CN101478977A - 神经变性疾病的治疗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及硒酸盐或其药学上可接受的盐在提高蛋白磷酸酶PP2A活性的方法和组合物中的应用。还描述了减少Tau蛋白磷酸化、抑制GSK3活性和治疗或预防神经变性疾病的方法。

Description

神经变性疾病的治疗

发明领域

本发明涉及硒酸盐或其药学上可接受的盐在提高PP2A活性的方法和组合物中的应用。本发明还涉及硒酸盐或其药学上可接受的盐在抑制或降低tau蛋白磷酸化的方法，抑制GSK3β活性的方法，具体说是治疗或预防神经变性疾病的方法中的应用。在某些实施方式中，本发明涉及将硒酸盐或其药学上可接受的盐与其它治疗药物联合用于治疗或预防神经变性疾病的方法中的应用。

发明背景

神经变性疾病是一些疾病的总称，包括使脑功能正常的神经元受损而致的脑控制自身或机体能力的丧失。神经变性疾病是老年人的主要疾病。随着预期寿命的增长，世界人群活得更长，神经变性疾病患者的数目随之增多。

在一些神经变性疾病中，脑中的神经元或神经胶质细胞中存在异常tau蛋白的沉积。例如，在阿尔茨海默病(AD)特征性神经原纤维缠结中发现了异常的tau蛋白。神经原纤维缠结(NT)是AD的二种神经病理改变之一[Lee等，2001]。形成配对的螺旋纤维是NT的主要成分，其主要由微管相关蛋白tau组成[Lee等，1991；Grundke-Iqbal等，1986a；Grundke-Iqbal等，1986b]。PHF-tau(从PHF分离的tau蛋白)是高度不溶性的蛋白，在SDS凝胶(电泳)中显示停滞不移动，不能结合微管，因为它被异常磷酸化(与正常tau蛋白相比，有多个位点磷酸化)[Lee等，1991；Grundke-Iqbal等，1986a；Grundke-Iqbal等，1986b]。去磷酸化后，PHF-tau蛋白变成可溶性蛋白而如同正常tau蛋白那样能结合和促进微管装配[Wang等，1995；Wang等，1996；Bramblett等，1993]。认为是tau蛋白异常磷酸化引起了tau功能不全、微管不稳定、轴突转运丧失、神经变性和与AD相关的痴呆。

一种异常类型的tau蛋白是超磷酸化的tau蛋白。已知体内糖原合酶的激酶3β(GSK3β)可使tau蛋白的多个磷酸化位点，包括阿尔茨海默病的特有Ser³⁹⁶残基磷酸化[Li和Paudel，2006]。进而，已知蛋白激酶Akt可使GSK3β磷酸化，已知蛋白磷酸酶PP2A可减弱Akt的活性。

PP2A是一种异质三聚体全酶，存在多种形式，由结合于不同调节亚基的共同核心结构组成[Mumby和Walter，1993]。此酶的核心是由催化(C)亚基和结构(A)亚基组成的复合体。第三种亚基称为B亚基，其包括能调节PP2A活性和特异性的几种多肽[Mumby和Walter，1993；Kamibayashi等，1994]。PP2A的ABC同工型重要部分能与神经元微管结合[Sontag等，1995]，意味着PP2A可能调节微管相关蛋白(MAP)如tau蛋白的磷酸化状态。已证明含B调节亚基的PP2A，而非其它形式(即含B’和B”亚基)的PP2A能在体外结合tau蛋白使之强效去磷酸化。另外，抑制PP2A的ABC同工型可诱导tau蛋白超磷酸化、tau蛋白与微管分离、和丧失tau蛋白导致的微管稳定性[Sontag等，1996]。近年来证明PP2A占人脑tau蛋白磷酸酶总活性的约71％[Liu等，2005]。AD病人脑中磷酸酶总活性和PP2A针对tau蛋白的活性显著降低，而AD脑中的其它磷酸酶如PP2B的活性实际上升高[LIU等，2005]。人脑中PP2A活性与大多数磷酸化位点的tau蛋白磷酸化水平呈负相关。这表明PP2A是主要的tau蛋白磷酸酶，调节着人脑多处部位的tau蛋白磷酸化。这意味着AD脑中tau蛋白的异常超磷酸化部分是由于PP2A活性下调所致，因此其作用是能提高PP2A活性，特别是能提高PP2A的ABC同工型活性的制剂将具有临床用途，可治疗或预防神经变性疾病的发展。

有证据证明，tau蛋白异常磷酸化的逐渐增多可能与存在异常的α-共核蛋白(α-synuclein)的神经变性疾病相关。在阿尔茨海默病、帕金森病、Guarn-帕金森-ALS-痴呆复合症和由α-共核蛋白突变引起的帕金森病中tau蛋白和α-共核蛋白二者发生病变[Duda等，2002；Forman等，2002；Ishizawa等，2003]。

α-共核蛋白看来在帕金森病(PD)的病理生理学中起着重要作用。雷维小体(Lewy body)是PD的病理学标志，其主要由α-共核蛋白组成[Spillantini等，1997；Spillantini等，1998b]。

认为α-共核蛋白在PD的病理生理学中起着关键作用，因为它在雷维小体中积累，且因为遗传学研究鉴定到α-共核蛋白中存在与家族性PD相关的突变[Kruger等，1998；Polymeropoulos等，1997；Singleton等，2003；Spillantini等，1998b；Zarranz等，2004]。

α-共核蛋白中的A53T和A30P突变导致α-共核蛋白聚集倾向升高看来是PD的病因。这二种突变提高了α-共核蛋白自发性聚集或因对外源因子如金属和氧化应激的反应而聚集的倾向[Conway等，2000；Hashimoto等，1999；Kruger等，1998；Ostreova-Golts等，2000；Paik等，1999、2000；Polymeropoulos等，1997]。

在转基因小鼠和果蝇中，α-共核蛋白的A53T和A30P突变也可引起年龄依赖的α-共核蛋白聚集和神经元损伤[Feany和Bender，2000；Giasson等，2002；Kahle等，2001；Masliah等，2000]。这些研究结果强调了α-共核蛋白与神经变性相关。

异常磷酸化的tau蛋白存在于散发PD病人的雷维小体中，出现在靠近含α-共核蛋白病态微管装配体区域的神经元中[Ishizawa等，2003]。体外证据也将α-共核蛋白与tau蛋白相联系，因为α-共核蛋白在体外能结合tau蛋白和通过蛋白激酶A刺激tau蛋白磷酸化[Giasson等，2003；Jensen等，1999]。近年的研究结果表明α-共核蛋白体外能提高tau蛋白的纤维化，而异常的tau蛋白纤维存在于过度表达A53T突变型α-共核蛋白的有症状转基因小鼠脑中[Giasson等，2003]。

Frasier M等，2005证明，在过度表达A30Pα-共核蛋白转基因小鼠中，A30Pα-共核蛋白聚集发生在病理性tau蛋白旁边，即产生的α-共核蛋白聚集与病理性tau蛋白平行分布，并证明有症状的A30Pα-共核蛋白转基因小鼠出现异常的tau蛋白磷酸化，这种磷酸化与c-jun激酶活化相关。

除了α-共核蛋白(α-Syn)聚集外，氧化应激和接触某些神经毒素如1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)与PD的病变相联系。在小鼠和灵长动物中MPTP能诱导黑质纹状体多巴胺能(神经)通路的选择性变性

，如PD中所见，此与α-Syn表达水平和聚集升高相关，但不诱生真正的雷维小体[Dauer和Przedborski，2003]，而连续给予MPTP可引发对泛素和α-共核蛋白具有免疫反应性的黑质包涵体形成[Fornai等，2005]。某些雷维小体的另一种成分是异常磷酸化的tau蛋白[Ishizawa等，2003]。已报导在家族性阿尔茨海默病(AD)、唐氏综合征和雷维小体病病人的脑中tau蛋白和α-Syn作为聚集体或包涵体共同定位在神经元中，或位于某些雷维小体或雷维小体样包涵体内部[Kotzbauer等，2001；Lippa等，1999；Arima等，1999；Iseki等，1999]。

tau蛋白和α-Syn之间的相似处包括在突触前神经元中的表达、体内半寿期长、它们的“天然不折叠”性质使它们对热稳定，和它们通过疏水性残基臂形成装配纤维的核心的纤维化倾向[Friedhoff等，2000；Serpell等，2000]。

[396/404]S3E双突变(模拟PHF-1磷酸化位点的伪磷酸化结构，其中在最长的人tau蛋白同工型-ht40中396位和404位的二个丝氨酸残基被替换成谷氨酸残基)的tau蛋白的其它体外资料也表明，Ser396/404的超磷酸化可引起tau蛋白C末端采取更为延伸的构型，而改变其对tau蛋白寡聚化的抑制作用和提高纤维形成的速度[Abraha等，2000]。

Duka等，2006现已证明，MPTP诱导的中脑多巴胺能神经元α-Syn表达水平升高促进了tau蛋白PHF-1结合位点(Ser396/404)磷酸化模式的改变，导致这二种蛋白的失位(mislocation)，促进其共同免疫沉淀，并提高了十二烷基肌氨酸钠不溶性超磷酸化tau蛋白的水平，提示MPTP-诱导的帕金森病机理和神经毒性的启动步骤是α-Syn指导的tau蛋白Ser396/404超磷酸化。

MPTP引起α-Syn与微管分离增加和与细胞骨架结合分数有关的磷酸化tau蛋白水平降低的发现，也可能是与神经变性过程的机制相关。tau蛋白的超磷酸化大大降低了tau蛋白对微管的亲和力，导致其失去稳定[Drechsel等，1992；Biernat等，1993；Michaelis等，2002]。此外，也知道磷酸化的tau蛋白能结合其它微管结合蛋白如MAP1和MAP2并从微管上除去这些蛋白[Iqbal和Grundke-Iqbal，2005]。然而，由于已知α-Syn能结合微管[Wersinger和Sidhu，2005]并且在轴突信号转运中可能起作用[Sidhu等，2004]，因此该蛋白与微管分离有可能进一步加剧微管的不稳定，破坏细胞骨架网络和细胞内稳态。因此，在导致与包涵体形成相关的神经变性过程的链式反应中，α-Syn与微管分离和结合于微管的tau蛋白发生异常可能包含另一种联系。

MPTP-诱导的α-Syn水平异常调节着磷酸化tau蛋白的形成，具体说，tau蛋白的PHF-1形式使我们能够了解PHF形成和重要神经功能相关丧失的早期阶段的情况，提示MPTP-诱导的帕金森综合征或神经毒性可能是tau蛋白疾病，伴随使人联想到共核蛋白病的α-Syn改变。

这提示，已知AD发病中的tau蛋白异常移动也可能出现在帕金森病中，但发生在与AD不相关的脑部区域中，因此提示其在某些神经变性疾病的发生中有相当大的重叠。由此提出，看似无关的神经变性疾病实际上可能有着共同的触发机制和后续病理变化，启动了运动神经元的变性。

因此需要能影响tau蛋白磷酸化的，临床上可用于治疗或预防神经变性疾病的制剂。

发明概述

本发明部分是基于以下发现，即蛋白磷酸化酶PP2A接触硒酸盐或其药学上可接受的盐可提高其活性。提高PP2A活性可降低或抑制tau蛋白的磷酸化，特别是超磷酸化，包括二种分支方法：i)去磷酸化灭活Akt，从而降低GSK3β的磷酸化，然后降低tau蛋白的磷酸化，和ii)tau蛋白直接去磷酸化。降低tau蛋白磷酸化特别是超磷酸化水平可减少或防止神经元或神经胶质细胞中异常tau蛋白的积累或沉积，因而可用于治疗或预防神经变性疾病。

因此，在一方面内容中，本发明提供治疗或预防对象神经变性疾病的方法，包括给予所述对象有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。在某些实施方式中，所述神经变性疾病是tau蛋白疾病。在某些实施方式中，所述神经变性疾病是α-共核蛋白疾病。在特定实施方式中，所述神经变性疾病选自早老性痴呆、老年痴呆、阿尔茨海默病和帕金森病。

在本发明另一方面内容中，提供抑制或降低神经元、神经胶质细胞或雷维小体中tau蛋白磷酸化的方法，包括使神经元或神经胶质细胞接触有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。在某些实施方式中，所述tau蛋白是微管相关tau蛋白。在某些实施方式中，所述tau蛋白位于神经原纤维缠结中。在某些实施方式中，抑制或防止了tau蛋白的超磷酸化。

在另一方面内容中，本发明提供增强PP2A活性的方法，包括使PP2A接触有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。在某些实施方式中，所述PP2A是去磷酸化Akt的一种同工型。在某些实施方式中，所述PP2A是去磷酸化tau蛋白，特别是在神经元、神经胶质细胞和雷维小体中发现的微管相关tau蛋白的一种同工型。

在另一方面内容中，本发明提供抑制神经元或神经胶质细胞中GSK3β活性的方法，该方法包括使神经元或神经胶质细胞接触有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。

在本发明还有一方面内容中，提供硒酸盐或其药学上可接受的盐在制造治疗或预防神经变性疾病药物中的应用。

在上述已广泛描述的方法和应用的某些实施方式中，硒酸盐或其药学上可接受的盐与适合治疗或预防神经变性疾病的其它疗法，或与适合减轻神经变性疾病症状的疗法联用。

发明详述

1.定义

除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员共同理解的相同含义。虽然与本文所述相似或等同的任何方法和材料可用于实施或测试本发明，但本文描述的是优选的方法和材料。对于本发明的目的，下面定义了以下术语。

本文所用冠词“一个”和“一种”指该冠词语法对象有一个或一个以上(即至少一个)。例如，“一种元件”指一个元件或一个以上元件。

本文所用术语“约”指与参比品的数量、水平、数值、维度、大小或用量相比，差异可高达30％、20％或10％的数量、水平、数值、维度、大小或用量。

在全篇说明书和权利要求书中，除非另有要求，以下词语“包含”和其变体“含有”和“包括”应理解为意指包括所述的整体或步骤，或一组整体或步骤，但不排除任何其它整体或步骤，或其它一组整体或步骤。

术语“去磷酸化”本文用于指用化学方法去除生化物质如蛋白质中的磷酸基团(PO₄ ^2-)。在细胞环境中，可通过酶如磷酸酶的酶促作用实现去磷酸化。

本文所用术语“胶质细胞”指非神经元细胞，它们能为中枢神经系统的神经元提供结构和代谢支持。胶质细胞也称为神经胶质细胞或胶质。

术语“超磷酸化”指某生化物质如蛋白质中所有可利用的磷酸化位点都被磷酸化。该生化物质不会发生进一步磷酸化。短语“抑制或减少超磷酸化”包括防止该生化物质所有的位点被磷酸化，和减少其所有磷酸化位点被磷酸化的生化物质的数量。

本文所用的术语“联用”指用至少二种制剂治疗对象，使得它们对神经变性疾病的作用在同一段时间内至少发挥一部分。可在一种组合物中同时给予至少二种制剂，或可用分开的组合物同时或依次给予各制剂。

术语“雷维小体”指神经细胞中发生的蛋白异常聚集。雷维小体中的主要蛋白聚集体由α-共核蛋白组成。

术语“神经变性疾病”本文用于指特征为神经元丧失或变性的神经疾病。神经变性疾病包括神经变性运动疾病和与记忆丧失和/或痴呆相关的神经变性疾病。神经变性疾病包括tau蛋白病和α-共核蛋白病。神经变性疾病的例子包括但不限于：早老性痴呆、老年痴呆、阿尔茨海默病、与染色体17连锁的帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上麻痹(PSP)、皮克病、原发进行性失语症、额颞叶痴呆、皮质基底(核)痴呆、帕金森病、伴痴呆的帕金森病、伴有雷维小体的痴呆、唐氏综合征、多发性系统性萎缩、淀粉样侧索硬化症(ALS)和哈-斯综合征。

术语“神经原纤维缠结”本文用于指位于脑中的异常结构，其由成对的螺旋纤维丝(神经原纤维和微管)的致密阵列组成。神经原纤维缠结中包含有tau蛋白，特别是微管相关tau蛋白。认为脑中存在的神经原纤维缠结数量与对象痴呆程度相关。神经原纤维缠结是阿尔茨海默病的一种区别特征。

本文所用术语“神经元”指在中枢神经系统中发现的细胞，它们是专门接收、加工和传输信息的细胞。神经元也可称为神经细胞。

本文所用术语“营养量”包括能提供每日平均摄入硒量的硒用量。在美国每日平均摄入量是80—120微克/天。

与硒酸盐相关的本文所用的“药学上的盐”指对于人类和动物给药毒理学安全的金属离子盐。例如，合适的药学上可接受的盐包括但不限于：药学上可接受的无机酸如氢氯酸、硫酸、磷酸、硝酸、碳酸、硼酸、磺酸和氢溴酸的盐，或药学可接受的有机酸如乙酸、丙酸、丁酸、酒石酸、马来酸、羟基马来酸、延胡索酸、马来酸、柠檬酸、乳酸、粘酸、葡糖酸、苯甲酸、琥珀酸、草酸、苯乙酸、甲烷磺酸、对甲苯磺酸、苯磺酸、水杨酸、苯磺胺酸、天冬氨酸、谷氨酸、乙二胺四乙酸、硬脂酸、棕榈酸、油酸、月桂酸、泛酸、鞣酸、抗坏血酸和正戊酸的盐。

碱盐包括但不限于：与药学上可接受的阳离子如钠、钾、锂、钙、镁、铁、镍、锌、铵和烷基铵形成的那些盐。

可用诸如低级烷基卤如甲基、乙基、丙基、丁基氯、溴和碘；二烷基硫酸盐如二甲基和二乙基酸盐；和其它盐制剂季铵化碱性含氮基团。

合适的硒酸的金属离子盐包括但不限于：钠、钾、锂、镁、钙、铁、镍、锌、铵和烷基铵盐。在某些实施方式中，所述盐不是硒酸锂。优选的硒酸盐是钠盐Na₂SeO₄。

术语“磷酸化”本文用于指在生化物质如蛋白质中化学加入磷酸基团(PO₄ ^2-)。在细胞环境中，可通过酶如激酶的酶促作用实现磷酸化。短语“抑制或减少磷酸化”包括防止生化物质的一个或多个磷酸化位点发生磷酸化，包括防止所有的磷酸化位点发生磷酸化，如超磷酸化。此短语也包括通过防止一个或多个磷酸化位点的磷酸化降低生化物质的磷酸化程度，或导致在该生化物质的一个或多个磷酸化位点发生去磷酸化。

术语“对象”或“个体”或“病人”本文中可互换使用，指需要预防或治疗的任何对象，特别是脊椎动物对象，更具体说是哺乳动物对象。合适的属于本发明范围的脊椎动物对象包括但不限于：灵长类、禽类、家畜动物(如猪、绵羊、牛、马、驴)、实验动物(如家兔、小鼠、大鼠、豚鼠、猪、仓鼠)、陪伴动物(如猫和狗)和捕获的野生动物(如狐狸、鹿、野狗)。优选的对象是需要治疗或预防神经变性疾病，特别是阿尔茨海默病或痴呆的人。然而，应理解以上术语不暗示存在症状。

术语“超营养量”本文用于指所用剂量高于认为符合营养要求的量。在美国，平均每日的硒摄入量为80-120微克/天。超营养的硒用量向对象提供了高于推荐的每日允许量。例如，超营养硒量可以是每天：3μg-20mg/kg、每天0.015mg-20mg/kg、0.1mg-20mg/kg、0.1mg-14mg/kg、0.1mg-13mg/kg、0.1mg-12mg/kg、0.1mg-10mg/kg、0.1mg-9mg/kg、0.1mg-8mg/kg、0.1mg-7mg/kg、0.1mg-6mg/kg、0.15mg-5mg/kg、0.15mg-4mg/kg、0.15mg-3mg/kg、0.15mg-2mg/kg、0.15mg-1mg/kg，具体是每天0.1mg-14mg/kg、0.07mg-6.5mg/kg或0.15mg-54mg/kg，更具体说是每天0.07mg-2mg/kg。

本文所用的术语“α-共核蛋白病”指涉及脑神经细胞中和α-共核蛋白聚集或异常α-共核蛋白的神经变性疾病或病症。α-共核蛋白病包括但不限于：帕金森病、伴痴呆的帕金森病、伴有雷维小体的痴呆、唐氏综合征、多发性系统性萎缩、淀粉样侧索硬化症(ALS)和哈-斯综合征。

在治疗或预防神经变性疾病，或抑制或降低tau蛋白磷酸化，或抑制GSK3β活性的本文描述中所用术语“有效量”指以单剂量或一系列剂量的一部分给予或加入的硒酸盐或其药学上可接受的盐的用量，该用量能有效提高PP2A的活性，具体是能有效预防神经变性疾病相关的症状、维持对症状的控制和/或治疗现有症状。此有效量取决于所治疗个体的健康和身体状况，所治疗个体的分类类别、组合物配方、医疗状况的评估和其它相关因素。预计所述剂量范围较广，可通过常规试验确定。在具体实施方式中，有效量是营养量或超营养量。

术语“tau蛋白病”本文用于指涉及脑神经元和胶质细胞中异常tau蛋白沉积的神经变性疾病或病症。tau蛋白病包括的疾病和病症中，tau蛋白异常磷酸化，包括tau蛋白超磷酸化。tau蛋白病包括但不限于：早老性痴呆、老年痴呆、阿尔茨海默病、与染色体17连锁的帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上麻痹(PSP)、皮克病、原发进行性失语症、额颞叶痴呆、皮质基底(核)痴呆。

2.治疗或预防神经变性疾病的方法

本发明的预测部分基于确定硒酸盐或其药学上可接受的盐能有效提高PP2A的活性，进而可通过GSK3β导致减少tau蛋白的磷酸化和/或提高tau蛋白去磷酸化的速率。本发明的方法通常包括使神经元或胶质细胞中的PP2A接触能增强PP2A活性用量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。在某些实施方式中，硒酸盐或其药学上可接受的盐的用量，具体是硒酸盐或其盐的用量每日为约0.015mg-20mg/kg，常为约0.1mg-14mg/kg、0.07mg-6.5mg/kg或0.15mg-5mg/kg，例如每日0.07mg-2mg/kg。

本发明可有效用于治疗或预防神经变性疾病。神经变性疾病包括神经变性运动疾病和与记忆丧失相关的神经变性疾病，包括tau蛋白病和α-共核蛋白病。神经变性疾病的示范性例子包括：早老性痴呆、老年痴呆、阿尔茨海默病、与染色体17连锁的帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上麻痹(PSP)、皮克病、原发进行性失语症、额颞叶痴呆、皮质基底(核)痴呆、帕金森病、伴痴呆的帕金森病、伴有雷维小体的痴呆、唐氏综合征、多发性系统性萎缩、淀粉样侧索硬化症(ALS)和哈-斯综合征。在优选的实施方式中，本发明适合治疗或预防tau蛋白病，特别是阿尔茨海默病和痴呆。在其它实施方式中，本发明适合治疗或预防α-共核蛋白病，特别是帕金森病。硒酸盐或其药学上可接受的盐的适合有效用量是营养性或超营养性硒酸量。在某些实施方式中，硒酸盐或其药学上可接受的盐的用量是0.015mg-20mg/kg，通常为每日约0.1mg-14mg/kg或0.07mg-6.5mg/kg或0.15mg-5mg/kg，例如每日0.07mg-2mg/kg。在优选实施方式中，硒酸盐或其药学上可接受的盐是硒酸钠(Na₂SeO₄)。

在某些实施方式中，给予硒酸盐或其药学上可接受的盐时联用另一种能治疗或预防神经变性疾病的药物。可与硒酸盐或其药学上可接受的盐联用的治疗或预防神经变性疾病药物的示范性例子包括但不限于：胆碱脂酶抑制剂如他克林

杜尼匹次、加兰他敏和雷司替明；N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂如美金刚胺；雌激素制剂如倍美力；非类固醇消炎药物(NSAID)如阿斯匹林和布洛芬；左旋多巴(L-多巴)，多巴脱羧酶抑制剂如卡比多巴和苄丝肼，或左旋多巴和多巴脱羧酶抑制剂如信尼麦

和

联用；多巴胺激动剂如溴隐亭

硫丙麦角林

派拉米苏

罗比尼洛卡麦角林、阿扑吗啡(APOKYN^TM)和稠环乙脲；单胺氧化酶B抑制剂如司来吉兰

和

和拉撒斯林(rasasiline)

抗胆碱能药物如苯并托品甲磺酸溴隐亭

和盐酸苯海索

以及COMT抑制剂如恩他卡朋

和托卡朋

或其它药物如酒石酸雷司替明

和金刚胺

或左旋多巴、多巴脱羧酶抑制剂、多巴胺激动剂、单胺氧化酶B抑制剂、抗胆碱能药物和COMT抑制剂的二种或多种混合物。

联合治疗可包括有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐，和通常在缺乏硒酸盐时所用的一定量的治疗或预防神经变性疾病的(其它)药物。例如盐酸他克林可作为联用药物的一部分与硒酸盐或其药学上可接受的盐一起给予神经变性疾病如AD病人，用量为40mg-160mg/天，或可给予用量5-10mg/天的杜尼匹次。可给予痴呆病人剂量达到1.25mg/天偶联马雌激素(CEE)的倍美力。或者，由于与硒酸盐或其药学上可接受的盐共同给药，可减少治疗神经变性疾病所用的药物剂量。在某些实施方式中，这种联用可显示协同效应。

本发明的某些实施方式涉及治疗或预防对象神经变性疾病的方法，该方法通常包括给予所述对象有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。为实施这些方法，治疗该对象的人员可根据该对象的具体情况和环境确定硒酸盐或其药学上可接受的盐的有效剂量。硒酸盐的有效剂量是能有效治疗或预防神经变性疾病，包括预防症状，维持对症状的控制或治疗症状的用量。在某些实施方式中，此有效量是营养量。在其它实施方式中，此有效量是超营养量。在具体实施方式中，所述硒酸或其药学上可接受的盐是硒酸钠。

以下叙述用于本发明方法的给药方式，硒酸盐的给药量和硒酸盐制剂。对于所要治疗的神经变性疾病，可通过测定能表明此类疾病进程的一种或多种诊断参数并与合适的对照相比而确定。以对象是人为例，“合适的对照”可以是治疗前的该个体，或可以是用安慰剂治疗的人(年龄相配或类似的对照)。按照本发明，神经变性疾病的治疗包括但不限于：(i)预防有患神经变性疾病倾向但尚未诊断此病的对象发生此病，因此这种治疗是对神经变性疾病的预防性治疗；(ii)抑制神经变性疾病，即制止神经变性疾病的发展；或(iii)缓解神经变性疾病产生的症状。

本发明的方法适合治疗已诊断为神经变性疾病，怀疑患有神经变性疾病，或已知被怀疑和认为可能发生神经变性疾病的个体。

在上述方法的某些实施方式中，所述神经变性疾病是tau蛋白病，特别是帕金森病，所述治疗任选还包括给予适合治疗上述α-共核蛋白病的其它药物。

在优选实施方式中，所述硒酸盐是硒酸钠。

可用本发明方法治疗的对象例子是脊椎动物，特别是哺乳动物。在某些实施方式中，所述对象选自：人、绵羊、牛、马、母牛、猪、狗和猫。优选的对象是人。

可采用药物递送领域已知的以下任何技术配制硒酸盐或其药学上可接受的盐。当然要记住，可以许多方式给予硒酸盐或其药学上可接受的盐，但并非所有的制剂都适合每种给药途径。可给予固体或液体形式的硒酸盐或其药学上可接受的盐。其应用可经口服、直肠、鼻、局部(包括口颊、舌下)或吸入途径。硒酸盐或其药学上可接受的盐可与常规的药学上可接受的辅佐剂、载体和/或稀释剂一起给药。

给药可用的固体剂型包括片剂、胶囊、粉剂、药丸、糊剂、栓剂和颗粒形式。它们也可包含载体或添加剂，如调味剂、染料、稀释剂、软化剂、粘合剂、防腐剂、持久剂和/或包裹材料。给药的液体剂型包括溶液、混悬液和乳液。这些也可与上述添加剂一起给予。

具有合适粘度易于使用的硒酸盐或其药学上可接受的盐的溶液和混悬液可用于注射。如需要，对注射而言太过粘稠的混悬液可用设计的装置将其植入(体内)。可通过肠胃道外途径或肠溶装置给予持续释放剂型。肠胃道外给药是用于实施本发明给予硒酸盐或其药学上可接受的盐的另一种途径。“肠胃道外”包括适合注射和经鼻、阴道、直肠和口颊给药的制剂。

硒酸盐或其药学上可接受的盐给药可包括口服延长给药剂型。口服制剂优选以缓释胶囊或片剂剂型，或者以水溶液形式每日给药1—3次。可每日、连续、一周一次或一周三次经静脉内给予硒酸盐或其药学上可接受的盐。

硒酸盐或其药学上可接受的盐的给药可包括每日给药，优选采用缓释胶囊或片剂剂型每日给予一次，或每日给予一次水溶液。

硒酸盐或其药学上可接受的盐与适合治疗神经变性疾病的至少一种药物联用时，可采用单一制剂或组合物，或采用分开的制剂或组合物的固体或液体剂型给药。在某些实施方式中，硒酸盐或其药学上可接受的盐和治疗神经变性疾病的这种药物，可作为单一片剂或胶囊，或作为分开的片剂或胶囊口服给药。在其它实施方式中，硒酸盐或其药学上可接受的盐和治疗神经变性疾病的这种药物，可作为单一组合物或分开的组合物静脉内给药。

本发明也提供含营养量或超营养量硒酸盐或其药学上可接受的盐的治疗或预防神经变性疾病的药物组合物。在某些实施方式中，所述组合物含有0.5mg-1.0g，例如5-450mg的硒酸盐或其药学上可接受的盐和药学上可接受的载体。在某些实施方式中，硒酸盐或其药学上可接受的盐的用量是约5.0-700mg或5-450mg。在说明性例子中，硒酸盐或其药学上可接受的盐的用量是1.6mg-450mg、5-450mg、7.5-250mg，具体是50-200mg，例如50-100mg或100-150mg，每日一次或分几次给药。在某些实施方式中，所述药物组合物可用于治疗或预防tau蛋白病，特别是阿尔茨海默病或痴呆。在其它实施方式中，所述药物组合物可用于治疗或预防α-共核蛋白病，特别是帕金森病。

含有硒酸盐或其药学上可接受的盐的药物组合物也可包含其它治疗或预防神经变性疾病的药物。例如，所述组合物可含硒酸盐或其药学上可接受的盐，和胆碱脂酶抑制剂如他克林、杜尼匹次、加兰他敏或雷司替明；N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂如美金刚胺；雌激素制剂如倍美力；或非类固醇消炎药物(NSAID)如阿斯匹林或布洛芬；左旋多巴，多巴脱羧酶抑制剂；左旋多巴和多巴脱羧酶抑制剂联用；和/或COMT抑制剂；多巴胺激动剂；单胺氧化酶B抑制剂；抗胆碱能药物；COMT抑制剂或其它药物如酒石酸雷司替明或金刚胺。

本发明的药物组合物可包含作为整个分子而无免疫原性、与硒酸盐生物相容的、能生物吸收、可生物降解而消除的任何其它成分。所述制剂可以即用剂型提供，或以给药前需加入运载体的灭菌粉末或液体剂型提供。如需无菌，可在无菌条件下制备该制剂，可灭菌混合物的各成分，或可除菌过滤该制剂后再使用。这种溶液还可含适当的药物载体，例如但不限于缓冲剂、盐、赋形剂、防腐剂等。

在某些实施方式中，本发明方法采用缓释的口服剂型给予硒酸盐或其药学上可接受的盐。这些制剂通常所含的硒酸盐或其药学上可接受的盐溶解性较低以延缓其被吸收入血流中。此外，这些制剂可包含也能延缓硒酸盐或其药学上可接受的盐吸收的其它成分、药物、载体等。可能或可能不会发生生物腐蚀的微胶囊、聚合物包裹系统和渗透泵也可用于延缓或控制硒酸盐或其药学上可接受的盐从胶囊或基质中释放。

硒酸盐或其药学上可接受的盐可单用，或作为另一种药物的组成部分使用。因此，本发明也考虑含有用于治疗神经变性疾病的硒酸盐或其药学上可接受的盐的药物。

为了更清楚了解本发明的性质和付诸实施，现参考以下非限制性实施例描述本发明的特别优选实施方式。

附图的简要说明

图1A是治疗后，PC3细胞的完整细胞中和无细胞环境中磷酸化Akt水平的比较报告。

图1B是采用卡尔生物化学公司(Calbiochem)K-LISA^TM Akt活性检测试剂盒，比较硒酸钠与星孢素(一种非特异性的蛋白激酶强抑制剂)对重组人Akt1酶活性影响的示意图。

图2A是存在硒酸钠或冈田酸(一种红潮藻类的聚醚毒素，能抑制磷酸蛋白的磷酸酶PP1和PP2A)时，Akt在Ser⁴⁷³位点磷酸化的比较图。

图2B是存在硒酸钠，或一些磷酸蛋白的磷酸酶抑制剂、互变霉素、冈田酸、内皮肽A(endothall A)、花萼海绵诱癌素A(calyculin A)和环孢菌素A时，Akt在Ser⁴⁷³位点磷酸化的比较图。

图2C提供PC3细胞中的Akt的免疫沉淀图，显示在缺乏(对照)和存在硒酸盐(ATE)或胎牛血清(FCS)时，与PP2A形成复合物的Akt量。

图2D是在存在或缺乏硒酸钠时，PC3细胞中磷酸酶PP2A活性的示意图。

图3是PP2A磷酸酶活性翻译后调节及底物特异性的示意图(LCMT-亮氨酸羧甲基转移酶，PME-1-磷酸酶甲基酯酶1，PTPA-磷酸酪氨酰(phospholyrosyl)磷酸酶激活剂)。

图4A(i)是在缺乏(对照)或存在硒酸钠或冈田酸(OKA)时，PP2A磷酸酶相对活性的示意图。

图4A(ii)示意图显示，硒酸钠对PP2A磷酸酶作用下丝氨酸磷酸肽释放无机磷酸浓度的影响。

图4B是显示硒酸钠对PP1的磷酸酶活性影响的示意图。

图5A是在氧化环境中PP2A失活的示意图。

图5B显示硒酸钠和过氧化氢对Akt磷酸化水平的影响。

图5C是在存在N-乙基马来酰亚胺(NEM)、过氧化氢、硒酸钠、硒酸钠和过氧化氢时，PP2A磷酸酶中的游离巯基示意图。

图5D是有或没有过氧化氢时，用硒酸钠或N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理的细胞的荧光分布图。

图5E示意图显示，用过氧化氢、硒酸钠、过氧化氢和硒酸钠、NAC、过氧化氢和NAC处理时，荧光细胞的平均百分数。

图6A示意图显示，用硒酸钠(ATE 500μM)或内皮肽A(ETA 100μM)或不用添加剂(对照)时，免疫沉淀的PP2A的相对磷酸酶活性。

图6B是以冈田酸(OKA 500nM)预处理或不预处理时，用LY294003(LY50μM)或硒酸钠(ATE 500μM)处理后，磷酸化p7OS6K水平的比较图。

图6C是用能识别Akt的抗体检测PP2A的不同B家族亚基(B和B’)的比较报告。Akt只与PP2A的B家族亚基共沉淀。

图7显示硒酸钠对GSK3β活化的影响。

图8是显示硒甲硫氨酸不影响Akt磷酸化水平，而硒酸盐抑制Akt磷酸化的比较图。

图9是显示不同的硒化合物对Akt活化影响的示意图。处理：对照(con)；硒酸钠(ATE)；硒酸(Sel acid)；亚硒酸钠(ITE)；二氧化硒(SeO₂)；硫化硒(SeS₂)；甲基硒代半胱氨酸(MSC)；和硒代半胱氨酸(SeC)。活性Akt信号的相对强度与Akt蛋白总水平相关，显示在y-轴上。此图表明只有硒酸钠(ATE)才能抑制Akt的活化，使磷酸化Akt的水平降低到对照(con)水平之下。相反，硒酸(Selacid)、亚硒酸钠(ITE)、二氧化硒(SeO₂)、硫化硒(SeS₂)、甲基硒代半胱氨酸(MSC)、硒代半胱氨酸(SeC)均导致Akt活化高于对照(con)水平。

图10A和10B示意图显示，在用pNPP(图10A)或丝氨酸磷酸肽(图10B)作为底物的pNPP水解试验中，硒酸钠(ATE)、亚硒酸钠(ITE)和硒甲硫氨酸(SeMet)对PP2A磷酸酶活性的影响。

图11是在不同包被条件下存在(+)或缺乏(-)硒酸钠时，人神经母细胞瘤BE2M17细胞系用抗人PHF-tau蛋白抗体作免疫印迹的比较图。

图12是在不同包被条件下存在(+)或缺乏(-)硒酸钠时，人神经母细胞瘤SY5Y细胞系用抗人PHF-tau蛋白抗体AT270(图12A)和HT-7(图12B)作免疫印迹的比较图。

图13是在存在(+)或缺乏(-)硒酸钠时，14周龄Balb/cNu Nu雄性裸小鼠的全脑裂解物用抗人PHF-tau蛋白抗体AT100(图13A)、AT180(图13B)、AT270(图13C)和HT-7(图13D)作免疫印迹的比较图。

图14示意图显示，在场地自主活动试验(趋触性(thigmotaxis))轮次1(图14A)和轮次2(图14B)中，硒酸钠处理对所测试行为的影响。

图15示意图显示，在以逃离潜伏期(时间：秒，图15A)和游泳路径(长度：米，图15B)进行评估的Morris水迷宫试验中，硒酸钠治疗对(小鼠)学习和记忆力的影响。

图16示意图显示，在hTAU441转基因TMHT小鼠中，用HT7免疫组化方法测定，硒酸钠对脑海马回(图16A)和脑扁桃体(amygdala)(图16B)中tau蛋白载量的影响。

图17示意图显示，在hTAU441转基因TMHT小鼠中，用AT180免疫组化方法测定，硒酸钠对脑海马回(图17A)和脑扁桃体(图17B)中tau蛋白载量的影响。

实施例

实施例1：硒酸钠通过间接机制使Akt去磷酸化

硒酸钠能一致地诱导前列腺癌完整细胞中的Akt去磷酸化。这种去磷酸化可能是由于对Akt蛋白本身的直接抑制作用。或者可能是通过增强对Akt磷酸化的负调节或抑制其正调节而间接实现。为鉴别直接与间接作用机制，在无细胞环境中测定了硒酸钠对Akt磷酸化和活性的影响。将PC3前列腺癌细胞接种在100mm平皿中，当细胞达到70-80％铺满时血清饥饿过夜。为检测对完整细胞中Akt磷酸化的作用，用新鲜无血清培养液配的500μM硒酸钠处理PC3细胞1小时。裂解细胞，用活化特异性抗体作免疫印迹分析测定Akt Ser473位点的磷酸化水平，与表达的Akt蛋白水平作比较。为检测对纯化Akt的作用，类似地接种但不处理PC3细胞，用RIPA(磷酸酶负调节剂，一种严谨的细胞裂解缓冲液，能最大程度降低对蛋白-蛋白复合物的维持)裂解。用泛Akt单克隆抗体作免疫沉淀纯化得到等量(40-500μg)全细胞裂解液(WCL)中的Akt，然后在37℃金属加热块上与500μM硒酸钠一起培育1小时。如上所述用免疫印迹分析分辨免疫沉淀蛋白和测定Akt活化水平。图1A比较了PC3细胞的完整细胞与无细胞环境经处理后的磷酸化Akt水平。完整PC3细胞用500μM硒酸钠处理1小时后Akt磷酸化大为降低。

为验证这些发现，用卡尔生物化学公司的K-LISA^TM Akt活性检测试剂盒检测了硒酸钠对重组人Akt酶活性的作用，将其与星孢素(一种非特异性的蛋白激酶抑制剂)的作用相比较。此ELISA试验采用的生物素化肽底物(GRPRTSSFAEG)在第二个丝氨酸处被Akt磷酸化。在链霉亲和素包被孔中将250ng的重组人Akt加或不加500μM硒酸钠或1μM星孢素，与生物素化Akt底物一起30℃培育30分钟。用磷酸丝氨酸的检测抗体，然后用HRP-抗体偶联物和TMB底物产生的颜色，来测定结合的磷酸化底物。测定450nm吸光值和590nm参比值。总结三次独立实验的结果，计算出平均吸光值(A₄₅₀-A₅₉₀-空白)±SEM，见图1B所示。与以上发现相一致，没有检测到硒酸钠对重组人Akt激酶活性的直接作用。相反，非特异性抑制剂星孢素强烈抑制了Akt的激酶活性。

小结：这些数据表明，硒酸钠对Akt活性无直接抑制作用，说明观察到的去磷酸化必然是通过一种间接机制完成。

实施例2：硒酸钠通过刺激PP2A的磷酸酶活性而去磷酸化Akt

通过防止最初的Akt磷酸化，或提高Akt去磷酸化，可间接降低Akt的净活性[Kohn等，1996]。然而，鉴于硒酸钠诱导的Akt磷酸化为双向反应(起初是瞬间增强，随后是深度和持续减弱)，似乎硒酸钠的作用不可能是简单地减弱上游激酶磷酸化Akt的能力。因此测定了硒酸钠的蛋白磷酸酶抑制作用能否诱导Akt去磷酸化。先用冈田酸，一种红潮藻类的聚醚毒素(是导致有壳水生生物造成毒性腹泻的致病因子)，其能抑制磷酸化蛋白的磷酸酶PP1和PP2A(二种调节Akt去磷酸化的磷酸酶)[Fernandez等.，2002]。在6孔板的每孔中接种5 x 10⁵个PC3前列腺癌细胞，使细胞贴壁8小时，然后血清饥饿过夜。在无血清的新鲜培养液中用或不用5nM或1000nM的冈田酸预处理细胞30分钟，然后加入最终浓度500μM的硒酸钠培养1小时。用SDS-PAGE分辨裂解的细胞，然后用能特异性识别AktSer⁴⁷³残基位点磷酸化的抗体作免疫印迹分析，检测Akt该位点的磷酸化，与表达的Akt蛋白总水平作比较(图2A)。用硒酸钠处理PTEN缺陷的PC3细胞，如预期那样显著降低了该细胞系中观察到的长期Akt磷酸化高水平，这种降低不受先前与5nM冈田酸培育的影响。相反，用1000nM冈田酸预处理不仅增强了非硒酸盐对照中的Akt磷酸化，而且完全抵消了硒酸钠的抑制作用。

为进一步精细辨别参与的磷酸酶，筛检了范围广泛的一组磷酸化蛋白的磷酸酶(PPP)抑制剂(它们对PPP抑制的特异性不相同)能否抵消硒酸钠对Akt磷酸化的抑制作用。这组(抑制剂)包括：500μM互变霉素(PP1)、500μM冈田酸(低剂量PP2A>PP1)、100μM内皮肽A(PP2A A)、2nM花萼海绵诱癌素A(低剂量PP1>PP2A)、10nM花萼海绵诱癌素A(高剂量抑制PP1和PP2A)和400ng/ml环孢菌素A(PP2B)。基本上按如上所述，接种PC3前列腺癌细胞，类似地用500μM硒酸钠处理1小时，之前用或不用PPP抑制剂预处理30分钟。另外，用SDS-PAGE分辨细胞裂解液，用能特异性识别Akt Ser⁴⁷³残基位点磷酸化的抗体作免疫印迹分析，检测细胞膜上Akt该位点的磷酸化，与表达的Akt蛋白总水平作比较，见图2B所示。没用PP1或PP2B特异性PPP抑制剂预处理，或处理的细胞，接触硒酸钠后导致Akt磷酸化的显著降低。相反，用低剂量冈田酸或内皮肽A(PP2A的特异性或相对特异性抑制剂)处理细胞完全阻断了硒酸钠诱导的Akt去磷酸化。

硒酸钠可能通过提高PP2A与Akt之间复合物的形成速率，或提高已结合于PP2A的磷酸酶固有活性，或二者而增强PP2A介导的Akt去磷酸化。为有助于鉴别这二种机制，先测定了硒酸钠上否能提高PP2A与Akt之间形成复合物的水平。将1 x 10⁶PC3前列腺癌细胞接种在6cm平皿上，让其贴壁8小时然后血清饥饿过夜。用新鲜无血清培养液或10％FCS配的500μM硒酸钠处理细胞1.5小时，然后用ELB缓冲液裂解。用捕获在蛋白A-琼脂糖珠上的抗Akt单克隆抗体免疫沉淀每份400μg全细胞裂解液中的总Akt。阴性对照裂解液(空白)省略免疫沉淀抗体。洗涤减少非特异性结合后，在3 x SDS蛋白加样缓冲液中煮沸珠5分钟，高速离心后用SDS-PAGE分辨上清液。用能特异性识别此磷酸酶催化亚基的抗体作免疫印迹分析，测定PP2A结合水平，与珠结合的Akt量和沉淀抗体(IgG)的浓度作比较。如图2C所示，免疫沉淀去除未处理PC3细胞中的Akt，将可检测到的PP2A催化亚基量提高到高于非特异性结合于珠(空白)的量，表明即使在基础状态下也有高水平的Akt磷酸化，至少某些Akt已与PP2A形成了复合物。用硒酸钠处理促进了PP2A催化亚基与Akt的结合，而用血清刺激使复合物的形成降低到基础水平之下。为了定量测定复合物形成的这种增加，数字化三次独立实验的免疫印迹数据，进行光密度分析，按每次实验的对照标准化。检测值为(检测的)PP2A催化亚基量与免疫沉淀得到的Akt总蛋白量的平均比率±SEM。见图2C所示，观察到硒酸钠处理后，PP2A催化亚基与Akt的结合提高了大约50％。

为了确定硒酸钠对Akt去磷酸化的作用是否完全可用简单促进这二种蛋白之间的结合来解释，检测了硒酸钠对Akt-相关磷酸酶活性的作用。将2 x 10⁶个PC3前列腺癌细胞接种在10cm平板上，让其贴壁8小时然后血清饥饿过夜。用或不用新鲜无血清培养液配的500μM硒酸钠处理细胞1小时，再用低浓度磷酸缓冲液裂解。用抗Akt单克隆抗体(1：100)和30μl蛋白A浆液免疫沉淀得到的总蛋白500-600μg，为了检测洗涤后有无磷酸污染，将25μl最终洗涤缓冲液与孔雀绿一起培育。30℃与500μM合成的磷酸化苏氨酸培育10分钟，检测免疫沉淀物的磷酸酶活性。每个样品一式二份加入孔雀绿溶液，读取590nm吸光值检测游离磷酸盐。三次独立实验的平均磷酸酶活性±SEM见图2D。用硒酸钠处理的PC3细胞使得与免疫沉淀Akt蛋白相关的磷酸酶活性高二倍以上，显著高于先前观察到的PP2A结合的简单增加。

小结：这些数据表明，硒酸钠是间接通过磷酸化蛋白的磷酸酶，特别是PP2A诱导了Akt去磷酸化。虽然硒酸钠提高了PP2A与Akt的结合量，但相关的磷酸酶活性却提高了约二倍，表明硒酸钠主要是影响酶活性。

实施例3：硒酸钠直接增强PP2A核心二聚体的磷酸酶活性

PP2A的核心结构由36kD的催化亚基(PP2Ac)和65kD的调控亚基(PR65或A亚基)组成。与第三个调节性B亚基结合可调节底物特异性[Wera和Hemmings，1995]。PP2A磷酸酶的活性受翻译后修饰的调节，其示意图见图3。已证明体外PP2A可被受体和非受体酪氨酸激酶二者，如EGFR、胰岛素受体p60v-src和p56lck磷酸化[Chen等，1992]。体内也鉴定到此种磷酸化，在用血清或EGF刺激或用p60v-src转化的成纤维细胞中此种磷酸化增加，而血清饥饿使其减少[Chen等，1992]。毗邻的Thr304磷酸化也与磷酸酶活性显著丧失相关[Guo和Damuni，1993]。与Tyr307相反，看来Thr304是通过自身磷酸化激活的蛋白激酶作用而磷酸化，从而放大了最初的抑制信号。二种情况中，PP2A的作用是其自身的磷酸酶，因为用冈田酸或微囊藻素-LR抑制提高了磷酸化[Chen等，1994，Guo和Damuni，1993]。因此，去除抑制性刺激后PP2A可水解二者的磷酸基团而快速再生活性磷酸酶。PP2Ac也受羧基末端赖氨酸残基L309的可逆性甲基化调节。亮氨酸羧基甲基转移酶可催化此甲基化反应[Xie和Clarke，1994]，这看来是亚基正确结合形成活性三聚体所需[Wu等，2000，Tulstylch等，2000，Bryant等，1999]。磷酸酶甲基脂酶1(PME-1)可去除PP2A的甲基[Lee等，1996]。令人感兴趣的是，据报导PME-1也能结合并明显稳定PP2A二聚体及三聚体的无活性构型，一种先前鉴定到的能刺激PP2A酪胺酰磷酸酶活性的磷酸酪胺酰磷酸酶激活剂(PTPA)可逆转此情况[Cayla等，1994，Langin等，2004，Van Hoof等，2005]。

为了确定观察到的硒酸钠增强PP2A磷酸酶活性不依赖于对上游参与翻译后调节成分的作用，测定了在存在或缺乏硒酸钠时培育的从血红细胞纯化得到的人PP2A A-C异质二聚体的酶活性。在初步试验中，采用了磷酸酶催化作用的化学底物对-硝基苯磷酸(pNPP)，其磷酸基团水解后可产生对-硝基苯酚，一种碱性条件下可溶解的深黄色色素。37℃将0.05单位的纯化PP2A二聚体与5μM的硒酸钠或500nM的冈田酸一起培育30分钟，测定产生的对-硝基苯酚量，作为磷酸酶活性的读数，与未处理对照样品作比较。一式二份地测定各样品的405nm吸光值，以590nm值为参比值。用以下公式计算PP2A活性：

活性＝(样品体积升数) x A₄₀₅/1.78 x 10⁴M^-1/cm(消光系数) x 0.25cm x 15分 x 0.05U酶

提供的数据是至少三次独立实验的磷酸酶相对平均活性±SEM。如图4A(i)所示，即使用如此低浓度的纯化酶，磷酸酶的活性也相当明显，但与冈田酸一起培育完全消除了此活性。相反，PP2A与硒酸钠一起培育观察到的磷酸酶活性几乎为三倍。

接着通过检测硒酸钠对PP2A A-C二聚体由内部苏氨酸残基上磷酸化的合成的6氨基酸肽释放无机磷酸的作用的影响，来确定磷酸酶活性的增强是否为底物特异性。37℃培育0.01-0.05U PP2A与500μM磷酸化肽15分钟，加或不加50μM硒酸钠。酶活性释放的无机磷酸量通过加入孔雀绿测定，读取590nm吸光值。在存在钼酸盐和正磷酸盐时孔雀绿形成稳定的绿色复合物，得以检测存在的无机磷酸浓度。提供的数据为至少三次独立实验的平均590nm吸光度±SEM。见图4A(ii)所示，硒酸钠再次使丝氨酸磷酸化肽因PP2A磷酸酶的作用而释放的无机磷酸浓度升高二倍以上。

PP1的催化亚基与PP2A的催化亚基具有大约50％的序列同源性，这是任何相关磷酸酶中最高的[Barton等，1994]。为了确定硒酸钠刺激增强磷酸酶活性是否对PP2A有特异性，测定了它对PP1活性的影响。37℃培育从家兔骨骼肌纯化的0.05U PP1与500μM磷酸化苏氨酸合成肽15分钟，加或不加50μM硒酸钠，游离磷酸的浓度如上所述用孔雀绿检测。提供的数据为三次独立实验的平均590nm吸光度±SEM。见图4B所示，硒酸钠不影响PP1的磷酸酶活性。

实施例4：硒酸钠不影响PP2A的氧化还原调节

不断增长的工作提示，可逆性氧化是负调节蛋白磷酸酶的常见机制[Wang等，1996，Barrett等，1999，Sohn和Rudolph 2003]。催化结构域中的保守性半胱氨酸残基是它们酶活性的关键，但在氧化环境中，此结构域可能通过形成分子内二硫键或磺酰胺键而受到修饰(图5A)丧失了磷酸酶活性[Salmeen等，2003，Kwon等，2004]。鉴于硒化合物可能影响细胞的氧化还原状态，研究了硒酸钠通过减轻对氧化的抑制作用而激活PP2A的可能性。

先测定硒酸钠诱导的Akt去磷酸化是否对细胞氧还状态敏感。在6孔板的每孔中接种5 x 10⁵个PC3前列腺癌细胞，使细胞贴壁8小时，然后血清饥饿过夜。用或不用500μM以新鲜培养液配的硒酸钠处理细胞，然后使其接触0.25mM或1mM的过氧化氢10分钟。分析等量全细胞裂解液，然后进行免疫印迹测定磷酸化Akt Ser⁴⁷³的水平。与表达的Akt蛋白总水平作比较。如图5B所示，用硒酸钠处理细胞显著降低了Akt磷酸化水平，并且不受紧急加入0.25mM过氧化氢的影响。相反，紧急接触高剂量的1mM过氧化氢完全消除了硒酸钠的去磷酸化作用，表明这种阻断是氧还敏感的。

使蛋白磷酸酶的可逆性氧化作用失活涉及到催化结构域中关键半胱氨酸的修饰，最终导致形成分子内二硫键或磺酰胺键。为了确定硒酸钠是否对PP2A的半胱氨酸有修饰作用，用Ellman试验[Ellman，1958]定量测定各种处理后纯化人PP2A A-C二聚体中游离巯基的数目。Ellman试剂(5，5’-二硫-二(2-硝基苯甲酸)，DTNB)能与游离的巯基迅速形成二硫键，伴随释放色素磺酸盐离子。37℃培育0.01U PP2A与10mM N-乙基马来酰亚胺(NEM)，或10mM过氧化氢，或10mM硒酸钠，或10mM硒酸钠和10mM过氧化氢15分钟。加入Ellman试剂然后检测412nm吸光值来测定磷酸酶中游离巯基的量(图5C)。与NEM(一种巯基烷化剂)和过氧化氢二者培育后显著降低了存在的游离巯基数目。相反，与硒酸钠一起培育没有作用，特别是不能保护PP2A的巯基不受到过氧化氢介导的修饰。实际上，过氧化氢对巯基的修饰在存在硒酸钠时更显著有效。

接着用二乙酸2′，7′-二氯二氢荧光素(DCFDA)测定硒酸钠是否影响了完整细胞的氧还电势。DCFDA无荧光可自由渗透入细胞，但在存在活性氧物质(ROS)时可快速转变成不能渗透细胞但发出亮荧光的2′，7′-二氯二氢荧光素(DCF)[Bass等，1983]。在60mm平板中接种1 x 10⁶个PC3前列腺癌细胞，使细胞贴壁8小时，然后血清饥饿过夜。细胞用5μM DCFDA培育15分钟然后处理。

细胞用500μM硒酸钠或1mM N-乙酰半胱氨酸(NAC)处理1小时，然后接触500μM过氧化氢10分钟。用流式细胞仪测定荧光细胞比例。图5D显示各处理组的荧光分布图。图5E小结了三次独立实验的荧光细胞平均百分比。如预计的那样，PC3细胞接触过氧化氢导致胞内氧自由基的显著增加，如分布图中峰形向右偏移所示。用硒酸钠预处理细胞对荧光细胞的基础比例无影响，不能保护细胞在接触过氧化氢后不产生ROS。相反，用氢供体NAC预处理导致荧光细胞基础比例的微小降低，特别是显著减弱了过氧化氢所产生的ROS。

小结：这些数据表明，虽然硒酸钠诱导的Akt磷酸化对细胞氧还状态敏感，但硒酸钠不能通过减轻固有、可逆的抑制性氧化作用而增强PP2A的磷酸酶活性。

实施例5：硒酸钠刺激PP2A的磷酸酶活性显示有底物特异性

PP2A是一种遍在的高表达蛋白质，估计占细胞总蛋白的0.1-1％[Gallego M和Virshup 2005；Cohen，1997]，涉及调节的蛋白底物数量不断增加[Zhu等，2004；Woetmann等，2003；Silverstein等，2002]。控制PP2A底物特异性的机制尚不完全了解，但特异性调节B亚基的差异性结合看来至关重要[Van Kanegan等，2005]。检测了对于特定异质三聚体硒酸钠刺激的PP2A磷酸酶活性增强是否不加选择或有特异性。

上面已证明，硒酸钠能增强从PC3前列腺癌细胞免疫沉淀的Akt相关的磷酸酶活性，和硒酸钠能直接刺激纯化的PP2AA-C二聚体的磷酸酶活性。为了确定这种磷酸酶活性的增强是否遍在化，用500μM硒酸钠或100μM内皮肽A处理1小时和用抗PP2A催化亚基的单克隆抗体检测从PC3细胞免疫沉淀得到的PP2A。使细胞裂解液通过脱盐柱除去游离磷酸，用磷酸化丝氨酸酸肽和孔雀绿检测磷酸酶活性。不同条件下免疫沉淀的PP2A的磷酸酶活性见图6A，为三次独立实验的平均吸光度±SEM。用硒酸钠处理PC3细胞不影响胞内PP2A混合物的磷酸酶活性。相反，用PP2A磷酸酶特异性抑制剂内皮肽A处理显著降低了磷酸酶活性。

检测了硒酸钠对另一种已知的PP2A底物p70S6K的作用[Peterson等，1999]。在6孔板的每孔中接种5 x 10⁵个PC3前列腺癌细胞，使细胞贴壁8小时，然后血清饥饿过夜。用或不用500nM冈田酸预处理30分钟，然后用50μM的LY294002或500μM的硒酸钠处理细胞1小时。用SDS-PAGE分析等量全细胞裂解液(75μg)，用能特异性识别Thr389位磷酸化的p70S6K蛋白的抗体作免疫印迹分析，测定p70S6K磷酸化水平。与蛋白加载对照β微管蛋白作比较。如图6B所示，即使在基础条件下，p70S6K的磷酸化也很明显，用PI3K抑制剂LY294002处理可消除此现象。与已知冈田酸是p70S6K磷酸化的负调节剂作用相符，用此酸抑制PP2A提高了所观察的磷酸化水平。然而与硒酸钠诱导Akt去磷酸化相反，在类似条件下p70S6K的磷酸化不受影响。

尝试了检测前列腺癌细胞中哪个B亚基家族可与Akt形成复合物。在100mm平皿中接种2 x 10⁶个PC3前列腺癌细胞，使细胞贴壁8小时，然后血清饥饿过夜。用ELB(一种温和的洗涤剂缓冲液)裂解细胞。用泛-Akt单克隆抗体(1：100)和30μl蛋白A琼脂糖珠免疫沉淀500μg裂解液中的总Akt蛋白。阴性对照(空白)中省略免疫沉淀抗体。反复洗涤后在3 x SDS蛋白加样缓冲液中煮沸珠5分钟，高速离心，用凝胶电泳分析得到的上清液。在同一凝胶上将100μg全细胞裂解液跑电泳，用能特异性识别B或B’家族亚基的抗体检测得到的膜。用识别泛-Akt的抗体检测相同印迹斑证实已成功将Akt去除。如图6C所示，此系统中只有B家族调节性亚基才能与Akt共沉淀，提示PP2Ac、A和R2B亚基家族成员的三聚体才能介导这些细胞中的Akt去磷酸化。

实施例6

胰岛素的代谢作用受Akt的直接下游底物糖原合酶激酶3(GSK-3)介导。GSK-3是一种遍在表达的丝氨酸/苏氨酸激酶，能磷酸化和灭活糖原合酶。在对胰岛素受体活化的反应中，Akt磷酸化和灭活了阻抑蛋白GSK-3，因而刺激了糖原的合成[Cross等，1995]。此外，GSK-3涉及对蛋白质翻译的控制，细胞周期进程和Wnt信号传递[Diehl等，1998，Welsh等，1996，He等，1995]。为了测定硒酸钠处理对GSK-3β活化的影响，接种PC3前列腺癌细胞，使细胞血清饥饿过夜，然后用新鲜培养液配的500μM硒酸钠处理(图7)所示的不同时间。用只能特异性识别Ser9位磷酸化(此位点是其激酶活性的关键位点)的GSK-3β的抗体作免疫印迹分析全细胞裂解液，与作为加样对照的细胞骨架蛋白β微管蛋白相比较。对照泳道(0时)观察到的高度磷酸化表明，PC3细胞中GSK-3β基础活化水平高。用硒酸钠处理导致磷酸化显著降低，1小时和3小时最大，6小时时间点回复到基础水平。为定量测定硒酸钠导致的抑制程度，制备数字化的免疫印迹结果，比较500μM硒酸钠3小时与50μM LY294002 1小时的效果，并测定GSK-3β磷酸化程度，光密度表示表达蛋白质的比例。硒酸钠平均降低了GSK-3β超过20％，而LY294002导致磷酸化水平降低约60％。

实施例7：硒酸钠而非硒甲硫氨酸强烈抑制了Akt/蛋白激酶B的活化

为了测定硒酸钠能否干扰PI3K通路的活性，用500μM硒酸钠处理PC3细胞不同时间。用活化特异性抗体检测全细胞裂解液中的Akt磷酸化状态。因为即使不加入血清PTEN也会丧失，故(认为)Akt的Ser473和Thr308二个位点被强激活。加入硒酸钠在接触的10分钟内诱导了Akt此二位点磷酸化增强。这种增强之后是显著和长久的失活，同时细胞的总Akt(泛Akt)水平基本上维持不变。

用500μM各化合物处理不同时间评估Akt的Ser473磷酸化(情况)，将硒酸钠对激活PC3细胞Akt的作用与与硒甲硫氨酸相比较。如图8所示，硒甲硫氨酸不影响所测定的所有时间点的Akt磷酸化水平，而硒酸钠明显抑制了Akt磷酸化。

实施例8：诱导Akt去磷酸化的能力是硒酸钠独有的

鉴于硒酸钠一直能诱导关键的激酶Akt深度去磷酸化而硒甲硫氨酸无此作用，测定了此能力是否为硒酸钠所独有或是与其它化学形式的硒所共有。测试了其它无机硒(硒酸钠、二氧化硒、硫化硒和硒酸)和有机硒物质(甲基硒半胱氨酸、硒半胱氨酸)能否影响Akt活化。除了硫化硒溶于DMSO外，所有形式的硒均溶于水，以500μM浓度将它们加入血清饥饿的PC3细胞中1小时。分析全细胞裂解液，用能特异性识别Akt Ser⁴⁷³位点磷酸化的抗体作免疫印迹分析，检测Akt该位点的活化状态，以及Akt表达总水平(泛Akt)。为了定量测定Akt活化程度，将免疫印迹结果数字化，以光密度测定磷酸化Akt与总Akt的比例。图9小结了三次独立实验测定的磷酸化Akt与总Akt蛋白水平的平均比例±SEM。与未处理细胞相比，用500μM硒酸钠处理PC3细胞1小时导致Akt的Ser473位磷酸化降低80％以上(p<0.05，斯氏t-检验)。相反，在相同条件下用其它无机和有机硒物质处理PC3细胞对Akt磷酸化程度无显著影响。小结：这些数据表明诱导Akt去磷酸化的能力是硒酸钠独有的。

实施例9：提高PP2A活性的能力是硒酸钠独有的

在实施例7中，数据显示所有测试的化学形式硒中，只有硒酸钠能显著诱导Akt去磷酸化。为了明确对PP2A活性的不同影响可否解释这种特异性，在pNPP水解试验中分别用pNPP和丝氨酸磷酸肽作为底物，比较了硒酸钠(5mM或50μM)、亚硒酸钠(5mM或50μM)和硒甲硫氨酸(5mM或50μM)对PP2A磷酸酶活性的影响(图10A和10B)。与观察到的用硒酸钠明显增强磷酸酶活性相反，亚硒酸钠或硒甲硫氨酸均不显著影响PP2A磷酸酶活性。

实施例1—9的材料和方法

试剂

细胞系：实验程序中所用的哺乳动物细胞系详情列于表1中。

表1

所有培养物维持在含5％或10％二氧化碳的37℃富马科技公司(FormaScientific)培养箱中，按照标准在培养液RPMI1641中加入L-谷氨酰胺(吉布科英杰公司(Gibco Invitrogen)#11875-119)、青霉素(100U/ml)、链霉素(100μg/ml)和两性霉素B(25ng/ml)(吉布科英杰公司#15240-062)。作为常规，细胞用5％或10％胎牛血清(吉布科英杰公司#10099-141)培养，除非另有说明。将接近铺满的细胞用胰蛋白酶-EDTA(吉布科英杰公司#15400-054)消化后传代。

购得的商品化抗体

在上述实验中采用了许多商品购得的第一抗体和辣根过氧化物酶偶联的或荧光标记的或生物素化的第二抗体，其详细情况小结如下：

兔抗-Akt多克隆抗体，商品目录号9272，细胞信号转导技术公司(CellSignalling Technology，CST)；

小鼠抗-Akt(5G3)单克隆抗体，商品目录号2966，CST；

兔抗磷酸化Akt(ser473)多克隆抗体，商品目录号9271，CST；

兔抗磷酸化GSK3β(ser9)多克隆抗体，商品目录号9336，CST；

不同的抗-PP2A抗体，商品目录号05-421、06-2221、07-334和05-592，安普斯特公司(Upstate)。

激酶、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和纯化的磷酸酶

表2：激酶和磷酸酶抑制剂

 

	名称	所抑制的酶	来源	商品目录号	稀释剂	贮液浓度	工作浓度
								激酶抑制剂	LY294002	PI2K	普洛麦格公司(Promega)	V1201	DMSO	50mM	10-50μM
磷酸酶抑制剂	互变霉素	PP1	百莫公司(Biomol)	109946-35-2	乙醇	500μM	500μM
								磷酸酶抑制剂	内皮肽	PP2A	卡尔生物化学公司(Calbiochem)	324760	H2O	100mM	100μM
磷酸酶抑制剂	花萼海绵诱癌素A	PP2A＝PP1	卡尔生物化学公司	208821	DMSO	80μM	10nM
								磷酸酶抑制剂	冈田酸	PP2A>>PP1	卡尔生物化学公司	495604	乙醇	50mM	500nM
磷酸酶抑制剂	环孢菌素A	PP2B	卡尔生物化学公司	239835	DMSO	400μg/mL	400ng/mL

表3：纯化的磷酸酶和重组的激酶

 

	名称	物种	来源	目录号	工作浓度
						纯化的磷酸酶	PP2A	人	安普斯特公司	14-111(批号#28002)	0.01-0.05U
纯化的磷酸酶	PP1	兔	安普斯特公司	14-110(批号#26200)	0.05U
						重组的激酶	Akt1	人	安普斯特公司	14-276(批号#25089BU)

缓冲液、溶液和培养基

所有溶液贮存在室温(RT)除非另有说明。

 

EDTA0.5M	186.1g Na2EDTA.2H2O溶于1升蒸馏水中，用NaOH调pH至8.0
		鸡蛋裂解缓冲液(ELB)	250mM NaCl，50mM Hepes pH7.0，5mM EDTA，1mMDTT，10％ Triton-X100
NaCl5M	292.2g NaCl溶于1升蒸馏水中，高压灭菌
		PBS	NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO4 1.44g、KH2PO4 0.24g，加水溶解至1升，pH7.4
RIPA裂解缓冲液	10％甘油、20mM Tris-HCl pH7.5，2mM EDTA，1％Triton-X100，1％ NP40，137mM NaCl，0.1％ SDS，新鲜制备置冰上
		SDS20％	200g SDS溶于1升蒸馏水中
SDS-PAGE电泳胶	0.375M Tris pH8.8，0.1％ SDS，APS，TEMED和6-14.5％丙烯酰胺
		SDS-PAGE样品缓冲液4x	15％甘油、0.6M 2-巯基乙醇、2％ SDS，62.5mM Tris-HClpH6.8和0.1％w/v溴酚蓝
SDS-PAGE浓缩胶	0.125M Tris pH6.8，0.1％ SDS，4.8％丙烯酰胺(伯乐公司(Biorad))、过硫酸铵(APS)和TEMED
		SDS-PAGE电泳缓冲液	9g Tris碱(25mM)pH8.3，43.2g甘氨酸(0.19M)和3gSDS(0.1％)加蒸馏水溶解至500ml
TBS10X	80g NaCl，2g KCl，30g Tris pH7.4加蒸馏水溶解至1升
		TBS-T0.1％	500ml TBS 10x，5ml吐温-20加蒸馏水溶解至1升
Tris-HCl	121.1g Tris溶于1升蒸馏水中，用浓HCl调pH至6.0-8.8，高压灭菌
		Western印迹转移缓冲液	14.4g甘氨酸、3.03g Tris，800ml蒸馏水和200ml甲醇
Western印迹转移缓冲液	3.03g Tris碱，14.4g甘氨酸溶于800ml蒸馏水和200ml甲醇
		Western印迹样品缓冲液4x	1ml 0.5M Tris pH6.8、800μl甘油、800μl 20％ SDS、400μl β巯基乙醇、400μl 1％溴酚蓝

硒化合物

硒酸钠购自西格玛公司(Sigma)。所有溶液用蒸馏水新鲜制备，按说明浓度使用。

蛋白表达

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)

按说明处理后，用PBS洗涤培养的细胞一次，然后4℃在细胞刮刀帮助下，用含蛋白酶抑制剂混合物(卡尔生物化学公司的蛋白酶抑制剂混合物，编号#539131)和磷酸酶抑制剂(10mM正钒酸盐和10mM氟化钠)的鸡蛋裂解缓冲液(ELB)或RIPA裂解缓冲液裂解细胞。4℃，14,000rpm离心15分钟澄清样品液，用上清液分析。用二辛可宁酸溶液试验(BCA)检测样品的蛋白浓度。取1μl裂解液在96孔板中用蒸馏水作1:25稀释。各样品中加入200μl二辛可宁酸溶液和4％(w/v)硫酸铜的80:1溶液，37℃培育30分钟。检测一系列蛋白标准液的590nm吸光度(珀金埃尔玛公司(Perkin Elmer)MBA2000)。

用变性聚丙烯酰胺凝胶(包括浓缩胶和分离胶)电泳分析蛋白质样品。将不同浓度的50-100μg蛋白质加到SDS-PAGE凝胶上。在加样前加入与样品相等体积的SDS样品缓冲液100℃煮沸5分钟。以大约100V跑凝胶电泳。利用各凝胶上加有的蛋白大小标记(伯乐万花筒(Biorad Kaleidoscope))评估感兴趣蛋白质的分子量。

Western印迹分析

将(电泳)分离的蛋白质转移到PVDF膜(Immobilon P，密理博公司(Millipore))后，将此膜浸入100％甲醇中10分钟，用蒸馏水淋洗，用印迹转移缓冲液平衡，室温100V转移1.5小时或4℃过夜。用TBS-T洗涤膜5分钟后让其干燥1小时。用含3％奶粉和0.1％吐温的TBS室温封闭1小时。用TBS-T洗涤此膜5次后，与用3％奶粉/0.1％ TBS-T或3％BSA/0.1％TBS-T稀释的第一抗体在室温下轻轻搅拌培育1—2小时或4℃培育过夜。用0.1％TBS-T洗涤5分钟三次，将此膜与辣根过氧化物酶偶联的第二抗体(用封闭缓冲液配)一起培育。再洗涤此膜5分钟三次，然后用

 WestDura时间延长底物(皮尔斯公司(Pierce)#34075)或ECL Western印迹检测试剂(安玛西亚生物科学公司(Amersham Biosciences)#RPN2106)进行增强化学发光反应，以检测抗体结合。用CL-曝光胶片(柯达公司(Kodak))记录放射自显影的发光。初步分析免疫印迹条带后用膜剥离缓冲液(62.5mM TRISpH7，2％ SDS，7％ β-巯基乙醇)60℃剥离15分钟，以TBS-T洗涤三次后封闭，可用于再探测。

光密度分析

用Vista数字扫描仪(优麦公司(Umax))以第8版科勒尔照片绘图软件(Corel Photo-Paint)(科勒尔公司(Corel Corporation))将有关免疫印迹条带转换成.GIF文件。采用为Windows设计的专业图像软件(Image-Pro-Plus)V4.5.1.22版(媒体控制公司(Media Cybernetics))进行光密度分析。采用线性校正法，其中白色值设为0，黑色值设为225，选择对应于有关条带的感兴趣区域测定其信号强度。

免疫沉淀

在转台上的微量离心管中将100-500μg的全细胞裂解液与1：100稀释的不同抗体在室温下培育1-2小时或4℃培育16小时。简单离心后，各管加入30-40μl的预先洗涤过的50％蛋白A琼脂糖快速流动珠(西格玛#9424)，室温或4℃转动1小时。简单离心后，弃上清液用500μl细胞裂解缓冲液洗涤沉淀。如此洗涤三次后用珠作酶试验，或用3 x SDS蛋白加样缓冲液煮沸5分钟洗脱蛋白质，在SDS-PAGE凝胶上分析。

磷酸酶试验

将纯化的人PP2A和兔PP1用提供的稀释缓冲液稀释到0.01U/μl，分装等份-20℃保存。

用纯化磷酸酶进行的磷酸肽试验

将1mg合成的磷酸肽K-R-pT-I-R-R(安普斯特公司#12-219)和R-R-A-pS-V-A(安普斯特公司#12-220)溶于1.10-1.285ml蒸馏水中制备1mM溶液，然后分装等份-20℃保存待用。将从人血红细胞纯化的0.01-0.05U纯化PP2A A-C二聚体，或0.05U由骨骼肌纯化的兔PP1与500μM磷酸肽混合，在存在的所示不同处理条件下在37℃加热块上培育15分钟。各反应物总体积为25μl，由pNPP缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.0，100μMCaCl₂)组成。加入100μl孔雀绿溶液(用10mM钼酸铵、1N HCl、3.4％乙醇、0.01％吐温-20液配制的0.034％孔雀绿)终止酶反应。孔雀绿在存在钼酸盐和正磷酸盐时可形成稳定的绿色复合物，得以检测无机磷酸存在的量。读取每个样品一式二份590nm的吸光度。

PP2A免疫沉淀和磷酸酶试验

将1 x 10⁶个PC3前列腺癌细胞接种在60mm平板上，让其贴壁8小时然后血清饥饿过夜。如所示进行各种处理后，吸弃培养液，细胞用TBS洗涤一次。用0.3ml裂解缓冲液(20mM Tris-HCl，pH7.0，1％ Igepal-CA，2mMEDTA，2mM EGTA，1x蛋白酶完全抑制剂混合液)裂解细胞，使裂解液通过2ml Zeba脱盐离心柱(皮尔斯公司#89890)除去磷酸。脱盐后裂解液所含蛋白尝试用上述BCA试验检测。用4μg抗PP2A单克隆抗体和30μl蛋白A琼脂糖珠浆液4℃免疫沉淀100-150μg总蛋白2小时。14,000rpm离心样品1分钟，用过量TBS洗涤三次，pNPP试验缓冲液洗涤一次。最后一次离心后小心除去所有的上清液，在珠中加入500μM磷酸苏氨酸肽，终体积80μl。30℃搅拌培育样品10分钟，加入孔雀绿溶液终止反应。读取每个样品一式二份590nm的吸光度。

pNPP水解试验

对-硝基苯磷酸(pNPP)是磷酸酶的一种化学底物，磷酸部分水解后产生对-硝基苯酚是一种深黄色色素，在碱性条件下可溶。检测磷酸酶相对活性的试验，在微离心管中将0.05U纯化的PP2A与5μl 40mM NiCl₂和5μlBSA液(5mg/ml)混合。如所示加入不同的处理液，用pNPP试验缓冲液调体积至80μl。样品37℃预培育15分钟。每次试验前新鲜配制pNPP底物液，将用50mM Tris-HCl，pH7.0溶解pNPP至1.5mg/ml。为启动磷酸酶反应，加入120μl pNPP，37℃再培育样品15分钟。检测每个样品一式二份的405nm吸光度，以590nm吸光度作参比。

用以下公式计算PP2A活性：

活性＝(样品体积升数) x A₄₀₅/1.78 x 10⁴M^-1/cm(消光系数) x 0.25cm x 15分 x 0.05U酶

检测游离巯基总含量

用Ellman试剂检测不同处理后纯化PP2A中游离巯基的变化。将0.01U PP2A加到37.5μl稀释缓冲液(30mM Tris-HCl，3mM EDTA，pH8.2)、12.5μl DTNB试剂(Ellman试剂)和200μl甲醇中，室温培育样品5分钟，然后检测每个样品一式二份的412nm消光(extinction)。结果与用N-乙酰半胱氨酸产生的标准曲线相比较。

Akt激酶活性试验

用K-LISA^TM AKT活性试剂盒(卡尔生物化学公司#CBA019)检测硒酸钠对重组人Akt1激酶活性的影响。此ELISA试验采用生物素化的肽底物(GRPRTSSFAEG)，其第二个丝氨酸可被Akt1、Akt2、Akt3、SGK(血清糖皮质素激酶)和MSK1磷酸化。生物素化的Akt底物和Akt样品在链霉亲和素包被的96孔板孔中与ATP一起培育，得以在一步中磷酸化和捕获底物。用磷酸丝氨酸检测抗体检测磷酸化的底物，然后用HRP-抗体偶联物处理，用TMB底物显色检测。

每次试验开始时，用蒸馏水1：100稀释生物素化Akt底物贮存液制备其新的工作液等份。按以下顺序加入各孔：10μl 5 x 激酶试验缓冲液；10μl生物素化Akt底物工作溶液；含250ng重组人Akt1的10μl蒸馏水；含500μM硒酸钠或1μM星孢素的10μl蒸馏水，或只用水的阳性对照；10μl 5 xATP/MgCl₂混合液，每孔总体积50μl。用密封条密封平板，微孔板振荡器上简单混合，37℃培育30分钟。各孔加入10μl激酶终止液终止激酶反应。倒弃各孔中内容物，用1x ELISA洗涤液(将ELISA贮存液用水1：20稀释制制备)洗涤三次，倒置在印迹纸垫上拍打干。各孔加入100μl磷酸丝氨酸检测抗体工作溶液(用蒸馏水1:1000稀释磷酸丝氨酸抗体贮存液制备)室温培育1小时。如上所述洗涤平板。然后各孔加入100μl HRP-抗体偶联物工作溶液(每次试验全部用蒸馏水1:1000稀释HRP-抗体贮存液得以新鲜制备)室温培育1小时。再如上所述洗涤平板。各孔加入100μl TMB底物，室温发色20分钟。各孔加入100μl ELISA终止液以停止反应，用微孔板读板仪读取450nm吸光度，以590nm吸光度为参比。

细胞内氧化还原状态试验

细胞内氧化还原状态可用二乙酸2′，7′-二氯二氢荧光素(DCFDA)测定。DCFDA无荧光，可自由渗透入细胞，但在存在活性氧物质(ROS)时可快速转变成不能渗透细胞但具有亮荧光的2′，7′-二氯二氢荧光素(DCF)。先用5μM DCFDA平衡细胞15分钟再进行不同处理。然后收获贴壁细胞，用PBS洗二次，用流式细胞术立即检测荧光细胞比例。

本文所引用的每一项专利、专利申请和出版物，其内容纳入本文作参考。

本文对任何参考文献的引用不代表承认这些参考文献是本申请的“现有技术”。

本说明书的目的是描述本发明的优选实施方式，而不是将本发明限制于任何一种实施方式或具体的特征集合。因此，本领域技术人员将明白，借助本文可对示范性的具体实施方式进行各种修改和变化，但这不脱离本发明的范围。所有这类修改和变化都包括在附件权利要求书的范围内。

实施例10：硒酸盐对小鼠脑组织和人神经母细胞瘤细胞系tau蛋白磷酸化的影响

材料和方法

细胞培养。人神经母细胞瘤细胞SY5Y和BE2M17细胞获自JanettaCulvenor(墨尔本大学病理学系，VIC)。SY5Y细胞常规培养在添加10％胎牛血清(FBS，英杰公司(Invitrogen)，吉布科(GIBCO))、1％非必须氨基酸(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司(Sigma，St Louis，MO，USA))、10mMHEPES(英杰公司，吉布科(GIBCO))、1mM丙酮酸钠(英杰公司，吉布科(GIBCO))和1％抗生素/抗霉菌素混合物(Invitrogen，GIBCO)的RPMI1640培养基(新西兰奥克兰的英杰公司(Invitrogen，Auckland，New Zeal))中，。BE2M17细胞培养在添加1％FBS(英杰公司，吉布科)、1％非必须氨基酸(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司)、10mM HEPES(英杰公司，吉布科)、1mM丙酮酸钠(英杰公司，吉布科)和1％抗菌素/抗霉菌素混合物(英杰公司，吉布科)的OPTI-MEM1血清减少的培养基(英杰公司，吉布科)中。37℃/5％CO₂培养细胞。硒酸钠获自西格玛公司(美国密苏里州圣路易斯)。

抗体：除非另有说明，以下抗体均购自美国洛克福特(Rockford，USA)的皮尔斯公司(Pierce)Endogen：抗人PHF-Tau单克隆抗体(克隆AT100；AT180；AT270)和抗人Tau单克隆抗体(克隆HT-7)。多克隆山羊抗小鼠免疫球蛋白/HRP(丹麦大科公司(Dako，Denmark))和抗微管蛋白(G712A，普洛麦格公司)。

体外试验：在有包被或无包被表面的Falcon 6孔板每孔中接种2 x 10⁵个SY5Y或B2M17细胞，在5％CO₂/37℃和完全生长培养基中让其贴壁过夜(如前所述)。用含100μM浓度硒酸钠的新鲜完全生长培养基置换旧培养基，培养3小时。细胞培养在用0.1％明胶(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司)、基质胶(目录号#354234，BD，NSW，澳大利亚)或用0.5μg/ml纤连蛋白(美国密苏里州圣路易斯的西格玛公司)包被表面的Falcon 6孔板中。

体内试验：14周龄Balb/C Nu Nu雄小鼠购自ARC。小鼠接受300μg硒酸钠/200μl PBS的一次皮下注射。注射后在不同时间点处死小鼠，收集血液和脑标本。

制备裂解液和免疫印迹：用冷PBS洗涤细胞，用150μl冷RIPA缓冲液(含10％甘油、20mM Tris、137mM NaCl、0.1％ SDS、0.05％ IGEPAL、1％ Triton X-100、2mM EDTA、10％ NaV、2％ NaF和4X蛋白酶抑制剂)裂解，类似地，在干冰上用研钵和碾槌匀浆脑组织，用150μl RIPA缓冲液裂解。冰上培育样品30分钟，然后4℃，13000rpm离心10分钟。收集上清液用BCA试剂(Sigma)计算各样品的蛋白估计值。将等量蛋白加到10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶的各泳道中。(电泳后)将蛋白转移到PVDF膜(密理博公司)上用5％脱脂奶粉溶液封闭2小时。封闭膜后加入第一抗体：或抗人PHF-Tau抗体(AT100为1:200；AT180为1:1000；AT270为1:2500)，或抗人Tau蛋白抗体(HT-7为1:1000)，在5％脱脂奶粉溶液中4℃培育过夜。加二抗培育前，用含0.01％吐温的Tris缓冲盐水室温淋洗膜三次3 x 5分钟。然后加入用5％脱脂奶粉溶液1:10000稀释的偶联辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠多克隆第二抗体(丹麦大科公司)，室温培育1小时。按上述洗涤膜用安玛西亚ECL western印迹检测试剂(英国白金汉郡的安玛西亚生物科学公司(Amersham Bioscience，Buckinghamshire，UK))检测。用2％SDS/β-巯基乙醇剥离缓冲液剥离膜，重新探测微管蛋白(普洛麦格)以验证蛋白加样量。

在存在(+)或缺乏(—)硒酸钠时，在不同包被表面用抗人PHF-Tau抗体免疫印迹人神经母细胞瘤BE2M17细胞系，见图11所示。BE2M17完全培养基中含100μM硒酸钠。在纤连蛋白包被、未包被(塑料)或基质胶包被的表面上用硒酸钠培养细胞3小时(如方法章节中所述)。

结果：

在68kDa处检测到抗人PHF-Tau克隆AT100。培养在纤连蛋白和基质胶表面上的细胞在硒酸钠存在时的PHF-Tau信号似乎比不用硒酸盐处理的细胞更低。

在71kDa和67kDa处检测到抗人PHF-Tau克隆AT180。培养在纤连蛋白、塑料(未包被)和基质胶上的硒酸钠处理细胞的PHF-Tau信号似乎比不用硒酸盐处理的细胞更弱。培养在基质胶上的细胞在67kDa产生的PHF-Tau信号比纤连蛋白和塑料上培养的细胞更强。

在66kDa和63kDa处检测到抗人PHF-Tau克隆AT270。培养在纤连蛋白、塑料(未包被)和基质胶上的硒酸钠处理细胞的PHF-Tau信号似乎比不用硒酸盐处理的细胞更弱。注意，培养在基质胶上的硒酸钠处理和不处理的细胞之间只有轻微差异。

在68、64和57kDa检测到抗人PHF-Tau克隆HT-7。在纤连蛋白上培养硒酸钠处理的细胞似乎能降低Tau蛋白的表达。

抗微管蛋白检测显示蛋白加样量相等。

在存在(+)或缺乏(—)硒酸钠时，在不同培养表面用抗人PHF-Tau抗体免疫印迹人神经母细胞瘤SY5Y细胞系，见图12所示。SY5Y完全培养基中含100μM硒酸钠。在明胶、纤连蛋白、未包被(塑料)或基质胶包被表面上用硒酸钠培养细胞3小时(如方法章节中所述)。

结果：

在70kDa处特异性检测到抗人PHF-Tau克隆AT270。相比，培养在明胶和纤连蛋白表面上的硒酸盐处理细胞的PHF-Tau信号似乎比不用硒酸钠处理的细胞更弱。

在60kDa处检测到抗人PHF-Tau克隆HT-7。基质胶和纤连蛋白似乎降低了抗Tau信号。具体说，培养在纤连蛋白表面用硒酸钠处理的细胞的抗Tau信号似乎比不用硒酸钠处理的培养细胞更弱。

抗微管蛋白检测显示蛋白加样量相对等量。

用抗人PHF-Tau免疫印迹14周龄Balb/C Nu Nu雄小鼠存在(+)或缺乏(—)硒酸钠时的全脑裂解液(如指示的那样)，见图13。皮下注射1.5μg/μl硒酸钠处理小鼠，不注射硒酸钠的小鼠(-)皮下注射PBS。在不同时间点：0、2和6小时收集脑组织(如方法章节中所述)。

结果：

PBS似乎对所有研究的克隆(AT100，AT180和AT270)抗人PHF-Tau信号有影响。为验证蛋白加样量相等，按方法章节中所述剥离所有膜，并再检测微管蛋白。

图13A显示抗人PHF-Tau克隆AT100在60kD处有免疫反应。存在硒酸钠时的2和6小时时间点，PHF-Tau信号似乎比不用硒酸钠处理的细胞低。

图13B显示抗人PHF-Tau克隆AT180在60kD处有免疫反应。存在硒酸钠时的2和6小时时间点，PHF-Tau信号比不用硒酸钠处理的细胞显著降低。

图13C显示AT270的免疫反应信号与AT180克隆相似。看来AT270克隆能检测到73、70和60kDa的三种PHF-Tau蛋白同工型。

图13D显示在存在(+)或缺乏(—)硒酸钠时小鼠全脑裂解液中的Tau蛋白表达。抗人Tau蛋白，特别是克隆HT-7在小鼠脑组织中似乎无特异性。

实施例11：硒酸钠对过度表达人Tau441转基因小鼠(TMHT)的行为和脑Tau蛋白病理学的影响

方法

序言：设计此项研究以评价用硒酸钠治疗对过度表达在脑特异性小鼠Thy-1启动子控制下的人TAU441基因(含二处突变V337M和R406W)的TAU441转基因(Tg)TMHT小鼠(C57BL6背景)的行为和脑形态的影响。评价治疗后1.5和3个月在开场(Open Field，OF)试验、旋转杆(Rota Rod，RR)试验和伸鼻(Nose poke)好奇心和活动试验(后者是评价好奇心行为的试验)中所有Tg小鼠的行为。治疗结束时另在莫利斯(Morris)水迷宫(MWM)试验中评价记忆和学习能力。也用OF试验、RR试验、鼻触试验和MWM任务测定未治疗的基线组小鼠。先检测每个治疗组3只动物的脑TAU病理学变化。

动物：所用的Tg TMHT雄性和雌性小鼠表达人TAU441，其携带有在脑特异性小鼠Thy-1启动子调控下的错义突变V337M和R406W。在奥地利格拉茨的JSW研究中心(JSW-Research，Graz，Austria)中繁殖和育种小鼠。这些小鼠的C57BL/6背景导致小鼠具有所知的良好学习能力。此小鼠模型类似于人阿尔茨海默病的Tau蛋白病理。治疗开始时小鼠为5个月±2周龄，这也是基线组的年龄。

动物辨认和饲养：小鼠靠耳环标记辨认，饲养在单个通风笼子(IVC)中，笼子中装有由提供的标准鼠类草垫。每只笼子最多装5只小鼠。按照基于国际标准的标准操作规程保持饲养小鼠。

每只笼子用颜色卡片辨认，表明研究的动物数目、性别、个体登记号(IRN)、出生日期及筛选日期和治疗组分配。

研究期间的温度维持在大约24℃，相对湿度维持约40—70％。在恒定的光照周期(12小时光照/黑暗)下饲养动物。

动物可自由获得干燥的颗粒状鼠类饼干

和普通自来水。

治疗：将小鼠随机分配到A组(硒酸钠)、B组(运载体)和C组(基线)。治疗组A通过饮水接受硒酸钠12周，而对照组(B)小鼠可饮用普通自来水。为了应用，将1.2mg硒酸钠溶于100ml灭菌水，记录重量，将水瓶放在笼子中，每周一、三、五这样做，换瓶时测定消耗的水重量。

行为试验

开场试验：最标准化的通用运动功能检测是开场(OF)试验中的自主活动。本项研究采用Plexiglas开场(48 x 48cm；

)试验。将红外光束置于盒子周围1.4cm距离。为检测后腿站立，将另一排光束固定在第一束光上方4cm处。测试持续5分钟以检查小鼠在新环境中的行为和习惯。然后，计数粪团数目作为情绪激动的衡量。每只鼠活动后用70％乙醇清洗OF去除味道痕迹。试验在标准的昼夜节律光照期室内光照条件下进行。

旋转杆试验：利用该试验来检测TAU Tg小鼠可能的运动缺陷。在加速的5道旋转杆上进行研究。小鼠必须在最多300秒内完成程序。它们开始时的速度为5rpm，120秒后杆旋转速度达到60rpm。此后，计算出跌倒的潜伏期和当时的速度。

伸鼻好奇心和活动试验：洞板装置提供检测小鼠对新环境反应的简单方法，其优点是利用了小鼠的好奇心和它们将鼻子伸入洞内的倾向。在装配有洞板(每板16个洞)的OF盒中进行好奇心行为研究。头伸入洞即阻断了刚好装在每只洞边缘下方的红外光束。计算出每只动物在5分钟内头伸入的次数和时间。

莫利斯水迷宫(MWM)试验：莫利斯水迷宫(MWM)试验在直径100cm的黑色圆形水池中进行。水池装满自来水，温度22±1℃，水池实际上分成4区。透明平台(直径8cm)安置在水表面下方约0.5cm处。整个试验期间，除了预测试，平台都位于水池的西南1/4区。

在4天持续训练课程前一天，动物必须进行所谓的“预试验”(二次60秒试验)以确保每只动物的视力正常。只有完成这种试验的动物才继续MWM试验。

在MWM任务中，每只小鼠必须在连续4天内进行三次试验。一次试验持续最长一分钟。在这段时间，小鼠有机会找到隐藏的模糊目标。如果动物不能找到离开水的“路”，研究人员可引导或将此小鼠放到平台上。每次训练后让小鼠在平台上休息10—15秒。此时小鼠可能弄清周围的方向。研究在昏暗的光照条件下进行以防止跟踪系统受到不良影响(Kaminski；PCS，生物医学研究系统公司(Biomedical Research Systems))。在水池四周池壁上，贴有固定的黑色醒目的几何符号(如园圈和方块)，使小鼠可利用这些符号作为定向标志。

每次游泳训练一组有5—6只小鼠，以保证训练间隙约5—10分钟。

为了定量测定逃脱潜伏期(小鼠找到隐藏的平台而从水中逃脱的以秒计的时间)、路径(以米计的到达目标的游泳轨迹长度)和在目标1/4区停留的时间，采用计算机处理的跟踪系统。将计算机连接于水池中央上方放置的照相机。用照相机检测用小发夹固定在小鼠尾巴上的发光二极管(LED)的信号。

探索试验(Probe Trial)：第4天最后一次训练后1小时，小鼠必须完成所谓的探索试验。此时，拆去水池中的平台，在一分钟探索试验中，实验者计算出(小鼠)穿越先前平台位置的次数。测定在此1/4区停留的时间。

组织的制备和取样

治疗结束和完成所有的行为测试后，处死各动物，采集血液(血浆和血清)、CSF和脑，立即加工或贮存待进一步实验。

为此目的，用标准吸入麻醉剂(异氟烷，Baxter)镇定所有小鼠。钝性解剖并暴露枕骨大孔，获得脑脊液。暴露时，将巴斯得(Pasteur)移液器尖头插入枕骨大孔内约0.3-1mm深处。依靠抽吸和毛细管作用收集CSF直到液流完全停止。立即-80℃冻存各样品，直到用ELISA进行分析。

CSF取样后，将各小鼠置于背平卧位，用套在1ml注射器上的26号针头插入胸腔通过横隔膜深入约2cm。向针头施加轻微吸力，通过回血确认已将针头置于小鼠的心室中。抽取血液直到血流停止。将血液收集在EDTA小瓶中-20℃保存待用。

采集转基因小鼠血样后心内灌注0.9％氯化钠。迅速取出脑，右半侧浸没在新配制的4％多聚甲醛中固定，石蜡包埋作组织学检查。左半球在干冰上冻结，于-80℃保存用于随后可能进行的生化分析。

先进行9个脑半球(每个Tg小鼠组≥3个)的组织学评价以定量和定性评价Tau蛋白病变。

按照Paxinos和Franklin编著的“小鼠脑”(The Mouse Brain)(第2版)的形态学实验集选择在大脑前卤的-1.82与-1.34mm之间的不同5层，在各层中切取厚5μm的15张冠状连续切片(Leica SM 2000R)，作Gallyas染色，用特异性抗体(AT180和HT7)检测Tau蛋白病理变化。以精确相同的方法操作研究的所有转基因小鼠组织以避免由于此方法的差异引起的偏差。保存和储存未使用的剩余的脑半球或组织，直到负责人决定如何处理或直到研究结束。

免疫组化检测Tau蛋白病理变化

用单克隆TAU-抗体AT180和HT7(皮尔斯公司

)检测Tau蛋白的沉积。AT180能识别PHF-TAU和形成的纤维缠结[此抗体识别的表位是磷酸化的Thr231残基]，HT7识别正常人Tau蛋白及PHF-TAU[此抗体识别的表位在人Tau蛋白的残基159与163之间]。

用上述单克隆小鼠抗人Tau蛋白抗体(AT180—1：100；HT7—1：1000)处理不同5层各层的5μm厚冠状石蜡切片，用抗小鼠Cy3二抗(1:500，杰克逊实验室公司(Jackson Laboratories)显色。染色的详细方法见下：

检测人PHF-TAU蛋白沉积的AT180培育方法

1.)使组织切片通过组织清洗液(樱花(Sakura)

和一系列等级酒精

脱蜡和水化。

2.)用重蒸馏水(Fresenius-

)洗涤2分钟。

3.)将组织切片置于10％柠檬缓冲液

中在95℃蒸气中蒸15分钟然后冷却到室温15分钟，以便进行抗原暴露(unmasking)

4.)用PBS洗涤切片2 x 5分钟。

5.)室温用1％过氧化氢

的甲醇

溶液封闭内源性过氧化物酶10分钟。

6.)用PBS洗涤切片2 x 5分钟。

7.)在潮湿室中用MOM-封闭试剂

在室温下封闭非特异性结合60分钟。

8.)用PBS洗涤切片2 x 5分钟。

9.)用MOM-稀释液

在室温下封闭非特异性结合5分钟。

10.)在潮湿室中与AT180(皮尔斯公司

用MOM-稀释液1:100稀释)一起于室温下培育60分钟。

11.)用PBS洗涤切片3 x 5分钟。

12.)在潮湿室中用10％非免疫山羊正常血清

封闭非特异性结合10分钟。

13.)用PBS洗涤切片2 x 5分钟。

14.)在潮湿室中与Cy3山羊抗小鼠抗体(

用MOM-稀释液1:500稀释)一起于室温下培育60分钟。

15.)用PBS洗涤切片5分钟。

16.)用重蒸馏水洗涤切片5分钟。

17.)用香柏油(Moviol)和盖玻片覆盖切片。

化学试剂：

1％过氧化氢的甲醇溶液：

60mL甲醇+2mL 30％过氧化氢+0.6mL Triton X-100

MOM-封闭试剂：

2 滴MOM-小鼠IgG封闭试剂(来自MOM-试剂盒

+2.5mLPBS。

MOM-稀释液：

10mL PBS+800μL蛋白浓缩液(来自MOM-试剂盒

抗体AT180：

用MOM-稀释液1:100稀释

抗体Cy3山羊抗小鼠：

用MOM-稀释液1:500稀释

检测正常人Tau蛋白和PHF-Tau蛋白沉积的HT7培育方法

1)使组织切片通过组织清洗液(樱花

和一系列等级酒精

脱蜡和水化。

2)用重蒸馏水

洗涤2分钟。

3)将组织切片置于10％柠檬缓冲液

中在95℃蒸气中蒸15分钟然后冷却到室温15分钟，以便进行抗原暴露。

4)用PBS洗涤切片2 x 5分钟。

5)室温用1％过氧化氢的甲醇

溶液封闭内源性过氧化物酶10分钟。

6)用PBS洗涤切片2 x 5分钟。

7)在潮湿室中用MOM-封闭试剂在室温下封闭非特异性结合60分钟。

8)用PBS洗涤切片2 x 5分钟。

9)用MOM-稀释液

在室温下封闭非特异性结合5分钟。

10)在潮湿室中与HT7(皮尔斯公司

用MOM-稀释液1:1000稀释)一起于室温下培育60分钟。

11)用PBS洗涤切片3 x 5分钟。

12)在潮湿室中用10％非免疫山羊正常血清

封闭非特异性结合10分钟。

13)用PBS洗涤切片2 x 5分钟。

14)在潮湿室中与Cy 3山羊抗小鼠抗体(

用MOM-稀释液1:500稀释)一起于室温下培育60分钟。

15)用PBS洗涤切片5分钟。

16)用重蒸馏水洗涤切片5分钟。

17)用香柏油(Moviol)和盖玻片覆盖切片。

化学试剂：

1％过氧化氢的甲醇溶液：

60mL甲醇+2mL 30％过氧化氢+0.6mL Triton X-100

MOM-封闭试剂：

2 滴MOM-小鼠IgG封闭试剂(来自MOM-试剂盒+2.5mLPBS。

MOM-稀释液：

10mL PBS+800μL蛋白浓缩液(来自MOM-试剂盒

抗体HT7：

用MOM-稀释液1:100稀释抗体Cy3山羊抗小鼠：

用MOM-稀释液1:500稀释

评价

行为

在开场(OF)试验中，检测了水平和垂直运动、排便次数、直立次数和持续时间、过度活动及在开场中心与外围消耗的时间比例

在伸鼻好奇心和活动试验中，计算了小鼠头伸入(洞)的次数和持续时间。

在旋转杆(Rota Rod)试验中，计算了跌倒的潜伏期和当时的杆旋转速度。

在莫利斯水迷宫(MWM)试验中，记录了游泳路径的长度和逃离潜伏期。游泳速度的计算方法为游泳路径长度除以逃离潜伏期。在探索试验中，拆去平台进行试验，在记录纸上记录(小鼠)穿越先前平台位置的次数，以及在水池每一1/4区消耗的时间。

神经病理学变化：为测定脑海马回和脑扁桃体中的Tau蛋白免疫反应性程度，采用专用的图象分析软件(专业图像软件(Image Pro Plus)，4.5.1.29版)。评价和计算了以下参数：

每张切片的脑海马回和脑扁桃体区域面积；

特定脑区域海马回和扁桃体中免疫反应阳性细胞所占的绝对面积；

免疫反应阳性面积与海马回和扁桃体特定脑区域面积之比。

定量测定方法：

a)调整该图像的对比度以更好观察切片形状，但不应将该对比度施加于该图像。

b)人机交互绘制海马回轮廓图测量其面积(＝区域面积)

c)人机交互绘制感兴趣区域(AOI)，其中检测到高于强度阈值水平的染色对象。为检测此域值，人机交互绘制在靠近AOI的没有可见免疫反应区域中的线直方图。此线直方图所有像素的平均强度水平，加上一个常数，得到此强度域值水平。排除小于7μm²的对象。

d)测定各对象的面积和AOI中染色面积之和，

e)对脑扁桃体重复步骤a)-d)，

f)计算相对Tau蛋白免疫阳性面积(＝Tau蛋白免疫反应性的总面积/区域面积x100)

g)将数据自动输出到Excel电子数据表中，包括参数“图像标题、区域面积、Tau总面积和Tau面积百分比”。利用注释区分别记录图像质量和排除标准。排除标准是该切片的丢失部分、许多是皱纹和明显裂缝。

h)关闭该图像而不保存(以保留原始数据)。

统计学处理：计算所有测定参数的平均值、标准差或SEM。

结果

一般观察：一般说，用硒酸钠治疗不会导致不良副作用或引起成熟前死亡。

行为试验结果：

开场试验：

虽然硒酸钠治疗不影响活动参数(活动、过度活动和直立行为)，但硒酸钠治疗小鼠在第一次OF试验中显示趋触行为被扰乱。这导致在该开场盒的中心区停留时间显著延长，意味着第一轮治疗后与运载体相比硒酸钠治疗的动物的趋触性差(见图14—“趋触性”，治疗组动物的T检验：p＝0.019)。第二轮治疗结束时，将趋触性行为按运载体对照组水平标准化。

一个半月后，与所研究的二个治疗组相比，OF试验中基线动物的特征是排便率较高(二个治疗组的ANOVA分析：p＝0.018，p<0.05)，表明实验动物对此试验方法有较高的情绪反应。

旋转杆(Rota Rod)试验，硒酸钠治疗不会改变小鼠的运动行为。

伸鼻好奇心和活动试验，硒酸钠治疗不会改变小鼠的好奇心行为。

莫利斯水迷宫(MWM)试验，图15显示了二个不同治疗组加基线(5月龄动物治疗)的莫利斯水迷宫(MWM)行为结果，表4显示其统计学分析结果。此MWM任务深刻揭示在某些情况下(见表4)，与运载体组、甚至是年幼3个月的基线组相比，硒酸钠治疗动物之间差异的显著性甚至更高。

表4：莫利斯水迷宫(MWM)试验结果的Mann Whitney U-检验结果表：

此结果清楚表明硒酸钠能够提高认知功能。

脑组织学和免疫组化检测结果

总结果：

在AT180和HT7 IHC定量中，在所有受检脑中海马回和扁桃体区的区域面积高度恒定，排除了免疫组化染色步骤中对组织的不良作用(如皱缩、切割环境不同)，因此进一步表明治疗不会导致萎缩。检测到的Tau蛋白含量数据与切片的个别区域大小相关，能应对小差异。

HT7和AT180：与运载体组(ANOVA：p<0.05，治疗组T-检验：p＝0.04)和未治疗的基线组(ANOVA：p<0.05，见图16A)相比，硒酸钠(1.2mg)治疗的动物海马回中HT7-Tau相对面积的百分比显著降低。这种作用在扁桃体中更显著(见图16B)，其中与未治疗基线组(ANOVA：p<0.01)和运载体治疗动物(ANOVA：p<0.05，治疗组T-检验：p＝0.0018)相比，硒酸钠治疗小鼠的HT7-Tau相对面积百分比明显降低。

与HT7-Tau类似，硒酸钠(1.2mg)治疗的动物海马回中AT180-Tau相对面积的百分比低于运载体组(治疗组T-检验：p＝0.04，见图17A)，然而显著性水平更低。还有，这种作用在扁桃体中更显著(见图17B)，其中硒酸钠治疗小鼠的HT7-Tau相对面积百分比显著低于运载体组(ANOVA：p<0.05，治疗组T-检验：p＝0.0045)，但不低于未治疗基线组。

海马回和扁桃体中的AT180和HT7免疫反应阳性神经元显示在与PHF-Yau紧密挤在一起的神经元细胞体中有大量的Tau蛋白沉积。硒酸钠治疗显著减少扁桃体和海马回CA1区神经元层中的Tau蛋白载量和Tau阳性细胞。

作用小结和结论

在硒酸钠治疗转基因小鼠中，治疗开始后一个半月趋触性降低，表明与扁桃体样结构相关的恐惧心理变化。经长期硒酸钠治疗后，小鼠在第二轮开场试验处死之前，趋触行为恢复到与运载体治疗对照组相仿和正常的水平。

硒酸钠治疗不影响所有的运动参数，如旋转杆能力、开场活动、过度活动和直立行为。

硒酸钠治疗可提高小鼠在莫利斯水迷宫(MWM)试验中的认知能力。第1、2和3天硒酸钠治疗动物找到平台明显快于运载体组动物(p≤0.01)，第1天也快于基线组的年幼3个月的动物。

当评价TMHT Tg小鼠海马回和扁桃体中的HT7免疫阳性Tau蛋白沉积和Tau蛋白载量时，可见硒酸钠治疗的显著影响。

与未治疗的基线组相比，甚至在扁桃体中也可与运载体(水)治疗的对照相比，可观察到这种治疗显著减少了海马回和扁桃体中HT7阳性Tau蛋白区域面积。

HT7-Tau沉积的结果得到AT180培育的支持。硒酸钠治疗后海马回和扁桃体中的AT180阳性Tau蛋白比运载体(水)治疗对照组显著减少。

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Claims (20)

1.一种治疗或预防对象神经变性疾病的方法，其特征在于，所述方法包括给予所述对象有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经变性疾病是tau蛋白病或α-共核蛋白疾病。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述tau蛋白病选自早老性痴呆、老年痴呆、阿尔茨海默病、与染色体17连锁的帕金森综合征(FTDP-17)、进行性核上麻痹、皮克病、原发进行性失语症、额颞叶痴呆和皮质基底痴呆。

4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述tau蛋白病选自早老性痴呆、老年痴呆或阿尔茨海默病。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述α-共核蛋白疾病选自帕金森病、伴痴呆的帕金森病、伴有雷维小体的痴呆、皮克病、唐氏综合征、多发性系统性萎缩、淀粉样侧索硬化症(ALS)或哈-斯综合征。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述α-共核蛋白疾病是帕金森病。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法还包括给予治疗或预防神经变性疾病的另一种疗法，或给予能缓解神经变性疾病症状的治疗。

8.一种抑制或降低神经元、神经胶质细胞或雷维小体中tau蛋白磷酸化的方法，所述方法包括使所述神经元或神经胶质细胞接触有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，其中所述tau蛋白是微管相关的tau蛋白。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述tau蛋白位于神经原纤维缠结中。

11.如权利要求8所述的方法，其特征在于，抑制或防止tau蛋白的超磷酸化。

12.一种增强PP2A活性的方法，所述方法包括使所述PP2A接触有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述PP2A是去磷酸化Akt的同工型。

14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述PP2A是去磷酸化tau蛋白的同工型。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，所述tau蛋白是在神经元、神经胶质细胞或雷维小体中发现的微管相关的tau蛋白。

16.一种抑制神经元或神经胶质细胞中GSK3β活性的方法，所述方法包括使所述神经元或神经胶质细胞接触有效量的硒酸盐或其药学上可接受的盐。

17.硒酸盐或其药学上可接受的盐在制造治疗或预防神经变性疾病药物中的应用。

18.一种药物组合物，其包含硒酸盐或其药学上可接受的盐，和另一种治疗或预防神经变性疾病的药物。

19.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述其它药物选自：胆碱脂酶抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸受体拮抗剂、雌激素制剂、非类固醇消炎药物、左旋多巴、多巴脱羧酶抑制剂、多巴胺激动剂、单胺氧化酶B抑制剂、抗胆碱能药物和COMT抑制剂中的一种或多种。

20.如权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，其中所述其它制剂选自：他克林、杜尼匹次、加兰他敏、雷司替明、美金刚胺、倍美力、阿斯匹林、布洛芬、左旋多巴、卡比多巴、苄丝肼、溴隐亭、硫丙麦角林、派拉米苏、罗比尼洛、卡麦角林、阿朴吗啡、稠环乙脲、司来吉兰、拉撒斯林、苯并托品甲磺酸溴隐亭、盐酸苯海索、恩他卡朋、托卡朋或金刚胺。

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