JPWO2006038684A1 - 膜貫通型酵素阻害物質のスクリーニング方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、膜貫通型酵素の膜貫通領域に結合することにより該酵素活性を阻害する化合物のスクリーニング方法であって、（ａ）膜貫通型酵素の活性中心を含む領域と膜貫通領域の一部もしくは全部とを含む、該酵素のアミノ酸配列の一部または全部を有する蛋白質、および必要に応じて、（ｂ）活性中心を含む領域を含み且つ前記膜貫通領域の一部もしくは全部を欠く、膜貫通型酵素のアミノ酸配列の一部を有する蛋白質を用い、各蛋白質への被験物質の結合および各蛋白質の酵素活性を測定することを特徴とする方法、並びに上記（ａ）および（ｂ）の蛋白質を含んでなるスクリーニング用キットを提供する。また、本発明は、βセクレターゼの膜貫通領域に結合する該酵素阻害物質を含有してなるβセクレターゼ選択的阻害剤、具体的にはアルツハイマー病、ダウン症または老年性記憶障害の予防・治療剤を提供する。

Description

本発明は、膜貫通型酵素の膜貫通領域に特異的に結合する該酵素阻害物質のスクリーニング方法に関する。

アルツハイマー病は、神経細胞変性・脱落と共に、老人斑の形成および神経原線維変化を特徴とする神経変性疾患である。アルツハイマー病に最も特徴的な老人斑は、βアミロイド蛋白（以下、Ａβと略記することもある）を主成分として、生体成分が脳内に沈着したものである。アミノ酸４０または４２個からなるＡβ（以下、それぞれＡβ１−４０およびＡβ１−４２と略記する。）は、神経細胞に対して毒性を示すことが知られている。したがって、Ａβの産生・分泌を阻害する薬剤は、Ａβに起因する疾患（例、アルツハイマー病、ダウン症など）の予防・治療に有効である。
Ａβ１−４０およびＡβ１−４２は、その前駆体蛋白であるＡＰＰ（Ａｍｙｌｏｉｄ Ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ）から、βセクレターゼとγセクレターゼとによって切り出されることにより産生される。これらの酵素を阻害する薬剤はＡβの産生・分泌を阻害するので、特に家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）などの、遺伝的にＡβに起因する疾患（例、アルツハイマー病（ＡＤ）、ダウン症など）に罹患する可能性が高い人や、外傷などにより脳内でＡβ蛋白の増加を起こす患者等、脳内でＡβ蛋白の増加している患者に対して、根本的な予防・治療効果を発揮し得ると考えられる。
１９９９年、βセクレターゼ活性を担うプロテアーゼであるＢＡＣＥ１（Ｂｅｔａ−ｓｉｔｅ ＡＰＰ Ｃｌｅａｖｉｎｇ Ｅｎｚｙｍｅ １；Ａｓｐ２，ｍｅｍａｐｓｉｎ ２とも呼ばれる）のｃＤＮＡの単離が４つの製薬企業グループからほぼ同時に報告された（非特許文献１に総説）。ＢＡＣＥ１は５０１アミノ酸からなる１回膜貫通型蛋白質であり、細胞外（小胞体・ゴルジ体にあっては内腔側）に存在する２つのアスパラギン酸を活性中心とする典型的なアスパラギン酸プロテアーゼである。その後、ＢＡＣＥ１ノックアウトマウスにおいてＡβ産生が完全に消失していることが証明され、ＢＡＣＥ１がβセクレターゼそのものであることが示された。また、このＫＯマウスは重篤な発生異常がみられず、遺伝子発現プロファイルにもほとんど変化がみられないことから、βセクレターゼ阻害剤は、γセクレターゼ阻害剤（γセクレターゼはＡＰＰ以外に免疫細胞の分化に関与するＮｏｔｃｈ１も切断するが、Ｎｏｔｃｈ１の切断が阻害されると免疫異常が起こることが分かっている）よりも安全で、副作用の少ないＡＤ治療薬となることが期待される。
βセクレターゼがアスパラギン酸プロテアーゼであることから、遷移状態ミミックとして機能し得るスタチン、ヒドロキシエチレン、ヒドロキシエチルカルボニル構造を持ったペプチド性阻害剤が開発されている（非特許文献１に総説）。しかし、ペプチド性阻害剤は体内動態や脳内移行効率に問題があり、多くの場合、インビボでの薬効発揮のためには高濃度を要求する。
非ペプチド性の低分子型阻害剤は上記の問題点を克服し得るのみならず、新たな阻害作用点を見出せる可能性がある。そのような低分子化合物は徐々に開発されており（特許文献１〜３）、例えば、コンピュータシミュレーションによりβセクレターゼの活性中心に直接作用する可能性が示唆されるものや（特許文献２）、ＡＰＰのプロセッシングをβセクレターゼ切断からαセクレターゼ切断にシフトさせる可能性が示唆されるもの（特許文献３）がある。また、緑茶カテキン類は、基質と非拮抗的にβセクレターゼ活性を阻害することが報告されている（非特許文献２）。
一方、βセクレターゼ阻害剤のスクリーニング方法としては、例えば特許文献１には、蛍光ドナーで標識され、かつ蛍光クエンチャーで標識されているペプチドを基質として用い、組換え型ヒトβセクレターゼ蛋白質による切断活性を検出する方法が記載されている。特許文献４および５には、β−アミロイド・ペプチド（βＡＰ）産生細胞系を用い、可溶性βＡＰ産生量の変化を指標にβＡＰ生産阻害剤を同定する方法が記載されている。また、特許文献６には、βセクレターゼの活性部位との結合を指標にしたβセクレターゼ阻害剤のスクリーニング方法が記載されている。
国際公開第０１／８７２９３号パンフレット 国際公開第０２／８８１０１号パンフレット 国際公開第０２／９６８９７号パンフレット 国際公開第９４／１０５６９号パンフレット 特開平７−１６５６０６号公報 特開２００３−２６１５９６公報 バーゲーズ（Ｖａｒｇｈｅｓｅ Ｊ．）ら，ジャーナル・オブ・メディカル・ケミストリー（Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．），第４６巻，第２２号，ｐｐ．４６２５−４６３０（２００３年） ジェオン（Ｊｅｏｎ Ｓ．Ｙ．）ら，バイオオーガニック・メディカル・ケミストリー・レターズ（Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．），第１３巻，ｐｐ．３９０５−３９０８（２００３年）

上記のように、多数の製薬企業がβセクレターゼ阻害剤の研究開発に多大の努力を費やしている。βセクレターゼの新たな阻害作用点を見出すことは、より優れたβセクレターゼ阻害作用を有する化合物を開発する上でも重要である。
従って、本発明の目的は、新規の阻害部位に作用するβセクレターゼ阻害剤のスクリーニング方法を提供することであり、ひいては、当該阻害部位に作用することにより優れたβセクレターゼ阻害作用、従って優れたＡＤ予防・治療活性を有する化合物を提供することである。
本発明者は、上記特許文献１に記載される種々のβセクレターゼ阻害活性を有する化合物について、βセクレターゼ阻害の速度論解析を行った結果、これらの化合物の阻害様式が非拮抗型阻害であることを見出した。そこで、これらの化合物のβセクレターゼ蛋白質に対する結合部位を調べたところ、意外にも、これらの化合物はβセクレターゼ蛋白質の膜貫通領域に結合することによりβセクレターゼ活性を阻害することが判明した。活性領域以外に結合して非拮抗的に酵素活性を阻害するアロステリックインヒビターは多くの酵素について周知であるが、膜貫通型酵素の膜貫通領域に結合して阻害活性を発揮する阻害物質に関する報告は、βセクレターゼに限らずこれまで皆無である。
本発明者は、遺伝子工学的手法を駆使してβセクレターゼ蛋白質のＣ末端側から膜貫通領域を徐々に欠失させた種々の変異蛋白質を作製し、これらの化合物が結合するβセクレターゼ蛋白質の部位を特定することに成功するとともに、該結合部位を保持するβセクレターゼ蛋白質と、該結合部位が欠失したβセクレターゼ蛋白質とを用いて、試験化合物のそれらへの結合と酵素阻害活性とを検出し得るスクリーニング系を構築して本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、
［１］膜貫通型酵素の活性中心を含む領域と膜貫通領域の一部もしくは全部とを含む、該酵素のアミノ酸配列の一部または全部を有する蛋白質を用いることを特徴とする、膜貫通領域に特異的に結合する該酵素阻害物質のスクリーニング方法；
［２］活性中心を含む領域を含み且つ前記膜貫通領域の一部もしくは全部を欠く、膜貫通型酵素のアミノ酸配列の一部を有する蛋白質をさらに用い、各蛋白質への被験物質の結合および各蛋白質の酵素活性を測定することを特徴とする、上記［１］記載の方法；
［３］活性中心を含む領域が細胞外もしくは内腔領域である上記［１］記載の方法；
［４］膜貫通型酵素がプロテアーゼである上記［１］記載の方法；
［５］プロテアーゼがアスパラギン酸プロテアーゼである上記［４］記載の方法；
［６］アスパラギン酸プロテアーゼがβセクレターゼである上記［５］記載の方法；
［７］βセクレターゼの活性中心を含む領域が配列番号２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜４５４で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、該酵素の膜貫通領域が配列番号２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４５５〜４８０で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するものである、上記［６］記載の方法；
［８］活性中心を含む領域として配列番号２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜４５４で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、膜貫通領域の一部として配列番号２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６６〜４７１で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を用いる、上記［７］記載の方法；
［９］以下の（ａ）および（ｂ）を含んでなる、膜貫通型酵素の膜貫通領域に特異的に結合する該酵素阻害物質のスクリーニング用キット；
（ａ）膜貫通型酵素の活性中心を含む領域と膜貫通領域の一部もしくは全部とを含む、該酵素のアミノ酸配列の一部または全部を有する蛋白質
（ｂ）該酵素の活性中心を含む領域を含み且つ上記（ａ）の膜貫通領域の一部もしくは全部を欠く、該酵素のアミノ酸配列の一部を有する蛋白質
［１０］βセクレターゼの膜貫通領域に結合する該酵素阻害物質（但し、下記構造式で示される化合物を除く）を含有してなる、βセクレターゼ選択的阻害剤；

［１１］阻害物質のβセクレターゼ結合部位が配列番号２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６６〜４７１で示されるアミノ酸配列中に存在する、上記［１０］記載の剤；
［１２］アルツハイマー病、ダウン症および老年性記憶障害からなる群より選択される疾患の予防・治療用である、上記［１０］記載の剤；
［１３］血圧低下を引き起こさないことを特徴とする上記［１２］記載の剤；
［１４］βセクレターゼの膜貫通領域に結合する該酵素阻害物質（但し、下記構造式で示される化合物を除く）を用いることを特徴とする、βセクレターゼの選択的阻害方法；

［１５］阻害物質のβセクレターゼ結合部位が配列番号２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６６〜４７１で示されるアミノ酸配列中に存在する、上記［１４］記載の方法；
［１６］アルツハイマー病、ダウン症および老年性記憶障害からなる群より選択される疾患の予防・治療用である、上記［１４］記載の方法；
［１７］血圧低下を引き起こさないことを特徴とする上記［１６］記載の方法；
［１８］βセクレターゼ選択的阻害剤の製造のための、βセクレターゼの膜貫通領域に結合する該酵素阻害物質（但し、下記構造式で示される化合物を除く）の使用；

［１９］阻害物質のβセクレターゼ結合部位が配列番号２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６６〜４７１で示されるアミノ酸配列中に存在する、上記［１８］記載の使用；
［２０］阻害剤がアルツハイマー病、ダウン症および老年性記憶障害からなる群より選択される疾患の予防・治療用である、上記［１８］記載の使用；および
［２１］阻害剤が血圧低下を引き起こさないことを特徴とする上記［２０］記載の使用；
を提供する。
本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットは、膜貫通領域に結合することによりβセクレターゼ活性を阻害する化合物を選択することができるので、遷移状態ミミックやその他の活性中心に作用する阻害薬等とは異なり、βセクレターゼ選択的に作用して他のアスパラギン酸プロテアーゼを阻害しない化合物を選択し得るという有利な効果を奏する。

図１は、ＢＡＣＥ１−５０１に対する化合物Ｄの阻害様式を解析するラインウェーバー−バークプロットを示す。化合物Ｄの濃度は、●：３０μＭ、▲：１０μＭ、■：０μＭである。
図２は、ＢＡＣＥ１−５０１と化合物Ｊの結合を示す表面プラズモン共鳴のシグナル（Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ）を示す。

本発明の、膜貫通型酵素の膜貫通領域に特異的に結合する該酵素阻害物質のスクリーニング方法（以下、「本発明のスクリーニング方法」と略記する場合がある）は、膜貫通型酵素の活性中心を含む領域と膜貫通領域の一部もしくは全部とを含む、該酵素のアミノ酸配列の一部または全部を有する蛋白質を用いることを特徴とする。
本発明のスクリーニング方法を用いることができる酵素としては、膜貫通領域を含むものであれば特に制限はなく、Ｔｙｐｅ ＩもしくはＴｙｐｅ ＩＩの１回膜貫通蛋白質に属するあらゆる酵素（例：βセクレターゼ、膜型マトリックスメタロプロテアーゼ、ＴＮＦα変換酵素、メルトリン、クズバニアン、ＣＤ３８、ＧＭ３合成酵素、胎盤性ロイシンアミノペプチダーゼ等）、７回膜貫通型受容体（７ＴＭＲ）等の複数回膜貫通蛋白質に属するあらゆる酵素（例：プレセニリン（ＰＳ）、ＮＡＤＨ−キノン酸化還元酵素、チトクロムＣ酸化還元酵素等）が挙げられるが、好ましくはプロテアーゼ（例：アスパラギン酸プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ等）であり、より好ましくはアスパラギン酸プロテアーゼ、さらに好ましくはＴｙｐｅ ＩＩ回膜貫通型のアスパラギン酸プロテアーゼであるβセクレターゼである。
「膜貫通型酵素の活性中心を含む領域」とは、活性中心を含み、かつ酵素活性を発現するのに十分な、該酵素の部分アミノ酸配列を含有する領域を意味する。該領域の配列上の位置に制限はなく、酵素蛋白質のＮ末端側領域、内部配列、Ｃ末端側領域のいずれに位置してもよい。また、細胞外（小胞体・ゴルジ体等にあっては内腔）、細胞質側、あるいは膜貫通領域（但し、酵素阻害物質の結合部位とは異なる）のいずれにあってもよい。例えば、活性中心が細胞外（もしくは内腔）領域、細胞質領域または膜貫通領域内に存在する場合、該「活性中心を含む領域」は活性中心が存在するいずれかの領域全体であってよいし、また、例えばＸ線結晶構造解析などにより酵素の三次元構造が明らかになっている場合には、活性中心が存在する領域内の、酵素活性の発現に最低限必要な部分のみを用いることもできる。
「膜貫通領域の一部もしくは全部」とは、目的とする酵素阻害活性を有する化合物が標的とする結合部位を最低限含んでいることを意味する。該結合部位は膜貫通領域内で任意に設定することができるが、膜貫通型酵素の活性中心が膜貫通領域に存在する場合には、該結合部位は該活性中心が存在する部位以外の膜貫通領域から選択される。
上述のように、本発明のスクリーニング方法に用いることができる好ましい膜貫通型酵素の１つはβセクレターゼである。本発明におけるβセクレターゼ蛋白質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜５０１で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質である。
βセクレターゼ蛋白質は、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）の細胞［例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、杯細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞など］もしくはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁桃核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、大脳皮質、延髄、小脳）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、脂肪組織、骨格筋］などに由来する蛋白質であってよく、また、化学合成もしくは無細胞翻訳系で合成された蛋白質であってもよい。あるいは上記アミノ酸配列をコードする塩基配列を含有する核酸を導入された形質転換体から産生された組換え蛋白質であってもよい。
配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜５０１で示されるアミノ酸配列と「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜５０１で示されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の相同性を有するアミノ酸配列をいう。ここで「相同性」とは、当該技術分野において公知の数学的アルゴリズムを用いて２つのアミノ酸配列をアラインさせた場合の、最適なアラインメント（好ましくは、該アルゴリズムは最適なアラインメントのために配列の一方もしくは両方へのギャップの導入を考慮し得るものである）における、オーバーラップする全アミノ酸残基に対する同一アミノ酸および類似アミノ酸残基の割合（％）を意味する。「類似アミノ酸」とは物理化学的性質において類似したアミノ酸を意味し、例えば、芳香族アミノ酸（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ）、脂肪族アミノ酸（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ）、極性アミノ酸（Ｇｌｎ、Ａｓｎ）、塩基性アミノ酸（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）、酸性アミノ酸（Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、水酸基を有するアミノ酸（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）、側鎖の小さいアミノ酸（Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ）などの同じグループに分類されるアミノ酸が挙げられる。このような類似アミノ酸による置換は蛋白質の表現型に変化をもたらさない（即ち、保存的アミノ酸置換である）ことが予測される。保存的アミノ酸置換の具体例は当該技術分野で周知であり、種々の文献に記載されている（例えば、Ｂｏｗｉｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４７：１３０６−１３１０（１９９０）を参照）。
本明細書におけるアミノ酸配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；マトリクス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；フィルタリング＝ＯＦＦ）にて計算することができる。アミノ酸配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、例えば、Ｋａｒｌｉｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７（１９９３）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９７））］、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４４−４５３（１９７０）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムに組み込まれている］、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＣＧＣ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ２．０）に組み込まれている］、Ｐｅａｒｓｏｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８（１９８８）に記載のアルゴリズム［該アルゴリズムはＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＦＡＳＴＡプログラムに組み込まれている］等が挙げられ、それらも同様に好ましく用いられ得る。
より好ましくは、「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜５０１で示されるアミノ酸配列と約７０％以上、好ましくは約８０％以上、さらに好ましくは約９０％以上、特に好ましくは約９５％以上、最も好ましくは約９８％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜５０１で示されるアミノ酸配列と「実質的に同一のアミノ酸配列を含有する蛋白質」とは、前記の配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜５０１で示されるアミノ酸配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含有し、配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜５０１で示されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性を有する蛋白質をいう。
「実質的に同質の活性」とは、（１）βセクレターゼ活性（即ち、ＡＰＰの６９５アミノ酸からなるアイソタイプ（ＡＰＰ６９５）を５９６番目のＭｅｔと５９７番目のＡｓｐの間で特異的に切断するプロテアーゼ活性）および（２）膜貫通領域に結合してβセクレターゼ阻害活性を発揮する化合物との結合活性をいう。実質的に同質とは、それらの活性が質的（定性的）に同様であることを示す。従って、βセクレターゼ活性および阻害物質との結合活性が同等であることが好ましいが、これらの活性の程度、蛋白質の分子量などの量的要素は異なっていてもよい（例えば、活性については、約０．０１〜約１００倍、好ましくは約０．１〜約１０倍、より好ましくは約０．５〜約２倍の範囲内が挙げられる）。
βセクレターゼ活性の測定は、公知の方法、例えば、ＡＰＰまたはそのβセクレターゼにより認識される部位と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む合成基質ペプチドとβセクレターゼ蛋白質とを反応させ、切断により生じる反応産物の一方もしくは両方を検出する方法、あるいは上記特許文献１に記載されるように蛍光物質と消光物質とを含む合成基質とβセクレターゼ蛋白質とを反応させ、酵素切断により蛍光物質と消光物質が分離することによって生じる蛍光を測定する方法などにより行うことができるが、それらに限定されない。一方、阻害物質との結合活性は、後記実施例に示されるように表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）等を用いて測定することができる。
また、本発明で用いられるβセクレターゼには、例えば、（１）配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜５０１で示されるアミノ酸配列の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、（２）配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜５０１で示されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が付加したアミノ酸配列、（３）配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜５０１で示されるアミノ酸配列に１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が挿入されたアミノ酸配列、（４）配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜５０１で示されるアミノ酸配列中の１または２個以上（例えば１〜５０個程度、好ましくは１〜３０個程度、より好ましくは１〜１０個程度、さらに好ましくは１〜５個）のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列、または（５）それらを組み合わせたアミノ酸配列を含有する蛋白質も含まれる。
但し、１または２個以上のアミノ酸を欠失する場合、該欠失部位は配列番号２に示されるアミノ酸配列中少なくともアミノ酸番号４６６〜４７１で示されるアミノ酸配列以外の部位であり、好ましくはアミノ酸番号４５５〜４８０で示されるアミノ酸配列以外の部位である。また、１または２個以上のアミノ酸が挿入されるか、他のアミノ酸で置換される場合、該挿入もしくは置換部位は、配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６６〜４７１で示されるアミノ酸配列以外の部位（好ましくはアミノ酸番号４５５〜４８０で示されるアミノ酸配列以外の部位）であるか、あるいは当該部位であっても、その挿入もしくは置換の結果、当該部位の活性（即ち、膜貫通領域に結合するβセクレターゼ阻害物質と結合する活性）に質的な影響を与えないものである必要がある。
βセクレターゼは、１回膜貫通型のアスパラギン酸プロテアーゼであり、細胞外（もしくは内腔）領域内に活性中心を含む。より具体的には、例えば、配列番号２に示されるヒトβセクレターゼにおいては、アミノ酸番号４６〜５０１で示されるアミノ酸配列が成熟βセクレターゼ蛋白質のアミノ酸配列であり（βセクレターゼはプレプロ酵素として生成し、分泌過程においてアミノ酸番号１〜２１で示されるアミノ酸配列からなるシグナルペプチド、アミノ酸番号２２〜４５で示されるアミノ酸配列からなるプロペプチドが切断される）、文献により多少位置は異なるが、例えば細胞外（内腔）領域はアミノ酸番号４５〜４５４、膜貫通領域はアミノ酸番号４５５〜４８０、細胞質領域はアミノ酸番号４８１〜５０１でそれぞれ示されるアミノ酸配列からなる。
細胞外（内腔）領域における活性中心のコンセンサスモチーフ（Ｄ−Ｔ／Ｓ−Ｇ−Ｔ／Ｓ）は、アミノ酸番号９３〜９６（ＤＴＧＳ）およびアミノ酸番号２８９〜２９２（ＤＳＧＴ）である。したがって、βセクレターゼの「活性中心を含む領域」としては、例えば、配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号９３〜２９２で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む領域が挙げられる。ここで「実質的に同一のアミノ酸配列」とは上記と同義であり、「実質的に同一のアミノ酸配列を含む領域」とは、実質的に同一のアミノ酸配列を含み、且つβセクレターゼ活性を有する領域である。βセクレターゼの活性中心を含む領域は、その細胞外（内腔）領域全体（即ち、配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜４５４で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列）であってもよく、あるいはさらにプロ配列もしくはプレプロ配列をＮ末端に含む配列（即ち、配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号２２〜４５４もしくは１〜４５４で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列）であってもよい。
βセクレターゼの「膜貫通領域の一部」としては、配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４５５〜４８０で示されるアミノ酸配列の任意の部分配列（例えば、連続する３〜２０アミノ酸程度、好ましくは連続する５〜１０アミノ酸程度からなる）と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列であれば特に制限はないが、好ましくは、アミノ酸番号４６６〜４７１で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列が挙げられる。ここで「実質的に同一のアミノ酸配列」とは、配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４５５〜４８０で示されるアミノ酸配列の任意の部分配列において、１〜数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入もしくは付加されたアミノ酸配列であって、該部分配列のβセクレターゼ阻害活性を有する化合物に対する結合能が少なくとも質的に変化しないアミノ酸配列をいう。このようなアミノ酸の変異は上述の保存的アミノ酸置換などによって達成され得る。特に、疎水度において類似するアミノ酸により置換することが好ましいと考えられるが、それに限定されない。
本発明のスクリーニング方法に用いられるβセクレターゼは、Ｎ末端側に上記「活性中心を含む領域」を、Ｃ末端側に「膜貫通領域の一部もしくは全部」を含むものであれば特に制限はない。例えば、膜貫通領域の一部もしくは全部のＣ末端側に細胞質領域の配列を含んでもよいし、含んでいなくてもよい。
本明細書に記載される蛋白質およびペプチドは、ペプチド標記の慣例に従って左端がＮ末端（アミノ末端）、右端がＣ末端（カルボキシル末端）である。本発明のスクリーニング方法に用いられる膜貫通型酵素は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。
ここでエステルにおけるＲとしては、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ_１−６アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのＣ_３−８シクロアルキル基；例えば、フェニル、α−ナフチルなどのＣ_６−１２アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル−Ｃ_１−２アルキル基；α−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ_１−２アルキル基などのＣ_７−１４アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
膜貫通型酵素がＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の膜貫通型酵素に含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、膜貫通型酵素には、Ｎ末端のアミノ酸残基（例、メチオニン残基）のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_１−６アルカノイルなどのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成するＮ末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば−ＯＨ、−ＳＨ、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのＣ_１−６アルカノイル基などのＣ_１−６アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども含まれる。
本発明で用いられる膜貫通型酵素の部分ペプチドは、上記した膜貫通型酵素の部分アミノ酸配列（即ち、活性中心を含む領域の配列と膜貫通領域の一部もしくは全部の配列）を有し、且つ膜貫通型酵素と実質的に同質の活性を有するペプチドである。ここで「実質的に同質の活性」とは上記と同意義を示す。また、「実質的に同質の活性」の測定は上記と同様にして行うことができる。本明細書においては、当該部分ペプチドを、以下「阻害物質結合型ペプチド」と称することとする。
阻害物質結合型ペプチドは、上記の性質を有する限り特に制限されないが、例えば、βセクレターゼの場合、細胞外（内腔）領域内の酵素活性に影響を与えない部分アミノ酸配列を欠くものや、膜貫通領域の標的結合部位以外の部分アミノ酸配列を欠くもの、細胞質領域の一部もしくは全部を欠くものなどが挙げられる。
一方、膜貫通型酵素の部分ペプチドであって、（１）活性中心を含む領域を保持し、且つ（２）膜貫通領域内の、目的とする酵素阻害物質が標的とする結合部位を欠く部分ペプチドは、酵素活性を保持するが、目的とする酵素阻害物質に対する結合活性がないので、該標的結合部位に特異的に結合して酵素阻害活性を発揮する化合物と接触させてもこれと結合せず、酵素活性も阻害されない。本明細書においては、当該部分ペプチドを、以下「阻害物質非結合型ペプチド」と称することとする。
膜貫通型酵素の部分ペプチド（阻害物質結合型ペプチドおよび阻害物質非結合型ペプチドの両者を包含する；以下、このような場合には「本発明の部分ペプチド」と称することがある）は、Ｃ末端がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）、カルボキシレート（−ＣＯＯ⁻）、アミド（−ＣＯＮＨ_２）またはエステル（−ＣＯＯＲ）の何れであってもよい。ここでエステルにおけるＲとしては、膜貫通型酵素について前記したと同様のものが挙げられる。これらのペプチドがＣ末端以外にカルボキシル基（またはカルボキシレート）を有している場合、カルボキシル基がアミド化またはエステル化されているものも本発明の部分ペプチドに含まれる。この場合のエステルとしては、例えば上記したＣ末端のエステルなどが用いられる。
さらに、本発明の部分ペプチドには、上記した膜貫通型酵素と同様に、Ｎ末端のメチオニン残基のアミノ基が保護基で保護されているもの、Ｎ端側が生体内で切断され生成したＧｌｎがピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基が適当な保護基で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合したいわゆる糖ペプチドなどの複合ペプチドなども含まれる。
膜貫通型酵素またはその部分ペプチドの塩としては、酸または塩基との生理学的に許容される塩が挙げられ、とりわけ生理学的に許容される酸付加塩が好ましい。この様な塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸、硫酸）との塩、あるいは有機酸（例えば、酢酸、ギ酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、蓚酸、安息香酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸）との塩などが用いられる。
膜貫通型酵素またはその塩は、その例示としてのβセクレターゼにおいて前述した、温血動物の細胞または組織から自体公知の蛋白質の精製方法によって調製することができる。具体的には、温血動物の組織または細胞をホモジナイズし、可溶性画分を逆相クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー等で分離精製することによって、膜貫通型酵素またはその塩を製造することができる。
膜貫通型酵素またはその部分ペプチドは、公知のペプチド合成法に従って製造することもできる。
ペプチド合成法は、例えば、固相合成法、液相合成法のいずれであってもよい。膜貫通型酵素を構成し得る部分ペプチドもしくはアミノ酸と残余部分とを縮合し、生成物が保護基を有する場合は保護基を脱離することにより目的とする蛋白質を製造することができる。
ここで、縮合や保護基の脱離は、自体公知の方法、例えば、以下の（１）〜（５）に記載された方法に従って行われる。
（１）Ｍ．ＢｏｄａｎｓｚｋｙおよびＭ．Ａ．Ｏｎｄｅｔｔｉ、ペプチド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６６年）
（２）ＳｃｈｒｏｅｄｅｒおよびＬｕｅｂｋｅ、ザ・ペプチド（Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９６５年）
（３）泉屋信夫他、ペプチド合成の基礎と実験、丸善（株）（１９７５年）
（４）矢島治明および榊原俊平、生化学実験講座１、蛋白質の化学ＩＶ、２０５、（１９７７年）
（５）矢島治明監修、続医薬品の開発、第１４巻、ペプチド合成、広川書店
このようにして得られた膜貫通型酵素またはその部分ペプチドは、公知の精製法により単離・精製することができる。ここで、精製法としては、例えば、溶媒抽出、蒸留、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶、これらの組み合わせなどが挙げられる。
上記方法で得られる膜貫通型酵素またはその部分ペプチドが遊離体である場合には、該遊離体を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって適当な塩に変換することができるし、逆に膜貫通型酵素またはその部分ペプチドが塩として得られた場合には、該塩を公知の方法あるいはそれに準じる方法によって遊離体または他の塩に変換することができる。
膜貫通型酵素またはその部分ペプチドの合成には、通常市販の蛋白質合成用樹脂を用いることができる。そのような樹脂としては、例えば、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃアミノエチル）フェノキシ樹脂などを挙げることができる。このような樹脂を用い、α−アミノ基と側鎖官能基を適当に保護したアミノ酸を、目的とする蛋白質もしくはペプチドの配列通りに、自体公知の各種縮合方法に従い、樹脂上で縮合させる。反応の最後に樹脂から蛋白質（ペプチド）を切り出すと同時に各種保護基を除去し、さらに高希釈溶液中で分子内ジスルフィド結合形成反応を実施し、目的の蛋白質（ペプチド）またはそのアミド体を取得する。
上記した保護アミノ酸の縮合に関しては、蛋白質合成に使用できる各種活性化試薬を用いることができるが、特に、カルボジイミド類がよい。カルボジイミド類としては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロリル）カルボジイミドなどが用いられる。これらによる活性化にはラセミ化抑制添加剤（例えば、ＨＯＢｔ、ＨＯＯＢｔ）とともに保護アミノ酸を直接樹脂に添加するか、または、対称酸無水物またはＨＯＢｔエステルあるいはＨＯＯＢｔエステルとしてあらかじめ保護アミノ酸の活性化を行なった後に樹脂に添加することができる。
保護アミノ酸の活性化や樹脂との縮合に用いられる溶媒は、蛋白質縮合反応に使用しうることが知られている溶媒から適宜選択されうる。例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド，Ｎ−メチルピロリドンなどの酸アミド類、塩化メチレン，クロロホルムなどのハロゲン化炭化水素類、トリフルオロエタノールなどのアルコール類、ジメチルスルホキシドなどのスルホキシド類、ピリジンなどのアミン類，ジオキサン，テトラヒドロフランなどのエーテル類、アセトニトリル，プロピオニトリルなどのニトリル類、酢酸メチル，酢酸エチルなどのエステル類あるいはこれらの適宜の混合物などが用いられる。反応温度は蛋白質結合形成反応に使用され得ることが知られている範囲から適宜選択され、通常約−２０℃〜５０℃の範囲から適宜選択される。活性化されたアミノ酸誘導体は通常１．５〜４倍過剰で用いられる。ニンヒドリン反応を用いたテストの結果、縮合が不十分な場合には保護基の脱離を行うことなく縮合反応を繰り返すことにより十分な縮合を行なうことができる。反応を繰り返しても十分な縮合が得られないときには、無水酢酸またはアセチルイミダゾールを用いて未反応アミノ酸をアセチル化することができる。
原料の反応に関与すべきでない官能基の保護および用いられる保護基、その保護基の脱離、並びに反応に関与する官能基の活性化などは、公知の基または公知の手段から適宜選択しうる。
原料のアミノ基の保護基としては、例えば、Ｚ、Ｂｏｃ、ターシャリーペンチルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、Ｃｌ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタロイル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
カルボキシル基は、例えば、アルキルエステル化（例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ターシャリーブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチル、２−アダマンチルなどの直鎖状、分枝状もしくは環状アルキルエステル化）、アラルキルエステル化（例えば、ベンジルエステル、４−ニトロベンジルエステル、４−メトキシベンジルエステル、４−クロロベンジルエステル、ベンズヒドリルエステル化）、フェナシルエステル化、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド化、ターシャリーブトキシカルボニルヒドラジド化、トリチルヒドラジド化などによって保護することができる。
セリンの水酸基は、例えば、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。このエステル化に適する基としては、例えば、アセチル基などの低級アルカノイル基、ベンゾイル基などのアロイル基、ベンジルオキシカルボニル基、エトキシカルボニル基などの炭酸から誘導される基などが用いられる。また、エーテル化に適する基としては、例えば、ベンジル基、テトラヒドロピラニル基、ｔ−ブチル基などである。
チロシンのフェノール性水酸基の保護基としては、例えば、Ｂｚｌ、Ｃｌ_２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、ターシャリーブチルなどが用いられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、例えば、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、Ｆｍｏｃなどが用いられる。
保護基の除去（脱離）方法としては、例えば、Ｐｄ−黒あるいはＰｄ−炭素などの触媒の存在下での水素気流中での接触還元や、また、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸あるいはこれらの混合液などによる酸処理や、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンなどによる塩基処理、また液体アンモニア中ナトリウムによる還元なども用いられる。上記酸処理による脱離反応は、一般に約−２０℃〜４０℃の温度で行なわれるが、酸処理においては、例えば、アニソール、フェノール、チオアニソール、メタクレゾール、パラクレゾール、ジメチルスルフィド、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのようなカチオン捕捉剤の添加が有効である。また、ヒスチジンのイミダゾール保護基として用いられる２，４−ジニトロフェニル基はチオフェノール処理により除去され、トリプトファンのインドール保護基として用いられるホルミル基は上記の１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオールなどの存在下の酸処理による脱保護以外に、希水酸化ナトリウム溶液、希アンモニアなどによるアルカリ処理によっても除去される。
原料のカルボキシル基の活性化されたものとしては、例えば、対応する酸無水物、アジド、活性エステル〔アルコール（例えば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、パラニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔ）とのエステル〕などが用いられる。原料のアミノ基の活性化されたものとしては、例えば、対応するリン酸アミドが用いられる。
蛋白質（ペプチド）のアミド体を得る別の方法としては、例えば、まず、蛋白質（ペプチド）を構成する部分ペプチドの各Ｃ末端アミノ酸のα−カルボキシル基をアミド化して保護し、アミノ基側にペプチド鎖を所望の鎖長（隣接する部分ペプチドのＣ末端アミノ酸と連結されるべきアミノ酸）まで延ばした後、Ｃ末端側ペプチド鎖のＮ末端アミノ酸のα−アミノ基の保護基のみを除いたペプチドと、Ｎ末端側ペプチド鎖のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基の保護基のみを除いたペプチドとを製造し、これらのペプチドを上記したような混合溶媒中で縮合させる方法が挙げられる。縮合反応の詳細については上記と同様である。縮合により得られた保護蛋白質（保護ペプチド）を精製した後、上記方法によって保護基を除去し、所望の粗蛋白質（粗ペプチド）を得ることができる。この粗蛋白質（粗ペプチド）は既知の各種精製手段を駆使して精製し、主要画分を凍結乾燥することで所望の蛋白質（ペプチド）のアミド体を得ることができる。
蛋白質（ペプチド）のエステル体は、例えば、Ｃ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を所望のアルコール類と縮合してアミノ酸エステルとした後、上記のアミド体の場合と同様に処理して得ることができる。
本発明の部分ペプチドまたはその塩は、膜貫通型酵素またはその塩を適当なペプチダーゼで切断することによっても製造することができる。
さらに、膜貫通型酵素またはその部分ペプチドは、それをコードする核酸を含有する形質転換体を培養し、得られる培養物から膜貫通型酵素またはその部分ペプチドを分離精製することによって製造することもできる。
膜貫通型酵素またはその部分ペプチドをコードする核酸はＤＮＡであってもＲＮＡであってもよく、あるいはＤＮＡ／ＲＮＡキメラであってもよい。好ましくはＤＮＡが挙げられる。また、該核酸は二本鎖であっても、一本鎖であってもよい。二本鎖の場合は、二本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＲＮＡのハイブリッドでもよい。一本鎖の場合は、センス鎖（即ち、コード鎖）であっても、アンチセンス鎖（即ち、非コード鎖）であってもよい。
膜貫通型酵素またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡ、温血動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）のあらゆる細胞［例えば、脾細胞、神経細胞、グリア細胞、膵臓β細胞、骨髄細胞、メサンギウム細胞、ランゲルハンス細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋細胞、脂肪細胞、免疫細胞（例、マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、肥満細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球）、巨核球、滑膜細胞、軟骨細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、乳腺細胞、肝細胞もしくは間質細胞、またはこれら細胞の前駆細胞、幹細胞もしくはガン細胞などや血球系の細胞］、あるいはそれらの細胞が存在するあらゆる組織［例えば、脳、脳の各部位（例、嗅球、扁頭核、大脳基底球、海馬、視床、視床下部、視末下核、大脳皮質、延髄、小脳、後頭葉、前頭葉、側頭葉、被殻、尾状核、脳染、黒質）、脊髄、下垂体、胃、膵臓、腎臓、肝臓、生殖腺、甲状腺、胆のう、骨髄、副腎、皮膚、筋肉、肺、消化管（例、大腸、小腸）、血管、心臓、胸腺、脾臓、顎下腺、末梢血、末梢血球、前立腺、睾丸、卵巣、胎盤、子宮、骨、関節、骨格筋など］由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡなどが挙げられる。膜貫通型酵素またはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡ画分および全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡ画分をそれぞれ鋳型として用い、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ（以下、「ＰＣＲ法」と略称する）およびＲｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ＰＣＲ（以下、「ＲＴ−ＰＣＲ法」と略称する）によって直接増幅することもできる。あるいは、膜貫通型酵素またはその部分ペプチドをコードするゲノムＤＮＡおよびｃＤＮＡは、上記した細胞・組織より調製したゲノムＤＮＡおよび全ＲＮＡもしくはｍＲＮＡの断片を適当なベクター中に挿入して調製されるゲノムＤＮＡライブラリーおよびｃＤＮＡライブラリーから、コロニーもしくはプラークハイブリダイゼーション法またはＰＣＲ法などにより、それぞれクローニングすることもできる。ライブラリーに使用するベクターは、バクテリオファージ、プラスミド、コスミド、ファージミドなどいずれであってもよい。
膜貫通型酵素がβセクレターゼである場合、βセクレターゼをコードするＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列中塩基番号１３６〜１５０３で示される塩基配列を含有するＤＮＡ、あるいは配列番号１に示される塩基配列中塩基番号１３６〜１５０３で示される塩基配列の相補鎖配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を含有し、前記した配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜５０１で示されるアミノ酸配列を含有する蛋白質と実質的に同質の活性（即ち、βセクレターゼ活性および標的結合部位でのβセクレターゼ阻害物質との結合活性など）を有する蛋白質をコードするＤＮＡなどが挙げられる。
配列番号１に示される塩基配列中塩基番号１３６〜１５０３で示される塩基配列の相補鎖配列とハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、配列番号１に示される塩基配列中塩基番号１３６〜１５０３で示される塩基配列と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
本明細書における塩基配列の相同性は、相同性計算アルゴリズムＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を用い、以下の条件（期待値＝１０；ギャップを許す；フィルタリング＝ＯＮ；マッチスコア＝１；ミスマッチスコア＝−３）にて計算することができる。塩基配列の相同性を決定するための他のアルゴリズムとしては、上記したアミノ酸配列の相同性計算アルゴリズムが同様に好ましく例示される。
ハイブリダイゼーションは、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ．Ｐｒｅｓｓ，１９８９）に記載の方法などに従って行なうことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、添付の使用説明書に記載の方法に従って行なうことができる。ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ハイストリンジェントな条件に従って行なうことができる。
ハイストリンジェントな条件としては、例えば、ナトリウム塩濃度が約１９〜約４０ｍＭ、好ましくは約１９〜約２０ｍＭで、温度が約５０〜約７０℃、好ましくは約６０〜約６５℃の条件等が挙げられる。特に、ナトリウム塩濃度が約１９ｍＭで温度が約６５℃の場合が好ましい。当業者は、ハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、ハイブリダゼーション反応の温度、プローブ濃度、プローブの長さ、ミスマッチの数、ハイブリダイゼーション反応の時間、洗浄液の塩濃度、洗浄の温度等を適宜変更することにより、所望のストリンジェンシーに容易に調節することができる。
βセクレターゼをコードするＤＮＡは、好ましくは配列番号１に示される塩基配列を含有するヒトβセクレターゼＤＮＡもしくはそのアレル変異体、または他の温血動物（例えば、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、ウマ、トリ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジーなど）におけるそのオルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）等である。
阻害物質結合型ペプチドをコードするＤＮＡは、膜貫通型酵素の活性中心を含む領域をコードする塩基配列と、膜貫通領域の一部もしくは全部をコードする塩基配列とを含むものであればいかなるものであってもよい。また、阻害物質非結合型ペプチドをコードするＤＮＡは、膜貫通型酵素の活性中心を含む領域をコードする塩基配列を含み、且つ上記「膜貫通領域の一部もしくは全部」をコードする塩基配列を含まないものであればいかなるものであってもよい。これらのＤＮＡは、ゲノムＤＮＡ、上記した細胞・組織由来のｃＤＮＡ、合成ＤＮＡのいずれでもよい。
具体的には、膜貫通型酵素がβセクレターゼの場合、阻害物質結合型ペプチドをコードするＤＮＡとしては、例えば、
（１ａ）配列番号１に示される塩基配列中塩基番号２７７〜８７６で示される塩基配列および塩基番号１３６３〜１４４０で示される塩基配列の一部もしくは全部を有するＤＮＡ、または
（２ａ）上記（１ａ）のＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、且つ配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜５０１で示されるアミノ酸配列を含むペプチドと実質的に同質の活性（即ち、βセクレターゼ活性および膜貫通領域内の標的結合部位における酵素阻害物質との結合活性）を有するペプチドをコードするＤＮＡが用いられる。
また、阻害物質非結合型ペプチドをコードするＤＮＡとしては、
（１ｂ）配列番号１に示される塩基配列中塩基番号２７７〜８７６で示される塩基配列を有し、且つ上記（１ａ）のＤＮＡが有する塩基番号１３６３〜１４４０で示される塩基配列の一部もしくは全部を有しないＤＮＡ、または
（２ｂ）上記（１ｂ）のＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列を有し、且つ配列番号２に示されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜４５４で示されるアミノ酸配列を含むペプチドと実質的に同質の活性（即ち、βセクレターゼ活性）を有するが、膜貫通領域内の標的結合部位における酵素阻害物質との結合活性を有しないペプチドをコードするＤＮＡが用いられる。
上記（１ａ）または（１ｂ）のＤＮＡとハイストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるＤＮＡとしては、例えば、該ＤＮＡの塩基配列中の対応する部分と約６０％以上、好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、特に好ましくは約９０％以上の相同性を有する塩基配列を含有するＤＮＡなどが用いられる。
膜貫通型酵素またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡは、該蛋白質またはペプチドをコードする塩基配列の一部分を有する合成ＤＮＡプライマーを用いてＰＣＲ法によって増幅するか、または適当な発現ベクターに組み込んだＤＮＡを、本発明の蛋白質の一部あるいは全領域をコードするＤＮＡ断片もしくは合成ＤＮＡを標識したものとハイブリダイゼーションすることによってクローニングすることができる。ハイブリダイゼーションは、例えば、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）第２版（前述）に記載の方法などに従って行うことができる。また、市販のライブラリーを使用する場合、ハイブリダイゼーションは、該ライブラリーに添付された使用説明書に記載の方法に従って行うことができる。
ＤＮＡの塩基配列は、公知のキット、例えば、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−ｓｕｐｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｋｍ（宝酒造（株））、Ｍｕｔａｎ^ＴＭ−Ｋ（宝酒造（株））等を用いて、ＯＤＡ−ＬＡ ＰＣＲ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法、Ｋｕｎｋｅｌ法等の自体公知の方法あるいはそれらに準じる方法に従って変換することができる。
クローン化されたＤＮＡは、目的によりそのまま、または所望により制限酵素で消化するか、リンカーを付加した後に、使用することができる。該ＤＮＡはその５’末端側に翻訳開始コドンとしてのＡＴＧを有し、また３’末端側には翻訳終止コドンとしてのＴＡＡ、ＴＧＡまたはＴＡＧを有していてもよい。これらの翻訳開始コドンや翻訳終止コドンは、適当な合成ＤＮＡアダプターを用いて付加することができる。
上記の膜貫通型酵素またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターで宿主を形質転換し、得られる形質転換体を培養することによって、該蛋白質またはペプチドを製造することができる。
膜貫通型酵素またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを含む発現ベクターは、例えば、膜貫通型酵素をコードするＤＮＡから目的とするＤＮＡ断片を切り出し、該ＤＮＡ断片を適当な発現ベクター中のプロモーターの下流に連結することにより製造することができる。
発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド（例、ｐＢＲ３２２，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣ１２，ｐＵＣ１３）；枯草菌由来のプラスミド（例、ｐＵＢ１１０，ｐＴＰ５，ｐＣ１９４）；酵母由来プラスミド（例、ｐｓＨ１９，ｐｓＨ１５）；λファージなどのバクテリオファージ；レトロウイルス，ワクシニアウイルス，バキュロウイルスなどの動物ウイルス；ｐＡ１−１１、ｐＸＴ１、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐｃＤＮＡＩ／Ｎｅｏなどが用いられる。
プロモーターとしては、遺伝子の発現に用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいかなるものでもよい。
例えば、宿主が動物細胞である場合、ＳＲαプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＨＳＶ−ＴＫプロモーターなどが用いられる。なかでも、ＣＭＶプロモーター、ＳＲαプロモーターなどが好ましい。
宿主がエシェリヒア属菌である場合、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、λＰ_Ｌプロモーター、ｌｐｐプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが好ましい。
宿主がバチルス属菌である場合、ＳＰＯ１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロモーターなどが好ましい。
宿主が酵母である場合、ＰＨＯ５プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰプロモーター、ＡＤＨプロモーターなどが好ましい。
宿主が昆虫細胞である場合、ポリヘドリンプロモーター、Ｐ１０プロモーターなどが好ましい。
発現ベクターとしては、上記の他に、所望によりエンハンサー、スプライシングシグナル、ポリＡ付加シグナル、選択マーカー、ＳＶ４０複製オリジン（以下、ＳＶ４０ｏｒｉと略称する場合がある）などを含有しているものを用いることができる。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素（以下、ｄｈｆｒと略称する場合がある）遺伝子〔メソトレキセート（ＭＴＸ）耐性〕、アンピシリン耐性遺伝子（以下、Ａｍｐ^ｒと略称する場合がある）、ネオマイシン耐性遺伝子（以下、Ｎｅｏ^ｒと略称する場合がある、Ｇ４１８耐性）等が挙げられる。特に、ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞を用い、ｄｈｆｒ遺伝子を選択マーカーとして使用する場合、目的遺伝子をチミジンを含まない培地によって選択することもできる。
また、必要に応じて、宿主に合ったシグナル配列をコードする塩基配列（シグナルコドン）を、膜貫通型酵素またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡの５’末端側に付加するか、あるいはネイティブなシグナル配列（もしくはプレプロ配列）と置換してもよい。宿主がエシェリヒア属菌である場合、ＰｈｏＡ・シグナル配列、ＯｍｐＡ・シグナル配列などが；宿主がバチルス属菌である場合、α−アミラーゼ・シグナル配列、サプチリシン・シグナル配列などが；宿主が酵母である場合、ＭＦα・シグナル配列、ＳＵＣ２・シグナル配列などが；宿主が動物細胞である場合、インシュリン・シグナル配列、α−インターフェロン・シグナル配列、抗体分子・シグナル配列などがそれぞれ用いられる。
宿主としては、例えば、エシェリヒア属菌、バチルス属菌、酵母、昆虫細胞、昆虫、動物細胞などが用いられる。
エシェリヒア属菌としては、例えば、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）Ｋ１２・ＤＨ１〔プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６０巻，１６０（１９６８）〕，ＪＭ１０３〔ヌクイレック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ），９巻，３０９（１９８１）〕，ＪＡ２２１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），１２０巻，５１７（１９７８）〕，ＨＢ１０１〔ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー，４１巻，４５９（１９６９）〕，Ｃ６００〔ジェネティックス（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），３９巻，４４０（１９５４）〕などが用いられる。
バチルス属菌としては、例えば、バチルス・サブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＭＩ１１４〔ジーン，２４巻，２５５（１９８３）〕，２０７−２１〔ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），９５巻，８７（１９８４）〕などが用いられる。
酵母としては、例えば、サッカロマイセス セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＨ２２，ＡＨ２２Ｒ⁻，ＮＡ８７−１１Ａ，ＤＫＤ−５Ｄ，２０Ｂ−１２、シゾサッカロマイセス ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）ＮＣＹＣ１９１３，ＮＣＹＣ２０３６、ピキア パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＫＭ７１などが用いられる。
昆虫細胞としては、例えば、ウイルスがＡｃＮＰＶの場合、夜盗蛾の幼虫由来株化細胞（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ ｃｅｌｌ；Ｓｆ細胞）、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉの中腸由来のＭＧ１細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｓｉａ ｎｉの卵由来のＨｉｇｈ Ｆｉｖｅ^ＴＭ細胞、Ｍａｍｅｓｔｒａ ｂｒａｓｓｉｃａｅ由来の細胞、Ｅｓｔｉｇｍｅｎａ ａｃｒｅａ由来の細胞などが用いられる。ウイルスがＢｍＮＰＶの場合、昆虫細胞としては、蚕由来株化細胞（Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ Ｎ細胞；ＢｍＮ細胞）などが用いられる。該Ｓｆ細胞としては、例えば、Ｓｆ９細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ１７１１）、Ｓｆ２１細胞（以上、Ｖａｕｇｈｎ，Ｊ．Ｌ．ら、イン・ヴィボ（Ｉｎ Ｖｉｖｏ），１３，２１３−２１７，（１９７７））などが用いられる。
昆虫としては、例えば、カイコの幼虫などが用いられる〔前田ら、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），３１５巻，５９２（１９８５）〕。
動物細胞としては、例えば、サル細胞ＣＯＳ−７，Ｖｅｒｏ，チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ細胞と略記），ｄｈｆｒ遺伝子欠損チャイニーズハムスター細胞ＣＨＯ（以下、ＣＨＯ（ｄｈｆｒ⁻）細胞と略記），マウスＬ細胞，マウスＡｔＴ−２０，マウスミエローマ細胞，ラットＧＨ３，ヒトＦＬ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などが用いられる。
形質転換は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
エシェリヒア属菌は、例えば、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンジイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），６９巻，２１１０（１９７２）やジーン（Ｇｅｎｅ），１７巻，１０７（１９８２）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
バチルス属菌は、例えば、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ＆ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），１６８巻，１１１（１９７９）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
酵母は、例えば、メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ），１９４巻，１８２−１８７（１９９１）、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７５巻，１９２９（１９７８）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
昆虫細胞および昆虫は、例えば、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），６，４７−５５（１９８８）などに記載の方法に従って形質転換することができる。
動物細胞は、例えば、細胞工学別冊８ 新細胞工学実験プロトコール．２６３−２６７（１９９５）（秀潤社発行）、ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），５２巻，４５６（１９７３）に記載の方法に従って形質転換することができる。
形質転換体の培養は、宿主の種類に応じ、公知の方法に従って実施することができる。
例えば、宿主がエシェリヒア属菌またはバチルス属菌である形質転換体を培養する場合、培養に使用される培地としては液体培地が好ましい。また、培地は、形質転換体の生育に必要な炭素源、窒素源、無機物などを含有することが好ましい。ここで、炭素源としては、例えば、グルコース、デキストリン、可溶性澱粉、ショ糖などが；窒素源としては、例えば、アンモニウム塩類、硝酸塩類、コーンスチープ・リカー、ペプトン、カゼイン、肉エキス、大豆粕、バレイショ抽出液などの無機または有機物質が；無機物としては、例えば、塩化カルシウム、リン酸二水素ナトリウム、塩化マグネシウムなどがそれぞれ挙げられる。また、培地には、酵母エキス、ビタミン類、生長促進因子などを添加してもよい。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、グルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地〔ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ），ジャーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー・ジェネティックス（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ），４３１−４３３，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ １９７２〕が好ましい。必要により、プロモーターを効率よく働かせるために、例えば、３β−インドリルアクリル酸のような薬剤を培地に添加してもよい。
宿主がエシェリヒア属菌である形質転換体の培養は、通常約１５〜４３℃で、約３〜２４時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主がバチルス属菌である形質転換体の培養は、通常約３０〜４０℃で、約６〜２４時間行なわれる。必要により、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が酵母である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、バークホールダー（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒ）最小培地〔Ｂｏｓｔｉａｎ，Ｋ．Ｌ．ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），７７巻，４５０５（１９８０）〕や０．５％カザミノ酸を含有するＳＤ培地〔Ｂｉｔｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら、プロシージングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシイズ・オブ・ザ・ユーエスエー（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ），８１巻，５３３０（１９８４）〕などが挙げられる。培地のｐＨは、好ましくは約５〜８である。培養は、通常約２０℃〜３５℃で、約２４〜７２時間行なわれる。必要に応じて、通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が昆虫細胞または昆虫である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えばＧｒａｃｅ’ｓ Ｉｎｓｅｃｔ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｇｒａｃｅ，Ｔ．Ｃ．Ｃ．，ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ），１９５，７８８（１９６２））に非動化した１０％ウシ血清等の添加物を適宜加えたものなどが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６．２〜６．４である。培養は、通常約２７℃で、約３〜５日間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
宿主が動物細胞である形質転換体を培養する場合の培地としては、例えば、約５〜２０％の胎児牛血清を含むＭＥＭ培地〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ），１２２巻，５０１（１９５２）〕，ＤＭＥＭ培地〔ヴィロロジー（Ｖｉｒｏｌｏｇｙ），８巻，３９６（１９５９）〕，ＲＰＭＩ １６４０培地〔ジャーナル・オブ・ザ・アメリカン・メディカル・アソシエーション（Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）１９９巻，５１９（１９６７）〕，１９９培地〔プロシージング・オブ・ザ・ソサイエティ・フォー・ザ・バイオロジカル・メディスン（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ），７３巻，１（１９５０）〕などが用いられる。培地のｐＨは、好ましくは約６〜８である。培養は、通常約３０℃〜４０℃で、約１５〜６０時間行なわれる。必要に応じて通気や撹拌を行ってもよい。
以上のようにして、形質転換体の細胞内または細胞外に膜貫通型酵素またはその部分ペプチドを生成させることができる。
前記形質転換体を培養して得られる培養物から、膜貫通型酵素またはその部分ペプチドを自体公知の方法に従って分離精製することができる。
例えば、膜貫通型酵素またはその部分ペプチドを培養菌体あるいは細胞から抽出する場合、培養物から公知の方法で集めた菌体あるいは細胞を適当な緩衝液に懸濁し、超音波、リゾチームおよび／または凍結融解などによって菌体あるいは細胞を破壊した後、遠心分離やろ過により可溶性蛋白質の粗抽出液を得る方法などが適宜用いられる。該緩衝液は、尿素や塩酸グアニジンなどの蛋白質変性剤や、トリトンＸ−１００^ＴＭなどの界面活性剤を含んでいてもよい。
このようにして得られた可溶性画分中に含まれる膜貫通型酵素またはその部分ペプチドの単離精製は、自体公知の方法に従って行うことができる。このような方法としては、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方法；透析法、限外ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する方法；イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を利用する方法；アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法；逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法；等電点電気泳動法などの等電点の差を利用する方法；などが用いられる。これらの方法は、適宜組み合わせることもできる。
かくして得られる膜貫通型酵素またはその部分ペプチドが遊離体である場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法によって該遊離体を塩に変換することができ、該蛋白質またはペプチドが塩として得られた場合には、自体公知の方法あるいはそれに準じる方法により該塩を遊離体または他の塩に変換することができる。
なお、形質転換体が産生する膜貫通型酵素またはその部分ペプチドを、精製前または精製後に適当な蛋白修飾酵素を作用させることにより、任意に修飾を加えたり、ポリペプチドを部分的に除去することもできる。該蛋白修飾酵素としては、例えば、トリプシン、キモトリプシン、アルギニルエンドペプチダーゼ、プロテインキナーゼ、グリコシダーゼなどが用いられる。
かくして得られる膜貫通型酵素またはその部分ペプチドの存在は、特異抗体を用いたエンザイムイムノアッセイやウエスタンブロッティングなどにより確認することができる。
さらに、膜貫通型酵素またはその部分ペプチドは、それをコードするＤＮＡに対応するＲＮＡを鋳型として、ウサギ網状赤血球ライセート、コムギ胚芽ライセート、大腸菌ライセートなどからなる無細胞蛋白質翻訳系を用いてインビトロ翻訳することによっても合成することができる。あるいは、さらにＲＮＡポリメラーゼを含む無細胞転写／翻訳系を用いて、膜貫通型酵素またはその部分ペプチドをコードするＤＮＡを鋳型としても合成することができる。無細胞蛋白質（転写）翻訳系は市販のものを用いることもできるし、それ自体既知の方法、具体的には大腸菌抽出液はＰｒａｔｔ Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ，１７９−２０９，Ｈａｍｅｓ Ｂ．Ｄ．＆Ｈｉｇｇｉｎｓ Ｓ．Ｊ．ｅｄｓ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９８４）に記載の方法等に準じて調製することもできる。市販の細胞ライセートとしては、大腸菌由来のものはＥ．ｃｏｌｉ Ｓ３０ ｅｘｔｒａｃｔ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）やＲＴＳ ５００ Ｒａｐｉｄ Ｔｒａｎｌａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ社製）等が挙げられ、ウサギ網状赤血球由来のものはＲａｂｂｉｔ Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ Ｌｙｓａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）等、さらにコムギ胚芽由来のものはＰＲＯＴＥＩＯＳ^ＴＭ（ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。このうちコムギ胚芽ライセートを用いたものが好適である。コムギ胚芽ライセートの作製法としては、例えばＪｏｈｎｓｔｏｎ Ｆ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１７９，１６０−１６１（１９５７）あるいはＥｒｉｃｋｓｏｎ Ａ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６，３８−５０（１９９６）等に記載の方法を用いることができる。
蛋白質合成のためのシステムまたは装置としては、バッチ法（Ｐｒａｔｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）前述）や、アミノ酸、エネルギー源等を連続的に反応系に供給する連続式無細胞蛋白質合成システム（Ｓｐｉｒｉｎ Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，１１６２−１１６４（１９８８））、透析法（木川等、第２１回日本分子生物学会、ＷＩＤ６）、あるいは重層法（ＰＲＯＴＥＩＯＳ^ＴＭ Ｗｈｅａｔ ｇｅｒｍ ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｃｏｒｅ ｋｉｔ取扱説明書：ＴＯＹＯＢＯ社製）等が挙げられる。さらには、合成反応系に、鋳型のＲＮＡ、アミノ酸、エネルギー源等を必要時に供給し、合成物や分解物を必要時に排出する方法（特開２０００−３３３６７３）等を用いることができる。
本発明のスクリーニング方法は、上記のいずれかの方法によって得られる膜貫通型酵素蛋白質または阻害物質結合型ペプチドを用いて、該蛋白質または該ペプチドへの被験物質の結合および該蛋白質または該ペプチドの酵素活性を測定することを特徴とする。
酵素活性の測定は、用いられる膜貫通型酵素に応じて、従来公知のいかなる方法を用いて行ってもよい。例えば、膜貫通型酵素がβセクレターゼの場合、酵素活性の測定は、例えば、上記特許文献１に記載の方法、特表平１１−５０７５３８号公報に記載の方法、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６，７３５−７４１（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ，４０２，５３３−５３７（１９９９）、Ｎａｔｕｒｅ，４０２，５３７−５４０（１９９９）などに記載の方法等を用いて行うことができる。
具体的には、例えば、βセクレターゼ蛋白質または阻害物質結合型ペプチドを、被験物質の存在下で、βセクレターゼの天然もしくは合成の基質［ＡＰＰまたはそのβセクレターゼ切断部位を含むフラグメント、あるいは該切断部位のアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を含む合成ペプチド（そのような合成ペプチドは市販されており、また、当業者はＡＰＰのβセクレターゼ切断部位近傍のアミノ酸配列を基にそのようなペプチドを上記のペプチド合成法を用いて容易に合成することもできる）］と接触させ、適当な反応条件下で一定時間インキュベートした後、切断により生じた産物の一方もしくは両方を検出する方法が挙げられる。反応産物の検出法としては、例えば、反応液をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付し、クーマシー・ブリリアント・ブルー（ＣＢＢ）染色等により２本のバンド（および未切断の基質ペプチドのバンド）を可視化し、デンシトメーターなどを用いて酵素活性を定量化する方法、標識剤でラベルした基質を用いて、同様にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ゲル上の各バンドの標識量を検出する方法等が挙げられる。標識剤としては、例えば、放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質などが用いられる。放射性同位元素としては、例えば、〔^１２５Ｉ〕、〔^１３１Ｉ〕、〔^３Ｈ〕、〔^１４Ｃ〕などが用いられる。上記酵素としては、安定で比活性の大きなものが好ましく、例えば、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、アルカリフォスファターゼ、パーオキシダーゼ、リンゴ酸脱水素酵素などが用いられる。蛍光物質としては、例えば、フルオレスカミン、フルオレッセンイソチオシアネートなどが用いられる。発光物質としては、例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、ルシゲニンなどが用いられる。
好ましくは、後述の実施例に示されるように、蛍光ドナーおよび蛍光クエンチャーで標識されたペプチドを基質として（蛍光ドナーと蛍光クエンチャーの間にβセクレターゼ切断部位があるので、未反応の基質はドナーとクエンチャーの接近により蛍光が検出されないが、βセクレターゼ活性により該切断部位で開裂するとクエンチャーが離れるため、蛍光が検出される）、上記と同様に被験物質の存在下でβセクレターゼまたは阻害物質結合型ペプチドと反応させ、反応液中の蛍光を測定することにより、βセクレターゼ活性を測定することができる。ここで、蛍光ドナーとしてはＮ^ε−Ｍｅｔｈｙｌａｎｔｈｒａｎｏｙｌ基、（７−ｍｅｔｈｏｘｙｃｏｕｍａｒｉｎ−４−ｙｌ）ａｃｅｔｙｌ基、４−（（４−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｈｅｎｙｌ）ａｚｏ）ｂｅｎｚｏｉｃ ａｃｉｄ（ｄａｂｃｙｌ）、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５等が、蛍光クエンチャーとしては２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ基、５−（（２−（Ｆｍｏｃ）−γ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏ）ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ（ＥＤＡＮＳ）、Ｃｙ５Ｑ、Ｃｙ７Ｑなどがそれぞれ例示されるが、これらに限定されない。
膜貫通型酵素または阻害物質結合型ペプチドと被験物質との結合は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いて、市販のセンサーチップ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ製）の表面上に、常法に従って膜貫通型酵素または阻害物質結合型ペプチドを固定化し、これに被験物質を接触させた後、該センサーチップに特定の波長の光を特定の角度から照射し、共鳴角度の変化を指標にして、固定化した酵素または阻害物質結合型ペプチドへの被験物質の結合の有無を判定することができる。あるいはまた、質量分析計に適合可能なプロテインチップの表面上に膜貫通型酵素または阻害物質結合型ペプチドを固定化し、これに被験物質を接触させた後、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ、ＦＡＢ−ＭＳなどのイオン化法と質量分析計（例：二重収束質量分析計、四重極型分析計、飛行時間型質量分析計、フーリエ変換質量分析計、イオンサイクロトロン質量分析計など）を組み合わせる方法により、被験物質に相当するピークの出現を検出することによっても、膜貫通型酵素または阻害物質結合型ペプチドと被験物質との結合を測定することができるが、これらの方法に限定されず、いかなる公知の他の方法も利用可能である。
被験物質が、膜貫通型酵素または阻害物質結合型ペプチドにおける膜貫通領域内の標的結合部位に結合すること、および該結合部位に結合することによって酵素阻害活性を発揮していることの確認は、上記した膜貫通型酵素または阻害物質結合型ペプチドの代わりに阻害物質非結合型ペプチドを用いて、上記と同様にして酵素活性および被験物質の結合活性を測定することにより行うことができる。
その結果、膜貫通型酵素または阻害物質結合型ペプチドに結合して該酵素活性を阻害するが、阻害物質非結合型ペプチドには結合せず、且つ該酵素活性を阻害しない物質を、膜貫通領域内の標的結合部位に結合することにより酵素阻害活性を発揮する化合物として選択することができる。
本発明はまた、本発明のスクリーニング方法を実施するのに好適なスクリーニング用キットを提供する。該キットは、少なくとも（ａ）対象となる膜貫通型酵素または阻害物質結合型ペプチド、および（ｂ）阻害物質非結合型ペプチドを構成として含むものである。該キットは、さらに酵素活性の測定や結合試験に必要な試薬類もしくは器具類（例えば、基質、反応用緩衝液、ＳＰＲ用センサーチップ、質量分析用プロテインチップ等）をさらに含んでもよい。
本発明のスクリーニング方法において、膜貫通型酵素としてβセクレターゼを用いることにより、βセクレターゼの膜貫通領域に結合する該酵素阻害物質を選択することができる。そのような化合物の例としては、後記実施例で示される化合物Ａ，Ｄ，Ｈ，Ｉ，Ｊなどが挙げられるが、これらに限定されない。該βセクレターゼ阻害物質は、βセクレターゼの膜貫通領域に結合してその酵素活性を阻害することから、従来知られている遷移状態ミミックやβセクレターゼの活性中心に作用するその他の阻害薬とは異なり、βセクレターゼへの選択性が高い。即ち、構造の類似したポケットを有する他のアスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、レニンやカテプシンＤなどの膜貫通型でないアスパラギン酸プロテアーゼ等）を阻害する可能性が極めて低いので、副作用（例えば、レニンやカテプシンＤ阻害による血圧低下など）を生じるおそれが少ない。従って、本発明のスクリーニング方法により選択され得るβセクレターゼ選択的阻害物質は、低毒性で安全なＡＤ、ダウン症、老年性記憶障害（ＡＡＭＩ）等の予防・治療剤として用いることができる（尚、ＡＡＭＩは、一般には、加齢に伴ってみられる記憶力滅退で、病気や診断名ではなく、生理的範囲であって病的過程を伴わない状態をいうとされるが、本明細書においては、ＡＡＭＩの「状態改善」も含めて、包括的に「治療」という語を用いることとする）。
βセクレターゼ選択的阻害物質を上記予防・治療剤として使用する場合は、常套手段に従って製剤化することができる。例えば、該阻害物質は、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤などとして経口的に、あるいは水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤などの注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、該阻害物質を、生理学的に認められる公知の担体、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、安定剤、結合剤などとともに、一般に認められた製剤実施に要求される単位用量形態で混和することによって製造することができる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにする
錠剤、カプセル剤などに混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン，コーンスターチ，トラガント，アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ，ゼラチン，アルギン酸などのような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖，乳糖またはサッカリンのような甘味剤、ペパーミント，アカモノ油またはチェリーのような香味剤などが用いられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記タイプの材料にさらに油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用水のようなベヒクル中の活性物質、胡麻油，椰子油などのような天然産出植物油などを溶解または懸濁させるなどの通常の製剤実施に従って処方することができる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水，ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液（例えば、Ｄ−ソルビトール，Ｄ−マンニトール，塩化ナトリウムなど）などが用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例：エタノール）、ポリアルコール（例：プロピレングリコール，ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（例：ポリソルベート８０^ＴＭ，ＨＣＯ−５０）などと併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油，大豆油などが用いられ、溶解補助剤である安息香酸ベンジル，ベンジルアルコールなどと併用してもよい。
また、上記予防・治療剤は、例えば、緩衝剤（例えば、リン酸塩緩衝液，酢酸ナトリウム緩衝液）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム，塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン，ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、ベンジルアルコール，フェノールなど）、酸化防止剤などと配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填される。
このようにして得られる製剤は安全で低毒性であるので、例えば、ヒトや他の温血動物（例えば、ラット，マウス，ハムスター，ウサギ，ヒツジ，ヤギ，ブタ，ウシ，ウマ，ネコ，イヌ，サル，チンパンジー，トリなど）に対して投与することができる。
βセクレターゼ選択的阻害物質の投与量は、投与対象、症状、投与方法などにより差異はあるが、経口投与の場合、一般的に、例えばＡＤ患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．１〜１００ｍｇ、好ましくは約１．０〜５０ｍｇ、より好ましくは約１．０〜２０ｍｇである。非経口的に投与する場合は、その１回投与量は投与対象、症状、投与方法などによっても異なるが、例えば注射剤の形では、通常、例えばＡＤ患者（６０ｋｇとして）においては、一日につき約０．０１〜３０ｍｇ程度、好ましくは約０．１〜２０ｍｇ程度、より好ましくは約０．１〜１０ｍｇ程度を投与するのが好都合である。他の動物の場合も、６０ｋｇ当たりに換算した量を投与することができる。
本発明のスクリーニング方法により選択され得るβセクレターゼ阻害物質は、活性中心に作用するβセクレターゼ阻害薬のように、構造の最適化において、他のアスパラギン酸プロテアーゼに対する阻害作用による制限を受けることなく構造展開が可能なリード化合物となりうる点でも有利である。
本明細書および図面において、塩基やアミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記する。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示すものとする。
ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸
ｃＤＮＡ ：相補的デオキシリボ核酸
Ａ ：アデニン
Ｔ ：チミン
Ｇ ：グアニン
Ｃ ：シトシン
ＲＮＡ ：リボ核酸
ｍＲＮＡ ：メッセンジャーリボ核酸
ｄＡＴＰ ：デオキシアデノシン三リン酸
ｄＴＴＰ ：デオキシチミジン三リン酸
ｄＧＴＰ ：デオキシグアノシン三リン酸
ｄＣＴＰ ：デオキシシチジン三リン酸
ＡＴＰ ：アデノシン三リン酸
ＥＤＴＡ ：エチレンジアミン四酢酸
ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム
Ｇｌｙ ：グリシン
Ａｌａ ：アラニン
Ｖａｌ ：バリン
Ｌｅｕ ：ロイシン
Ｉｌｅ ：イソロイシン
Ｓｅｒ ：セリン
Ｔｈｒ ：スレオニン
Ｃｙｓ ：システイン
Ｍｅｔ ：メチオニン
Ｇｌｕ ：グルタミン酸
Ａｓｐ ：アスパラギン酸
Ｌｙｓ ：リジン
Ａｒｇ ：アルギニン
Ｈｉｓ ：ヒスチジン
Ｐｈｅ ：フェニルアラニン
Ｔｙｒ ：チロシン
Ｔｒｐ ：トリプトファン
Ｐｒｏ ：プロリン
Ａｓｎ ：アスパラギン
Ｇｌｎ ：グルタミン
ｐＧｌｕ ：ピログルタミン酸
Ｍｅ ：メチル基
Ｅｔ ：エチル基
Ｂｕ ：ブチル基
Ｐｈ ：フェニル基
ＴＣ ：チアゾリジン−４（Ｒ）−カルボキサミド基
また、本明細書中で繁用される置換基、保護基および試薬を下記の記号で表記する。
Ｔｏｓ ：ｐ−トルエンスルフォニル
ＣＨＯ ：ホルミル
Ｂｚｌ ：ベンジル
Ｃｌ_２Ｂｚｌ ：２，６−ジクロロベンジル
Ｂｏｍ ：ベンジルオキシメチル
Ｚ ：ベンジルオキシカルボニル
Ｃｌ−Ｚ ：２−クロロベンジルオキシカルボニル
Ｂｒ−Ｚ ：２−ブロモベンジルオキシカルボニル
Ｂｏｃ ：ｔ−ブトキシカルボニル
ＤＮＰ ：ジニトロフェノール
Ｔｒｔ ：トリチル
Ｂｕｍ ：ｔ−ブトキシメチル
Ｆｍｏｃ ：Ｎ−９−フルオレニルメトキシカルボニル
ＨＯＢｔ ：１−ヒドロキシベンズトリアゾール
ＨＯＯＢｔ ：３，４−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン
ＨＯＮＢ ：１−ヒドロキシ−５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド
ＤＣＣ ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
本発明は、さらに以下の参考例、実施例によって詳しく説明されるが、これらの例は単なる実例であって、本発明を限定するものではなく、また本発明の範囲を逸脱しない範囲で変化させてもよい。

以下の実施例で用いられる５化合物：

は、上記特許文献１の記載に従って製造した。
尚、大腸菌を用いての遺伝子操作法は、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）に記載されている方法に従った。
参考例１ βセクレターゼの全長蛋白の発現用プラスミドの調製
βセクレターゼの全長蛋白を調製するための発現用プラスミドの構築は、βセクレターゼをコードする遺伝子の塩基配列において、Ｂｅｎｎｅｔｔらが報告（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８６，７３５−７４１（１９９９））している塩基配列と比較して、クローン番号ＦＧ０４０８７（ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０３２９７５、かずさＤＮＡ研究所）の塩基配列に１塩基の挿入（第１０２番目）があったため、変換を行い、さらに精製が容易なようにＣ末端側にＦｌａｇペプチド（Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号：４））をコードする塩基配列（５’−ＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧＡＴＡＡＧ−３’（配列番号：３））を付加した。まず、クローン番号ＦＧ０４０８７の遺伝子を鋳型に、Ｂｅｎｎｅｔｔらが報告しているβ−セクレターゼ遺伝子塩基配列を参考に作製したプライマーセット：５’−ＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＣＣＴＴＣＧＴ−３’（配列番号：５）とＦｌａｇペプチドをコードする塩基配列を含む５’−ＧＧＴＡＣＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＧＡＧＡＴＧＴＣＡＴＣＡＧ−３’（配列番号：６）とを各２０ｐｍｏｌずつ添加し、ＫＯＤ（東洋紡）を使用してＰＣＲ反応をＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒＴＭ（エムジェイリサーチ）にて行った（反応条件：９４℃で２分間を１サイクル、９８℃で１５秒間、７２℃で２秒間、７４℃で１０秒間を３サイクル、９８℃で１５秒間、６８℃で２秒間、７４℃で１０秒間を３サイクル、９８℃で１５秒間、６４℃で２秒間、７４℃で１０秒間を３サイクル、９８℃で１５秒間、６０℃で２秒間、７４℃で１０秒間を２８サイクル）。そのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約７００ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。その断片をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン）を用いて、クローニングした。得られたプラスミドを制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造）とＫｐｎＩ（宝酒造）で消化した後、アガロースゲル電気泳動し、約２５０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。クローン番号ＦＧ０４０８７を含むプラスミドをＡｐａＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動し、約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。これらＤＮＡ断片とＡｐａＩとＫｐｎＩで消化した動物細胞用発現プラスミドｐｃＤＮＡ３．１（−）（フナコシ）を混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡）を用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセル（宝酒造）を形質転換することでプラスミドｐＢＡＣＥ−Ｆを得た。次に１塩基挿入の変換を行うために、クローン番号ＦＧ０４０８７の遺伝子を鋳型に、Ｂｅｎｎｅｔｔらが報告しているβ−セクレターゼ遺伝子塩基配列を参考に作製したプライマーセット：５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’（配列番号：７）と５’−ＧＧＣＧＣＣＣＣＣＣＡＧＡＣＣＡＣＴＴＣＴＣＡＧ−３’（配列番号：８）を各２０ｐｍｏｌずつ添加し、ＫＯＤ（東洋紡）を使用して、ＰＣＲ反応をＭｉｎｉＣｙｃｌｅｒＴＭにて行った（反応条件：９４℃で２分間を１サイクル、９８℃で１５秒間、７２℃で２秒間、７４℃で１０秒間を３サイクル、９８℃で１５秒間、６８℃で２秒間、７４℃で５秒間を３サイクル、９８℃で１５秒間、６４℃で２秒間、７４℃で５秒間を３サイクル、９８℃で１５秒間、６０℃で２秒間、７４℃で５秒間を２８サイクル）。そのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１７０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。その断片をＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＴＯＰＯＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（インビトロジェン）を用いて、クローニングした。得られたプラスミドを制限酵素ＡｐａＩ（宝酒造）とＢｂｅＩ（宝酒造）で消化した後、アガロースゲル電気泳動し、約１２０ｂｐのＤＮＡ断片を回収した。ｐＢＡＣＥ−Ｆを同様の制限酵素で消化した後、アガロースゲル電気泳動し、約１．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。さらにｐＢＡＣＥ−ＦをＡｐａＩで消化した後、アガロースゲル電気泳動し、約５．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。これらの３つの断片をＬｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いて連結し、大腸菌ＪＭ１０９のコンピテントセルを形質転換することでプラスミドｐＢＡＣＥ１−５０１を得た。得られたｃＤＮＡ断片は、配列番号：９で表わされる塩基配列を有しており、その塩基配列の第１番目〜第１５２７番目に配列番号：１０で表わされるアミノ酸配列がコードされていた。
参考例２ βセクレターゼの全長蛋白のＨＥＫ２９３細胞での発現と精製
βセクレターゼの全長蛋白（ＢＡＣＥ１−５０１）の発現はＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン）を用いて行った。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞を１．１×ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ１４０ｍｌに播種した。２９３ｆｅｃｔｉｎ２００μｌを５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地で希釈し、５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地で希釈した１５０μｇの発現用プラスミドと混合し２０分間、室温で放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％炭酸ガス、１２５ｒｐｍで２日間振とう培養後、細胞を回収し、５ｍｌの縣濁用緩衝液（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）を添加後、超音波破砕機（トミー精工）（破砕条件：アウトプット５、１５秒間×４回）を用いて破砕した。その破砕液を遠心分離（５００ｇ、１０分間）し、その上清をさらに遠心分離（１００，０００ｇ、４５分間）し、その沈殿物を０．５ｍｌの可溶化用緩衝液（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．０５Ｍオクチル−β−グルコシド１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）で可溶化（４℃、２．５時間）した後、遠心分離（１００，０００ｇ、４５分間）した。その上清を１００μｌの抗Ｆｌａｇ抗体（シグマ）を用いて精製した。その結果、目的のＢＡＣＥ１−５０１を３９５μｇ取得できた。
参考例３ ＢＡＣＥ１−５０１蛋白に対する化合物Ａ、Ｄ、Ｈ、ＩおよびＪの阻害様式の解析
９６穴黒色プレート（コーニング）に２５μｌの０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、１０μｌの０．１ｍＭ、０．１５ｍＭ、０．２５ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ各基質（Ｎｍａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ_２；配列番号：１１）、上記（２）で得られた１０μｌのＢＡＣＥ１−５０１（０．０７ｍｇ／ｍｌ）、５μｌの０．１ｍＭ、０．３ｍＭ各化合物Ａ１０％ＤＭＳＯ溶液、対照には５μｌの１０％ＤＭＳＯをそれぞれ添加し、３７℃にて２０時間反応した。反応終了後、蛍光強度（励起波長３２５ｎｍ、測定波長４６０ｎｍ）をフルオロスキャンアセント（ラボシステムズ）を用いて測定した。各濃度の化合物存在下における蛍光値の変化量の逆数を縦軸に基質濃度の逆数を横軸にプロット（ラインウェーバー−バークプロット）した結果、いずれの化合物も横軸上で直線が交差したことから全長ＢＡＣＥ１−５０１に対する阻害様式は非拮抗型阻害であることが明らかになった。一例として化合物Ｄのグラフを図１に示す。
各化合物は全長ＢＡＣＥ１−５０１を非拮抗的に阻害することから活性部位以外に結合しているものと考えられた。次に、その結合部位を明らかにするため、各ドメインからなる蛋白を調製し、阻害および結合実験を行った。
参考例４ βセクレターゼの細胞外ドメインからなる蛋白および細胞外ドメインと膜貫通ドメインからなる蛋白の発現用プラスミドの調製
βセクレターゼの細胞外ドメインからなる蛋白を調製するための発現用プラスミドは、第１番目〜第４５４番目のアミノ酸にＦｌａｇペプチドが付加された塩基配列を有するものを調製した。まず、プラスミドｐＢＡＣＥ１−５０１を鋳型にプライマーセット：５’−ＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡ−３’（配列番号：１２）と５’−ＴＴＴＴＧＧＴＡＣＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＧＧＴＴＧＡＣＴＣＡＴＣＴＧＴＣ−３’（配列番号：１３）を各２０ｐｍｏｌずつ添加し、ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏ（ストラッタジーン）を使用して、ＰＣＲ反応をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（アプライドバイオシステム）にて行った（反応条件：９４℃で１分間を１サイクル、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で２分間を２０サイクル）。そのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｈｅＩ（宝酒造）とＫｐｎＩを用いて消化した後、スピンカラムＳ−３００（アマシャムバイオサイエンス）を用いて回収した。これらＤＮＡ断片とＮｈｅＩとＫｐｎＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１（−）を混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いて連結し、大腸菌ＤＨ５−αのコンピテントセル（東洋紡）を形質転換することでプラスミドｐＢＡＣＥ１−４５４を得た。得られたｃＤＮＡ断片は、配列番号：１４で表わされる塩基配列を有しており、その塩基配列の第１番目〜第１３８６番目に配列番号：１５で表わされるアミノ酸配列がコードされていた。
βセクレターゼの細胞外ドメイン部分と膜貫通ドメインからなる蛋白を調製するための発現用プラスミドの調製は、第１番目〜第４７４番目のアミノ酸にＦｌａｇペプチドが付加された塩基配列を有するものを調製した。まず、プラスミドｐＢＡＣＥ１−５０１を鋳型にプライマーセット：５’−ＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡ−３’（配列番号：１２）と５’−ＴＴＴＴＧＧＴＡＣＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＧＣＡＧＡＧＴＧＧＣＡＧＣＡＴＧ−３’（配列番号：１６）を各２０ｐｍｏｌずつ添加し、ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏを使用して、ＰＣＲ反応をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００にて行った（反応条件：９４℃で１分間を１サイクル、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で２分間を２０サイクル）。そのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｈｅＩとＫｐｎＩを用いて消化した後、スピンカラムＳ−３００を用いて回収した。これらＤＮＡ断片とＮｈｅＩとＫｐｎＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１（−）を混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いて連結し、大腸菌ＤＨ５−αのコンピテントセルを形質転換することでプラスミドｐＢＡＣＥ１−４７４を得た。得られたｃＤＮＡ断片は、配列番号：１７で表わされる塩基配列を有しており、その塩基配列の第１番目〜第１４４６番目に配列番号：１８で表わされるアミノ酸配列がコードされていた。
参考例５ βセクレターゼの細胞外ドメインからなる蛋白（ＢＡＣＥ１−４５４）および細胞外ドメインと膜貫通ドメインからなる蛋白（ＢＡＣＥ１−４７４）のＨＥＫ２９３細胞での発現と精製
各蛋白の発現はＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン）を用いて行った。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞を１．１×ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ １４０ｍｌに播種した。２９３ｆｅｃｔｉｎ２００μｌを５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地で希釈し、５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地で希釈した１５０μｇの発現用プラスミドと混合し２０分間、室温で放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％炭酸ガス、１２５ｒｐｍで２日間振とう培養後、ＢＡＣＥ１−４７４については細胞を回収し、５ｍｌの縣濁用緩衝液（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）を添加後、超音波破砕機（トミー精工）（破砕条件：アウトプット５、１５秒間×４回）を用いて破砕した。その破砕液を遠心分離（５００ｇ、１０分間）し、その上清をさらに遠心分離（１００，０００ｇ、４５分間）し、その沈殿物を０．５ｍｌの可溶化用緩衝液（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．０５Ｍオクチル−β−グルコシド１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）で可溶化（４℃、２．５時間）した後、遠心分離（１００，０００ｇ、４５分間）した。その上清を１００μｌの抗Ｆｌａｇ抗体を用いて精製した。その結果、目的のＢＡＣＥ１−４７４を７０μｇ取得できた。ＢＡＣＥ１−４５４については培養上清を回収し、１００μｌの抗Ｆｌａｇ抗体を用いて精製した。その結果、目的のＢＡＣＥ１−４５４を１４μｇ取得できた。
実施例１ 各ＢＡＣＥ蛋白に対する化合物Ａ、Ｄ、Ｈ、ＩおよびＪの阻害作用の測定
９６穴黒色プレートに２５μｌの０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、１０μｌの２５０μＭ基質（Ｎｍａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ_２；配列番号：１１）、上記参考例５で得られた１０μｌのＢＡＣＥ１−４７４（０．０２ｍｇ／ｍｌ）またはＢＡＣＥ１−４５４（０．０１ｍｇ／ｍｌ）あるいは細胞外ドメインとして市販されている組換え型ヒトＢＡＣＥ−１（アミノ酸残基１−４６０、アールアンドディーシステムズ）（０．０２５ｍｇ／ｍｌ）、５μｌの各化合物１０％ＤＭＳＯ溶液、対照には５μｌの１０％ＤＭＳＯをそれぞれ添加し、３７℃にて６３時間反応した。反応終了後、蛍光強度（励起波長３２５ｎｍ、測定波長４６０ｎｍ）をフルオロスキャンアセントを用いて測定した。各化合物（終濃度は１０μＭ）はＢＡＣＥ１−４７４に対して３０％（化合物Ａ）、３８％（化合物Ｄ）、３４％（化合物Ｈ）、３７％（化合物Ｉ）、３７％（化合物Ｊ）の阻害率を示したが、ＢＡＣＥ１−４５４および組換え型ヒトＢＡＣＥ−１に対しては阻害活性を示さなかった。
実施例２ 表面プラズモン共鳴法を用いた各ＢＡＣＥ蛋白と化合物Ａ、Ｄ、Ｈ、ＩおよびＪとの結合の検出
表面プラズモン共鳴法を用いた解析にはＢｉａｃｏｒｅ３０００（ビアコア）を用いた。ＢＡＣＥ１−５０１および組換え型ヒトＢＡＣＥ−１（アミノ酸残基１−４６０）は、ｐＨ４．５の酢酸バッファー中で、Ｎ−ｈｙｄｒｏｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）／Ｎ−ｅｔｈｙｌ−Ｎ’−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）−ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＥＤＣ）で活性化したＣＭ５センサーチップ（ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ｄｅｘｔｒａｎ ｍａｔｒｉｘｃｈｉｐ）上のカルボキシル基に固相化した。ＢＡＣＥ１−４５４、ＢＡＣＥ１−４７４はｐＨ４．０の酢酸バッファー中で同様の方法で固相化した。化合物と酵素の結合は１０％ＤＭＳＯと０．００５％ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０を含むＰＢＳ中で測定した。バルク効果により生じるフローセル間でのＲｅｓｏｎａｎｃｅ Ｕｎｉｔ（ＲＵ）値のずれの修正は、ＤＭＳＯ濃度を９％から１１％までの５段階に変化させたバッファーを用いて作成した補正曲線を用いて行なった。その結果、ＢＡＣＥ１−５０１とＢＡＣＥ１−４７４に結合することを示すシグナルが得られた。一方、ＢＡＣＥ１−４５４と組換え型ヒトＢＡＣＥ−１（アミノ酸残基１−４６０）に対しては、結合を示すシグナルは得られなかった。一例としてＢＡＣＥ１−５０１と化合物Ｊとの結合を示すシグナル図を図２に示す。
各化合物は膜貫通領域の４６１番目から４７４番目のアミノ酸のいずれかの部位に結合することによって全長ＢＡＣＥ１−５０１を阻害することが明らかになった。次に、膜貫通領域の４６１番目から４７４番目のアミノ酸のどの部分に結合することにより阻害するかを詳細に検討するため、ＢＡＣＥ１−４７４のカルボキシル末端側からアミノ酸を削除した蛋白を作製し、阻害および結合実験を行った。
参考例６ ＢＡＣＥ１−４７４のカルボキシル末端側からアミノ酸を削除したβセクレターゼ蛋白発現プラスミドの構築
ＢＡＣＥ１−４７４のカルボキシル末端側から段階的にアミノ酸を削除したβセクレターゼ蛋白発現プラスミドの調製を行った。まず、第１番目〜第４７１番目のアミノ酸にＦｌａｇペプチドが付加された塩基配列を有するものの調製にはプラスミドｐＢＡＣＥ１−４７４を鋳型にプライマーセット：５’−ＣＡＴＣＴＧＣＧＣＣＣＴＣＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧ−３’（配列番号：１９）と５’−ＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＣＡＧＣＡＴＧＡＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号：２０）とＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ストラッタジーン）を用いて９塩基の削除することでプラスミドｐＢＡＣＥ１−４７１を得た。得られたｃＤＮＡ断片は、配列番号：２１で表わされる塩基配列を有しており、その塩基配列の第１番目〜第１４３７番目に配列番号：２２で表わされるアミノ酸配列がコードされていた。
次に第１番目〜第４６９番目のアミノ酸にＦｌａｇペプチドが付加された塩基配列を有するものを調製した。プラスミドｐＢＡＣＥ１−４７４を鋳型にプライマーセット：５’−ＧＣＴＧＧＣＴＡＧＣＧＴＴＴＡＡＡＣＧＧＧＣＣＣＴＣＴＡＧＡ−３’（配列番号：１２）と５’−ＴＴＴＴＧＧＴＡＣＣＴＡＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＧＡＡＧＡＧＧＧＣＧＣＡＧＡＴＧ−３’（配列番号：２３）を各２０ｐｍｏｌずつ添加し、ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏを使用して、ＰＣＲ反応をＧｅｎｅ Ａｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ９７００にて行った（反応条件：９４℃で１分間を１サイクル、９４℃で３０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で２分間を２０サイクル）。そのＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動し、約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｈｅＩとＫｐｎＩを用いて消化した後、スピンカラムＳ−３００を用いて回収した。これらＤＮＡ断片とＮｈｅＩとＫｐｎＩで消化したｐｃＤＮＡ３．１（−）を混合し、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈを用いて連結し、大腸菌ＤＨ５−αのコンピテントセルを形質転換することでプラスミドｐＢＡＣＥ１−４６９を得た。得られたｃＤＮＡ断片は、配列番号：２４で表わされる塩基配列を有しており、その塩基配列の第１番目〜第１４３１番目に配列番号：２５で表わされるアミノ酸配列がコードされていた。さらに第１番目〜第４６５番目のアミノ酸にＦｌａｇペプチドが付加された塩基配列を有するものを調製した。すなわち、プラスミドｐＢＡＣＥ１−４６９を鋳型にプライマーセット：５’−ＧＣＣＴＡＴＧＴＣＡＴＧＧＣＴＧＣＣＡＴＣＧＡＴＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＣＧ−３’（配列番号：２６）と５’−ＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＴＴＧＴＡＡＴＣＧＡＴＧＧＣＡＧＣＣＡＴＧＡＣＡＴＡＧＧＣ−３’（配列番号：２７）とＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔを用いて１２塩基を削除することでプラスミドｐＢＡＣＥ１−４６５を得た。得られたｃＤＮＡ断片は、配列番号：２８で表わされる塩基配列を有しており、その塩基配列の第１番目〜第１４１９番目に配列番号：２９で表わされるアミノ酸配列がコードされていた。
参考例７ ＢＡＣＥ１−４７１およびＢＡＣＥ１−４６５のＨＥＫ２９３細胞での発現と精製
各蛋白の発現はＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（インビトロジェン）を用いて行った。ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞を１．１×ｃｅｌｌｓ／ｍｌになるようにＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｍｅｄｉｕｍ １４０ｍｌに播種した。２９３ｆｅｃｔｉｎ２００μｌを５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地で希釈し、５ｍｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地で希釈した１５０μｇの発現用プラスミドと混合し２０分間、室温で放置した後にＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３−Ｆ細胞に添加した。３７℃、８％炭酸ガス、１２５ｒｐｍで２日間振とう培養後、ＢＡＣＥ１−４７１については細胞を回収し、５ｍｌの縣濁用緩衝液（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）を添加後、超音波破砕機（トミー精工）（破砕条件：アウトプット５、１５秒間×４回）を用いて破砕した。その破砕液を遠心分離（５００ｇ、１０分間）し、その上清をさらに遠心分離（１００，０００ｇ、４５分間）し、その沈殿物を０．５ｍｌの可溶化用緩衝液（０．０１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、０．０５Ｍオクチル−β−グルコシド１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ）で可溶化（４℃、２．５時間）した後、遠心分離（１００，０００ｇ、４５分間）した。その上清を１００μｌの抗Ｆｌａｇ抗体を用いて精製した。その結果、目的のＢＡＣＥ１−４７１を１０５μｇ取得できた。ＢＡＣＥ１−４６５については培養上清を回収し、１００μｌの抗Ｆｌａｇ抗体を用いて精製した。その結果、目的のＢＡＣＥ１−４６５を９１μｇ取得できた。
実施例３ ＢＡＣＥ１−４７１および１−４６５に対する化合物Ａ、Ｄ、Ｈ、ＩおよびＪの阻害作用の測定
９６穴黒色プレートに２５μｌの０．０５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．５）、１０μｌの２５０μＭ基質（Ｎｍａ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ（Ｄｎｐ）−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＮＨ_２；配列番号：１１）、上記参考例７で得られた１０μｌのＢＡＣＥ１−４７１（０．０５ｍｇ／ｍｌ）またはＢＡＣＥ１−４６５（０．０４ｍｇ／ｍｌ）、５μｌの０．１ｍＭ化合物Ａ１０％ＤＭＳＯ溶液、対照には５μｌの１０％ＤＭＳＯをそれぞれ添加し、３７℃にてＢＡＣＥ１−４７１については５０時間、ＢＡＣＥ１−４６５については２２時間反応した。反応終了後、蛍光強度（励起波長３２５ｎｍ、測定波長４６０ｎｍ）をフルオロスキャンアセントを用いて測定した。各化合物（終濃度は１０μＭ）はＢＡＣＥ１−４７１に対して２９％（化合物Ａ）、４２％（化合物Ｄ）、３１％（化合物Ｈ）、７０％（化合物Ｉ）、４８％（化合物Ｊ）の阻害率を示したが、ＢＡＣＥ１−４６５に対しては阻害活性を示さなかった。
実施例４ 表面プラズモン共鳴法を用いたＢＡＣＥ１−４７１およびＢＡＣＥ１−４６５と化合物Ａ、Ｄ、Ｈ、ＩおよびＪとの結合の検出
表面プラズモン共鳴法を用いた解析にはＢｉａｃｏｒｅ３０００を用いた。ＢＡＣＥ１−４６５は、ｐＨ４．５の酢酸バッファー中でＮＨＳ／ＥＤＣで活性化したＣＭ５センサーチップ上のカルボキシル基に固相化した。、ＢＡＣＥ１−４６５は、ｐＨ４．０の酢酸バッファー中で同様に固相化した。化合物と酵素の結合は１０％ＤＭＳＯと０．００５％ＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０を含むＰＢＳ中で測定した。バルク効果により生じるフローセル間でのＲＵ値のずれの修正は、ＤＭＳＯ濃度を９％から１１％までの５段階に変化させたバッファーを用いて作成した補正曲線を用いて行なった。その結果、各化合物がＢＡＣＥ１−４７１に結合することを示すシグナルが得られた。しかし、ＢＡＣＥ１−４６５に結合することを示すシグナルは得られなかった。
以上の結果から化合物Ａ、Ｄ、Ｈ、ＩおよびＪはβセクレターゼの４６６番目から４７１番目のアミノ酸位置に結合し、阻害活性を示すことが明らかとなった。このことはβセクレターゼの４６６番目から４７１番目のアミノ酸位置は活性調節に重要な影響を及ぼす部位であることを示している。

本発明のスクリーニング方法またはスクリーニング用キットを用いて得られうる、膜貫通領域に結合することによりβセクレターゼ活性を阻害する化合物は、従来知られている遷移状態ミミックやその他の活性中心に作用する阻害薬等とは異なるβセクレターゼ阻害様式を示すことから、βセクレターゼを阻害することにより予防・治療効果が期待される疾患、例えばＡＤ、ダウン症などのＡβの異常蓄積が関与する疾患、ＡＡＭＩなどの状態の予防・治療において有利な特性（例えば、βセクレターゼ選択的に作用し、レニンやカテプシンＤ等の他のアスパラギン酸プロテアーゼを阻害しないなど）を有する可能性がある。従って、本発明のスクリーニング方法は、副作用の危険性が低いような、新規な阻害作用点を有するＡＤ、ダウン症、ＡＡＭＩ等の予防・治療薬の探索に有用である。
本出願は、日本で出願された特願２００４−２９０７８４（出願日：２００４年１０月１日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

［配列番号３］
Ｆｌａｇペプチドをコードするオリゴヌクレオチド。
［配列番号４］
合成コンストラクト。
［配列番号５］
プライマー。
［配列番号６］
プライマー。
［配列番号７］
プライマー。
［配列番号８］
プライマー。
［配列番号９］
（１５０４）．．（１５２７） Ｆｌａｇタグ。
［配列番号１１］
βセクレターゼの合成基質。
（１）．．（１） Ｎ−メチルアントラノイル−Ｌ−セリン
（９）．．（９） ２，４−ジニトロフェニル−Ｌ−リシン
（１１）．．（１１） アミド化
［配列番号１２］
プライマー。
［配列番号１３］
プライマー。
［配列番号１４］
（１３６３）．．（１３８６） Ｆｌａｇタグ。
［配列番号１６］
プライマー。
［配列番号１７］
（１４２３）．．（１４４６） Ｆｌａｇタグ。
［配列番号１９］
プライマー。
［配列番号２０］
プライマー。
［配列番号２１］
（１４１４）．．（１４３７） Ｆｌａｇタグ。
［配列番号２３］
プライマー。
［配列番号２４］
（１４０８）．．（１４３１） Ｆｌａｇタグ。
［配列番号２６］
プライマー。
［配列番号２７］
プライマー。
［配列番号２８］
（１３９６）．．（１４１９） Ｆｌａｇタグ。

Claims (21)

1. 膜貫通型酵素の活性中心を含む領域と膜貫通領域の一部もしくは全部とを含む、該酵素のアミノ酸配列の一部または全部を有する蛋白質を用いることを特徴とする、膜貫通領域に特異的に結合する該酵素阻害物質のスクリーニング方法。
2. 活性中心を含む領域を含み且つ前記膜貫通領域の一部もしくは全部を欠く、膜貫通型酵素のアミノ酸配列の一部を有する蛋白質をさらに用い、各蛋白質への被験物質の結合および各蛋白質の酵素活性を測定することを特徴とする、請求項１記載の方法。
3. 活性中心を含む領域が細胞外もしくは内腔領域である請求項１記載の方法。
4. 膜貫通型酵素がプロテアーゼである請求項１記載の方法。
5. プロテアーゼがアスパラギン酸プロテアーゼである請求項４記載の方法。
6. アスパラギン酸プロテアーゼがβセクレターゼである請求項５記載の方法。
7. βセクレターゼの活性中心を含む領域が配列番号２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜４５４で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、該酵素の膜貫通領域が配列番号２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４５５〜４８０で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有するものである、請求項６記載の方法。
8. 活性中心を含む領域として配列番号２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６〜４５４で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有し、膜貫通領域の一部として配列番号２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６６〜４７１で示されるアミノ酸配列と同一もしくは実質的に同一のアミノ酸配列を有する蛋白質を用いる、請求項７記載の方法。
9. 以下の（ａ）および（ｂ）を含んでなる、膜貫通型酵素の膜貫通領域に特異的に結合する該酵素阻害物質のスクリーニング用キット。
   （ａ）膜貫通型酵素の活性中心を含む領域と膜貫通領域の一部もしくは全部とを含む、該酵素のアミノ酸配列の一部または全部を有する蛋白質
   （ｂ）該酵素の活性中心を含む領域を含み且つ上記（ａ）の膜貫通領域の一部もしくは全部を欠く、該酵素のアミノ酸配列の一部を有する蛋白質
10. βセクレターゼの膜貫通領域に結合する該酵素阻害物質（但し、下記構造式で示される化合物を除く）を含有してなる、βセクレターゼ選択的阻害剤。
    

    

    
11. 阻害物質のβセクレターゼ結合部位が配列番号２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６６〜４７１で示されるアミノ酸配列中に存在する、請求項１０記載の剤。
12. アルツハイマー病、ダウン症および老年性記憶障害からなる群より選択される疾患の予防・治療用である、請求項１０記載の剤。
13. 血圧低下を引き起こさないことを特徴とする請求項１２記載の剤。
14. βセクレターゼの膜貫通領域に結合する該酵素阻害物質（但し、下記構造式で示される化合物を除く）を用いることを特徴とする、βセクレターゼの選択的阻害方法。
    

    

    
15. 阻害物質のβセクレターゼ結合部位が配列番号２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６６〜４７１で示されるアミノ酸配列中に存在する、請求項１４記載の方法。
16. アルツハイマー病、ダウン症および老年性記憶障害からなる群より選択される疾患の予防・治療用である、請求項１４記載の方法。
17. 血圧低下を引き起こさないことを特徴とする請求項１６記載の方法。
18. βセクレターゼ選択的阻害剤の製造のための、βセクレターゼの膜貫通領域に結合する該酵素阻害物質（但し、下記構造式で示される化合物を除く）の使用。
    

    

    
19. 阻害物質のβセクレターゼ結合部位が配列番号２で表されるアミノ酸配列中アミノ酸番号４６６〜４７１で示されるアミノ酸配列中に存在する、請求項１８記載の使用。
20. 阻害剤がアルツハイマー病、ダウン症および老年性記憶障害からなる群より選択される疾患の予防・治療用である、請求項１８記載の使用。
21. 阻害剤が血圧低下を引き起こさないことを特徴とする請求項２０記載の使用。

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