase is an aspartic protease, peptidic inhibitors with statin, hydroxyethylene, and hydroxyethylcarbonyl structures that can function as transition state mimics have been developed (reviewed in Non-Patent Document 1). . However, peptidic inhibitors have problems in pharmacokinetics and intracerebral transfer efficiency ', and in many cases, high concentrations are required for in vivo efficacy.
  • Non-peptide low-molecular-weight inhibitors can not only overcome the above-mentioned problems but also find new inhibitory action points. Such low molecular weight compounds have been gradually developed (Patent Documents 1 to 3). For example, computer simulations suggest the possibility of acting directly on the active center of 3 secretase (Patent Document 2). There is a suggestion that the processing of APP may be shifted from ⁇ -secretase cleavage to ⁇ -secretase cleavage (Patent Document 3). In addition, green tea strength textiles have been reported to inhibit the
  • screening methods for secretase inhibitors include, for example, patent literature 1 describes a method for detecting the cleavage activity by a recombinant human / 3-secretase protein using a peptide labeled with a fluorescent donor and labeled with a fluorescent quencher as a substrate.
  • Patent Documents 4 and 5 describe a method for identifying an inhibitor of A ⁇ production using an indicator of changes in the amount of soluble A ⁇ produced using a] 3-amyloid 'peptide () 3 ⁇ ) production cell line.
  • Patent Document 6 describes a method for screening a j3 secretase inhibitor using as an index the binding of a secretase to the active site.
  • Patent Document 1 International Publication No. 01Z87293 pamphlet
  • Patent Document 2 International Publication No. 02Z88 101 Pamphlet
  • Patent Document 3 International Publication No. 02/96897 pamphlet
  • Patent Document 4 International Publication No. 94Z10569 Pamphlet
  • Patent Document 5 Japanese Patent Laid-Open No. 7-165606
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 2003- 26 1 596
  • Non-Patent Document 1 Varghese J. et al., Journal of “Medical” Chemistry, Vol. 46, No. 22, pp. 4625—4630 (2003) )
  • Non-Patent Document 2 Jeon SY et al., Bioorganic 'Medi Power Nore' Chemistry 'Letters (Bioorg. Med. Chera. Lett.), XIII, ⁇ . 3905-3908 (2003) Disclosure of Invention ⁇
  • an object of the present invention is to provide a screening method for a secretase inhibitor that acts on a novel inhibitory site, and thus acts on the inhibitory site. It is to provide a compound having an excellent secretase inhibitory action and thus an excellent AD prevention / treatment activity.
  • the present inventor made various mutant proteins in which the transmembrane region was gradually deleted from the C-terminal side of the J3 secretase protein using genetic engineering techniques, and the ⁇ -secretase protein to which these compounds bind Using the secretase protein that retains the binding site and the J3 secretase protein lacking the binding site, the binding of the test compound to them and the enzyme inhibitory activity are successfully determined.
  • a screening system capable of detection was constructed to complete the present invention.
  • a transmembrane protein characterized by using a protein having a part or all of the amino acid sequence of the enzyme, including a region containing the active center of the transmembrane enzyme and part or all of the transmembrane region.
  • a protein having a part of the amino acid sequence of a transmembrane enzyme which contains a region containing an active center and lacks a part or all of the transmembrane region, and binds each test substance to each protein and each Measuring the enzyme activity of a protein,
  • the region containing the active center of secretase has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by amino acid numbers 46 to 454 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
  • the transmembrane region of the enzyme has the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by amino acid numbers 455-480 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2, 6] described method;
  • [8] It has an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by amino acid numbers 46 to 454 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 as a region containing the active center, The method according to [7] above, wherein a protein having the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by amino acid numbers 466 to 471 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 is used as a part;
  • a kit for screening for an enzyme inhibitor that specifically binds to a transmembrane region of a transmembrane enzyme comprising the following (a) and (b):
  • a protein having a part or all of the amino acid sequence of the enzyme comprising a region containing the active center of the transmembrane enzyme and a part or all of the transmembrane region
  • [10] / 3 secretase selective inhibitor comprising the enzyme inhibitor that binds to the transmembrane region of / 3 secretase (excluding compounds represented by the following structural formula);
  • the ⁇ -secretase binding site of the inhibitor is present in the amino acid sequence represented by amino acid numbers 466 to 471 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
  • the secretase binding site of the inhibitor is present in the amino acid sequence represented by amino acid numbers 466 to 471 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
  • the inhibitory substance] 3 secretase-binding site is present in the amino acid sequence represented by amino acid numbers 466 to 471 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2,
  • the screening method or screening kit of the present invention can select a compound that inhibits J3 secretase activity by binding to the transmembrane region, it can be used as a transition state mimic, an inhibitor that acts on other active centers, etc.
  • ] 3 secretase acts selectively and has the advantageous effect of selecting compounds that do not inhibit other aspartate proteases.
  • Figure 1 shows a line-aver-bark plot that analyzes the mode of inhibition of compound D against BACE 1-501.
  • the concentrations of Compound D are: ⁇ : 30 ⁇ , ⁇ : 10 AtM, ⁇ : 0 // M.
  • Figure 2 shows the surface plasmon resonance showing binding of BACE 1-501 and Compound J Shi Gunaru (Resonance Unit) n BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the screening method for the enzyme inhibitor that specifically binds to the transmembrane region of the transmembrane enzyme of the present invention is a transmembrane enzyme.
  • the enzyme that can be used for the screening method of the present invention is not particularly limited as long as it contains a transmembrane region.
  • Any enzyme belonging to Type I or Type II single transmembrane protein eg, J3 secretase, Multiple membrane metabolite protease, TNF a converting enzyme, Meltrin, Kuzvanian, CD 3 8, GM 3 synthase, placental leucine aminopeptidase, etc.), 7 transmembrane receptor (7 TM R), etc.
  • Any enzyme belonging to the transmembrane protein eg, presenilin (PS), N AD H-quinone oxidoreductase, cytochrome C oxidoreductase, etc.
  • a protease eg, aspartic protease, serine proteare
  • it is a type I I transmembrane type aspartic protease] 3 secretase.
  • the “region containing the active center of a transmembrane enzyme” means a region containing the active amino acid and containing a partial amino acid sequence of the enzyme sufficient to express the enzyme activity.
  • the position of the region on the sequence is not limited, and the region may be located in any of the N-terminal region, internal sequence, and C-terminal region of the enzyme protein. Further, it may be either extracellular (in the case of endoplasmic reticulum or Golgi apparatus), cytoplasmic side, or transmembrane region (however, different from the binding site of the enzyme inhibitor).
  • the “region including the active center” may be the entire region in which the active center exists.
  • the three-dimensional structure of the enzyme has been clarified by X-ray crystal structure analysis or the like, it is possible to use only the minimum part necessary for the expression of the enzyme activity in the region where the active center exists.
  • Part or all of the transmembrane region means that the target compound has at least the target binding site.
  • the binding site can be arbitrarily set within the transmembrane region, but when the active center of a transmembrane enzyme is present in the transmembrane region, the binding site is a membrane other than the site where the active center exists. Selected from the penetration area.
  • the 3 secretase protein in the present invention is a protein containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence shown by amino acid numbers 46 to 51 in the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2. is there.
  • j3 secretase protein is a warm-blooded animal (eg, human, mouse, rat, monoremot, hamster, usagi, hidge, goat, pig, sushi, horse, bird, cat, din, monkey, chimpanzee, etc.)
  • Cells eg, spleen cells, neurons, glial cells, knees] 3 cells, bone marrow cells, mesangium cells, Langerhans cells, epidermal cells, epidermal cells, goblet cells, endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, Fibrocytes, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils, monocytes), megakaryocytes, synovium Cells, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells of these cells, stem
  • the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is substantially the same as the amino acid sequence shown in amino acid Nos. 4-6 to 51, the amino acid number in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 4 to 5 0 1 and about 70% or more, preferably about 80% or more, more preferably about 90% or more, particularly preferably about 95% or more, most preferably about 9 8% or more.
  • An amino acid sequence having at least% homology means an optimal alignment when two amino acid sequences are aligned using a mathematical algorithm known in the art (preferably, the algorithm is used for optimal alignment).
  • Similar amino acids means amino acids that are similar in physicochemical properties, such as aromatic amino acids (Phe, Trp, Tyr), aliphatic amino acids (Ala, Leu, Ile, Val), polar amino acids (Gln, Asn) ), Basic amino acids (Lys, Arg, His), acidic amino acids (Glu, Asp), amino acids with hydroxyl groups (Ser, Thr), amino acids with small side chains (Gly, Ala, Ser, Thr, Met) ) And other amino acids that fall into the same group.
  • the homology of amino acid sequences in this specification is based on the homology calculation algorithm NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local
  • the “substantially identical amino acid sequence” means about 70% or more, preferably about 8%, of the amino acid sequence represented by amino acid numbers 4 6-5 0 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 the amino acid sequence represented by amino acid numbers 4 6 to 5 0 1 "a protein containing substantially the same amino acid sequence" refers to SEQ ID NO: 2 An amino acid sequence substantially the same as the amino acid sequence represented by amino acid numbers 46 to 51 in the amino acid sequence shown, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 A protein having substantially the same activity as a protein containing the amino acid sequence shown.
  • “Substantially equivalent activity” means (1)] 3 secretase activity (ie,?
  • Binding activity with a compound that binds to the transmembrane region and exhibits J3 secretase inhibitory activity Binding activity with a compound that binds to the transmembrane region and exhibits J3 secretase inhibitory activity. “Substantially homogeneous” means that their activities are qualitatively (qualitatively) similar. Therefore, it is preferable that the J3 secretase activity and the binding activity to the inhibitor are equivalent, but quantitative factors such as the degree of these activities and the molecular weight of the protein may be different (for example, the activity About 0.1 to about 100 times, preferably about 0.1 to about 10 times, more preferably about 0.5 to about 2 times).
  • Measurement of j3 secretase activity is carried out by a known method, for example, by reacting a synthetic substrate peptide containing the same or substantially the same amino acid sequence as APP or its site recognized by J3 secretase with j3 secretase protein, and cleaving it. Or a synthetic substrate containing a fluorescent substance and a quenching substance as described in Patent Document 1 above] and a secretase protein are reacted with each other, and the fluorescent substance is obtained by enzymatic cleavage.
  • the present invention is not limited to these methods by measuring fluorescence generated by separating the quencher and the quenching substance.
  • the binding activity with an inhibitory substance can be measured by using surface plasmon resonance (SPR) or the like as shown in Examples below.
  • the secretase used in the present invention includes, for example, (1) one or more of the amino acid sequences represented by amino acid numbers 46 to 51 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (for example, 1 An amino acid sequence from which about ⁇ 50, preferably about 1 to 30, more preferably about 1 to 10 and even more preferably 1 to 5 amino acids have been deleted; (2) SEQ ID NO: 1 or 2 or more (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30 and more preferably 1 to 1) in the amino acid sequence represented by amino acid numbers 46 to 50 in the amino acid sequence shown in 2 About 0, more preferably 1 to 5 amino acid sequences added, (3) 1 or 2 in the amino acid sequence represented by amino acid numbers 4 6 to 5 0 1 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 Or more (for example, about 1 to 50, preferably about 1 to 30 and more preferably Clause 1 to 1 0 or so, More preferably, 1 to 5 amino acid sequences are inserted, (4) in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 in the
  • the deletion site is at least a site other than the amino acid sequence represented by amino acid numbers 4 6 6 to 4 71 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2. And preferably a site other than the amino acid sequence represented by amino acid numbers 4 5 5 to 4 80.
  • the insertion or substitution site is amino acid numbers 4 6 6 to 4 7 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • a site other than the amino acid sequence shown by 1 preferably a site other than the amino acid sequence shown by amino acid numbers 4 5 5 to 4 80, or even if it is the site, its insertion or substitution
  • the activity of the site should not be qualitatively affected.
  • 3 Secretase is a one-transmembrane aspartic protease that contains an active center in the extracellular (or lumenal) region. More specifically, for example, in the human] 3 secretase represented by SEQ ID NO: 2, the amino acid sequence represented by amino acid numbers 46-6501 is mature] is the amino acid sequence of the 3 secretase protein ( ⁇ -section The retase is produced as a pre-mouth enzyme, and during the secretion process, the signal peptide consisting of the amino acid sequence shown by amino acid numbers 1-21 and the propeptide consisting of the amino acid sequence shown by amino acid numbers 22-45 are cleaved.
  • the extracellular (lumen) region has amino acid numbers 45 to 45
  • the transmembrane region has amino acid numbers 45 to 45
  • the cytoplasmic region has amino acids. It consists of an amino acid sequence represented by the numbers 4 8 1 to 5 0 1, respectively.
  • the consensus motif (D-T / S-G-T / S) for the active center in the extracellular (luminal) region is amino acid number 9 3-9 6 (DTGS) and amino acid number 2 8 9-2 9 2 (DSGT ). Therefore, the “region containing the active center” of / 3 secretase is, for example, an amino acid that is identical or substantially identical to the amino acid sequence represented by amino acid numbers 93 to 29 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • regions containing sequences include regions containing sequences.
  • substantially identical amino acid sequence has the same meaning as described above, and “region containing substantially the same amino acid sequence” includes substantially the same amino acid sequence, and has a secretase activity. It is an area to have.
  • the region containing the active center of ⁇ -secretase is the entire extracellular (lumen) region (that is, the same or substantially the same as the amino acid sequence represented by amino acid numbers 46 to 45 4 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2).
  • a sequence containing a pro-sequence or pre-mouth sequence at the terminus that is, amino acid numbers 2 2 to 45 4 4 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or The amino acid sequence represented by 1 to 45 4 may be the same or substantially the same amino acid sequence.
  • any partial partition sequence of amino acid sequences represented by amino acid numbers 4 5 5 to 4 80 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 (for example, There is no particular limitation as long as it is the same or substantially the same amino acid sequence as that of about 3 to 20 amino acids, preferably about 5 to 10 amino acids in succession. Examples include the same or substantially the same amino acid sequence as the amino acid sequence represented by the numbers 4 6 6 to 4 7 1.
  • substantially the same amino acid sequence means 1 to several amino acid sequences in the amino acid sequence represented by amino acid numbers 4 5 5 to 4 80 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
  • amino acid sequence in which an amino acid is substituted, deleted, inserted or added, and the binding ability of the partial partition sequence to a compound having 3 secretase inhibitory activity does not change at least qualitatively.
  • amino acid mutation can be achieved by the above-mentioned conservative amino acid substitution and the like.
  • amino acids that are similar in hydrophobicity More substitution is considered preferable, but is not limited thereto.
  • the secretase used in the screening method of the present invention is not particularly limited as long as it contains the “region containing the active center” on the N-terminal side and “part or all of the transmembrane region” on the C-terminal side.
  • a cytoplasmic region sequence may or may not be included on the C-terminal side of part or all of the transmembrane region.
  • the proteins and peptides described herein are N-terminal (amino terminal) at the left end and C-terminal (forced loxyl terminal) at the right end in accordance with the 'I poor example of peptide description.
  • the C-terminus is either a carboxyl group (-COOH), a carboxylate (one COO—), an amide (one CONH 2 ) or an ester (one COOR). There may be.
  • R in the ester e.g., methyl, Echiru, n- propyl, isopropyl, C i, such as n- butyl - 6 alkyl group; for example, C 3 cyclopentylene Honoré, cyclohexane, etc.
  • cyclohexyl - 8 cycloalkyl group
  • phenyl, ⁇ -naphthyl and the like C 6 -J 2 aryl group; for example, benzyl, phenethyl and other phenyl- 2- alkyl groups; ⁇ -naphthylmethyl and the like ⁇ -naphthyl mono C- 2 alkyl.
  • C 7 such as the group! 4- aralkyl group; bivalyloxymethyl group and the like are used.
  • the transmembrane enzyme of the present invention includes those in which a strong lpoxyl group is amidated or esterified.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • amino acid residues e.g., Mechionin residues
  • N-terminal Amino group protecting groups e.g., formyl group, Flip E such _ 6 Arukanoi Le such Asechiru group - 6 Ashiru group , Etc.
  • N-terminal glutamine residue produced by cleavage in the body is pyroglutamine oxidized
  • Substituents on the side chain of amino acid in the molecule eg —OH, — SH , Amino group, imidazole group, in Dole group, etc.
  • Guanijino group appropriate protecting groups (e.g., formyl group, shall be protected by such C i 6 Ashiru group such as C 6 Al force Noiru group such Asechiru group), or a sugar chain is bound It also includes complex proteins such as so-called glycoproteins.
  • the partial peptide of the transmembrane enzyme used in the present invention has a partial amino acid sequence of the above-mentioned transmembrane enzyme (that is, the sequence of the region including the active center and the partial or entire sequence of the transmembrane region). And a peptide having substantially the same activity as a transmembrane enzyme.
  • “substantially the same quality of activity” has the same meaning as described above.
  • “substantially the same quality of activity” can be measured in the same manner as described above.
  • the partial peptide is hereinafter referred to as “inhibitor binding peptide”.
  • the inhibitor-binding peptide is not particularly limited as long as it has the above properties.
  • it lacks a partial amino acid sequence that does not affect the enzyme activity in the extracellular (lumen) region. And those lacking a partial amino acid sequence other than the target binding site in the transmembrane region, and those lacking part or all of the cytoplasmic region.
  • a partial peptide of a transmembrane enzyme which is (1) a region that contains an active center, and (2) a portion of the transmembrane region that lacks the binding site targeted by the target enzyme inhibitor Peptide retains enzyme activity but does not have binding activity to the target enzyme inhibitor, so it binds even if it is brought into contact with a compound that specifically binds to the target binding site and exhibits enzyme inhibitory activity. And enzyme activity is not inhibited.
  • the partial peptide is hereinafter referred to as “inhibitor non-binding peptide”.
  • Partial peptides of transmembrane enzymes is, C-terminal, a carboxyl group (one COOH), carbo Kishireto (one COO _), Ami de (one CONH 2) or an ester (one COO R).
  • R in the ester include those described above for the transmembrane enzyme.
  • these peptides have a strong lpoxyl group (or carboxylate) other than the C-terminal, those in which the carboxyl group is amidated or esterified are also included in the partial peptide of the present invention.
  • the ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • the N-terminal methionine residue is protected with a protecting group, and the N-terminal side is cleaved in vivo to produce G
  • a protecting group examples include those obtained by pyroglutamine oxidation of ln, those in which the substituent on the side chain of the amino acid in the molecule is protected with an appropriate protecting group, or complex peptides such as so-called glycopeptides to which sugar chains are bound.
  • Examples of the salt of the transmembrane enzyme or its partial peptide include physiologically acceptable salts with acids or bases, and physiologically acceptable acid addition salts are particularly preferred.
  • Examples of such salts include salts with inorganic acids (eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid), or organic acids (eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, cono , Succinic acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, succinic acid, benzoic acid, methane sulfonic acid, benzene sulfonic acid) and the like.
  • inorganic acids eg, hydrochloric acid, phosphoric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid
  • organic acids eg, acetic acid, formic acid, propionic acid, fumaric acid, maleic acid, cono , Succinic acid, tartaric acid, succinic acid, malic acid, succinic
  • the transmembrane enzyme or a salt thereof can be prepared from a warm-blooded animal cell or tissue by the known method for purifying a protein as described above for the i3 secretase as an example. Specifically, tissue or cells of warm-blooded animals are homogenized and the soluble fraction is separated and purified by chromatography such as reverse phase chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. Type enzyme or a salt thereof can be produced.
  • the transmembrane enzyme or its partial peptide can also be produced according to a known peptide synthesis method.
  • the peptide synthesis method may be, for example, either a solid phase synthesis method or a liquid phase synthesis method. If the partial peptide or amino acid capable of constituting the transmembrane enzyme is condensed with the remaining part, and the product has a protecting group, the target protein can be produced by removing the protecting group.
  • condensation and the removal of the protecting group are carried out according to a method known per se, for example, the method described in the following (1) to (5).
  • the transmembrane enzyme or partial peptide thereof thus obtained can be isolated and purified by a known purification method.
  • the purification method include solvent extraction, distillation, column chromatography, liquid chromatography, recrystallization, and a combination thereof.
  • the transmembrane enzyme or its partial peptide obtained by the above method is a free form
  • the free form can be converted into an appropriate salt by a known method or a method analogous thereto, and conversely, a transmembrane form.
  • the enzyme or its partial peptide is obtained as a salt
  • the salt can be converted into a free form or other salt by a known method or a method analogous thereto.
  • a commercially available protein synthesis resin can be used.
  • resins include chloromethyl resin, hydroxymethyl resin, benzhydrylamine resin, aminomethyl resin, 4-benzyloxybenzyl alcohol resin, 4-methylbenzhydrylamine resin, PAM resin, 4-hydroxymethylmethyl phenylacetamide methyl resin, polyacrylamide resin, 4 (2, 4, 4-dimethoxyphenyl, hydroxymethyl) phenoxy resin, 4- (2,, 4'-dioxyphenoxy Fmoc aminoethyl) phenoxy resin.
  • an amino acid in which the x-amino group and the side chain functional group are appropriately protected is condensed on the resin according to various known condensation methods according to the sequence of the target protein or peptide.
  • the protein (peptide) is cut out from the resin, and at the same time, various protecting groups are removed, and the intramolecular disulfide bond formation reaction is performed in a highly diluted solution to obtain the target protein (peptide) or its amide. To do.
  • calpositimides are particularly preferable.
  • the carpositimides include DCC, N, N′-diisopropyl carpositimide, N-ethyl-N ′-(3-dimethylaminoprolyl) carpositimide, and the like.
  • a protected amino acid is added directly to the resin together with a racemization inhibitor (eg, HOB t, HOOB t), or in advance as a symmetric anhydride, HOB t ester or HOOB t ester. It can be added to the resin after activation of the protected amino acid.
  • the solvent used for the activation of the protected amino acid and the condensation with the resin can be appropriately selected from solvents known to be usable for the protein condensation reaction.
  • acid amides such as N, N-dimethylformamide, N, N-dimethylacetamide, N-methylpyrrolidone, halogenated hydrocarbons such as methylene chloride, black mouth form, trifluor Alcohols such as roethanol, sulfoxides such as dimethyl sulfoxide, amines such as pyridine, ethers such as dioxane and tetrahydrofuran, nitriles such as acetonitrile and propionitryl, esters such as methyl acetate and ethyl acetate Or an appropriate mixture thereof.
  • the reaction temperature is appropriately selected from a range known to be usable for protein bond formation reaction. Usually, it is appropriately selected from the range of about 120 ° C to 50 ° C.
  • the activated amino acid derivative is usually used in an excess of 1.5 to 4 times. As a result of tests using the ninhydrin reaction, if the condensation is insufficient, sufficient condensation can be achieved by repeating the condensation reaction without removing the protecting group. If sufficient condensation is not obtained even after repeating the reaction, the unreacted amino acid can be acetylated using acetic anhydride or acetyl imidazole.
  • the protection of the functional groups that should not be involved in the reaction of the raw material and the protective groups used, the removal of the protective groups, and the activation of the functional groups involved in the reaction are appropriately selected from known groups or known means. sell.
  • protecting groups for the starting amino groups include Z, B oc, tertiary pentyloxycarbonyl, isobornoxy sulfonyl, 4-methoxybenzyloxycarbonyl, C 1 _Z, Br-Z, Examples thereof include adamantyloxycarbonyl, trif-noroleoloacetinole, phthaloidore, honoreminole, 2-nitrophenenolesnorefeninore, diphenylphosphinooil, and Fmoc.
  • Forced loxyl groups are, for example, alkyl esterified (eg, methyl, ethyl, propinole, butinole, tertiary petitnore, cyclopentinole, cyclohexyl / re, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • alkyl esterified eg, methyl, ethyl, propinole, butinole, tertiary petitnore, cyclopentinole, cyclohexyl / re, cycloheptyl, cyclooctyl, 2-adamantyl, etc.
  • Branched or cyclic alkyl esterification branched or cyclic alkyl esterification
  • aralkyl ester eg, benzyl ester, 4-nitrobenzeno estenole, 4-methoxy benzeno estenole, 4-chloro mouth It can be protected by benzyl ester, benzhydryl esterification), phenacyl esterification, benzyloxycarbonyl hydrazide, tertiary butoxycarbonyl hydrazide, tritinolehydrazide and the like.
  • the hydroxyl group of serine can be protected by, for example, ester or ether.
  • the group suitable for esterification include a lower alkanoyl group such as an acetyl group, an aroyl group such as a benzoyl group, a group derived from carbonic acid such as a benzyloxycarbonyl group and an ethoxycarbonyl group. Also, ,
  • groups suitable for etherification include benzyl group, tetrahydrobiranyl group, and t-butyl group.
  • protecting groups for Fuenonore hydroxyl group of tyrosine for example, B z 1, C 1 2 - B zl, 2- nitrobenzyl, B r- Z, such as tertiary heptyl is used.
  • protecting groups for histidine imidazole include Tos, 4-methoxy-2,3,6-trimethinorebenzenesulfonyl, DNP, benzyloxymethinole, Bum, Boc, Trt, Fmoc, etc. Used.
  • Examples of methods for removing (eliminating) protecting groups include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, and anhydrous hydrogen fluoride and methanesulfonic acid.
  • a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon
  • anhydrous hydrogen fluoride and methanesulfonic acid include catalytic reduction in a hydrogen stream in the presence of a catalyst such as Pd-black or Pd-carbon, and anhydrous hydrogen fluoride and methanesulfonic acid.
  • Acid treatment with trifluoromethanesulfonic acid, trifluoroacetic acid or a mixture thereof, base treatment with diisopropylethylamine, triethylamine, piperidine, piperazine, etc., or sodium in liquid ammonia Reduction is also used.
  • the elimination reaction by the acid treatment is performed at a temperature of about 120 ° C. to 40 ° C.
  • Examples of the activated carboxyl group of the raw material include, for example, the corresponding acid anhydride, azide, active ester [anolechol (for example, pentachlorophenol, 2,4,5-trichlorodiphenol, 2,4-dinitrophenol) , Cyanomethyl alcohol, paranitrophenol, HONB, N—hydroxysuccinimide, N— Hydroxyphthalimide, ester with HOB t)] and the like are used.
  • the corresponding phosphoric acid amide is used as the activated amino group of the raw material.
  • an amide form of a protein for example, first, the ⁇ -carboxyl group of each C-terminal amino acid of the partial peptide constituting the protein (peptide) is protected by amidation, and the amino group side is protected. After extending the peptide chain to the desired chain length (the amino acid to be linked to the C-terminal amino acid of the adjacent partial peptide), only the protecting group for the a-amino group of the ⁇ -terminal amino acid of the C-terminal peptide chain is removed.
  • Examples include a method of producing a peptide and a peptide excluding only the protecting group of the carboxyl group of the C-terminal amino acid of the ⁇ -terminal peptide chain, and condensing these peptides in a mixed solvent as described above.
  • the details of the condensation reaction are the same as described above.
  • the desired crude protein obtained by the condensation
  • This crude protein can be purified using various known purification means, and the main fraction can be freeze-dried to obtain an amide form of the desired protein (peptide).
  • An ester form of a protein can be obtained, for example, by condensing the Q! -Carboxyl group of the C-terminal amino acid with a desired alcohol to form an amino acid ester, and then treating it in the same manner as in the case of the above-mentioned amide form. be able to.
  • the partial peptide of the present invention or a salt thereof can also be produced by cleaving a transmembrane enzyme or a salt thereof with an appropriate peptidase.
  • a transmembrane enzyme or a partial peptide thereof is produced by culturing a transformant containing a nucleic acid encoding it, and separating and purifying the transmembrane enzyme or a partial peptide from the resulting culture. You can also.
  • the nucleic acid encoding the transmembrane enzyme or its partial peptide may be DNA or RNA, or may be DNA / RNA chimera. Preferably, DNA is used.
  • the nucleic acid may be double-stranded or single-stranded. Yes.
  • double-stranded DNA, double-stranded DNA, double-stranded RNA, or DNA: RNA hybrid may be used.
  • a single strand it may be a sense strand (that is, a coded strand) or an antisense strand (that is, a non-coded strand).
  • DNA encoding a transmembrane enzyme or its partial peptide examples include genomic DNA, warm-blooded animals (eg, human, mouse, rat, guinea pig, hamster, usagi, hidge, goat, peta, tussi, All cells of horses, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.
  • warm-blooded animals eg, human, mouse, rat, guinea pig, hamster, usagi, hidge, goat, peta, tussi, All cells of horses, birds, cats, dogs, monkeys, chimpanzees, etc.
  • spleen cells neurons, glia cells, knee j3 cells, bone marrow cells, mesangium cells, Langerhans cells, epidermis cells, epithelial cells , Endothelial cells, fibroblasts, fibrocytes, muscle cells, fat cells, immune cells (eg, macrophages, T cells, B cells, natural killer cells, mast cells, neutrophils, basophils, eosinophils Monocytes), megakaryocytes, synoviocytes, chondrocytes, bone cells, osteoblasts, osteoclasts, breast cells, hepatocytes or stromal cells, or precursor cells of these cells , Stem cells, cancer cells, and blood cells], or any tissue in which those cells exist [eg, brain, brain regions (eg, olfactory bulb, skull nucleus, basal sphere, hippocampus, thalamus) , Hypothalamus, hypothalamic nucleus, cerebral cortex, medulla, cerebellum
  • brain brain
  • genomic DNA and cDNA encoding a transmembrane enzyme or its partial peptide use the genomic DNA fraction prepared from the cells / tissues described above and the total RNA or mRNA fraction as a cage, respectively.
  • Polymerase Chain Reaction (Hereinafter abbreviated as “PCR method”) and Reverse Transcriptase-PCR (hereinafter abbreviated as “RT-PCR method”).
  • genomic DNA and cDNA encoding a transmembrane enzyme or its partial peptide are genomic DNA and total RNA or mRNA fragments prepared from the cells and tissues described above. It can also be cloned from a genomic DNA library and cDNA library prepared by inserting into an appropriate vector by colony or plaque hybridization or PCR.
  • the vector used for the library may be any of pacteriophage, plasmid, cosmid, phagemid and the like.
  • the DNA encoding i3 secretase is, for example, a DNA containing the base sequence represented by base numbers 1 3 6 to 1 5 0 3 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1,
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 contains a complementary strand sequence of the base sequence shown in base numbers 1 3 6 to 1 50 3 and a base sequence that hybridizes under high stringency conditions, and the sequence described above Activity substantially the same as a protein containing the amino acid sequence shown in amino acid Nos. 46-501 in the amino acid sequence shown in No. 2 (that is, 3 secretase activity and a secretase inhibitor at the target binding site) DNA encoding a protein having a binding activity of
  • Examples of DNA that can hybridize under high stringency conditions with the complementary strand sequence of the base sequence represented by base numbers 1 3 6 to 15 50 3 in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 include, for example, SEQ ID NO: 1. About 60% or more, preferably about 70% or more, more preferably about 80% or more, and particularly preferably about 90% of the nucleotide sequence represented by base numbers 1 3 6 to 1 5 0 3 in the indicated base sequence DNA containing a base sequence having a homology of at least% is used.
  • NCBI BLAST National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool
  • Hypridation is a method known per se or a method similar thereto, such as the method described in Molecular Cloning 2nd edition (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989). It can be done according to In addition, when using a commercially available library, high-prisition can be performed according to the method described in the attached instruction manual. Preferably, the hybridization can be carried out according to high stringency conditions.
  • High stringent conditions include, for example, a sodium salt concentration of about 19 to about 40 mM, preferably about 19 to about 20 mM, and a temperature of about 50 to about 70 ° C., preferably Examples include conditions of about 60 to about 65 ° C. In particular, it is preferable that the sodium salt concentration is about 19 mM and the temperature is about 65 ° C.
  • the salt concentration of the hybridization solution the temperature of the hybridization reaction, the probe concentration, the length of the probe, the number of mismatches, the time of the hybridization reaction, the salt concentration of the washing solution, and the washing. By appropriately changing the temperature, etc., the desired stringency can be easily adjusted.
  • the DNA encoding 13 secretase is preferably human J3 secretase DNA containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or an allelic variant thereof, or other warm-blooded animals (eg, mouse, rat, guinea pig, Such as orthologs in hamsters, usagis, sheeps, goats, peta, sushi, horses, birds, cats, nu, monkeys, chimpanzees, etc.
  • warm-blooded animals eg, mouse, rat, guinea pig, Such as orthologs in hamsters, usagis, sheeps, goats, peta, sushi, horses, birds, cats, nu, monkeys, chimpanzees, etc.
  • the DNA encoding the inhibitor-binding peptide includes a base sequence encoding a region containing the active center of the transmembrane enzyme and a base sequence encoding part or all of the transmembrane region. Anything can be used.
  • the DNA encoding the non-inhibitor-binding peptide contains a base sequence that encodes a region containing the active center of the transmembrane enzyme, and contains the above “part or all of the transmembrane region”. Anything may be used as long as it does not contain the base sequence to be encoded.
  • These DNs A may be any of genomic DNA, cDNA derived from the cell's tissue described above, and synthetic DNA.
  • the transmembrane enzyme is] 3 secretase
  • the DNA encoding the inhibitor-binding peptide for example,
  • a DNA that encodes a peptide having no activity of binding to an enzyme inhibitor at the target binding site in the transmembrane region is used.
  • Examples of the DNA that can be hybridized with the DNA of (la) or (lb) under highly stringent conditions include, for example, about 60% or more, preferably about 70% or more, of the corresponding portion in the nucleotide sequence of the DNA. More preferably, DNA containing a base sequence having a homology of about 80% or more, particularly preferably about 90% or more is used.
  • DNA encoding the transmembrane enzyme or its partial peptide is amplified by PCR using a synthetic DNA primer having a part of the base sequence encoding the protein or peptide, or an appropriate expression vector.
  • the DNA incorporated into the DNA can be cloned by hybridization with a DNA fragment that encodes a part or all of the protein of the present invention or a DNA labeled with synthetic DNA. The determination can be performed, for example, according to the method described in Molecular Cloning, Second Edition (described above), etc. When using a commercially available library, This can be done according to the method described in the instruction manual attached to the rally.
  • the nucleotide sequence of DNA is determined using known kits such as Mutan TM -super Express Km (Takara Shuzo Co., Ltd.), Mutan TM -K (Takara Shuzo Co., Ltd.), etc., using the ODA-LA PCR method, Gapped duplex
  • the method can be converted according to a method known per se, such as the Kunkel method or the like, or a method analogous thereto.
  • the cloned DNA can be used as it is depending on the purpose, or after digestion with a restriction enzyme, if desired, or after adding a linker.
  • the DNA may have ATG as a translation initiation codon on the 5 ′ end side, and may have TAA, TGA, or TAG as a translation termination codon on the third end side. These translation initiation codon and translation termination codon can be added using an appropriate synthetic DNA adapter.
  • the protein or peptide can be produced by transforming a host with an expression vector containing DNA encoding the above transmembrane enzyme or a partial peptide thereof, and culturing the resulting transformant. .
  • An expression vector containing a DNA encoding a transmembrane enzyme or a partial peptide thereof is, for example, excising a target DNA fragment from the DNA encoding a transmembrane enzyme and using the DNA fragment as a promoter in an appropriate expression vector. It can be manufactured by connecting downstream.
  • Expression vectors include plasmids derived from E.
  • coli eg, pBR 322, p BR 325, pUC 12, pUC 13
  • plasmids derived from Bacillus subtilis eg, ⁇ p UB 110, p TP 5, p C 194
  • Yeast-derived plasmids eg, p SH19, p SH 15
  • pacteriophages such as ⁇ phage
  • animal winores such as retrovirus, vaccinia inoless, baculoinores; ⁇ -11, XT 1, R c / CMV pRcZRSV, p cDNAI Neo, etc. are used.
  • the promoter may be any promoter as long as it is appropriate for the host used for gene expression.
  • SR promoter when the host is an animal cell, SR promoter, SV40 promoter, LTR promoter, CMV (cytomegalovirus) promoter, H SV-TK promoter, etc. are used. Of these, CMV promoter, S R ⁇ promoter and the like are preferable.
  • trp promoter When the host is Eshierihia genus, trp promoter, lac promoter one, re cA promoter,; i P L promoter, lpp promoter, such as the T7-flop opening motor is preferred.
  • an SPOL promoter When the host is a bacterium belonging to the genus Bacillus, an SPOL promoter, an SPO2 promoter, a penP promoter, and the like are preferable.
  • the PHO 5 promoter, PGK promoter, GAP promoter, ADH promoter and the like are preferable.
  • polyhedrin promoter When the host is an insect cell, polyhedrin promoter, P10 promoter and the like are preferable.
  • SV40 ori SV40 replication origin
  • selectable markers include dihydrofolate reductase (hereinafter sometimes abbreviated as dhfr) gene [methotrexate (MTX) resistance], ampi Syrin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Amp r ), neomycin resistance gene (hereinafter sometimes abbreviated as Neo r , G418 resistance) and the like.
  • dhfr gene-deficient Chinese hamster cells are used and the dhfr gene is used as a selection marker
  • the target gene can be selected using a medium not containing thymidine.
  • nucleotide sequence (signal codon) encoding a signal sequence that matches the host to the 5 'end of the DNA encoding the transmembrane enzyme or its partial peptide, or use a native signal. It may be replaced with a sequence (or pre-mouth sequence).
  • the host is Escherichia, PhoA 'signal sequence, OmpA signal sequence, etc .;
  • the host is Bacillus, amylase signal sequence, subtilisin signal sequence, etc .
  • insulin signal sequence, a-interferon 'signal sequence, antibody molecule ⁇ signal sequence, etc. are used.
  • hosts examples include Escherichia, Bacillus, yeast, insect cells, insects, and animal cells.
  • Escherichia examples include Escherichia coli K 12 ⁇ DH 1 [Proc. Acad. Sci. USA), 60 ⁇ , 160 (.1 968)], JM103 [Nucleic Acids Research, 9 ⁇ , 309 (198 1)], JA 221 [Journal-Op- Molecular ⁇ Neology (Journal of Molecular Biology), 120 ⁇ , 517 (1978)], HB 101 [Journal 'Molecular-Biology, 41 ⁇ , 459 (1 969)], C 600 [Genetics] (Genetics), 39 ⁇ , 440 (1 954)].
  • Bacillus subtilis Bacillus subtilis
  • MI 1 14 Gen, 24 ⁇ , 255 (1 983)]
  • yeasts examples include Saccharomyces cerevisiae AH 22, AH22R—, ⁇ 87-1 1 A, DKD—5D, 20 ⁇ —12, Schizosaccharomyces pombe NC YC 19 1 3, NCYC 2036 Pichia pastoris K ⁇ 71 etc. are used.
  • Insect cells include, for example, when the virus is Ac NPV, a cell line derived from a night larvae larvae (Spodoptera frugiperda cell; S f cell), an MG 1 cell derived from the midgut of Trichoplusia ni, and a high cell derived from an egg of Trichoplusia ni Five TM cells, cells derived from Maraestra brassicae, cells derived from Estigmena acrea, and the like are used. When Winores is BmNPV, insect-derived cell lines (Bombyx raori N cells; BmN cells) are used as insect cells. Examples of the S f cells include S f 9 cells (ATCC CRL 1711), S f 21 cells (above, Vaughn, JL et al., In Vivo, 13, 213-217, (1977)) and the like. Used.
  • insects for example, silkworm larvae are used [Maeda et al., Nature, 3 15 (, 592 (1985)].
  • animal cells examples include monkey cells COS-7, Vero, Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO cells), dhfr gene-deficient Chinese hamster cells CHO (hereinafter abbreviated as CHO (dhfr-) cells), Mouse L cells, mouse At T-20, mouse myeloma cells, rat GH3, human FL cells, HEK293 cells, HeLa cells, etc. are used.
  • Transformation can be performed according to a known method depending on the type of host. Escherichia spp., For example, Proc. Natl. Acad. Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 69 ⁇ , 21 10 (1 972) and Gene, 17 ⁇ , 107 (1982).
  • Bacillus can be transformed according to the method described in, for example, Molecular & General Genetics, 168s, 11 (1 979).
  • Yeast is, for example, Methods' In ⁇ Enzymology
  • Insect cells and insects can be transformed according to the method described in, for example, Bio / Technology, 6, 47-55 (1988).
  • animal cells are characterized by the method described in Cell Engineering Supplement 8 New Cell Engineering Experimental Protocol. 263-267 (1 995) (published by Shujunsha), Virology, 52, 4 56 (1 973). Can be converted.
  • the transformant can be cultured according to a known method according to the type of host.
  • a liquid medium is preferable as the medium used for the culture.
  • the medium preferably contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like necessary for the growth of the transformant.
  • the carbon source for example, glucose, dextrin, soluble starch, sucrose, etc .
  • the nitrogen source for example, ammonium salt, nitrates, corn steeple, liquor, peptone, casein, meat extract, soybean cake
  • examples include inorganic or organic substances such as potato extract; examples of inorganic substances include calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride.
  • yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added to the medium.
  • Medium p H is preferably about 5-8.
  • an M 9 medium containing glucose and casamino acid As a medium for culturing a transformant whose host is Escherichia coli, for example, an M 9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Ob Molecular Geneetics
  • Culture of transformants whose host is Escherichia is usually performed at about 15 to 43 ° C for about 3 to 24 hours. If necessary, aeration or agitation may be performed.
  • the transformant whose host is Bacillus is usually cultured at about 30 to 40 ° C for about 6 to 24 hours. If necessary, aeration or agitation may be performed.
  • Burkholder's minimum medium As a medium for cultivating a transformant whose host is yeast, for example, Burkholder's minimum medium [Bostian, KL et al., Proceedings' of The National Academy of Ops Sciences, Ob The Usue (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 77 ⁇ , 4505 (1 980)] and 0.
  • SD medium containing 5% casamino acid [Bitter, GA, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA ), 8 1 ⁇ , 5330 (1984)].
  • the ⁇ of the medium is preferably about 5-8.
  • the culture is usually performed at about 20 ° C to 35 ° C for about 24 to 72 hours. Aeration and agitation may be performed as necessary.
  • the ⁇ of the medium is preferably about 6.2 to 6.4. Incubation is usually performed at about 27 ° C for about 3 to 5 days. Aeration and agitation may be performed as necessary.
  • a medium for culturing a transformant whose host is an animal cell for example, a MEM medium containing about 5 to 20% fetal bovine serum [Science, 1 22 ⁇ , 501 (1 952)], DMEM medium [Virology, 8 ⁇ , 396 (1 959)], RPM I 1640 medium [Journal of the American Meticanore 'Association (The Journal of the American Medical).
  • the pH of the medium is preferably about 6-8.
  • Incubation is usually performed at about 30 ° C to 40 ° C for about 15 to 60 hours. Aeration and agitation may be performed as necessary.
  • a transmembrane enzyme or a partial peptide thereof can be produced inside or outside the transformant.
  • the transmembrane enzyme or its partial peptide can be separated and purified according to a method known per se.
  • the cells or cells collected from the culture by a known method are suspended in an appropriate buffer solution, and ultrasound, lysozyme and For example, a method of obtaining a crude extract of soluble protein by centrifuging or filtering after cell bodies or cells have been lysed by cell culture or freeze-thawing is appropriately used.
  • the buffer solution may contain a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride, or a surfactant such as Triton X-100 TM.
  • Isolation and purification of the transmembrane enzyme or its partial peptide contained in the soluble fraction thus obtained can be performed according to a method known per se.
  • Such methods include solubility methods such as salting out, solvent precipitation, dialysis, and ultrafiltration.
  • Methods that mainly use molecular weight differences such as over-method, gel filtration, and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis; methods that use charge differences such as ion-exchange chromatography; Such as reverse phase high-performance liquid chromatography or the like; using isoelectric point differences such as isoelectric focusing, or the like. These methods can be combined as appropriate.
  • the transmembrane enzyme obtained by force or its partial peptide is a free form
  • the free form can be converted into a salt by a method known per se or a method analogous thereto
  • the protein or peptide Is obtained as a salt the salt can be converted into a free form or other salt by a method known per se or a method analogous thereto.
  • transmembrane enzyme produced by the transformant or its partial peptide can be arbitrarily modified or partially removed by applying an appropriate protein-modifying enzyme before or after purification. You can also.
  • protein modifying enzyme include trypsin, chymotrypsin, arginylendopeptidase, protein kinase, daricosidase and the like.
  • the presence of the transmembrane enzyme or the partial peptide thus obtained can be confirmed by Western blotting or the like using a specific antibody.
  • the transmembrane enzyme or its partial peptide uses a cell-free protein translation system consisting of rabbit reticulocyte lysate, wheat germ lysate, E. coli lysate, etc., with RNA corresponding to the DNA encoding it as a saddle type. It can also be synthesized by in vitro translation. Alternatively, a DNA encoding a transmembrane enzyme or a partial peptide thereof can also be synthesized as a cage using a cell-free transcription Z translation system further containing an RNA polymerase.
  • Examples include Tranlation System (Roche), Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega), etc. derived from rabbit reticulocytes, and PR0TEI0S TM (T0Y0B0), etc. derived from wheat germ. Of these, those using wheat germ lysate are preferred. For example, Johnston FB et al., Nature, 179, 160-161 (1957) can be used to prepare wheat germ lysate.
  • Protein synthesis systems or devices include batch methods (Pratt, JM et al. (1984), supra) and continuous cell-free protein synthesis systems that continuously supply amino acids, energy sources, etc. to the reaction system ( Spirin AS et al., Science, 242, 1162-1164 (1988)), dialysis (Kikawa et al., 21st Japan Molecular Biology Society, WID6), or multi-layer method (PR0TEI0S TM Wheat germ cell-free protein synthesis core kit Instruction manual: manufactured by T0Y0B0). Furthermore, it is possible to use a method (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-333673) for supplying a synthetic reaction system with vertical RNA, amino acids, energy sources, etc. when necessary, and discharging synthetic products and decomposition products when necessary. .
  • the screening method of the present invention uses a transmembrane enzyme protein or an inhibitor-binding peptide obtained by any of the above methods, and binds the test substance to the protein or the peptide. It is characterized by measuring the enzyme activity of a protein or the peptide.
  • the enzyme activity may be measured using any conventionally known method depending on the transmembrane enzyme used.
  • the enzyme activity is measured, for example, by the method described in Patent Document 1 above, The method described in Publication No. 8 and the method described in Science, 286, 735-741 (1999), Nature, 402, 533-537 (1999), Nature, 402, 537-540 (1999), etc. That power S.
  • a 3 secretase protein or an inhibitor-binding peptide in the presence of a test substance, a natural or synthetic substrate of 3 secretase [APP or a fragment containing the i3 secretase cleavage site, or the cleavage site
  • Synthetic peptides containing an amino acid sequence identical or substantially identical to the amino acid sequence of there is such a synthetic peptide available on the market, and those skilled in the art will know the amino acid sequence near the APP] 3 secretase cleavage site.
  • Such peptides can be easily synthesized using the above peptide synthesis method), and incubated for a certain period of time under appropriate reaction conditions. One or both methods can be detected.
  • reaction solution is subjected to SDS-polyacrylamide electrophoresis (SDS—PAGE), and then two bands (and uncut substrate) by Coomassie 'Brilliant' blue (CBB) staining. Peptide band) and quantifying enzyme activity using a densitometer, etc., SDS-PAGE in the same way using a substrate labeled with a labeling agent, and the amount of each band on the gel The method etc. which detect are mentioned.
  • labeling agent for example, radioisotopes, enzymes, fluorescent substances, luminescent substances, etc. are used.
  • radioisotopes for example, 25 I], 3 1 I], [ 3 H], C 14 C) and the like are used.
  • the enzyme is preferably stable and has a large specific activity.
  • ⁇ -galactosidase, ⁇ -darcosidase, alfa phosphatase, peroxidase, malate dehydrogenase and the like are used.
  • fluorescent substance for example, fluorescamine, fluorescein isothiocyanate and the like are used.
  • luminescent substance for example, noreminol, luminol derivative, luciferin, lucigenin and the like are used.
  • the fluorescent donor and fluorescent there is a secretase cleavage site between the fluorescent donor and the fluorescent quencher, so that the fluorescence of the unreacted substrate is not detected due to the proximity of the donor and the quencher, but it is cleaved by the secretase activity
  • Fluorescence is detected when cleavage occurs at the site, and fluorescence is detected.
  • N E -Methylanthranoyl3 ⁇ 4, (7-methoxycoumarin-4-yl) acetyl3 ⁇ 4, 4-((4- ⁇ dimethylamino; phenyl) azo) benzoic acid (dabcyl), Cy3B Cy5, etc. are the fluorescent donors.
  • Examples include 2,4-dinitrophenyl group, 5-((2- (Fmoc) -y-L-glutraylaminoethyl) amino; naphthalene-l-sulfonic acid (EDA S) Cy5Q, Cy7Q, etc. It is not limited to.
  • the binding between the transmembrane enzyme or the inhibitor-binding peptide and the test substance can be performed, for example, on the surface of a commercially available sensor chip (for example, manufactured by Biacore) using the surface plasmon resonance (SPR) method according to a conventional method. Immobilize a transmembrane enzyme or inhibitor-binding peptide, contact a test substance with it, and then irradiate the sensor chip with light of a specific wavelength from a specific angle to indicate changes in the resonance angle. Thus, the presence or absence of the test substance binding to the immobilized enzyme or inhibitor binding peptide can be determined.
  • a commercially available sensor chip for example, manufactured by Biacore
  • SPR surface plasmon resonance
  • a transmembrane enzyme or inhibitor-binding peptide is immobilized on the surface of a protein chip compatible with a mass spectrometer, contacted with a test substance, then MALDI-MS, ESI-MS, FAB Combining ionization methods such as -MS and mass spectrometers (eg double-focusing mass spectrometer, quadrupole analyzer, time-of-flight mass spectrometer, Fourier transform mass spectrometer, ion cyclotron mass spectrometer, etc.) By detecting the appearance of a peak corresponding to the test substance by the method, the binding between the transmembrane enzyme or the inhibitor-binding peptide and the test substance can be measured, but it is limited to these methods. Instead, any other known method can be used.
  • the test substance is a transmembrane region in a transmembrane enzyme or inhibitor-binding peptide. Binding to the target binding site and confirmation of exerting enzyme inhibitory activity by binding to the binding site is inhibited in place of the above-mentioned transmembrane enzyme or inhibitor binding peptide.
  • the enzyme activity and the binding activity of the test substance can be measured in the same manner as described above.
  • a substance that binds to a transmembrane enzyme or an inhibitor-binding peptide and inhibits the enzyme activity but does not bind to a non-inhibitory substance-binding peptide and does not inhibit the enzyme activity is converted into a transmembrane region. It can be selected as a compound that exhibits enzyme inhibitory activity by binding to the target binding site.
  • the present invention also provides a screening kit suitable for carrying out the screening method of the present invention.
  • the kit comprises at least (a) a target transmembrane enzyme or inhibitor-binding peptide, and (b) a non-inhibitor-binding peptide.
  • the kit may further include reagents or instruments necessary for enzyme activity measurement or binding test (for example, substrate, reaction buffer, SPR sensor chip, mass spectrometry protein chip, etc.).
  • the enzyme inhibitor that binds to the transmembrane region of the 3 secretase can be selected by using / 3 seclet as a transmembrane enzyme.
  • examples of such compounds include, but are not limited to, compounds A, D, H, I, J and the like shown in the Examples below.
  • The) 3-secretase inhibitor] binds to the transmembrane region of 3 secretase and inhibits its enzyme activity, so that conventionally known transition-state mimics and other substances that act on the activity center of 3 secretase Unlike inhibitors, it is highly selective for / 3 secretase.
  • the 3 secretase selective inhibitor can be selected by the screening method of the present invention.
  • D Down syndrome, senile memory impairment (AAM I), etc. can be used as a therapeutic agent (Note that AAM I is generally a memory loss associated with aging, and is used to identify the disease and diagnosis. In this specification, the term “therapy” is used in a comprehensive manner, including AAM I's “condition improvement”. To be used).
  • a secretase selective inhibitor when used as the prophylactic / therapeutic agent, it can be formulated according to conventional means.
  • the inhibitor may be given orally as a sugar-coated tablet, force-pelling agent, elixir, micro-forced pellating agent, or aseptically with water or other pharmaceutically acceptable liquid. It can be used parenterally in the form of an injection such as an aqueous solution or suspension.
  • the inhibitor together with known physiologically recognized carriers, flavoring agents, excipients, vehicles, preservatives, stabilizers, binders, etc. It can be produced by mixing in the form. The amount of active ingredient in these preparations should be within the indicated range.
  • Additives that can be mixed into tablets, capsules, etc. include, for example, binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic, excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • binders such as gelatin, corn starch, tragacanth, gum arabic
  • excipients such as crystalline cellulose, corn starch, gelatin, alginic acid, etc.
  • swelling agents such as magnesium stearate, lubricants such as magnesium stearate, sweeteners such as sucrose, lactose or saccharin, and flavoring agents such as peppermint, cocoa oil or cherry are used.
  • a liquid carrier such as fats and oils can be further contained in the material of the above type.
  • Sterile compositions for injection should be formulated according to normal pharmaceutical practice, such as dissolving or suspending active substances in vehicles such as water for injection, naturally occurring vegetable oils such as sesame oil, coconut oil, etc. Can do.
  • aqueous solutions for injection include physiological saline, isotonic solutions containing glucose and other adjuvants (eg, D-sorbitol, D-mannitol, sodium chloride, etc.)
  • Adjuvants such as alcohol (eg eta (Nonole), polyanoloresole (eg, propylene glycolate, polyethylene glycol), nonionic surfactant (eg, polysorbate SO TM, HC0-50), etc.
  • the oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and they may be used in combination with solubilizing agents such as benzyl benzoate and benzyl alcohol.
  • the prophylactic / therapeutic agent includes, for example, a buffer (eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer), a soothing agent (eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.), a stabilizer (eg, human serum). Alpmin, polyethylene glycol, etc.), preservatives (eg, benzyl alcohol, phenol, etc.), antioxidants, etc. may be combined.
  • a buffer eg, phosphate buffer, sodium acetate buffer
  • a soothing agent eg, benzalkonium chloride, procaine hydrochloride, etc.
  • a stabilizer eg, human serum
  • Alpmin polyethylene glycol, etc.
  • preservatives eg, benzyl alcohol, phenol, etc.
  • antioxidants etc.
  • the preparations obtained in this way are safe and have low toxicity.
  • humans and other warm-blooded animals eg, rats, mice, hamsters, rabbits, sheep, goats, pigs, rabbits, horses, Cats, dogs, monkeys, chimpanzees, birds, etc..
  • the dose of the / 3 secretase selective inhibitor varies depending on the subject of administration, symptoms, administration method, etc.
  • oral administration for example, in AD patients (60 kg) per day About 0.1-100 mg, preferably about 1.0-50 mg, more preferably about 1.0-20 rag.
  • the single dose varies depending on the administration target, symptoms, administration method, etc.
  • the amount converted per 60 kg can be administered.
  • the secretase inhibitor that can be selected by the screening method of the present invention like a secretase inhibitor that acts on the active center, is structurally optimized in the structure optimization without being restricted by the inhibitory action against other aspartic proteases. It is also advantageous in that it can be a possible lead compound.
  • bases, amino acids, etc. are indicated by abbreviations, they are based on abbreviations by I UP AC—I UB Commission on Biochemical Nomenclature or conventional abbreviations in the field. To do. If there is an optical isomer of amino acid, L form is indicated unless otherwise specified.
  • DNA Deoxyliponucleic acid
  • RNA Ribonucleic acid
  • mRNA Messenger liponucleic acid
  • EDTA ethylenediamine tetraacetic acid
  • a 1 a Alanine
  • GGTACCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTTCAGCAGGGAGATGTCATCAG-3, (SEQ ID NO: 6) and 20 pmo each were added, and PCR reaction was carried out using KOD (Toyobo) at MiniCyclerTM (Research condition: 94 ° C).
  • the obtained plasmid was digested with restriction enzymes Ap a I (Takara Shuzo) and Kp nl (Takara Shuzo) and then subjected to agarose gel electrophoresis to obtain a DNA fragment of about 250 b ⁇ . It was collected.
  • a plasmid containing clone number FG04087 was digested with ApaI and then subjected to agarose gel electrophoresis to recover a DNA fragment of about 1.2 kbp.
  • reaction conditions 1 cycle at 94 ° C for 2 minutes, 15 seconds at 98 ° C, 2 seconds at 72 ° C, 3 cycles at 74 ° C for 10 seconds, 15 seconds at 98 ° C) 68 ° C for 2 seconds, 74 ° C for 5 seconds for 3 cycles, 98 ° C for 15 seconds, 64 ° C for 2 seconds, 74 ° C for 5 seconds for 3 cycles, 98 ° C for 15 seconds, 60 28 cycles of 2 seconds at 74 ° C for 5 seconds at 74 ° C).
  • the PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 170 bp was recovered. The fragment is Zero Blunt T0P0PCR
  • Cloning was performed using Cloning Kit (Invitrogen).
  • the obtained plasmid was digested with restriction enzymes Apa I (Takara Shuzo) and Bbe I (Takara Shuzo) and then subjected to agarose gel electrophoresis to recover a DNA fragment of about 120 bp.
  • pBACE-F was digested with the same restriction enzyme and then subjected to agarose gel electrophoresis to recover a DNA fragment of about 1. lkbp.
  • p BACE-F was digested with Ap a I and then subjected to agarose gel electrophoresis to recover a DNA fragment of about 5.7 kbp.
  • the expression of the full-length / 3 secretase protein was performed using the FreeStyle 293 Expression System (Invitrogen).
  • FreeStyle 293-F cells were seeded in 140 ml of FreeStyle 293 Expression Medium at 1.1 X c e 1 1 s / m 1.
  • 3 After shaking culture at 7 ° C, 8% carbon dioxide, 1 25 rpm for 2 days, collect cells, and add 5 ml suspension buffer (0. OlM Tris—HC 1 (pH8), (0.15M NaCl, 1mM EDTA, 0.5mM PMSF)
  • the fluorescence intensity (excitation wavelength: 325 nm, measurement wavelength: 460 nm) was measured using Fluoroscan Ascent (Lab Systems).
  • Fluoroscan Ascent (Lab Systems).
  • all compounds were linear on the horizontal axis.
  • the inhibition pattern for full-length BACE 1-501 was revealed to be non-antagonistic inhibition.
  • a graph of Compound D is shown in FIG. Since each compound inhibits full-length BACE 1-501 non-antagonistically, it was considered that each compound was bound outside the active site.
  • An expression plasmid for preparing a protein consisting of the extracellular domain of 3 secretase was prepared having a base sequence in which an F 1 ag peptide was added to the first to 454th amino acids.
  • Pfu Turbo (Stratagene) was used to perform PCR reaction with Gene Amp PCR system 9700 (Applied Biosystem) (Reaction conditions: 1 cycle at 94 ° C for 1 cycle, 30 cycles at 94 ° C) Seconds, 58 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes for 20 cycles).
  • the PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 1.4 kbp was recovered.
  • the resulting DNA fragment was digested with restriction enzymes Nh e I (Takara Shuzo) and Kp n I, followed by spinning. Collected using column S-300 (Amersham Bioscience).
  • plasmid pBACE 1-454 was obtained.
  • the obtained cDNA fragment has the base sequence represented by SEQ ID NO: 14, and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 is encoded in the 1st to 1386th positions of the base sequence. It had been.
  • the preparation of an expression plasmid for preparing a protein consisting of the extracellular domain part of a secretase and a transmembrane domain is one having a base sequence in which an F 1 ag peptide is added to the first to 474th amino acids.
  • the plasmid p BACE l-501 is put into a cocoon-shaped primer set: 5'-
  • TTTTGGTACCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGCAGAGTGGCAGCATG-3 '(SEQ ID NO: 1 6) was added at 20 pmol each, and PCR reaction was performed with Gene Amp PCR system 9700 using pfu Turbo (reaction condition: 94 ° C for 1 minute) 1 cycle, 9 4. C for 30 seconds, 58 for 30 seconds, 72 for 2 minutes for 20 cycles).
  • the PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 1.5 kbp was recovered.
  • the obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes Nhe I and Kpn I, and then recovered using a spin column S-300.
  • FreeStyle 293-F cells were seeded on FreeStyle 293 Expression Medium 1 4 0 ml to 1.1 x c e 1 1 s / m 1. Dilute 293fectin20 ⁇ 1 in 5 ml Opti-MEM I medium, mix with 5 ml Opti-MEM I medium diluted 150 ⁇ g expression plasmid and leave for 20 minutes at room temperature. Added to FreeStyle 293-F cells. 3 After culturing for 2 days at 7 ° C, 8% carbon dioxide, 1 2 5 rpm, collect cells for B AC E 1-4 74 and add 5 ml suspension buffer (0.
  • Biacore 3000 (Biacore) was used for analysis using the surface plasmon resonance method.
  • BACE 1—501 and recombinant human BACE—1 (amino acid residues 1-460) are: N-hydrosuccinimide (NH 2 S) / N -ethyl ⁇ -(3 -It was immobilized on a force loxyl group on a CM5 sensor chip (carboxymethylated dextran matrix chip) activated with dimethyl-aminopropy ⁇ ) carboaiimide hydrochloride, £ DC).
  • BACE 1-454 and BACE 1 -4 74 were immobilized in the same manner in a pH 4.0 acetate buffer.
  • a secretase protein expression plasmid was prepared. First, for preparation of the one having the base sequence lj in which the F 1 ag peptide is added to the 1st to 471st amino acids, the plasmid pBACE 1-474 is used as a primer and the primer set: 5, 1
  • the obtained cDNA fragment has the base sequence represented by SEQ ID NO: 21 and is represented by SEQ ID NO: 22 in the first to 1437th positions of the base sequence. The amino acid sequence was coded.
  • the PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis, and a DNA fragment of about 1.4 kbp was recovered.
  • the obtained DNA fragment was digested with restriction enzymes Nhe I and Kpn I, and then recovered using a spin column S-300. These DNA fragments were digested with Nhe I and Kpn I; pc DNA 3.1 (—) was mixed, ligated using Ligation High, and transformed into E. coli DH 5- ⁇ competent cells. Plasmid ⁇ ⁇ ⁇ £ 1— 4 6 9 was obtained.
  • the obtained cDNA fragment has a base sequence represented by SEQ ID NO: 24, and is represented by SEQ ID NO: 25 in the 1st to 1 4 3 1st of the base sequence.
  • the amino acid sequence was encoded. 1st to 4th
  • the plasmid p BACE 1—4 6 9 is in the shape of a primer set: 5, -GGCTATGTCATGGCTGCCATCGATTACAAGGATGACGACG-3 (SEQ ID NO: 2 6) and 5 '-CGTCGTCATCCTTGTAATCGATGGCAGCCATGACATAGGC-3' (SEQ ID NO: 2 7) 'and QuickChange Plasmid pBACE1-4 6 5 was obtained by removing 12 bases using the Site-Directed Mutagenesis Kit.
  • the obtained cDNA fragment has the base sequence represented by SEQ ID NO: 28, and the first to the 14th base sequences.
  • FreeStyle 293-F cells were seeded in FreeStyle 293 Expression Medium 1 4 0 ml to 1.1 X ce 1 1 s / m 1.
  • 293fectin20 0 ⁇ 1 diluted in 5 ml Opti-MEM I medium and diluted in 5 ml Opti-MEM I medium 1 5 It was mixed with 0 ⁇ g of the expression plasmid and allowed to stand at room temperature for 20 minutes, and then added to Freestyle 293-F cells.
  • 3 After culturing for 2 days at 7 ° C, 8% carbon dioxide, 1 2 5 rpm, collect cells for BACE 1—4 7 1 and add 5 ml suspension buffer (0.
  • Biacorre 3000 was used for the analysis using the surface plasmon resonance method.
  • B ACE 1-465 was immobilized on a carboxyl group on a CM 5 sensor chip activated with NH S ⁇ E D C in an acetate buffer of H4.5.
  • BACE 1-465 was similarly immobilized in a pH 4.0 acetate buffer.
  • Compound-enzyme binding was measured in PBS containing 10% DMSO and 0.005% Surfac tant P20.
  • the correction of the RU difference between the flow cells caused by the Balta effect was performed using a correction curve created using a buffer in which the DMSO concentration was changed in 5 steps from 9% to 11%. As a result, a signal indicating that each compound binds to BACE 1-471 was obtained. However, no signal was obtained indicating binding to BACE 1-465.
  • the screening method of the present invention is useful for searching for prophylactic / therapeutic agents for AD, Down syndrome, AAMI, etc. having novel inhibitory action points with a low risk of side effects.
  • This application is based on Japanese Patent Application No. 2004-290784 filed in Japan (filing date: October 1, 2004), the contents of which are incorporated in full herein. Sequence listing free text
  • Oligonucleotide that codes for F 1 a g peptide.
  • a synthetic substrate for secretase A synthetic substrate for secretase.

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Abstract

本発明は、膜貫通型酵素の膜貫通領域に結合することにより該酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、(a)膜貫通型酵素の活性中心を含む領域と膜貫通領域の一部もしくは全部とを含む、該酵素のアミノ酸配列の一部または全部を有する蛋白質、および必要に応じて、(b)活性中心を含む領域を含み且つ前記膜貫通領域の一部もしくは全部を欠く、膜貫通型酵素のアミノ酸配列の一部を有する蛋白質を用い、各蛋白質への被験物質の結合および各蛋白質の酵素活性を測定することを特徴とする方法、並びに上記(a)および(b)の蛋白質を含んでなるスクリーニング用キットを提供する。また、本発明は、βセクレターゼの膜貫通領域に結合する該酵素阻害物質を含有してなるβセクレターゼ選択的阻害剤、具体的にはアルツハイマー病、ダウン症または老年性記憶障害の予防・治療剤を提供する。

Description

明 細 書 膜貫通型酵素阻害物質のスクリ一二ング方法 技術分野
本発明は、 膜貫通型酵素の膜貫通領域に特異的に結合する該酵素阻害物質のス クリーニング方法に関する。
背景技術
アルツハイマー病は、 神経細胞変性 '脱落と共に、 老人斑の形成および神経原 線維変化を特徴とする神経変性疾患である。 アルツハイマー病に最も特徴的な老 人斑は、 ）3アミロイド蛋白 （以下、 A /3と略記することもある） を主成分として、 生体成分が脳内に沈着したものである。 アミノ酸 4 0または 4 2個からなる A J3 (以下、 それぞれ A ]3 1—4 0および A 1 - 4 2と略記する。 ) は、 神経細胞 に対して毒性を示すことが知られている。 したがって、 A の産生 '分泌を阻害 する薬剤は、 A J3に起因する疾患 （例、 アルツハイマー病、 ダウン症など） の予 防-治療に有効である。
A j3 1— 4 0および A j3 1— 4 2は、 その前駆体蛋白である A P P (Amyloid Precursor Protein) から、 セクレターゼと γセクレターゼとによって切り出 されることにより産生される。 これらの酵素を阻害する薬剤は A ]3の産生 ·分泌 を阻害するので、 特に家族性アルツハイマー病 （F AD) などの、 遺伝的に A ]3 に起因する疾患 （例、 アルツハイマー病 （AD) 、 ダウン症など） に罹患する可 能性が高い人や、 外傷などにより脳内で 蛋白の増加を起こす患者等、 脳内で 蛋白の増加している患者に対して、 根本的な予防 ·治療効果を発揮し得ると 考えられる。
1 9 9 9年、 βセクレターゼ活性を担うプ テアーゼである B A C Ε 1 (Beta-site APP Cleaving Enzyme 1； Asp2, raeraapsin 2とも呼ばれる) の c D N Aの単離が 4つの製薬企業グループからほぼ同時に報告された （非特許文献 1 に総説） 。 B A C E 1は 5 0 1アミノ酸からなる 1回膜貫通型蛋白質であり、 細 胞外 （小胞体 'ゴルジ体にあっては内腔側） に存在する 2つのァスパラギン酸を 活性中心とする典型的なァスパラギン酸プロテアーゼである。 その後、 B A C E 1ノックァゥトマウスにおいて Α ]3産生が完全に消失していることが証明され、 B A C E 1が /3セクレターゼそのものであることが示された。 また、 この K Oマ ウスは重篤な発生異常がみられず、 遺伝子発現プロフアイルにもほとんど変化が みられないことから、 セクレターゼ阻害剤は、 γセクレターゼ阻害剤 （yセク レターゼは A P P以外に免疫細胞の分化に関与する N o t c h 1も切断するが、 N o t c h 1の切断が阻害されると免疫異常が起こることが分かっている） より も安全で、 副作用の少ない A D治療薬となることが期待される。
セクレターゼがァスパラギン酸プロテアーゼであることから、 遷移状態ミミ ックとして機能し得るスタチン、 ヒドロキシエチレン、 ヒドロキシェチルカルボ ニル構造を持ったペプチド性阻害剤が開発されている （非特許文献 1に総説） 。 し力 し、 ペプチド性阻害剤は体内動態や脳内移行効率に問題があり'、 多くの場合、 インビボでの薬効発揮のためには高濃度を要求する。
非ぺプチド性の低分子型阻害剤は上記の問題点を克服し得るのみならず、 新た な阻害作用点を見出せる可能性がある。 そのような低分子化合物は徐々に開発さ れており （特許文献 1〜3 ) 、 例えば、 コンピュータシミュレーションにより ]3 セクレターゼの活性中心に直接作用する可能性が示唆されるものや （特許文献 2 ) 、 A P Pのプロセッシングを; 8セクレターゼ切断から αセクレターゼ切断に シフトさせる可能性が示唆されるもの （特許文献 3 ) がある。 また、 緑茶力テキ ン類は、 基質と非拮抗的に |3セクレターゼ活性を阻害することが報告されている (非特許文献 2 ) 。
一方、 セクレターゼ阻害剤のスクリーニング方法としては、 例えば特許文献 1には、 蛍光ドナーで標識され、 かつ蛍光クェンチヤ一で標識されているぺプチ ドを基質として用い、 組換え型ヒト /3セクレターゼ蛋白質による切断活性を検出 する方法が記載されている。 特許文献 4および 5には、 ]3—アミロイド 'ぺプチ ド （]3ΑΡ) 産生細胞系を用い、 可溶性 A Ρ産生量の変化を指標に A Ρ生産 阻害剤を同定する方法が記載されている。 また、 特許文献 6には、 セクレター ゼの活性部位との結合を指標にした j3セクレターゼ阻害剤のスクリ一ユング方法 が記載されている。
特許文献 1 ：国際公開第 01Z87293号パンフレツト
特許文献 2 ：国際公開第 02Z88 101号パンフレツト
特許文献 3 ：国際公開第 02/96897号パンフレッ ト
特許文献 4 ：国際公開第 94Z10569号パンフレツト
特許文献 5 ：特開平 7— 165606号公報
特許文献 6 ：特開 2003— 26 1 596公報
非特許文献 1 ：バーゲーズ （Varghese J.) ら， ジャーナル■ォプ 'メディ力 ル ' ケミス トリー （J. Med. Chera. ) ， 第 46巻， 第 22号， p p. 4625— 4630 (2003年）
非特許文献 2 ：ジェオン （Jeon S.Y. ) ら， バイオオーガニック 'メディ力 ノレ ' ケミス トリー ' レターズ (Bioorg. Med. Chera. Lett. ) , 第 13卷， ρ . 3905-3908 (2003年） 発明の開示 ·
上記のように、 多数の製薬企業が i3セクレターゼ阻害剤の研究開発に多大の努 力を費やしている。 ]3セクレターゼの新たな阻害作用点を見出すことは、 より優 れた /3セクレターゼ阻害作用を有する化合物を開発する上でも重要である。 従って、 本発明の目的は、 新規の阻害部位に作用する セクレターゼ阻害剤の スクリーユング方法を提供することであり、 ひいては、 当該阻害部位に作用する ことにより優れた セクレターゼ阻害作用、 従って優れた A D予防■治療活性を 有する化合物を提供することである。
本発明者は、 上記特許文献 1に記載される種々の セクレターゼ阻害活性を有 する化合物について、 ]3セクレターゼ阻害の速度論解析を行った結果、 これらの 化合物の阻害様式が非拮抗型阻害であることを見出した。 そこで、 これらの化合 物の 3セクレターゼ蛋白質に対する結合部位を調べたところ、 意外にも、 これら の化合物は セクレターゼ蛋白質の膜貫通領域に結合することにより ]3セクレタ ーゼ活性を阻害することが判明した。 活性領域以外に結合して非拮抗的に酵素活 性を阻害するァロステリックインヒビタ一は多くの酵素について周知であるが、 膜貫通型酵素の膜貫通領域に結合して阻害活性を発揮する阻害物質に関する報告 は、 ]3セクレターゼに限らずこれまで皆無である。
本発明者は、 遺伝子工学的手法を駆使して J3セクレターゼ蛋白質の C末端側か ら膜貫通領域を徐々に欠失させた種々の変異蛋白質を作製し、 これらの化合物が 結合する βセクレターゼ蛋白質の部位を特定することに成功するとともに、 該結 合部位を保持する セクレターゼ蛋白質と、 該結合部位が欠失した J3セクレター ゼ蛋白質とを用いて、 試験化合物のそれらへの結合と酵素阻害活性とを検出し得 るスクリーニング系を構築して本発明を完成するに至った。
即ち、 本発明は、
[ 1 ] 膜貫通型酵素の活性中心を含む領域と膜貫通領域の一部もしくは全部とを 含む、 該酵素のアミノ酸配列の一部または全部を有する蛋白質を用いることを特 徴とする、 膜貫通領域に特異的に結合する該酵素阻害物質のスクリーニング方 法；
[ 2 ] 活性中心を含む領域を含み且つ前記膜貫通領域の一部もしくは全部を欠く、 膜貫通型酵素のアミノ酸配列の一部を有する蛋白質をさらに用い、 各蛋白質への 被験物質の結合および各蛋白質の酵素活性を測定することを特徴とする、 上記
[ 1 ] 記載の方法； [3] 活性中心を含む領域が細胞外もしくは内腔領域である上記 [1] 記載の方 法；
[4] 膜貫通型酵素がプロテアーゼである上記 [1] 記載の方法；
[5] プロテアーゼがァスパラギン酸プロテアーゼである上記 [4] 記載の方 法；
[6] ァスパラギン酸プロテアーゼが ]3セクレターゼである上記 [5] 記載の方 法；
[7] |3セクレターゼの活性中心を含む領域が配列番号 2で表されるァミノ酸配 列中アミノ酸番号 46〜4 54で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に 同一のアミノ酸配列を有し、 該酵素の膜'貫通領域が配列番号 2で表されるァミノ 酸配列中アミノ酸番号 4 5 5〜480で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実 質的に同一のアミノ酸配列を有するものである、 上記 [6] 記載の方法；
[ 8 ] 活性中心を含む領域として配列番号 2で表されるァミノ酸配列中アミノ酸 番号 46〜454で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ 酸配列を有し、 膜貫通領域の一部として配列番号 2で表されるアミノ酸配列中ァ ミノ酸番号 466〜47 1で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一 のアミノ酸配列を有する蛋白質を用いる、 上記 [7] 記載の方法；
[9] 以下の（a)および (b)を含んでなる、 膜貫通型酵素の膜貫通領域に特異的に 結合する該酵素阻害物質のスクリーニング用キット ；
(a) 膜貫通型酵素の活性中心を含む領域と膜貫通領域の一部もしくは全部とを含 む、 該酵素のアミノ酸配列の一部または全部を有する蛋白質
(b) 該酵素の活性中心を含む領域を含み且つ上記 (a)の膜貫通領域の一部もしく は全部を欠く、 該酵素のアミノ酸配列の一部を有する蛋白質
[1 0] /3セクレターゼの膜貫通領域に結合する該酵素阻害物質 （但し、 下記構 造式で示される化合物を除く） を含有してなる、 J3セクレターゼ選択的阻害剤；
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[1 1] 阻害物質の βセクレターゼ結合部位が配列番号 2で表されるアミノ酸配 列中アミノ酸番号 466〜471で示されるアミノ酸配列中に存在する、 上記
[10] 記載の剤；
[1 2] アルツハイマー病、 ダウン症および老年性記憶障害からなる群より選択 される疾患の予防■治療用である、 上記 [10] 記載の剤；
[1 3] 血圧低下を引き起こさないことを特徴とする上記 [1 2] 記載の剤； [14] ]3セクレターゼの膜貫通領域に結合する該酵素阻害物質 （但し、 下記構 造式で示される化合物を除く） を用いることを特徴とする、 ]3セクレターゼの選 択的阻害方法；
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[15] 阻害物質の セクレターゼ結合部位が配列番号 2で表されるアミノ酸配 列中アミノ酸番号 466〜471で示されるアミノ酸配列中に存在する、 上記
[14] 記載の方法；
[16] アルツハイマー病、 ダウン症および老年性記憶障害からなる群より選択 される疾患の予防'治療用である、 上記 [14] 記載の方法；
[17] 血圧低下を引き起こさないことを特徴とする上記 [16] 記載の方法； [18] ]3セクレターゼ選択的阻害剤の製造のための、 /3セクレターゼの膜貫通 領域に結合する該酵素阻害物質 （但し、 下記構造式で示される化合物を除く） の 使用；
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[19] 阻害物質の ]3セクレターゼ結合部位が配列番号 2で表されるアミノ酸配 列中アミノ酸番号 466〜471で示されるアミノ酸配列中に存在する、 上記
[18] 記載の使用；
[20] 阻害剤がアルツハイマー病、 ダウン症および老年性記憶障害からなる群 より選択される疾患の予防 ·治療用である、 上記 [18] 記載の使用；および
[21] 阻害剤が血圧低下を引き起こさないことを特徴とする上記 [20] 記載 の使用；
を提供する。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットは、 膜貫通領域に 結合することにより J3セクレターゼ活性を阻害する化合物を選択することができ るので、 遷移状態ミミックやその他の活性中心に作用する阻害薬等とは異なり、 ]3セクレターゼ選択的に作用して他のァスパラギン酸プ口テアーゼを阻害しない 化合物を選択し得るという有利な効果を奏する。 図面の簡単な説明
図 1は、 BACE 1— 501に対する化合物 Dの阻害様式を解析するラインゥ エーバ一—バークプロットを示す。 化合物 Dの濃度は、 參： 30μΜ、 Α： 10 AtM、 ■： 0 //Mである。
図 2は、 BACE 1— 501と化合物 Jの結合を示す表面プラズモン共鳴のシ グナル (Resonance Unit) 示す n 発明を実施するための最良の形態
本発明の、 膜貫通型酵素の膜貫通領域に特異的に結合する該酵素阻害物質のス クリーニング方法 （以下、 「本発明のスクリーニング方法」 と略記する場合があ る） は、 膜貫通型酵素の活性中心を含む領域と膜貫通領域の一部もしくは全部と を含む、 該酵素のアミノ酸配列の一部または全部を有する蛋白質を用いることを 特徴とする。
本発明のスクリーニング方法を用いることができる酵素としては、 膜貫通領域 を含むものであれば特に制限はなく、 Type Iもしくは Type IIの 1回膜貫通蛋白 質に属するあらゆる酵素 （例： J3セクレターゼ、 膜型マトリックスメタ口プロテ ァーゼ、 T N F a変換酵素、 メルトリン、 クズバニアン、 C D 3 8、 GM 3合成 酵素、 胎盤性ロイシンアミノぺプチダーゼ等） 、 7回膜貫通型受容体 （7 TM R) 等の複数回膜貫通蛋白質に属するあらゆる酵素 （例：プレセ二リン （P S ) 、 N AD H—キノン酸化還元酵素、 チトクロム C酸化還元酵素等） が挙げられる力 好ましくはプロテアーゼ （例：ァスパラギン酸プロテアーゼ、 セリンプロテア一 ゼ、 スレオニンプロテアーゼ、 システィンプロテアーゼ等） であり、 より好まし くほァスパラギン酸プロテアーゼ、 さらに好ましくは Type I I回膜貫通型のァス パラギン酸プロテアーゼである ]3セクレターゼである。
「膜貫通型酵素の活性中心を含む領域」 とは、 活性中心を含み、 かつ酵素活性 を発現するのに十分な、 該酵素の部分アミノ酸配列を含有する領域を意味する。 該領域の配列上の位置に制限はなく、 酵素蛋白質の N末端側領域、 内部配列、 C 末端側領域のいずれに位置してもよい。 また、 細胞外 （小胞体 ·ゴルジ体等にあ つては内腔） 、 細胞質側、 あるいは膜貫通領域 （但し、 酵素阻害物質の結合部位 とは異なる） のいずれにあってもよい。 例えば、 活性中心が細胞外 （もしくは内 腔） 領域、 細胞質領域または膜貫通領域内に存在する場合、 該 「活性中心を含む 領域」 は活性中心が存在するいずれかの領域全体であってよいし、 また、 例えば X線結晶構造解析などにより酵素の三次元構造が明らかになつている場合には、 活性中心が存在する領域内の、 酵素活性の発現に最低限必要な部分のみを用いる こともできる。
「膜貫通領域の一部もしくは全部」 とは、 目的とする酵素阻害活性を有する化 合物が標的とする結合部位を最低限含んでいることを意味する。 該結合部位は膜 貫通領域内で任意に設定することができるが、 膜貫通型酵素の活性中心が膜貫通 領域に存在する場合には、 該結合部位は該活性中心が存在する部位以外の膜貫通 領域から選択される。
上述のように、 本発明のスクリーニング方法に用いることができる好ましい膜 貫通型酵素の 1つは J3セクレターゼである。 本発明における )3セクレターゼ蛋白 質は、 配列番号 2に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 4 6〜5 0 1で示され るァミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含有する蛋白質で ある。
j3セクレターゼ蛋白質は、 温血動物 （例えば、 ヒト、 マウス、 ラット、 モノレモ ット、 ハムスター、 ゥサギ、 ヒッジ、 ャギ、 ブタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィ ヌ、 サル、 チンパンジーなど） の細胞 [例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 ]3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上 皮細胞、 杯細胞、 内皮細胞、 平滑筋細胞、 線維芽細胞、 線維細胞、 筋細胞、 脂肪 細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファージ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれ ら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしくはガン細胞など] もしくはそれらの細胞が存在 するあらゆる組織 [例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁桃核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視床下部、 大脳皮質、 延髄、 小脳） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎 臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 脂肪組織、 骨格筋] などに由来する蛋白質であってよく、 また、 化学合成もしくは無細胞翻訳系で合成された蛋白質であってもよい。 ある いは上記ァミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸を導入された形質転 換体から産生された組換え蛋白質であってもよい。
配列番号 2に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 4 6〜5 0 1で示されるァ ミノ酸配列と 「実質的に同一のアミノ酸配列」 とは、 配列番号 2に示されるアミ ノ酸配列中アミノ酸番号 4 6〜5 0 1で示されるアミノ酸配列と約 7 0 %以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 特に好ましくは約 9 5 %以上、 最も好ましくは約 9 8 %以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。 ここで 「相同性」 とは、 当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用い て 2つのアミノ酸配列をァラインさせた場合の、 最適なアラインメント （好まし くは、 該アルゴリズムは最適なァラインメントのために配列の一方もしくは両方 へのギャップの導入を考慮し得るものである） における、 オーバーラップする全 アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合 （％) を意味 する。 「類似アミノ酸」 とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、 例えば、 芳香族アミノ酸 （Phe、 Trp、 Tyr) 、 脂肪族アミノ酸 （Ala、 Leu、 Ile、 Val) 、 極性アミノ酸 （Gln、 Asn) 、 塩基性アミノ酸 （Lys、 Arg、 His) 、 酸性ァ ミノ酸 （Glu、 Asp) 、 水酸基を有するアミノ酸 （Ser、 Thr) 、 側鎖の小さいアミ ノ酸 （Gly、 Ala, Ser、 Thr、 Met) などの同じグループに分類されるアミノ酸が 挙げられる。 このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもた らさない （即ち、 保存的アミノ酸置換である） ことが予測される。 保存的ァミノ 酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、 種々の文献に記載されている （例 えば、 Bowieら， Science, 247： 1306-1310 (1990)を参照） 。 .
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local
Alignment Search Tool) を用い、 以下の条件 （期待値 =10；ギャップを許す；マ トリタス =BL0SUM62；フィノレタリング =0FF) にて計算することができる。 ァミノ 酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、 例えば、 Karlinら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90 : 5873-5877 (1993)に記載のアルゴリズム
[該アルゴリズムは BLASTおよび XBLASTプログラム （version 2. 0) に組み込ま れている （Altschulら， Nucleic Acids Res. ， 25 : 3389-3402 (1997) ) ] 、
Needlemanら， J. Mol. BioL , 48 : 444-453 (1970)に記載のアルゴリズム [該 アルゴリズムは GCGソフトウエアパッケージ中の GAPプログラムに組み込まれてい る] 、 Myersおよび Miller, CABI0S, 4： 11-17 (1988)に記載のアルゴリズム [該 アルゴリズムは CGC配列ァラインメントソフトウエアパッケージの一部である ALIGNプログラム （version 2. 0) に組み込まれている] 、 Pearsonら， Proc.
• Natl. Acad. Sci. USA, 85： 2444-2448 (1988)に記載のアルゴリズム [該ァルゴ リズムは GCGソフトウエアパッケージ中の FASTAプログラムに組み込まれている] 等が挙げられ、 それらも同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、 「実質的に同一のアミノ酸配列」 とは、 配列番号 2に示され るアミノ酸配列中アミノ酸番号 4 6 - 5 0 1で示されるアミノ酸配列と約 7 0 % 以上、 好ましくは約 8 0 %以上、 さらに好ましくは約 9 0 %以上、 特に好ましく は約 9 5 %以上、 最も好ましくは約 9 8 %以上の同一性を有するアミノ酸配列で ある。
配列番号 2に示されるァミノ酸配列中ァミノ酸番号 4 6〜 5 0 1で示されるァ ミノ酸配列と 「実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質」 とは、 前記の配 列番号 2に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 4 6〜 5 0 1で示されるァミノ 酸配列と実質的に同一のァミノ酸配列を含有し、 配列番号 2に示されるアミノ酸 配列中アミノ酸番号 4 6〜 5 0 1で示されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実 質的に同質の活性を有する蛋白質をいう。
「実質的に同質の活性」 とは、 （1) ]3セクレターゼ活性 （即ち、 ？ の6 9
5ァミノ酸からなるアイソタイプ （A P P 6 9 5 ) を 5 9 6番目の M e tと 5 9 7番目の A s pの間で特異的に切断するプロテアーゼ活性） および (2) 膜貫通領 域に結合して J3セクレターゼ阻害活性を発揮する化合物との結合活性をいう。 実 質的に同質とは、 それらの活性が質的 （定性的） に同様であることを示す。 従つ て、 J3セクレターゼ活性および阻害物質との結合活性が同等であることが好まし いが、 これらの活性の程度、 蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよ い （例えば、 活性については、 約 0 . 0 1〜約 1 0 0倍、 好ましくは約 0 . 1〜 約 1 0倍、 より好ましくは約 0 . 5〜約 2倍の範囲内が挙げられる） 。
j3セクレターゼ活性の測定は、 公知の方法、 例えば、 A P Pまたはその J3セク レターゼにより認識される部位と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含 む合成基質ペプチドと j3セクレターゼ蛋白質とを反応させ、 切断により生じる反 応産物の一方もしくは両方を検出する方法、 あるいは上記特許文献 1に記載され るように蛍光物質と消光物質とを含む合成基質と ]3セクレターゼ蛋白質とを反応 させ、 酵素切断により蛍光物質と消光物質が分離することによって生じる蛍光を 測定する方法などにより行うことができるが、 それらに限定されない。 一方、 阻 害物質との結合活性は、 後記実施例に示されるように表面プラズモン共鳴 （S P R) 等を用いて測定することができる。
また、 本発明で用いられる セクレターゼには、 例えば、 （1) 配列番号 2に示 されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 4 6〜5 0 1で示されるアミノ酸配列の 1ま たは 2個以上 （例えば 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好まし くは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が欠失したァミノ 酸配列、 （2) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 4 6〜5 0 1で 示されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、 (3) 配列番号 2に示されるアミノ酸配列中 アミノ酸番号 4 6〜5 0 1で示されるアミノ酸配列に 1または 2個以上 （例えば 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が揷入されたアミノ酸配列、 (4) 配列番 号 2に示されるアミノ酸配列中ナミノ酸番号 4 6〜5 0 1で示されるアミノ酸配 列中の 1または 2個以上 （例えば 1〜5 0個程度、 好ましくは 1〜3 0個程度、 より好ましくは 1〜1 0個程度、 さらに好ましくは 1〜5個） のアミノ酸が他の アミノ酸で置換されたアミノ酸配列、 または（5) それらを組み合わせたアミノ酸 配列を含有する蛋白質も含まれる。
但し、 1または 2個以上のアミノ酸を欠失する場合、 該欠失部位は配列番号 2 に示されるアミノ酸配列中少なくともアミノ酸番号 4 6 6〜4 7 1で示されるァ ミノ酸配列以外の部位であり、 好ましくはァミノ酸番号 4 5 5〜 4 8 0で示され るアミノ酸配列以外の部位である。 また、 1または 2個以上のアミノ酸が揷入さ れるか、 他のアミノ酸で置換される場合、 該揷入もしくは置換部位は、 配列番号 2に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 4 6 6〜4 7 1で示されるアミノ酸配 列以外の部位 （好ましくはァミノ酸番号 4 5 5〜 4 8 0で示されるァミノ酸配列 以外の部位） であるか、 あるいは当該部位であっても、 その揷入もしくは置換の 結果、 当該部位の活性 （即ち、 膜貫通領域に結合する セクレターゼ阻害物質と 結合する活性） に質的な影響を与えないものである必要がある。
]3セクレターゼは、 1回膜貫通型のァスパラギン酸プロテアーゼであり、 細胞 外 （もしくは内腔） 領域内に活性中心を含む。 より具体的には、 例えば、 配列番 号 2に示されるヒト ]3セクレターゼにおいては、 アミノ酸番号 4 6〜 5 0 1で示 されるアミノ酸配列が成熟 ]3セクレターゼ蛋白質のアミノ酸配列であり ( βセク レターゼはプレブ口酵素として生成し、 分泌過程においてアミノ酸番号 1〜 2 1 で示されるァミノ酸配列からなるシグナルぺプチド、 ァミノ酸番号 2 2〜 4 5で 示されるアミノ酸配列からなるプロペプチドが切断される） 、 文献により多少位 置は異なるが、 例えば細胞外 （内腔） 領域はアミノ酸番号 4 5〜4 5 4、 膜貫通 領域はァミノ酸番号 4 5 5〜 4 8 0、 細胞質領域はァミノ酸番号 4 8 1〜 5 0 1 でそれぞれ示されるァミノ酸配列からなる。 細胞外 （内腔） 領域における活性中心のコンセンサスモチーフ （D- T/ S - G- T/ S ) は、 アミノ酸番号 9 3〜9 6 (D T G S ) およびアミノ酸番号 2 8 9〜 2 9 2 (D S G T ) である。 したがって、 /3セクレターゼの 「活性中心を含む領 域」 としては、 例えば、 配列番号 2に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 9 3 〜2 9 2で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を 含む領域が挙げられる。 ここで 「実質的に同一のアミノ酸配列」 とは上記と同義 であり、 「実質的に同一のアミノ酸配列を含む領域」 とは、 実質的に同一のアミ ノ酸配列を含み、 且つ セクレターゼ活性を有する領域である。 βセクレターゼ の活性中心を含む領域は、 その細胞外 （内腔） 領域全体 （即ち、 配列番号 2に示 されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 4 6〜4 5 4で示されるアミノ酸配列と同一 もしくは実質的に同一のアミノ酸配列） であってもよく、 あるいはさらにプロ配 列もしくはプレブ口配列を Ν末端に含む配列 （即ち、 配列番号 2に示されるアミ ノ酸配列中アミノ酸番号 2 2〜4 5 4もしくは 1〜4 5 4で示されるアミノ酸配 列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列） であってもよい。
セクレターゼの 「膜貫通镇域の一部」 としては、 配列番号 2に示されるアミ ノ酸配列中ァミノ酸番号 4 5 5〜 4 8 0で示されるァミノ酸配列の任意の部分配 列 （例えば、 連続する 3〜 2 0アミノ酸程度、 好ましくは連続する 5〜 1 0アミ ノ酸程度力 らなる） と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列であれば特に制 限はないが、 好ましくは、 アミノ酸番号 4 6 6〜4 7 1で示されるアミノ酸配列 と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列が挙げられる。 ここで 「実質的に同 一のアミノ酸配列」 とは、 配列番号 2に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 4 5 5〜4 8 0で示されるアミノ酸配列の任意の部分配列において、 1〜数個のァ ミノ酸が置換、 欠失、 揷入もしくは付加されたアミノ酸配列であって、 該部分配 列の ]3セクレターゼ阻害活性を有する化合物に対する結合能が少なくとも質的に 変化しないアミノ酸配列をいう。 このようなアミノ酸の変異は上述の保存的アミ' ノ酸置換などによって達成され得る。 特に、 疎水度において類似するアミノ酸に より置換することが好ましいと考えられるが、 それに限定されない。
本発明のスクリーニング方法に用いられる セクレターゼは、 N末端側に上記 「活性中心を含む領域」 を、 C末端側に 「膜貫通領域の一部もしくは全部」 を含 むものであれば特に制限はない。 例えば、 膜貫通領域の一部もしくは全部の C末 端側に細胞質領域の配列を含んでもよいし、 含んでいなくてもよい。
本明細書に記載される蛋白質およびぺプチドは、 ぺプチド標記の' I貧例に従って 左端が N末端 （ァミノ末端） 、 右端が C末端 （力ルポキシル末端） である。 本発 明のスクリーニング方法に用いられる膜貫通型酵素は、 C末端がカルボキシル基 (- C O O H) 、 カルボキシレート（一 C O O— ) 、 アミド （一 C O N H 2 ) ま たはエステル （一 C O O R ) の何れであってもよい。
ここでエステルにおける Rとしては、 例えば、 メチル、 ェチル、 n—プロピル、 イソプロピル、 n—ブチルなどの C i ― 6 アルキル基；例えば、 シクロペンチノレ、 シクロへキシルなどの C 3― 8 シクロアルキル基；例えば、 フエニル、 α—ナフ チルなどの C 6 ― J 2 ァリール基；例えば、 ベンジル、 フエネチルなどのフエ二 ルー ― 2 アルキル基； α—ナフチルメチルなどの α—ナフチル一 C ― 2 ァ. ルキル基などの C 7― ！ 4 ァラルキル基； ビバロイルォキシメチル基などが用い られる。
膜貫通型酵素が C末端以外にカルボキシル基 （またはカルボキシレート） を有 している場合、 力ルポキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本 発明の膜貫通型酵素に含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられる。
さらに、 膜貫通型酵素には、 N末端のアミノ酸残基 （例、 メチォニン残基） の ァミノ基が保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル基などの _ 6 アルカノィ ルなどのじェ― 6 ァシル基など） で保護されているもの、 生体内で切断されて生 成する N末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ 酸の側鎖上の置換基 （例えば— O H、 — S H、 アミノ基、 イミダゾール基、 イン ドール基、 グァニジノ基など） が適当な保護基 （例えば、 ホルミル基、 ァセチル 基などの C 6 アル力ノィル基などの C i 6 ァシル基など） で保護されてい るもの、 あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含ま れる。
本発明で用いられる膜貫通型酵素の部分ペプチドは、 上記した膜貫通型酵素の 部分アミノ酸配列 （即ち、.活性中心を含む領域の配列と膜貫通領域の一部もしく は全部の配列） を有し、 且つ膜貫通型酵素と実質的に同質の活性を有するぺプチ ドである。 ここで 「実質的に同質の活性」 とは上記と同意義を示す。 また、 「実 質的に同質の活性」 の測定は上記と同様にして行うことができる。 本明細書にお いては、 当該部分ペプチドを、 以下 「阻害物質結合型ペプチド」 と称することと する。
阻害物質結合型ペプチドは、 上記の性質を有する限り特に制限されないが、 例 えば、 ]3セクレターゼの場合、 細胞外 （内腔） 領域内の酵素活性に影響を与えな い部分アミノ酸配列を欠くものや、 膜貫通領域の標的結合部位以外の部分アミノ 酸配列を欠くもの、 細胞質領域の一部もしくは全部を欠くものなどが挙げられる。 一方、 膜貫通型酵素の部分ペプチドであって、 （1) 活性中心を含む領域を保持 し、 且つ (2) 膜貫通領域内の、 目的とする酵素阻害物質が標的とする結合部位を 欠く部分ペプチドは、 酵素活性を保持するが、 目的とする酵素阻害物質に対する 結合活性がないので、 該標的結合部位に特異的に結合して酵素阻害活性を発揮す る化合物と接触させてもこれと結合せず、 酵素活性も阻害されない。 本明細書に おいては、 当該部分ペプチドを、 以下 「阻害物質非結合型ペプチド」 と称するこ ととする。
膜貫通型酵素の部分ぺプチド （阻害物質結合型ぺプチドおよび阻害物質非結合 型ペプチドの両者を包含する；以下、 このような場合には 「本発明の部分ぺプチ ド」 と称することがある） は、 C末端がカルボキシル基 （一 C O O H) 、 カルボ キシレート （一 C O O _ ) 、 アミ ド （一 C O N H 2 ) またはエステル （一 C O O R) の何れであってもよい。 ここでエステルにおける Rとしては、 膜貫通型酵素 について前記したと同様のものが挙げられる。 これらのぺプチドが C末端以外に 力ルポキシル基 （またはカルボキシレート） を有している場合、 カルボキシル基 がァミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ぺプチドに含まれる。 この場合のエステルとしては、 例えば上記した C末端のエステルなどが用いられ る。
さらに、 本発明の部分ペプチドには、 上記した膜貫通型酵素と同様に、 N末端 のメチォニン残基のァミノ基が保護基で保護されているもの、 N端側が生体内で 切断され生成した G l nがピログルタミン酸化したもの、 分子内のアミノ酸の側 鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、 あるいは糖鎖が結合したい わゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
膜貫通型酵素またはその部分ペプチドの塩としては、 酸または塩基との生理学 的に許容される塩が挙げられ、 とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好まし レ、。 この様な塩としては、 例えば、 無機酸 （例えば、 塩酸、 リン酸、 臭化水素酸、 硫酸） との塩、 あるいは有機酸 （例えば、 酢酸、 ギ酸、 プロピオン酸、 フマル酸、 マレイン酸、 コノ、ク酸、 酒石酸、 クェン酸、 リンゴ酸、 蓚酸、 安息香酸、 メタン スルホン酸、 ベンゼンスルホン酸） との塩などが用いられる。
膜貫通型酵素またはその塩は、 その例示としての i3セクレターゼにおいて前述 した、 温血動物の細胞または組織から自体公知の蛋白質の精製方法によつて調製 することができる。 具体的には、 温血動物の組織または細胞をホモジナイズし、 可溶性画分を逆相クロマトグラフィー、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ 二ティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等で分離精製することに よって、 膜貫通型酵素またはその塩を製造することができる。
膜貫通型酵素またはその部分べプチドは、 公知のぺプチド合成法に従って製造 することもできる。
ペプチド合成法は、 例えば、 固相合成法、 液相合成法のいずれであってもよい。 膜貫通型酵素を構成し得る部分べプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、 生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を 製造することができる。
ここで、 縮合や保護基の脱離は、 自体公知の方法、 例えば、 以下の（1)〜（5)に 記載された方法に従って行われる。
(1) M. Bodanszkyおよび M. A. 0ndetti、 ペプチド ·シンセシス （Peptide Synthesis) , Interscience Publishers, New York .(1966年)
(2) Schroederおよび Luebke、 ザ 'ペプチド（The Peptide) , Academic Press, New York (1965年）
(3) 泉屋信夫他、 ペプチド合成の基礎と実験、 丸善 (株） （1975年）
(4) 矢島治明 および榊原俊平、 生化学実験講座 1、 蛋白質の化学 IV、 205、 (1977年）
(5) 矢島治明監修、 続医薬品の開発、 第 14巻、 ペプチド合成、 広川書店
このようにして得られた膜貫通型酵素またはその部分ペプチドは、 公知の精製 法により単離'精製することができる。 ここで、 精製法としては、 例えば、 溶媒 抽出、 蒸留、 カラムクロマトグラフィー、 液体クロマトグラフィー、 再結晶、 こ れらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られる膜貫通型酵素またはその部分ペプチドが遊離体である場合 には、 該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換 することができるし、 逆に膜貫通型酵素またはその部分ペプチドが塩として得ら れた場合には、 該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体また は他の塩に変換することができる。
膜貫通型酵素またはその部分ぺプチドの合成には、 通常市販の蛋白質合成用樹 脂を用いることができる。 そのような樹脂としては、 例えば、 クロロメチル樹脂、 ヒ ドロキシメチル樹脂、 ベンズヒドリルァミン樹脂、 アミノメチル樹脂、 4—ベ ンジルォキシベンジルアルコール樹脂、 4ーメチルベンズヒドリルァミン樹脂、 PAM樹脂、 4—ヒ ドロキシメチルメチルフエニルァセトアミ ドメチル樹脂、 ポリ アクリルアミ ド樹脂、 4一 （2， ， 4， ージメ トキシフエ二ル一ヒドロキシメチ ル） フエノキシ樹脂、 4— ( 2， ， 4 ' ージメ トキシフエ二ルー F mocアミノエ チル） フエノキシ樹脂などを挙げることができる。 このような樹脂を用い、 x— ァミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、 目的とする蛋白質もしくは ペプチドの配列通りに、 自体公知の各種縮合方法に従い、 樹脂上で縮合させる。 反応の最後に樹脂から蛋白質 （ペプチド） を切り出すと同時に各種保護基を除去 し、 さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフイド結合形成反応を実施し、 目的の蛋 白質 （ペプチド） またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、 蛋白質合成に使用できる各種活性化 試薬を用いることができるが、 特に、 カルポジイミド類がよい。 カルポジイミド 類としては、 D C C、 N， N ' —ジイソプロピルカルポジイミド、 N—ェチルー N ' 一 （3—ジメチルァミノプロリル） カルポジイミ ドなどが用いられる。 これ らによる活性化にはラセミ化抑制添加剤 （例えば、 H O B t、 H O O B t)ととも に保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、 または、 対称酸無水物または H O B t エステルあるいは H O O B tエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を 行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、 蛋白質縮合反応に 使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。 例えば、 N， N—ジ メチルホルムアミ ド， N， N—ジメチルァセトアミ ド， N—メチルピロリ ドンな どの酸アミ ド類、 塩化メチレン， クロ口ホルムなどのハロゲン化炭化水素類、 ト リフルォロエタノールなどのアルコール類、 ジメチルスルホキシドなどのスルホ キシド類、 ピリジンなどのアミン類， ジォキサン， テトラヒドロフランなどのェ 一テル類、 ァセトニトリル， プロピオ二トリルなどの二トリル類、 酢酸メチル， 酢酸ェチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。 反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜 選択され、 通常約一 2 0 °C〜5 0 °Cの範囲から適宜選択される。 活性化されたァ ミノ酸誘導体は通常 1 . 5〜 4倍過剰で用いられる。 ニンヒドリン反応を用いた テストの結果、 縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を 繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。 反応を繰り返しても十分 な縮合が得られないときには、 無水酢酸またはァセチルイミダゾールを用いて未 反応ァミノ酸をァセチル化することができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および用いられる保護基、 その保 護基の脱離、 並びに反応に関与する官能基の活性化などは、 公知の基または公知 の手段から適宜選択しうる。
原料のァミノ基の保護基としては、 例えば、 Z、 B o c、 ターシャリーペンチ ルォキシカルポニル、 イソボルエルォキシ力ルポニル、 4—メトキシベンジルォ キシカルボニル、 C 1 _ Z、 B r— Z、 ァダマンチルォキシカルポニル、 トリフ ノレオロアセチノレ、 フタロイノレ、 ホノレミノレ、 2—ニ トロフエニノレスノレフエ二ノレ、 ジ フエニルホスフイノチオイル、 F m o cなどが用いられる。
力ルポキシル基は、 例えば、 アルキルエステル化 （例えば、 メチル、 ェチル、 プロピノレ、 ブチノレ、 ターシャリープチノレ、 シクロペンチノレ、 シクロへキシ /レ、 シ クロへプチル、 シクロオタチル、 2—ァダマンチルなどの直鎖状、 分枝状もしく は環状アルキルエステル化） 、 ァラルキルエステルイ匕 （例えば、 ベンジルエステ ノレ、 4—ニトロべンジノレエステノレ、 4ーメ トキシべンジノレエステノレ、 4—クロ口 ベンジルエステル、 ベンズヒ ドリルエステル化） 、 フエナシルエステル化、 ベン ジルォキシカルポニルヒドラジド化、 ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジ ド化、 トリチノレヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、 例えば、 エステルイ匕またはエーテルィ匕によって保護するこ とができる。 このエステノレ化に適する基としては、 例えば、 ァセチル基などの低 級アルカノィル基、 ベンゾィル基などのァロイル基、 ベンジルォキシカルポニル 基、 エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。 また、 、
エーテル化に適する基としては、 例えば、 ベンジル基、 テトラヒドロビラニル基、 t一ブチル基などである。
チロシンのフエノーノレ性水酸基の保護基としては、 例えば、 B z 1、 C 12 - B z l、 2—ニトロベンジル、 B r— Z、 ターシャリープチルなどが用いられる。 ヒスチジンのィミダゾールの保護基としては、 例えば、 T o s、 4—メトキシ ー2， 3, 6—トリメチノレベンゼンスルホニル、 DNP、 ベンジルォキシメチノレ、 Bum, B o c、 T r t、 Fmo cなどが用いられる。
保護基の除去 （脱離） 方法としては、 例えば、 P d—黒あるいは P d—炭素な どの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、 また、 無水フッ化水素、 メタ ンスルホン酸、 トリフルォロメタンスルホン酸、 トリフルォロ酢酸あるいはこれ らの混合液などによる酸処理や、 ジイソプロピルェチルァミン、 トリェチルァミ ン、 ピぺリジン、 ピぺラジンなどによる塩基処理、 また液体アンモニア中ナトリ ゥムによる還元なども用いられる。 上記酸処理による脱離反応は、 一般に約一 2 0°C〜40°Cの温度で行なわれるが、 酸処理においては、 例えば、 ァニソール、 フエノーノレ、 チオアニソーノレ、 メタクレゾ一ノレ、 パラクレゾーノレ、 ジメチノレスノレ フイド、 1, 4—ブタンジチオール、 1， 2—エタンジチオールなどのような力 チオン捕捉剤の添加が有効である。 また、 ヒスチジンのイミダゾール保護基とし て用いられる 2， 4—ジニトロフエニル基はチォフエノール処理により除去され、 トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の 1， 2 一エタンジチオール、 1, 4—ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱 保護以外に、 希水酸化ナトリウム溶液、 希アンモニアなどによるアルカリ処理に よっても除去される。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応する酸無水 物、 アジド、 活性エステル 〔ァノレコール （例えば、 ペンタクロロフエノール、 2， 4， 5—トリクロ口フエノール、 2, 4—ジニトロフエノール、 シァノメチルァ ルコール、 パラニトロフエノーノレ、 HONB、 N—ヒ ドロキシスクシミ ド、 N— ヒドロキシフタルイミ ド、 H O B t) とのエステル〕 などが用いられる。 原料の ァミノ基の活性化されたものとしては、 例えば、 対応するリン酸アミドが用いら れる。
蛋白質 （ペプチド） のアミド体を得る別の方法としては、 例えば、 まず、 蛋白 質 （ペプチド） を構成する部分ペプチドの各 C末端アミノ酸の α—カルボキシル 基をアミド化して保護し、 アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長 （隣接する部分 ペプチドの C末端アミノ酸と連結されるべきアミノ酸） まで延ばした後、 C末端 側ぺプチド鎖の Ν末端ァミノ酸の a—ァミノ基の保護基のみを除いたぺプチドと、 Ν末端側ペプチド鎖の C末端アミノ酸のカルボキシル基の保護基のみを除いたぺ プチドとを製造し、 これらのペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる 方法が挙げられる。 縮合反応の詳細については上記と同様である。 縮合により得 られた保護蛋白質 （保護ペプチド） を精製した後、 上記方法によって保護基を除 去し、 所望の粗蛋白質 （粗ペプチド） を得ることができる。 この粗蛋白質 （粗べ プチド） は既知の各種精製手段を駆使して精製し、 主要画分を凍結乾燥すること で所望の蛋白質 （ペプチド） のアミド体を得ることができる。
蛋白質 （ペプチド） のエステル体は、 例えば、 C末端アミノ酸の Q! —カルボキ シル基を所望のアルコール類と縮合してアミノ酸エステルとした後、 上記のアミ ド体の場合と同様に処理して得ることができる。
本発明の部分ぺプチドまたはその塩は、 膜貫通型酵素またはその塩を適当なぺ プチダーゼで切断することによつても製造することができる。
さらに、 膜貫通型酵素またはその部分ペプチドは、 それをコードする核酸を含 有する形質転換体を培養し、 得られる培養物から膜貫通型酵素またはその部分べ プチドを分離精製することによって製造することもできる。
膜貫通型酵素またはその部分ペプチドをコードする核酸は D NAであっても R N Aであってもよく、 あるいは D NA/R N Aキメラであってもよい。 好ましく は D NAが挙げられる。 また、 該核酸は二本鎖であっても、 一本鎖であってもよ い。 二本鎖の場合は、 二本鎖 DNA、 二本鎖 RNAまたは DNA： RNAのハイ プリッドでもよい。 一本鎖の場合は、 センス鎖 （即ち、 コード鎮） であっても、 アンチセンス鎖 （即ち、 非コード鎖） であってもよい。
膜貫通型酵素またはその部分ペプチドをコードする DNAとしては、 ゲノム D NA、 温血動物 （例えば、 ヒ ト、 マウス、 ラッ ト、 モルモット、 ハムスター、 ゥ サギ、 ヒッジ、 ャギ、 プタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジ 一など） のあらゆる細胞 [例えば、 脾細胞、 神経細胞、 グリア細胞、 膝臓 j3細胞、 骨髄細胞、 メサンギゥム細胞、 ランゲルハンス細胞、 表皮細胞、 上皮細胞、 内皮 細胞、 線維芽細胞、 線維細胞、 筋細胞、 脂肪細胞、 免疫細胞 （例、 マクロファー ジ、 T細胞、 B細胞、 ナチュラルキラー細胞、 肥満細胞、 好中球、 好塩基球、 好 酸球、 単球） 、 巨核球、 滑膜細胞、 軟骨細胞、 骨細胞、 骨芽細胞、 破骨細胞、 乳 腺細胞、 肝細胞もしくは間質細胞、 またはこれら細胞の前駆細胞、 幹細胞もしく はガン細胞などや血球系の細胞] 、 あるいはそれらの細胞が存在するあらゆる組 織 [例えば、 脳、 脳の各部位 （例、 嗅球、 扁頭核、 大脳基底球、 海馬、 視床、 視 床下部、 視床下核、 大脳皮質、 延髄、 小脳、 後頭葉、 前頭葉、 側頭葉、 被殻、 尾 状核、 脳染、 黒質） 、 脊髄、 下垂体、 胃、 膝臓、 腎臓、 肝臓、 生殖腺、 甲状腺、 胆のう、 骨髄、 副腎、 皮膚、 筋肉、 肺、 消化管 （例、 大腸、 小腸） 、 血管、 心臓、 胸腺、 脾臓、 顎下腺、 末梢血、 末梢血球、 前立腺、 睾丸、 卵巣、 胎盤、 子宮、 骨、 関節、 骨格筋など] 由来の cDNA、 合成 DNAなどが挙げられる。 膜貫通型酵 素またはその部分ペプチドをコードするゲノム DNAおよび cDNAは、 上記し た細胞 ·組織より調製したゲノム DNA画分おょぴ全 RNAもしくは mRNA画 分をそれぞれ铸型として用い、 Polymerase Chain Reaction (以下、 「PCR 法」 と略称する） および Re verse Transcriptase- PCR (以下、 「RT— PCR 法」 と略称する） によって直接増幅することもできる。 あるいは、 膜貫通型酵素 またはその部分ペプチドをコードするゲノム DN Aおよび c DN Aは、 上記した 細胞 ·組織より調製したゲノム DNAおよぴ全 RNAもしくは mRNAの断片を 適当なベクター中に挿入して調製されるゲノム D N Aライブラリーおよび c D N Aライプラリーから、 コロニーもしくはプラークハイプリダイゼーション法また は P C R法などにより、 それぞれクローユングすることもできる。 ライプラリー に使用するベクターは、 パクテリオファージ、 プラスミド、 コスミド、 ファージ ミドなどいずれであってもよい。
膜貫通型酵素が セクレターゼである場合、 i3セクレターゼをコードする D N Aとしては、 例えば、 配列番号 1に示される塩基配列中塩基番号 1 3 6〜1 5 0 3で示される塩基配列を含有する D N A、 あるいは配列番号 1に示される塩基配 列中塩基番号 1 3 6〜 1 5 0 3で示される塩基配列の相補鎖配列とハイス トリン ジ ントな条件下でハイブリダィズする塩基配列を含有し、 前記した配列番号 2 に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 4 6〜5 0 1で示されるアミノ酸配列を 含有する蛋白質と実質的に同質の活性 （即ち、 ]3セクレターゼ活性および標的結 合部位での セクレターゼ阻害物質との結合活性など） を有する蛋白質をコード する D N Aなどが挙げられる。
配列番号 1に示される塩基配列中塩基番号 1 3 6〜 1 5 0 3で示される塩基配 列の相補鎖配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる D N A としては、 例えば、 配列番号 1に示される塩基配列中塩基番号 1 3 6〜1 5 0 3 で示される塩基配列と約 6 0 %以上、 好ましくは約 7 0 %以上、 さらに好ましく は約 8 0 %以上、 特に好ましくは約 9 0 %以上の相同性を有する塩基配列を含有 する D N Aなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、 相同性計算アルゴリズム NCBI BLAST (National Center for Biotechnology Information Basic Local Alignment Search Tool) を用い、 以下の条件 （期待値 =10；ギヤップを許す；フィルタリン グ =0N；マッチスコア =1； ミスマッチスコア =-3) にて計算することができる。 塩 基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、 上記したアミノ酸 配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。 ハイプリダイゼーシヨンは、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、 例え ば、 モレキュラー ·クローユング （Molecular Cloning) 第 2版 （J. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) に記載の方法などに従って行 なうことができる。 また、 市販のライプラリーを使用する場合、 ハイプリダイゼ ーシヨンは、 添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。 ノ、ィ ブリダィゼーションは、 好ましくは、 ハイストリンジェシトな条件に従って行な うことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、 例えば、 ナトリウム塩濃度が約 1 9〜 約 4 0 mM、 好ましくは約 1 9〜約 2 0 mMで、 温度が約 5 0〜約 7 0 °C、 好ま しくは約 6 0〜約 6 5 °Cの条件等が挙げられる。 特に、 ナトリウム塩濃度が約 1 9 mMで温度が約 6 5 °Cの場合が好ましい。 当業者は、 ハイブリダィゼーシヨン 溶液の塩濃度、 ハイプリダゼーシヨン反応の温度、 プローブ濃度、 プローブの長 さ、 ミスマッチの数、 ハイブリダィゼーシヨン反応の時間、 洗浄液の塩濃度、 洗 浄の温度等を適宜変更することにより、 所望のストリンジエンシーに容易に調節 することができる。
13セクレターゼをコ一ドする D NAは、 好ましくは配列番号 1に示される塩基 配列を含有するヒト J3セクレターゼ D N Aもしくはそのアレル変異体、 または他 の温血動物 （例えば、 マウス、 ラット、 モルモッ ト、 ハムスター、 ゥサギ、 ヒッ ジ、 ャギ、 プタ、 ゥシ、 ゥマ、 トリ、 ネコ、 ィヌ、 サル、 チンパンジーなど） に おけるそのオルソログ （ortholog) 等である。
阻害物質結合型ぺプチドをコードする D N Aは、 膜貫通型酵素の活性中心を含 む領域をコードする塩基配列と、 膜貫通領域の一部もしくは全部をコードする塩 基配列とを含むものであればいかなるものであってもよい。 また、 阻害物質非結 合型ぺプチドをコ一ドする D N Aは、 膜貫通型酵素の活性中心を含む領域をコー ドする塩基配列を含み、 且つ上記 「膜貫通領域の一部もしくは全部」 をコードす る塩基配列を含まないものであればいかなるものであってもよい。 これらの D N Aは、 ゲノム DNA、 上記した細胞 '組織由来の c DNA、 合成 DNAのいずれ でもよい。
具体的には、 膜貫通型酵素が ]3セクレターゼの場合、 阻害物質結合型ペプチド をコードする DNAとしては、 例えば、
(la) 配列番号 1に示される塩基配列中塩基番号 277〜 876で示される塩基 配列および塩基番号 1 363〜 1440で示される塩基配列の一部もしくは全部 を有する DNA、 または
(2a) 上記 （la) の DNAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズす る塩基配列を有し、 且つ配列番号 2に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号 46 〜501で示されるアミノ酸配列を含むペプチドと実質的に同質の活性 （即ち、 0セクレターゼ活性および膜貫通領域内の標的結合部位における酵素阻害物質と の結合活性） を有するペプチドをコードする DNAが用いられる。
また、 阻害物質非結合型ペプチドをコードする DN Aとしては、
(lb) 配列番号 1に示される塩基配列中塩基番号 277〜876で示される塩基 配列を有し、 且つ上記 （la) の DNAが有する塩基番号 1363〜1440で示 される塩基配列の一部もしくは全部を有しない DNA、 または
(2b) 上記 （lb) の DNAとハイストリンジェントな条件下でハイブリダィズす る塩基配列を有し、 且つ配列番号 2に示されるアミノ酸配列中ァミノ酸番号 46 〜454で示されるアミノ酸配列を含むペプチドと実質的に同質の活性 （即ち、 セクレターゼ活性） を有する力 膜貫通領域内の標的結合部位における酵素阻 害物質との結合活性を有しないペプチドをコードする D N Aが用いられる。 上記 （la) または （lb) の DNAとハイストリンジェントな条件下でハイプリ ダイズできる DNAとしては、 例えば、 該 DN Aの塩基配列中の対応する部分と 約 60 %以上、 好ましくは約 70 %以上、 より好ましくは約 80 %以上、 特に好 ましくは約 90%以上の相同性を有する塩基配列を含有する DN Aなどが用いら れる。 膜貫通型酵素またはその部分ペプチドをコードする DNAは、 該蛋白質または ペプチドをコ^"ドする塩基配列の一部分を有する合成 DNAプライマ を用いて P C R法によって増幅するか、 または適当な発現べクタ一に組み込んだ D N Aを、 本発明の蛋白質の一部あるいは全領域をコードする DN A断片もしくは合成 DN Aを標識したものとハイブリダィゼーシヨンすることによってクロ一ユングする ことができる。 ハイブリダィゼーシヨンは、 例えば、 モレキュラー 'クローニン グ （Molecular Cloning) 第 2版 （前述） に記載の方法などに従って行うことが できる。 また、 市販のライブラリーを使用する場合、 ハイプリダイゼーシヨンは、 該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
DN Aの塩基配列は、 公知のキット、 例えば、 MutanTM- super Express Km (宝 酒造 （株） ) 、 Mutan™-K (宝酒造 （株） ） 等を用いて、 ODA- LA PCR法、 Gapped duplex法、 Kunkel法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変 換することができる。
クローン化された DNAは、 目的によりそのまま、 または所望により制限酵素 で消化するか、 リンカ一を付加した後に、 使用することができる。 該 DNAはそ の 5 ' 末端側に翻訳開始コドンとしての ATGを有し、 また 3， 末端側には翻訳 終止コドンとしての TAA、 TGAまたは TAGを有していてもよい。 これらの 翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、 適当な合成 DNAアダプターを用いて付加 することができる。
上記の膜貫通型酵素またはその部分ペプチドをコードする DNAを含む発現べ クタ一で宿主を形質転換し、 得られる形質転換体を培養することによって、 該蛋 白質またはべプチドを製造することができる。
膜貫通型酵素またはその部分ペプチドをコードする D N Aを含む発現ベクター は、 例えば、 膜貫通型酵素をコードする DNAから目的とする DNA断片を切り 出し、 該 DNA断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結するこ とにより製造することができる。 発現ベクターとしては、 大腸菌由来のプラスミ ド （例、 pBR 322, p BR 325, pUC 12, pUC 13) ；枯草菌由来のプラスミ ド （例、 · p U B 11 0, p TP 5, p C 194) ；酵母由来プラスミ ド （例、 p SH19， p SH 1 5) ； λファージなどのパクテリオファージ； レトロウイルス， ワクシニアウイ ノレス， バキュロウイノレスなどの動物ウイノレス ； ρΑΙ— 11、 XT 1 , R c /CMV, pRcZRSV、 p cDNAI Ne oなどが用いられる。
プロモーターとしては、 遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモー ターであればいかなるものでもよい。
例えば、 宿主が動物細胞である場合、 SRひプロモーター、 SV40プロモー ター、 LTRプロモーター、 CMV (サイ トメガロウィルス） プロモーター、 H SV-TKプロモーターなどが用いられる。 なかでも、 CMVプロモーター、 S R αプロモーターなどが好ましい。
宿主がェシエリヒア属菌である場合、 t r pプロモーター、 l a cプロモータ 一、 r e cAプロモーター、 ；i PL プロモーター、 l p pプロモーター、 T7プ 口モーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、 SPO lプロモーター、 SPO2プロモータ 一、 p e n Pプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、 PHO 5プロモーター、 PGKプロモーター、 GAP プロモーター、 ADHプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、 ポリヘドリンプロモーター、 P 10プロモーター などが好ましい。
発現ベクターとしては、 上記の他に、 所望によりェンハンサー、 スプライシン グシグナル、 ポリ A付加シグナル、 選択マーカー、 SV40複製オリジン （以下、 SV40 o r iと略称する場合がある） などを含有しているものを用いることが できる。 選択マーカーとしては、 例えば、 ジヒ ドロ葉酸還元酵素 （以下、 d h f rと略称する場合がある） 遺伝子 〔メソトレキセート （MTX) 耐性〕 、 アンピ シリン耐性遺伝子 （以下、 Ampr と略称する場合がある） 、 ネオマイシン耐性 遺伝子 （以下、 Ne o r と略称する場合がある、 G418耐性） 等が挙げられる。 特に、 d h f r遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、 d h f r遺伝子 を選択マーカーとして使用する場合、 目的遺伝子をチミジンを含まない培地によ つて選択することもできる。
また、 必要に応じて、 宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列 （シグ ナルコドン） を、 膜貫通型酵素またはその部分ペプチドをコードする DNAの 5' 末端側に付加するか、 あるいはネイティブなシグナル配列 （もしくはプレブ 口配列） と置換してもよい。 宿主がェシエリヒア属菌である場合、 PhoA 'シグ ナル配列、 OmpA■シグナル配列などが；宿主がバチルス属菌である場合、 一 ァミラーゼ■シグナル配列、 サブチリシン ·シグナル配列などが；宿主が酵母で ある場合、 MFひ ■シグナル配列、 SUC 2 ·シグナル配列などが；宿主が動物 細胞である場合、 ィンシュリン ·シグナル配列、 a—インターフェロン 'シグナ ル配列、 抗体分子 ·シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
宿主としては、 例えば、 ェシエリヒア属菌、 バチルス属菌、 酵母、 昆虫細胞、 昆虫、 動物細胞などが用いられる。
ェシェリヒア属菌としては、 例えば、 ェシェリヒア · コリ （Escherichia coli) K 12 ■ DH 1 〔プロシージングズ 'ォプ 'ザ 'ナショナル'ァカデミ 一 'ォプ■サイエンシィズ■ォブ'ザ 'ユーエスエー (Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 60卷， 160 (.1 968)〕 ， JM103 〔ヌクイレック 'ァシッズ' リサーチ （Nucleic Acids Research) ， 9卷， 309 (198 1)〕 ， J A 221 〔ジャーナル -ォプ -モレキュラー■ノ ィォロジー (Journal of Molecular Biology) ， 1 20卷， 517 (1978)〕 ， HB 101 〔ジャーナル'ォブ - モレキュラー .バイオロジー， 41卷， 459 (1 969)〕 ， C 600 〔ジエネ ティックス （Genetics) ， 39卷， 440 (1 954)〕 などが用いられる。
バチルス属菌としては、 例えば、 バチルス 'サブチルス （Bacillus subtilis) M I 1 14 〔ジーン， 24卷， 255 (1 983)〕 ， 207— 21
〔ジャーナル ·ォブ■バイオケミストリー （Journal of Biochemistry) ， 95 卷， 87 (1984)〕 などが用いられる。
酵母としては、 例えば、 サッカロマイセス セレビシェ （Saccharomyces cerevisiae) AH 22, AH22R— , ΝΑ87- 1 1 A, DKD—5D, 20 Β— 12、 シゾサッカロマイセス ポンべ (Schizosaccharomyces pombe) NC Y C 19 1 3 , NCYC 2036、 ピキア パストリス （Pichia pastoris) K Μ71などが用いられる。
昆虫細胞としては、 例えば、 ウィルスが Ac NPVの場合、 夜盗蛾の幼虫由来 株化細胞 (Spodoptera frugiperda cell； S f 細胞） 、 Trichoplusia niの中腸 由来の MG 1細胞、 Trichoplusia niの卵由来の High FiveTM細胞、 Maraestra brassicae由来の細胞、 Estigmena acrea由来の細胞などが用いられる。 ウイノレス が BmNPVの場合、 昆虫細胞としては、 蚕由来株化細胞 （Bombyx raori N細 胞； BmN細胞） などが用いられる。 該 S f細胞としては、 例えば、 S f 9細胞 (ATCC CRL1711) 、 S f 21細胞 （以上、 Vaughn, J. L.ら、 イン■ヴィポ （In Vivo) ,13， 213-217, (1977)) などが用いられる。
昆虫としては、 例えば、 カイコの幼虫などが用いられる 〔前田ら、 ネイチヤー (Nature) ， 3 15卷， 592 (1985)〕 。
動物細胞としては、 例えば、 サル細胞 COS— 7， V e r o, チャイニーズハ ムスター細胞 CHO (以下、 CHO細胞と略記） , d h f r遺伝子欠損チヤィニ ーズハムスター細胞 CHO (以下、 CHO (d h f r— ) 細胞と略記） ， マウス L細胞， マウス A t T— 20， マウスミエローマ細胞， ラット GH3, ヒト FL 細胞、 HEK293細胞、 H e L a細胞などが用いられる。
形質転換は、 宿主の種類に応じ、 公知の方法に従って実施することができる。 ェシェリヒァ属菌は、 例えば、 プロシージングズ ·ォブ■ザ ·ナショナル ·ァ 力デミ一 ·ォブ ·サイェンジィズ■ォプ，ザ ·ユーエスエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 69卷， 21 10 (1 972)やジーン （Gene) , 17卷， 107 (1982)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、 例えば、 モレキュラー 'アンド 'ジエネラノレ■ジエネティッ クス （Molecular & General Genetics) ， 168卷， 1 1 1 (1 979)などに 記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、 例えば、 メソッズ 'イン■ェンザィモロジ一 （Methods in
Enzymology) , 1 94卷， 182— 187 (1 991) 、 プロシージングズ ·ォ プ .ザ.ナショナル ·アカデミー ·ォプ ·サイェンシィズ .ォブ .ザ■ユーエス エー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 75卷， 1929 (1 978)などに記載 の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、 例えば、 パイオ テクノロジー （Bio/Technology) ,6， 47-55(1988)などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、 例えば、 細胞工学別冊 8 新細胞工学実験プロトコール. 263 - 267 (1 995) (秀潤社発行） 、 ヴイロロジー （Virology) ， 52巻， 4 56 (1 973)に記載の方法に従って形質転換することができる。
形質転換体の培養は、 宿主の種類に応じ、 公知の方法に従って実施することが できる。
例えば、 宿主がェシエリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養 する場合、 培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。 また、 培地は、 形質転換体の生育に必要な炭素源、 窒素源、 無機物などを含有することが好まし い。 ここで、 炭素源としては、 例えば、 グルコース、 デキストリン、 可溶性澱粉、 ショ糖などが；窒素源としては、 例えば、 アンモニゥム塩類、 硝酸塩類、 コーン スチープ. リカー、 ペプトン、 カゼイン、 肉エキス、 大豆粕、 バレイショ抽出液 などの無機または有機物質が；無機物としては、 例えば、 塩化カルシウム、 リン 酸二水素ナトリウム、 塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。 また、 培地 には、 酵母エキス、 ビタミン類、 生長促進因子などを添加してもよい。 培地の p Hは、 好ましくは約 5〜 8である。
宿主がェシ工リヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例 えば、 グルコース、 カザミノ酸を含む M 9培地 〔ミラー （Miller) , ジャーナ ノレ ·ォブ ·ェクスペリメンッ 'イン ·モレキュラー ·ジエネティックス
(Journal of Experiments in Molecular Genetics) , 431—433， Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1972〕 が好ましい。 必要により、 プ 口モーターを効率よく働かせるために、 例えば、 3 )3—インドリルアクリル酸の ような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がェシエリヒア属菌である形質転換体の培養は、 通常約 15〜43°Cで、 約 3〜24時間行なわれる。 必要により、 通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、 通常約 30〜40°Cで、 約 6 〜 24時間行なわれる。 必要により、 通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例えば、 バーク ホーノレダー （Burkholder) 最小培地 〔Bostian， K. L. ら、 プロシージングズ' ォブ ·ザ■ナショナル 'アカデミー 'ォプ■サイェンシィズ ·ォブ■ザ ·ユーェ スエー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) ， 77卷， 4505 (1 980)] や 0.
5%カザミノ酸を含有する SD培地 〔Bitter， G. A. ら、 プロシージングズ 'ォ プ .ザ.ナショナル ·アカデミー ·ォプ ·サイェンシィズ ·ォブ .ザ■ユーエス エー （Proc. Natl. Acad. Sci. USA) , 8 1卷， 5330 (1984) 〕 な どが挙げられる。 培地の ρΗは、 好ましくは約 5〜8である。 培養は、 通常約 2 0°C〜35°Cで、 約 24〜 72時間行なわれる。 必要に応じて、 通気や撹拌を行 つてもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例えば Grace's Insect Medium (Grace, T. C.C.，ネイチヤー
(Nature) , 195, 788(1962)) に非動化した 10 %ゥシ血清等の添力卩物を適宜加え たものなどが用いられる。 培地の ρΗは、 好ましくは約 6. 2〜6. 4である。 培養は、 通常約 27°Cで、 約 3〜5日間行なわれる。 必要に応じて通気や撹拌を 行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、 例えば、 約 5〜 20%の胎児牛血清を含む MEM培地 〔サイエンス （Science) , 1 22卷, 501 (1 952)〕 ， DMEM培地 〔ヴイロロジー （Virology) ， 8卷， 396 (1 959)〕 ， RPM I 1640培地 〔ジャーナル ·ォブ■ザ ·アメリカン · メティカノレ'アソシエーション (The Journal of the American Medical
Association) 1 99巻， 519 (1967)〕 ， 199培地 〔プロシージング■ ォブ ·ザ■ ソサイエティ ■フォー ·ザ ·バイオロジカル 'メディスン
(Proceeding of the Society for the Biological Medicine) ， 73 , 1、1 950)〕 などが用いられる。 培地の pHは、 好ましくは約 6〜8である。 培養 は、 通常約 30 °C〜 40 °Cで、 約 15〜 60時間行なわれる。 必要に応じて通気 や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、 形質転換体の細胞内または細胞外に膜貫通型酵素またはそ の部分ペプチドを生成させることができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物から、 膜貫通型酵素またはその部分 ぺプチドを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、 膜貫通型酵素またはその部分ぺプチドを培養菌体あるいは細胞から抽 出する場合、 培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に 懸濁し、 超音波、 リゾチームおよびノまたは凍結融解などによって菌体あるいは 細胞を破壌した後、 遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法な どが適宜用いられる。 該緩衝液は、 尿素や塩酸グァニジンなどの蛋白質変性剤や、 トリ トン X— 100™などの界面活性剤を含んでいてもよい。
このようにして得られた可溶性画分中に含まれる膜貫通型酵素またはその部分 ペプチドの単離精製は、 自体公知の方法に従って行うことができる。 このような 方法としては、 塩析ゃ溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、 限外ろ 過法、 ゲルろ過法、 および S D S—ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主 として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の 差を利用する方法；アブイ-ティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利 用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方 法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。 こ れらの方法は、 適宜 aみ合わせることもできる。
力べして得られる膜貫通型酵素またはその部分べプチドが遊離体である場合に は、 自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によつて該遊離体を塩に変換する ことができ、 該蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、 自体公知の 方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換すること ができる。
なお、 形質転換体が産生する膜貫通型酵素またはその部分ペプチドを、 精製前 または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、 任意に修飾をカロえ たり、 ポリペプチドを部分的に除去することもできる。 該蛋白修飾酵素としては、 例えば、 トリプシン、 キモトリプシン、 アルギニルェンドぺプチダーゼ、 プロテ インキナーゼ、 ダリコシダーゼなどが用いられる。
かくして得られる膜貫通型酵素またはその部分ペプチドの存在は、 特異抗体を 用いたェンザィムィムノアツセィゃウェスタンプロッティングなどにより確認す ることができる。
さらに、 膜貫通型酵素またはその部分ペプチドは、 それをコードする D N Aに 対応する R N Aを铸型として、 ゥサギ網状赤血球ライセート、 コムギ胚芽ライセ ート、 大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ翻 訳することによつても合成することができる。 あるいは、 さらに R NAポリメラ ーゼを含む無細胞転写 Z翻訳系を用いて、 膜貫通型酵素またはその部分ぺプチド をコードする D N Aを錄型としても合成することができる。 無細胞蛋白質 （転 写） 翻訳系は市販のものを用いることもできるし、 それ自体既知の方法、 具体的 には大腸菌抽出液は Pratt J. M. et al. , Transcription and Tranlation, 179 - 209， Hames B. D. &Higgins S. J. eds. , IRL Press, Oxford (1984)に記載の方法 等に準じて調製することもできる。 市販の細胞ライセートとしては、 大腸菌由来 のものは E. coli S30 extract system (Protnega社製）や RTS 500 Rapid
Tranlation System (Roche社製)等が挙げられ、 ゥサギ網状赤血球由来のものは Rabbit Reticulocyte Lysate System (Promega社製）等、 さらにコムギ胚芽由来 のものは PR0TEI0S™ (T0Y0B0社製）等が挙げられる。 このうちコムギ胚芽ライセ ートを用いたものが好適である。 コムギ胚芽ライセートの作製法としては、 例え ば Johnston F. B. et al. , Nature, 179， 160 - 161 (1957)あるレヽは Erickson A. H. et al. , Meth. Enzyraol. , 96， 38-50 (1996)等に記載の方法を用いることができ る。
蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、 バッチ法（Pratt, J. M. et al. (1984) 前述）や、 アミノ酸、 エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連 続式無細胞蛋白質合成システム （Spirin A. S. et al. , Science, 242, 1162- 1164 (1988) ) 、 透析法 （木川等、 第 21回日本分子生物学会、 WID6) 、 あるいは 重層法 (PR0TEI0S™ Wheat germ cell-free protein synthesis core kit取扱説 明書： T0Y0B0社製） 等が挙げられる。 さらには、 合成反応系に、 铸型の R NA、 アミノ酸、 エネルギー源等を必要時に供給し、 合成物や分解物を必要時に排出す る方法 （特開 2000- 333673) 等を用いることができる。
本発明のスクリーニング方法は、 上記のいずれかの方法によって得られる膜貫 通型酵素蛋白質または阻害物質結合型ぺプチドを用いて、 該蛋白質または該ぺプ チドへの被験物質の結合おょぴ該蛋白質または該ぺプチドの酵素活性を測定する ことを特徴とする。
酵素活性の測定は、 用いられる膜貫通型酵素に応じて、 従来公知のいかなる方 法を用いて行ってもよい。 例えば、 膜貫通型酵素が ]3セクレターゼの場合、 酵素 活性の測定は、 例えば、 上記特許文献 1に記載の方法、 特表平 1 1一 5 0 7 5 3 8号公報に記載の方法、 Science, 286, 735-741 (1999) , Nature, 402, 533-537 (1999)、 Nature, 402, 537-540 (1999)などに記載の方法等を用いて行うこと力 S できる。
具体的には、 例えば、 ]3セクレターゼ蛋白質または阻害物質結合型ペプチドを、 被験物質の存在下で、 3セクレターゼの天然もしくは合成の基質 [A P Pまたは その i3セクレターゼ切断部位を含むフラグメント、 あるいは該切断部位のァミノ 酸配列と同一もしくは実質的に同一のァミノ酸配列を含む合成べプチド （そのよ うな合成ペプチドは市販されており、 また、 当業者は A P Pの ]3セクレターゼ切 断部位近傍のァミノ酸配列を基にそのようなぺプチドを上記のぺプチド合成法を 用いて容易に合成することもできる） ] と接触させ、 適当な反応条件下で一定時 間インキュベートした後、 切断により生じた産物の一方もしくは両方を検出する 方法が挙げられる。 反応産物の検出法としては、 例えば、 反応液を S D S -ポリ アクリルアミド電気泳動 （S D S— P A G E ) に付し、 クーマシー 'ブリリアン ト ■ブルー ( C B B ) 染色等により 2本のバンド （および未切断の基質ペプチド のバンド） を可視化し、 デンシトメ一ターなどを用いて酵素活性を定量化する方 法、 標識剤でラベルした基質を用いて、 同様に S D S— P A G Eを行い、 ゲル上 の各バンドの標識量を検出する方法等が挙げられる。 標識剤としては、 例えば、 放射性同位元素、 酵素、 蛍光物質、 発光物質などが用いられる。 放射性同位元素 としては、 例えば、 2 5 I〕 、 3 1 I〕 、 〔3 H〕 、 C1 4 C) などが 用いられる。 上記酵素としては、 安定で比活性の大きなものが好ましく、 例えば、 βーガラクトシダーゼ、 β -ダルコシダーゼ、 アル力リフォスファターゼ、 パー ォキシダーゼ、 リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。 蛍光物質としては、 例え ば、 フルォレスカミン、 フルォレツセンイソチオシァネートなどが用いられる。 発光物質としては、 例えば、 ノレミノール、 ルミノール誘導体、 ルシフェリン、 ル シゲニンなどが用いられる。
好ましくは、 後述の実施例に示されるように、 蛍光ドナーおよび蛍光タエンチ ヤーで標識されたペプチドを基質として （蛍光ドナーと蛍光クェンチヤ一の間に セクレターゼ切断部位があるので、 未反応の基質はドナーとクェンチヤ一の接 近により蛍光が検出されないが、 セクレターゼ活性により該切断部位で開裂す るとクェンチヤ一が離れるため、 蛍光が検出される） 、 上記と同様に被験物質の 存在下で /3セクレターゼまたは阻害物質結合型ペプチドと反応させ、 反応液中の 蛍光を測定することにより、 J3セクレターゼ活性を測定することができる。 ここ で、 光ドナーとしては NE - Methylanthranoyl¾、 (7— methoxycoumarin—4- yl) acetyl¾、 4- { (4- ^dimethylamino; phenyl) azo) benzoic acid (dabcyl)、 Cy3B Cy5等が、 蛍光クェンチヤ一としては 2，4- dinitrophenyl基、 5- ( (2- (Fmoc) - y - L- glutaraylaminoethyl) amino; naphthalene-l-sulf onic acid(EDA S) Cy5Q、 Cy7Q などがそれぞれ例示されるが、 これらに限定されない。
膜貫通型酵素または阻害物質結合型ぺプチドと被験物質との結合は、 例えば、 表面プラズモン共鳴 （S P R ) 法を用いて、 市販のセンサーチップ （例えば、 Biacore製） の表面上に、 常法に従って膜貫通型酵素または阻害物質結合型ぺプ チドを固定化し、 これに被験物質を接触させた後、 該センサーチップに特定の波 長の光を特定の角度から照射し、 共鳴角度の変化を指標にして、 固定化した酵素 または阻害物質結合型ペプチドへの被験物質の結合の有無を判定することができ る。 あるいはまた、 質量分析計に適合可能なプロテインチップの表面上に膜貫通 型酵素または阻害物質結合型ぺプチドを固定化し、 これに被験物質を接触させた 後、 MALDI- MS、 ESI- MS、 FAB-MSなどのイオン化法と質量分析計 （例：二重収束質 量分析計、 四重極型分析計、 飛行時間型質量分析計、 フーリエ変換質量分析計、 イオンサイクロトロン質量分析計など） を組み合わせる方法により、 被験物質に 相当するピークの出現を検出することによつても、 膜貫通型酵素または阻害物質 結合型べプチドと被験物質との結合を測定することができるが、 これらの方法に 限定されず、 いかなる公知の他の方法も利用可能である。
被験物質が、 膜貫通型酵素または阻害物質結合型ぺプチドにおける膜貫通領域 内の標的結合部位に結合すること、 および該結合部位に結合することによって酵 素阻害活性を発揮していることの確認は、 上記した膜貫通型酵素または阻害物質 結合型べプチドの代わりに阻害物質非結合型ぺプチドを用いて、 上記と同様にし て酵素活性および被験物質の結合活性を測定することにより行うことができる。 その結果、 膜貫通型酵素または阻害物質結合型ペプチドに結合して該酵素活性 を阻害するが、 阻害物質非結合型ペプチドには結合せず、 且つ該酵素活性を阻害 しない物質を、 膜貫通領域内の標的結合部位に結合することにより酵素阻害活性 を発揮する化合物として選択することができる。
本発明はまた、 本発明のスクリーニング方法を実施するのに好適なスクリー二 ング用キットを提供する。 該キットは、 少なくとも（a) 対象となる膜貫通型酵素 または阻害物質結合型ペプチド、 および (b) 阻害物質非結合型ペプチドを構成と して含むものである。 該キットは、 さらに酵素活性の測定や結合試験に必要な試 薬類もしくは器具類 （例えば、 基質、 反応用緩衝液、 S P R用センサーチップ、 質量分析用プロテインチップ等） をさらに含んでもよい。
本発明のスクリーニング方法において、 膜貫通型酵素として /3セクレター を 用いることにより、 ]3セクレタ一ゼの膜貫通領域に結合する該酵素阻害物質を選 択することができる。 そのような化合物の例としては、 後記実施例で示される化 合物 A, D , H, I， Jなどが挙げられるが、 これらに限定されない。 該 )3セク レターゼ阻害物質は、 ]3セクレターゼの膜貫通領域に結合してその酵素活性を阻 害することから、 従来知られている遷移状態ミミックや ]3セクレターゼの活性中 心に作用するその他の阻害薬とは異なり、 /3セクレターゼへの選択性が高い。 即 ち、 構造の類似したポケットを有する他のァスパラギン酸プロテアーゼ （例えば、 レニンゃカテブシン Dなどの膜貫通型でないァスパラギン酸プロテアーゼ等） を 阻害する可能性が極めて低いので、 副作用 （例えば、 レニンゃカテブシン D阻害 による血圧低下など） を生じるおそれが少ない。 従って、 本発明のスクリーニン グ方法により選択され得る )3セクレターゼ選択的阻害物質は、 低毒性で安全な A D、 ダウン症、 老年性記憶障害 （AAM I ) 等の予防 '治療剤として用いること ができる （尚、 AAM Iは、 一般には、 加齢に伴ってみられる記憶力滅退で、 病 気や診断名ではなく、 生理的範囲であって病的過程を伴わない状態をいうとされ るが、 本明細書においては、 AAM Iの 「状態改善」 も含めて、 包括的に 「治 療」 という語を用いることとする） 。
0セクレターゼ選択的阻害物質を上記予防■治療剤として使用する場合は、 常 套手段に従って製剤化することができる。 例えば、 該阻害物質は、 必要に応じて 糖衣を施した錠剤、 力プセル剤、 ェリキシル剤、 マイクロ力プセル剤などとして 経口的に、 あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、 または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。 例えば、 該阻害物質 を、 生理学的に認められる公知の担体、 香味剤、 賦形剤、 べヒクル、 防腐剤、 安 定剤、 結合剤などとともに、 一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形 態で混和することによって製造することができる。 これら製剤における有効成分 量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにする
錠剤、 カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、 例えば、 ゼラ チン， コーンスターチ， トラガント， アラビアゴムのような結合剤、 結晶性セル ロースのような賦形剤、 コーンスターチ, ゼラチン， アルギン酸などのような膨 化剤、 ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、 ショ糖， 乳糖またはサッカリ ンのような甘味剤、 ペパーミント， ァカモノ油またはチェリーのような香味剤な どが用いられる。 調剤単位形態がカプセルである場合には、 上記タイプの材料に さらに油脂のような液状担体を含有することができる。 注射のための無菌組成物 • は注射用水のようなべヒクル中の活性物質、 胡麻油， 椰子油などのような天然産 出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方するこ とができる。 注射用の水性液としては、 例えば、 生理食塩水， ブドウ糖やその他 の補助薬を含む等張液 （例えば、 D-ソルビトール， D-マンニトール， 塩化ナトリ ゥムなど） などが用いられ、 適当な溶解補助剤、 例えば、 アルコール （例： エタ ノーノレ）、 ポリアノレコースレ （例： プロピレングリ コーノレ， ポリエチレングリ コー ル)、 非イオン性界面活性剤 （例： ポリソルベート SO™, HC0-50) などと併用し てもよい。 油性液としては、 例えば、 ゴマ油， 大豆油などが用いられ、 溶解補助 剤である安息香酸ベンジル， ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、 上記予防 '治療剤は、 例えば、 緩衝剤 （例えば、 リン酸塩緩衝液， 酢酸 ナトリウム緩衝液）、 無痛化剤 （例えば、 塩化ベンザルコニゥム， 塩酸プロカイ ンなど）、 安定剤 （例えば、 ヒト血清アルプミン， ポリエチレングリコールなど）、 保存剤 （例えば、 ベンジルアルコール， フエノールなど）、 酸化防止剤などと配 合してもよい。 調製された注射液は通常、 適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、 例えば、 ヒ トゃ他の 温血動物 （例えば、 ラット， マウス， ハムスター， ゥサギ， ヒッジ， ャギ， ブタ， ゥシ， ゥマ， ネコ， ィヌ， サル， チンパンジー， トリなど） に対して投与するこ とができる。
/3セクレターゼ選択的阻害物質の投与量は、 投与対象、 症状、 投与方法などに より差異はあるが、 経口投与の場合、 一般的に、 例えば AD患者 (60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 1〜100 mg、 好ましくは約 1. 0〜50 mg、 より好まし くは約 1. 0〜20 ragである。 非経口的に投与する場合は、 その 1回投与量は投与対 象、 症状、 投与方法などによっても異なるが、 例えば注射剤の形では、 通常、 例 えば AD患者 (60 kgとして） においては、 一日につき約 0. 01〜30 mg程度、 好ま しくは約 0. 1〜20 mg程度、 より好ましくは約 0. 1〜10 mg程度を投与するのが好都 合である。 他の動物の場合も、 60 kg当たりに換算した量を投与することができ る。
本発明のスクリーニング方法により選択され得る セクレターゼ阻害物質は、 活性中心に作用する セクレターゼ阻害薬のように、 構造の最適化において、 他 のァスパラギン酸プロテアーゼに対する阻害作用による制限を受けることなく構 造展開が可能なリ一ド化合物となりうる点でも有利である。 本明細書おょぴ図面において、 塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、 I UP AC— I UB Commission on Biochemical Nomenclature による略 ある いは当該分野における慣用略号に基づくものであり、 その例を下記する。 またァ ミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、 特に明示しなければ L体を示すもの とする。
DNA ：デォキシリポ核酸
c DNA ：相補的デォキシリボ核酸
A ：アデニン
T ：チミン
G ：グァニン
C ：シトシン
RNA ： リボ核酸
mRNA ：メッセンジャーリポ核酸
d AT P ：デォキシアデノシン三リン酸
d TT P ：デォキシチミジン三リン酸
d GT P ：デォキシグアノシン三リン酸
d CT P ：デォキシシチジン三リン酸
ATP ：アデノシン三リン酸
EDTA ：エチレンジァミン四酢酸
SD S ： ドデシル硫酸ナトリゥム
G 1 y ：グリシン
A 1 a ：ァラニン
V a 1 ：バリン
L e u ： ロイシン
I 1 e ：イソロイシン S e r ： セリン
Th r ： スレ才ニン
C y s ： システィン
Me t ： メチォニン
G 1 u ： グノレタミン酸
As ： ァスパラギン酸
L y s ： リジン
A r g ： アルギニン
H i s ： ヒスチジン
P h e ： フエニノレアラニン
T y r ：チロシン
T r p ： トリブトファン
P r o ：プロリン
A s n ： ァスパラギン
G 1 n ： グルタミン
p G 1 u ： ピログノレタミン酸
Me ： メチル基
E t ：ェチノレ基
B u ：プチル基
P h ： フエニル基
TC ：チアゾリジンー4 (R) 一カルボキサミ ド基
また、 本明細書中で繁用される置換基、 保護基および試薬を下記の記号で表記 する。
T o s ： ρ—トノレエンスノレフォニノレ
CHO ： ホルミル
B z 1 ： ベンジノレ Cl2 B z 1 ： 2， 6—ジクロ口べンジノレ
B om ：ベンジノレォキシメチノレ
Z ：ペンジノレオキシカノレポ二ノレ
C 1— z ： 2—クロ口ベンジルォキシカノレボニル
B r— Z ： 2—プロモベンジルォキシカルポニル
B o c ： tープトキシカルボニル
DNP ：ジニト口フエノーノレ
T r t ： トリチル
Bum ： tープトキシメチル
F m o c ： N— 9—フルォレニルメ トキシカルポ二ノレ
HOB t ： 1—ヒドロキシベンズトリアゾール
HOOB t ： 3， 4—ジヒ ドロー 3—ヒ ドロキシ一4—ォキソ一
1, 2, 3—べンゾトリァジン
HONB ： 1-ヒドロキシ- 5-ノルポルネン- 2, 3-ジカルポキシィ
DCC ： N, N' ージシクロへキシルカルポジイミ ド
本発明は、 さらに以下の参考例、 実施例によって詳しく説明されるが、 これら の例は単なる実例であって、 本発明を限定するものではなく、 また本発明の範囲 を逸脱しない範囲で変化させてもよい。 実施例
以下の実施例で用いられる 5化合物：
化合物 A
Figure imgf000047_0001
Figure imgf000048_0001
化合物 H
Figure imgf000048_0002
化合物 I
Figure imgf000048_0003
化合物 J
Figure imgf000048_0004
は、 上記特許文献 1の記載に従って製造した 尚、 大腸菌を用いての遺伝子操作法は、 モレキュラー 'クローユング
(Molecular cloning) に記載されている方法に従った。 参考例 1 ]3セクレターゼの全長蛋白の発現用プラスミ ドの調製
)3セクレターゼの全長蛋白を調製するための発現用プラスミ ドの構築は、 /3セ クレターゼをコードする遺伝子の塩基配列において、 Bennettらが報告 （Science 286， 735-741 (1999) ) している塩基配列と比較して、 クローン番号 FG04087
(GenBank Accession No.AB032975s かずさ DN A研究所） の塩基配列に 1塩基 の揷入 （第 102番目） があったため、 変換を行い、 さらに精製が容易なように C末端側に F 1 a gペプチド （Asp- Tyr_Lys- Asp- Asp- Asp- Asp- Lys (配列番号： 4) ) をコードする塩基配列（ 5， - GATTACAAGGATGACGACGATAAG - 3， （配列番 号： 3) )を付加した。 まず、 クローン番号 FG04087の遺伝子を铸型に、 Bennett らが報告している セクレターゼ遺伝子塩基配列を参考に作製したプライマー セット ： 5'— GGCACCACCMCCTTCGT— 3' (配列番号： 5) と F 1 a gぺプチドを コードする塩基配列を含む 5'―
GGTACCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCCTTCAGCAGGGAGATGTCATCAG- 3， （配列番号： 6) とを各 20 pmo 1ずつ添加し、 KOD (東洋紡） を使用して PCR反応を MiniCyclerTM (ェムジエイリサーチ） にて行った （反応条件： 94°Cで 2分間 を 1サイクル、 98 °Cで 15秒間、 72 °Cで 2秒間、 74 °Cで 10秒間を 3サイ クル、 98 °Cで 1 5秒間、 68 °Cで 2秒間、 74°Cで 10秒間を 3サイクル、 9 8 °Cで 15秒間、 64 °Cで 2秒間、 74 °Cで 10秒間を 3サイクル、 98 °Cで 1 5秒間、 60でで 2秒間、 74 °Cで 10秒間を 28サイクル） 。 その P C R産物 をァガロースゲル電気泳動し、 約 700 b p の DNA断片を回収した。 その断 片を Zero Blunt T0P0 PCR Cloning Kit (インビトロジェン） を用いて、 クロー ユングした。 得られたプラスミドを制限酵素 Ap a I (宝酒造） と Kp n l (宝 酒造） で消化した後、 ァガロースゲル電気泳動し、 約 250 b ρの DNA断片を 回収した。 クローン番号 FG04087を含むプラスミドを A p a Iで消化した後、 ァ ガロースゲル電気泳動し、 約 1. 2 k b p .の DNA断片を回収した。 これら D NA断片と Ap a Iと Kp n I で消化した動物細胞用発現プラスミド p cDN A3. 1 (一） （フナコシ） を混合し、 Ligation High (東洋紡） を用いて連結し、 大腸菌 JM109のコンビテントセル （宝酒造） を形質転換することでプラスミ ド; p BACE- Fを得た。 次に 1塩基挿入の変換を行うために、 クローン番号 FG04087の遺伝子を錄型に、 Bennettらが報告している β—セクレターゼ遺伝子塩 基配列を参考に作製したプライマーセット ： 5，一 TMTACGACTCACTATAGGG— 3， (配列番号： 7) と 5'— GGCGCCCCCCAGACCACTTCTCAG— 3' (配列番号： 8) を各 20 pmo 1 ずつ添加し、 KOD (東洋紡） を使用して、 PCR反応を
MiniCyclerTMにて行った （反応条件： 94°Cで 2分間を 1サイクル、 98°Cで 15秒間、 72 °Cで 2秒間、 74 °Cで 10秒間を 3サイクル、 98 °Cで 1 5秒間、 68でで 2秒間、 74 °Cで 5秒間を 3サイクル、 98 °Cで 15秒間、 64 °Cで 2 秒間、 74 °Cで 5秒間を 3サイクル、 98 °Cで 1 5秒間、 60でで 2秒間、 7 4°Cで 5秒間を 28サイクル） 。 その P CR産物をァガロースゲル電気泳動し、 約 170 b p の DNA断片を回収した。 その断片を Zero Blunt T0P0PCR
Cloning Kit (インビトロジェン） を用いて、 クローニングした。 得られたプラ スミドを制限酵素 A p a I (宝酒造） と B b e I (宝酒造） で消化した後、 ァガ ロースゲル電気泳動し、 約 120 b p の DNA断片を回収した。 pBACE-F を同様の制限酵素で消化した後、 ァガロースゲル電気泳動し、 約 1. l k b p の DNA断片を回収した。 さらに p BACE- Fを Ap a Iで消化した後、 ァガ ロースゲル電気泳動し、 約 5. 7 kbpの DNA断片を回収した。 これらの 3つの 断片を Ligation Highを用いて連結し、 大腸菌 J M 109のコンビテントセルを 形質転換することでプラスミド p BACE 1-501を得た。 得られた cDNA 断片は、 配列番号： 9で表わされる塩基配列を有しており、 その塩基配列の第 1 番目〜第 1 527番目に配列番号： 10で表わされるアミノ酸酉己列がコードされ ていた。 参考例 2 ]3セクレターゼの全長蛋白の HE K 2 9 3細胞での発現と精製
/3セクレターゼの全長蛋白 （BACE 1— 5 0 1) の発現は FreeStyle 293 Expression System (インビトロジェン） を用いて行った。 FreeStyle 293- F細 胞を 1. 1 X c e 1 1 s /m 1になるように FreeStyle 293 Expression Medium 140m lに播種した。 293fectin200 μ 1を 5 m 1の Opti- MEM I培地で希釈 し、 5m lの Opti- MEM I培地で希釈した 1 50 gの発現用プラスミドと混合し 20分間、 室温で放置した後に FreeStyle 293- F細胞に添加した。 3 7°C、 8% 炭酸ガス、 1 2 5 r pmで 2日間振とう培養後、 細胞を回収し、 5m lの縣濁用 緩衝液 (0. O lM T r i s— HC 1 (pH8) 、 0. 1 5M Na C l、 1 m M EDTA、 0. 5mM PMSF) を添加後、 超音波破碎機 （トミー精ェ）
(破碎条件：アウトプット 5、 1 5秒間 4回） を用いて破碎した。 その破砕液 を遠心分離 （500 g、 1 0分間） し、 その上清をさらに遠心分離 （1 00， 0 00 g、 45分間） し、 その沈殿物を 0. 5 m 1の可溶化用緩衝液 （0. 0 1 M T r i s— HC 1 (pH8) 、 0. 05M オタチル一 ]3—ダルコシド 1 mM E DTA、 0. 5mM PMS F) で可溶化 （4°C、 2. 5時間） した後、 遠心分 離'（1 00， 000 g、 45分間） した。 その上清を 1 00 /X 1の抗 F 1 a g抗 体 （シグマ） を用いて精製した。 その結果、 目的の BACE 1— 50 1を 3 9 5 /i g取得できた。 参考例 3 BACE 1— 50 1蛋白に対する化合物 A、 D、 H、 Iおよび Jの阻 害様式の解析 ·
9 6穴黒色プレート （コーユング） に 25 i lの 0. 0 5M酢酸緩衝液 (p H5. 5) 、 Ι Ο μ Ιの 0. 1 mM、 0. 1 5 mM、 0. 2 5 mM、 0. 5 mM 1 mM各基質 (Nma-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Lys (Dnp) -Arg-Arg-NHo ； 配列番号： 1 1) 、 上記 （2) で得られた 1 Ομ 1の BACE 1— 501 (0. 07mg/m l) 、 5 /ζ 1の 0. 1 mM、 0. 3 mM各化合物 A 10 %DM S O 溶液、 対照には 5 1の 10 °/0DM S Oをそれぞれ添加し、 37 °Cにて 20時間 反応した。 反応終了後、 蛍光強度 （励起波長 325 nm、 測定波長 460 nm) をフルォロスキャンアセント （ラボシステムズ） を用いて測定した。 各濃度の化 合物存在下における蛍光値の変化量の逆数を縦軸に基質濃度の逆数を横軸にプロ ット （ラインゥエーバ一一バークプロット） した結果、 いずれの化合物も横軸上 で直線が交差したことから全長 BACE 1—501に対する阻害様式は非拮抗型 阻害であることが明らかになった。 一例として化合物 Dのグラフを図 1に示す。 各化合物は全長 BACE 1— 501を非拮抗的に阻害することから活性部位以 外に結合しているものと考えられた。 次に、 その結合部位を明らかにするため、 各ドメインからなる蛋白を調製し、 阻害およぴ結合実験を行つた。 参考例 4 ]3セクレターゼの細胞外ドメインからなる蛋白およぴ細胞外ドメイン と膜貫通ドメインから ¾る蛋白の発現用プラスミドの調製
]3セクレターゼの細胞外ドメインからなる蛋白を調製するための発現用プラス ミドは、 第 1番目〜第 454番目のアミノ酸に F 1 a gペプチドが付加された塩 基配列を有するものを調製した。 まず、 プラスミド pBACE 1—501を錶型 にプライマーセット： 5' -GCTGGCTAGCGTTTAAACGGGCCCTCTAGA- 3 ' (配列番号： 12 ) と 5， - TTTTGGTACCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGGTTGACTCATCTGTC - 3， (配列番号： 1 3) を各 20 p m o 1ずつ添加し、 pfu Turbo (ストラッタジー ン） を使用して、 PCR反応を Gene Amp PCR system 9700 (アプライドバイオシ ステム） にて行った （反応条件： 94°Cで 1分間を 1サイクル、 94°Cで 30秒 間、 58°Cで 30秒間、 72°Cで 2分間を 20サイクル） 。 その PCR産物をァ ガロースゲル電気泳動し、 約 1. 4 k b pの DNA断片を回収した。 得られた D NA断片を制限酵素 Nh e I (宝酒造） と Kp n Iを用いて消化した後、 スピン カラム S— 300 (アマシャムバイオサイエンス） を用いて回収した。 これら D NA断片と Nh e Iと Kp n Iで消化した p c DNA3. 1 (—） を混合し、 Ligation Highを用いて連結し、 大腸菌 DH 5— αのコンビテントセル （東洋 紡） を形質転換することでプラスミド pBACE l— 454を得た。 得られた c DNA断片は、 配列番号： 14で表わされる塩基配列を有しており、 その塩基配 列の第 1番目〜第 1386番目に配列番号： 15で表わされるァミノ酸配列がコ 一ドされていた。
セクレターゼの細胞外ドメイン部分と膜貫通ドメインからなる蛋白を調製す るための発現用プラスミドの調製は、 第 1番目〜第 474番目のアミノ酸に F 1 a gペプチドが付加された塩基配列を有するものを調製した。 まず、 プラスミド p BACE l— 501を铸型にプライマーセット ： 5'—
GCTGGCTAGCGTTTAAACGGGCCCTCTAGA- 3， （配列番号： 12) と 5 '—
TTTTGGTACCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGCAGAGTGGCAGCATG- 3 ' (配列番号： 1 6) を各 20 pmo l ずつ添加し、 pfu Turboを使用して、 PCR反応を Gene Amp PCR system 9700にて行った （反応条件： 94°Cで 1分間を 1サイクル、 9 4。Cで 30秒間、 58でで 30秒間、 72 で 2分間を 20サイクル） 。 その P CR産物をァガロースゲル電気泳動し、 約 1. 5 k b pの DNA断片を回収した。 得られた DNA断片を制限酵素 Nh e Iと Kp n Iを用いて消化した後、 スピン カラム S— 300を用いて回収した。 これら DNA断片と Nh e Iと Kp n Iで 消化した p c DNA3. 1 (-) を混合し、 Ligation Highを用いて連結し、 大腸 菌 DH5—ひのコンビテントセルを形質転換することでプラスミド p BACE 1 —474を得た。 得られた cDNA断片は、 配列番号： 17で表わされる塩基配 列を有しており、 その塩基配列の第 1番目〜第 1446番目に配列番号： 18で 表わされるアミノ酸配列がコードされていた。 参考例 5 ]3セクレターゼの細胞外ドメインからなる蛋白 （BACE 1— 45 4) および細胞外ドメインと膜貫通ドメインからなる蛋白 （BACE 1— 4 7 4) の HEK 2 9 3細胞での発現と精製
各蛋白の発現は FreeStyle 293 Expression System (インビトロジェン） を用 いて行った。 FreeStyle 293 - F細胞を 1. 1 X c e 1 1 s /m 1になるように . FreeStyle 293 Expression Medium 1 4 0m lに播種した。 293fectin20 0 μ 1を 5 m 1の Opti- MEM I培地で希釈し、 5m lの Opti- MEM I培地で希釈した 1 5 0 μ gの発現用プラスミドと混合し 2 0分間、 室温で放置した後に FreeStyle 293- F細胞に添加した。 3 7°C、 8%炭酸ガス、 1 2 5 r p mで 2日間振とう培 養後、 B AC E 1— 4 74については細胞を回収し、 5 m lの縣濁用緩衝液 (0. O lM T r i s— HC 1 (p H8) 、 0. 1 5M N a C l、 1 mM EDTAヽ 0. 5mM PMS F) を添加後、 超音波破砕機 （トミー精ェ） （破碎条件：ァ ゥトプット 5、 1 5秒間 4回） を用いて破砕した。 その破碎液を遠心分離 （5 00 g、 1 0分間） し、 その上清をさらに遠心分離 （1 0 0， 00 0 g、 4 5分 間） し、 その沈殿物を 0. 5m lの可溶化用緩衝液 (0. O lM T r i s— H C 1 (p H 8) 、 0. 0 5M ォクチルー ]3—ダルコシド 1 mM EDTA、 0. 5mM PMS F) で可溶化 （4°C、 2. 5時間） した後、 遠心分離 （1 0 0， 0 0 0 g、 4 5分間） した。 その上清を 1 0 0 μ 1の抗 F 1 a g抗体を用いて精 製した。 その結果、 目的の BACE 1— 4 74を 7 0 / g取得できた。 BACE 1 - 4 5 4については培養上清を回収し、 1 0 0 μ 1の抗 F 1 a g抗体を用いて 精製した。 その結果、 目的の BAC E 1— 4 5 4を 1 4 μ g取得できた。 実施例 1 各 B AC E蛋白に対する化合物 A、 D、 H、 Iおよび Jの阻害作用の 測定
9 6穴黒色プレートに 2 5 μ 1の 0. 0 5Μ酢酸緩衝液 （ρ Η 5. 5) 、 1 0 1の 2 5 0 基質 （ Nma-Ser-Glu-Val-Lys-Met-Asp-Ala-Glu-Lys(Dnp)- Arg-Arg- H2 ；配列番号： 1 1) 、 上記参考例 5で得られた 1 0 /i 1の BACE 1-474 (0. 02mg/m 1 ) または BACE 1—454 (0. 01 m g / m l ) あるいは細胞外ドメインとして市販されている組換え型ヒト BACE— 1
(アミノ酸残基 1一 460、 アールアンドディーシステムズ） （0. 025mg /m 1 ) 、 5 μ 1の各化合物 10 %DMS Ο溶液、 対照には 5 μ 1の 10 %DM SOをそれぞれ添加し、 37 °Cにて 63時間反応した。 反応終了後、 蛍光強度
(励起波長 325 nm、 測定波長 460 nm) をフルォロスキャンアセントを用 いて測定した。 各化合物 （終濃度は Ι Ο^Μ) は BACE 1—474に対して 3 0% (化合物 A) 、 38% (化合物 D) 、 34% (化合物 H) 、 37% (化合物 I) 、 37% (化合物】） の阻害率を示したが、 BACE 1— 454およぴ耝換 ぇ型ヒト BACE— 1に対しては阻害活性を示さなかった。 実施例 2 表面プラズモン共鳴法を用いた各 BACE蛋白と化合物 A、 D、 H、 Iおよび Jとの結合の検出
表面プラズモン共鳴法を用いた解析には B i a c o r e 3000 (ビアコア） を用いた。 BACE 1— 501およぴ組換え型ヒト BACE— 1 (アミノ酸残基 1-460) は、 ； pH4. 5の酢酸バッファ一中で、 N- hydrosuccinimide(NH S)/N - ethyl~ - (3 - dimethyl - aminopropy丄)一 carboaiimide hydrochloride 、£ DC) で活性化した CM 5センサーチップ (carboxymethylated dextran matrix chip) 上の力ルポキシル基に固相化した。 BACE 1— 454、 BACE 1 -4 74は pH4. 0の酢酸バッファ一中で同様の方法で固相化した。 化合物と酵素 の結合は 10%DMSOと 0. 005%S u r f a c t a n t P 20 を含む P B S中で測定した。 バルタ効果により生じるフローセル間での Resonance Unit (RU) 値のずれの修正は、 DMSO濃度を 9%から 1 1%までの 5段階に変化 させたバッファーを用いて作成した捕正曲線を用いて行なった。 その結果、 BA CE 1— 501と BACE 1— 474に結合することを示すシグナルが得られた。 一方、 BACE 1—454と組換え型ヒト BACE— 1 (アミノ酸残基 1—46 0) に対しては、 結合を示すシグナルは得られなかっ 。 一例として BACE 1 一 501と化合物 Jとの結合を示すシグナル図を図 2に示す。
各化合物は膜貫通領域の 46 1番目から 474番目のアミノ酸のいずれかの部 位に結合することによって全長 BACE 1— 501を阻害することが明らかにな つた。 次に、 膜貫通領域の 461番目から 474番目のアミノ酸のどの部分に結 合することにより阻害するかを詳細に検討するため、 BACE 1— 474のカル ボキシル末端側からアミノ酸を削除した蛋白を作製し、 阻害および結合実験を行 つた。 参考例 6 BACE 1—474のカルボキシル末端側からアミノ酸を削除した ]3 セクレターゼ蛋白発現プラスミドの構築
BACE 1-474のカルボキシル末端側から段階的にアミノ酸を削除した ]3 セクレターゼ蛋白発現プラスミ ドの調製を行った。 まず、 第 1番目〜第 471番 目のアミノ酸に F 1 a gペプチドが付加された塩基配歹 ljを有するものの調製には プラスミド p BACE 1 -474を铸型にプライマーセット ： 5，一
CATCTGCGCCCTCTTCATGCTGGATTACAAGGATGACGACG- 3， （配列番号： 1 9) と 5，一 CGTCGTCATCCTTGTAATCCAGCATGAAGAGGGCGCAGATG- 3， （配列番号： 20 ) と QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (ストラッタジーン J を用いて 9塩基の削除することでプラスミド p BACE 1-471を得た。 得られた cD NA断片は、 配列番号： 2 1で表わされる塩基配列を有しており、 その塩基配列 の第 1番目〜第 1437番目に配列番号： 22で表わされるアミノ酸配列がコー ドされていた。
次に第 1番目〜第 469番目のアミノ酸に F 1 a gペプチドが付加された塩基 配列を有するものを調製した。 プラスミド p BACE 1-474を錄型にプライ マーセット ： 5'—GCTGGCTAGCGTTTAMCGGGCCCTCTAGA— 3， （配列番号： 12) と 5， - TTTTGGTACCTACTTATCGTCGTCATCCTTGTAATCGAAGAGGGCGCAGATG - 3 ' (配列番 号： 2 3) を各 2 0 pmo l ずつ添加し、 pfu Turboを使用して、 P CR反応を Gene Amp PCR system 9ァ00にて行った （反応条件： 9 4°Cで 1分間を 1サイクル、
9 4でで 3 0秒間、 5 8 °Cで 3 0秒間、 7 2 °Cで 2分間を 2 0サイクル） 。 その
P CR産物をァガロースゲル電気泳動し、 約 1. 4 k b p の DNA断片を回収 した。 得られた DNA断片を制限酵素 Nh e Iと Kp n Iを用いて消化した後、 スピンカラム S— 3 0 0を用いて回収した。 これら DNA断片と Nh e Iと Kp n I で消化した; p c DNA 3. 1 (—） を混合し、 Ligation Highを用いて連結 し、 大腸菌 D H 5— αのコンビテントセルを形質転換することでプラスミ ド ρ Β 〇£ 1— 4 6 9を得た。 得られた c DNA断片は、 配列番号： 2 4で表わされ る塩基配列を有しており、 その塩基配列の第 1番目〜第 1 4 3 1番目に配列番 号： 2 5で表わされるアミノ酸配列がコードされていた。 さらに第 1番目〜第 4
6 5番目のアミノ酸に F l a gペプチドが付加された塩基配列を有するものを調 製した。 すなわち、 プラスミド p BACE 1— 4 6 9を錄型にプライマーセッ ト ： 5， -GGCTATGTCATGGCTGCCATCGATTACAAGGATGACGACG- 3， （配列番号： 2 6) と 5' - CGTCGTCATCCTTGTAATCGATGGCAGCCATGACATAGGC - 3' (配列番号： 2 7) 'と QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kitを用いて 1 2塩基を肖 lj除するこ とでプラスミド p B AC E 1—4 6 5を得た。 得られた c DNA断片は、 配列番 号： 28で表わされる塩基配列を有しており、 その塩基配列の第 1番目〜第 1 4
1 9番目に配列番号： 2 9で表わされるアミノ酸配列がコードされていた。 参考例 7 B ACE 1 - 4 7 1および BACE 1— 4 6 5の HEK 2 9 3細胞で の発現と精製
各蛋白の発現は FreeStyle 293 Expression System (インビトロジェン） を用 いて行った。 FreeStyle 293- F細胞を 1. 1 X c e 1 1 s /m 1になるように FreeStyle 293 Expression Medium 1 4 0m lに播種した。 293fectin20 0 μ 1を 5 m 1の Opt i- MEM I培地で希釈し、 5 m 1の Opti- MEM I培地で希釈した 1 5 0 μ gの発現用プラスミドと混合し 2 0分間、 室温で放置した後に Freestyle 293- F細胞に添加した。 3 7°C、 8%炭酸ガス、 1 2 5 r pmで 2日間振とう培 養後、 BACE 1— 4 7 1については細胞を回収し、 5m lの縣濁用緩衝液 （0. O lM T r i s—HC l (p H8) 、 0. 1 5M N a C l、 1 mM EDTA、 0. 5mM PMS F) を添加後、 超音波破砕機 （トミー精ェ） （破碎条件：ァ ゥトプット 5、 1 5秒間 4回） を用いて破砕した。 その破砕液を遠心分離 （5 O O g、 1 0分間） し、 その上清をさらに遠心分離 （1 0 0， 00 0 g、 4 5分 間） し、 その沈殿物を 0. 5m lの可溶化用緩衝液 （0. O lM T r i s— H C 1 (p H 8) 、 0. 0 5M ォクチル一 ]3—ダルコシド I mM EDTA、 0. 5mM PMS F) で可溶化 （4°C、 2. 5時間） した後、 遠心分離 （1 0 0，
0 0 0 g、 4 5分間） した。 その上清を 1 0 0 / 1の抗 F 1 a g抗体を用いて精 製した。 その結果、 目的の BAC E 1— 4 7 1を 1 0 5 t g取得できた。 BAC E 1 -4 6 5については培養上清を回収し、 1 0 0 μ 1の抗 F 1 a g抗体を用い て精製した。 その結果、 目的の BAC E 1— 4 6 5を 9 1 g取得できた。 実施例 3 BAC E 1 _ 4 7 1および 1一 4 6 5に対する化合物 A、 D、 H、 I および Jの阻害作用の測定
9 6穴黒色プレートに 2 5 μ 1の 0. 0 5Μ酢酸緩衝液 （ρ Η 5. 5) 、 1 0 μ 1の 2 5 0 μΜ基質 （Nma-Ser- Glu- Val-Lys- Met-Asp- Ala- Glu- Lys(Dnp)- Arg-Arg-NH2 ；配列番号： 1 1) 、 上記参考例 7で得られた 1 0 μ 1の BACE 1 - 4 7 1 (0. 0 5mg/m 1 ) または BACE 1—4 6 5 (0. 04mg/ m 1 ) 、 5 μ 1の 0. 1 mM化合物 A 1 0 %DMS O溶液、 対照には 5 /x 1の 1 0%DMS Oをそれぞれ添加じ、 3 7°Cにて B ACE 1—4 7 1については 5 0 時間、 BACE 1—4 6 5については 2 2時間反応した。 反応終了後、 蛍光強度 (励起波長 3 2 5 nm、 測定波長 4 6 0 nm) をフルォロスキャンアセントを用 いて測定した。 各化合物 （終濃度は 1 0 μΜ) は BACE 1— 4 7 1に対して 2 9% (化合物 A) 、 42% (化合物 D) 、 3 1% (化合物 H) 、 70% (化合物 I) 、 48% (化合物 J) の阻害率を示したが、 BACE 1— 465に対しては 阻害活性を示さなかった。 実施例 4 表面プラズモン共鳴法を用いた BACE 1— 471および BACE 1 —465と化合物 A、 D、 H、 Iおよび Jとの結合の検出
表面プラズモン共鳴法を用いた解析には B i a c o r e 3000を用いた。 B ACE 1—465は、 ： H4. 5の酢酸バッファ一中で NH S^E D Cで活性化 した CM 5センサーチップ上のカルボキシル基に固相化した。 、 BACE 1—4 65は、 pH4. 0の酢酸バッファ一中で同様に固相化した。 化合物と酵素の結 合は 10%DMSOと 0. 005%S u r f a c t a n t P 20 を含む PB S 中で測定した。 バルタ効果により生じるフローセル間での RU値のずれの修正は、 DMSO濃度を 9%から 1 1%までの 5段階に変化させたバッファーを用いて作 成した補正曲線を用いて行なった。 その結果、 各化合物が BACE 1—471に 結合することを示すシグナルが得られた。 し力 し、 BACE 1—465に結合す ることを示すシグナルは得られなかった。
以上の結果から化合物 A、 D、 H、 Iおよび Jは ]3セクレターゼの 466番目 から 471番目のアミノ酸位置に結合し、 阻害活性を示すことが明らかとなった。 このことは セクレターゼの 466番目から 471番目のアミノ酸位置は活性調 節に重要な影響を及ぼす部位であることを示している。 産業上の利用可能性
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られう る、 膜貫通領域に結合することにより ]3セクレターゼ活性を阻害する化合物は、 従来知られている遷移状態ミミックやその他の活性中心に作用する阻害薬等とは 異なる /3セクレターゼ阻害様式を示すこと力ゝら、 セクレターゼを阻害すること により予防 '治療効果が期待される疾患、 例えば AD、 ダウン症などの A/3の異 常蓄積が関与する疾患、 A AM Iなどの状態の予防■治療において有利な特性
(例えば、 ]3セクレターゼ選択的に作用し、 レニンゃカテブシン D等の他のァス パラギン酸プロテアーゼを阻害しないなど） を有する可能性がある。 従って、 本 発明のスクリーニング方法は、 副作用の危険性が低いような、 新規な阻害作用点 を有する AD、 ダウン症、 AAMI等の予防 '治療薬の探索に有用である。 本出願は、 日本で出願された特願 2004— 290784 (出願日 ： 2004 年 10月 1日） を基礎としており、 その内容は本明細書に全て包含されるもので ある。 配列表フリーテキスト
[配列番号 3]
F 1 a gぺプチドをコ一ドするオリゴヌクレオチド。
[配列番号 4]
合成コンストラクト。
[配列番号 5]
プライマー。
[配列番号 6]
プライマー。
[配列番号 7]
プライマー。
[配列番号 8]
プライマー。
[配列番号 9]
(1504).. (1527) F 1 a gタグ。 [配列番号 1 1]
セクレターゼの合成基質。
(I) .. (1) N—メチルアントラノィル一Lーセリン (9).. (9) 2， 4ージニトロフエ二ルー L—リシン
(II) .. (11) アミド化
[配列番号 12]
プライマー。
[配列番号 13]
プライマー。
[配列番号 14]
(1363).. (1386) F 1 a gタグ。
[配列番号 16]
プライマー。
[配列番号 17]
(1423).. (1446) F 1 a gタグ <
[配列番号 19]
プライマー。
[配列番号 20]
プライマー。
[配列番号 21]
(1414).. (1437) F 1 a gタグ。
[配列番号 23]
プライマー。
[配列番号 24]
(1408).. (1431) F 1 a gタグ。
[配列番号 26] プライマー。
[配列番号 27]
プライマ一。
[配列番号 28]
(1396).. (1419) F 1 a gタグ。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 膜貫通型酵素の活性中心を含む領域と膜貫通領域の一部もしくは全部とを含 む、 該酵素のァミノ酸配列の一部または全部を有する蛋白質を用いることを特徴 とする、 膜貫通領域に特異的に結合する該酵素阻害物質のスクリーニング方法。
2 . 活性中心を含む領域を含み且つ前記膜貫通領域の一部もしくは全部を欠く、 膜貫通型酵素のアミノ酸配列の一部を有する蛋白質をさらに用い、 各蛋白質への 被験物質の結合および各蛋白質の酵素活性を測定することを特徴とする、 請求項 1記載の方法。
3 . 活性中心を含む領域が細胞外もしくは内腔領域である請求項 1記載の方法。
4 . 膜貫通型酵素がプロテアーゼである請求項 1記載の方法。
5 . プロテアーゼがァスパラギン酸プ口テアーゼである請求項 4記載の方法。
6 . ァスパラギン酸プロテアーゼが ]3セクレターゼである請求項 5記載の方法。
7 . /3セクレターゼの活性中心を含む領域が配列番号 2で表されるァミノ酸配列 中アミノ酸番号 4 6〜4 5 4で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同 一のアミノ酸配列を有し、 該酵素の膜貫通領域が配列番号 2で表されるアミノ酸 配列中アミノ酸番号 4 5 5〜4 8 0で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質 的に同一のアミノ酸配列を有するものである、 請求項 6記載の方法。
8 . 活性中心を含む領域として配列番号 2で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番 号 4 6〜4 5 4で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸 配列を有し、 膜貫通領域の一部として配列番号 2で表されるァミノ酸配列中ァミ ノ酸番号 4 6 6〜4 7 1で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一の ァミノ酸配列を有する蛋白質を用いる、 請求項 7記載の方法。
9 . 以下の (a)および (b)を含んでなる、 膜貫通型酵素の膜貫通領域に特異的に結 合する該酵素阻害物質のスクリーユング用キット。 ·
(a) 膜貫通型酵素の活性中心を含む領域と膜貫通領域の一部もしくは全部とを含 む、 該酵素のアミノ酸配列の一部または全部を有する蛋白質
(b) 該酵素の活性中心を含む領域を含み且つ上記 (a)の膜貫通領域の 部もしく は全部を欠く、 該酵素のアミノ酸配列の一部を有する蛋白質
1 0 . セクレターゼの膜貫通領域に結合する該酵素阻害物質 （但し、 下記構造 式で示される化合物を除く） を含有してなる、 /3セクレターゼ選択的阻害剤。
Figure imgf000064_0001
Figure imgf000064_0002
Figure imgf000064_0003
Figure imgf000065_0001
Figure imgf000065_0002
1 1. 阻害物質の J3セクレターゼ結合部位が配列番号 2で表されるアミノ酸配列 中アミノ酸番号 466〜471で示されるアミノ酸配列中に存在する、 請求項 1 0記載の剤。
1 2. アルツハイマー病、 ダウン症おょぴ老年性記憶障害からなる群より選択さ れる疾患の予防 ·治療用である、 請求項 10記載の剤。
13. 血圧低下を引き起こさないことを特徴とする請求項 1 2記載の剤。
14. セクレターゼの膜貫通領域に結合する該酵素阻害物質 （但し、 下記構造 式で示される化合物を除く） を用いることを特徴とする、 ]3セクレターゼの選択 的阻害方法。
Figure imgf000065_0003
Figure imgf000066_0001
Figure imgf000066_0002
Figure imgf000066_0003
Figure imgf000066_0004
1 5 . 阻害物質の i3セクレターゼ結合部位が配列番号 2で表されるアミノ酸配列 中アミノ酸番号4 6 6〜4 7 1で示されるアミノ酸配列中に存在する、 請求項 1 4記載の方法。
16. アルツハイマー病、 ダウン症および老年性記憶障害からなる群より選択さ れる疾患の予防 ·治療用である、 請求項 14記載の方法。
1 7. 血圧低下を引き起こさないことを特徴とする請求項 16記載の方法。
18. ]3セクレターゼ選択的阻害剤の製造のための、 /3セクレターゼの膜貫通領 域に結合する該酵素阻害物質 （但し、 下記構造式で示される化合物を除く） の使 用。
Figure imgf000067_0001
Figure imgf000067_0002
Figure imgf000067_0003
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000068_0002
1 9 . 阻害物質の βセクレターゼ結合部位が配列番号 2で表されるァミノ酸配列 中アミノ酸番号 4 6 6〜4 7 1で示されるアミノ酸配列中に存在する、 請求項 1 8記載の使用。
2 0 . 阻害剤がアルツハイマー病、 ダウン症および老年性記憶障害からなる群よ り選択される疾患の予防 ·治療用である、 請求項 1 8記載の使用。
2 1 . 阻害剤が血圧低下を引き起こさないことを特徴とする請求項 2 0記載の使 用。
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