CN114206214A - 用于生物流体的蛋白质冕分析的组合物、方法和系统及其用途 - Google Patents

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CN114206214A CN202080039113.6A CN202080039113A CN114206214A CN 114206214 A CN114206214 A CN 114206214A CN 202080039113 A CN202080039113 A CN 202080039113A CN 114206214 A CN114206214 A CN 114206214A
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迈克尔·菲加
霍普·里欧
沙迪·罗什迪费尔多西
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    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry

Abstract

本公开提供用于生物流体的生物分子冕分析的方法和组合物。生物流体可以与纳米颗粒接触以形成生物分子冕，并且可以分析所得的冕的组成。还提供了制备用于通过串行探询进行冕分析的生物流体的方法。

Description

用于生物流体的蛋白质冕分析的组合物、方法和系统及其 用途
交叉引用
本申请要求2019年3月26日提交的名称为“用于生物流体的蛋白质冕分析的组合物、方法和系统及其用途”的第62/824,279号申请(律师案号53344-711.101)以及2019年3月26日提交的名称为“用于生物流体的蛋白质冕分析的组合物、方法和系统及其用途”的第62/824,284号申请(律师案号53344-712.101)的权益，所述申请各自通过引用整体并入本文中用于所有目的。
背景技术
生物流体包含各种蛋白质，所述蛋白质的存在和浓度可以指示受试者健康状态。高峰度的蛋白质及其他蛋白质可能掩盖测定的信号。蛋白质冕可以在颗粒暴露于包含蛋白质的生物流体时在颗粒上形成。对蛋白质冕的许多工作已经在来自血流(血浆或血清)上进行。多样化的生物流体与颗粒的相互作用大部分是未知的。
分级分离可以用于在测定生物流体时降低高丰度蛋白的信号。目前存在各种分级分离方法，其促进蛋白质的分离和提取。这些方法允许在测定中检测不同的蛋白质图谱(profile)。然而，仍然需要更多样化的蛋白质组学的分析。
发明内容
在各种方面中，本公开提供一种串行探询样品的方法，所述方法包括：a)使所述样品与第一颗粒类型接触并且将所述第一颗粒类型与所述样品一起孵育以形成第一生物分子冕，其中在所述第一颗粒类型与所述样品一起孵育时所述第一生物分子冕形成并且其中所述第一生物分子冕包含蛋白质；b)将包含所述第一生物分子冕的第一颗粒类型与所述样品分离；c)使所述样品与第二颗粒类型接触并且将所述第二颗粒类型与所述样品一起孵育以形成第二生物分子冕，其中在所述第二颗粒类型与所述样品一起孵育时所述第二生物分子冕形成，其中所述第二生物分子冕包含蛋白质，并且进一步地其中(i)所述第一颗粒类型和所述第二颗粒类型是相同的颗粒类型，或者(ii)所述第一颗粒类型和所述第二颗粒类型不同；d)将包含所述第二生物分子冕的所述第二颗粒类型与所述样品分离；e)测定所述第一生物分子冕和所述第二生物分子冕以基于所测定的第一生物分子冕和第二生物分子冕而确定所述样品中的多种蛋白质的组成和浓度。
在一些方面中，在将所述第一颗粒类型与所述样品一起孵育以形成所述第一生物分子冕时，如通过总蛋白分析方法测量的，相对于所述样品中多种蛋白质的动态范围压缩所述第一生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围。
在一些方面中，所述第一生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是以下a)与b)的第一比率：a)由在所述第一生物分子冕中的多种蛋白质中的较高丰度蛋白产生的信号；b)由所述第一生物分子冕中的多种蛋白质中的较低丰度蛋白产生的信号。在一些方面中，所述第一生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是所述第一生物分子冕中的多种蛋白质中的最高丰度蛋白的浓度与最低丰度蛋白的浓度的第一比率。在一些方面中，所述第一生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是所述第一生物分子冕中的多种蛋白质中前十分位数蛋白质与后十分位数蛋白质的第一比率。在一些方面中，所述第一生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是第一比率，所述第一比率包括所述第一生物分子冕中的多种蛋白质中的蛋白质的四分间距的跨度。在一些方面中，所述第一生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是第一比率，所述第一比率包括所述第一生物分子冕中的多种蛋白质中的所有蛋白质浓度相对于样品中的相同蛋白质的已知浓度的曲线中的拟合数据的斜率。
在一些方面中，从数据库获得样品中的相同蛋白质的已知浓度。在一些方面中，样品中的多种蛋白质的动态范围是以下a)与b)的第二比率：a)如通过总蛋白分析方法测量的，由所述样品中的多种蛋白质中的较高丰度蛋白产生的信号；b)如通过总蛋白分析方法测量的，由所述样品中的多种蛋白质中的较低丰度蛋白产生的信号。在一些方面中，如通过总蛋白分析方法测量的，所述样品中的种蛋白质的动态范围是所述样品中的多种蛋白质中的最高丰度蛋白的浓度与最低丰度蛋白的浓度的第二比率。在一些方面中，如通过总蛋白分析方法测量的，所述样品中的多种蛋白质的动态范围是所述样品中的多种蛋白质中的前十分位数蛋白质与后十分位数蛋白质的第二比率。
在一些方面中，如通过总蛋白分析方法测量的，所述样品中的多种蛋白质的动态范围是第二比率，所述第二比率包括所述样品中的多种蛋白质中的蛋白质的四分间距的跨度。在一些方面中，如通过总蛋白分析方法测量的，所述样品中的多种蛋白质的动态范围是第二比率，所述第二比率包括所述样品中的多种蛋白质中的所有蛋白质浓度相对于所述样品中的相同蛋白质的已知浓度的曲线中的拟合数据的斜率。在一些方面中，从数据库获得所述样品中的相同蛋白质的已知浓度。在一些方面中，压缩所述动态范围包括相对于所述第二比率降低的第一比率。在进一步的方面中，所述降低的第一比率低于所述第二比率至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。
在一些方面中，所述方法进一步包括：确定所述第二生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度。在一些方面中，确定所述第一生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度或确定所述第二生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度包括进行质谱分析法。在一些方面中，所述方法进一步包括用一种或多种额外的颗粒类型重复步骤a)、b)和e)以形成一种或多种额外的生物分子冕。在一些方面中，所述一种或多种额外的颗粒类型与所述第一颗粒类型或所述第二颗粒类型相同。在一些方面中，所述一种或多种额外的颗粒类型与所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型或其组合不同。
在一些方面中，所述一种或多种额外的生物分子冕包含来自所述样品的蛋白质。在一些方面中，所述第一生物分子冕、所述第二生物分子冕、所述一种或多种额外的生物分子冕或其任何组合包含至少100种不同的蛋白质。在一些方面中，所述第一生物分子冕、所述第二生物分子冕、所述一种或多种额外的生物分子冕或其任何组合包含至少200种不同的蛋白质、至少300种不同的蛋白质、至少400种不同的蛋白质、至少500种不同的蛋白质、至少1000种不同的蛋白质、至少2000种不同的蛋白质、或至少5000种不同的蛋白质。
在一些方面中，所述第一生物分子冕、所述第二生物分子冕、所述一种或多种额外的生物分子冕或其任何组合包含不同组成的蛋白质、不同浓度的蛋白质的子集或其组合。在一些方面中，如通过总蛋白分析方法测量的，在所述一种或多种额外的颗粒类型与所述样品一起孵育以形成一种或多种额外的生物分子冕时，相对于所述样品中的多种蛋白质的动态范围压缩所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围。
在一些方面中，所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是以下a)与b)的额外比率：a)由所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质中的较高丰度蛋白产生的信号；b)由所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质中的较低丰度蛋白产生的信号。
在一些方面中，所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是所述一种或多种生物分子冕中的多种蛋白质中的最高丰度蛋白的浓度与最低丰度蛋白的浓度的额外比率。在一些方面中，所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是所述一种或多种生物分子冕中的多种蛋白质中的前十分位数蛋白质与后十分位数蛋白质的额外比率。在一些方面中，所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是额外比率，所述额外比率包括所述一种或多种生物分子冕中的多种蛋白质中的蛋白质的四分间距的跨度。
在一些方面中，所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是额外比率，所述额外比率包括所述一种或多种生物分子冕中的多种蛋白质中的所有蛋白质浓度相对于样品中的相同蛋白质的已知浓度的曲线中的拟合数据的斜率。在一些方面中，从数据库获得所述样品中的相同蛋白质的已知浓度。在一些方面中，压缩所述动态范围包括相对于所述第二比率降低的额外比率。在进一步的方面中，所述降低的第一比率低于所述第二比率至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。
在一些方面中，总蛋白分析方法包括通过质谱分析法、凝胶电泳或液相色谱法而直接定量所述样品中的所述多种蛋白质。在一些方面中，所述样品包括不超过约1000μL、不超过约900μL、不超过约800μL、不超过约700μL、不超过约600μL、不超过约500μL、不超过约400μL、不超过约300μL、不超过约200μL、不超过约100μL、不超过约50μL、不超过约20μL、不超过约10μL、不超过约5μL、不超过约2μL或不超过约1μL的样品体积。
在一些方面中，所述样品包括生物样品。在一些方面中，所述生物样品包括生物流体。在一些方面中，所述生物流体选自血浆、血清、尿液、脑脊髓液、滑液、眼泪、唾液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、汗液、沟液、精液、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、流体化的固体、细针抽吸样品、组织匀浆和细胞培养样品。在一些方面中，所述生物流体是血浆或血清。在一些方面中，所述生物流体是脑脊髓液。在一些方面中，所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型、所述一种或多种额外的颗粒类型或其任何组合选自表1。
在一些方面中，所述方法进一步包括在步骤a)之前通过耗尽或分级分离所述样品从所述样品去除高丰度蛋白。在一些方面中，一种或多种额外的生物分子冕包含蛋白质。在一些方面中，所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型、所述一种或多种额外的颗粒类型或其任何组合包含脂质、核酸、多糖或其任何组合。
在一些方面中，所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型或所述一种或多种额外的颗粒类型因至少一种物理化学性质而不同。在一些方面中，所述第一颗粒类型和所述第二颗粒类型因至少一种物理化学性质而不同，并且其中所述第一生物分子冕相对于所述第二生物分子冕包含不同但重叠的蛋白质子集。在一些方面中，基于所述第一生物分子冕和所述第二生物分子冕中不同但重叠的蛋白质子集确定所述多种蛋白质的组成和所述多种蛋白质中的蛋白质的浓度。
在一些方面中，所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型、所述一种或多种额外的颗粒类型或其任何组合选自纳米颗粒、微粒、微团、脂质体、铁氧化物颗粒、石墨烯颗粒、二氧化硅颗粒、基于蛋白质的颗粒、聚苯乙烯颗粒、银颗粒、金颗粒、金属颗粒、量子点、超顺磁性颗粒或其任何组合。在一些方面中，所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型、所述一种或多种额外的颗粒类型或其任何组合是超顺磁性颗粒。
在一些方面中，所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型、所述一种或多种额外的颗粒类型或其任何组合选自表1。在一些方面中，所述第一颗粒类型和所述第二颗粒类型是相同的颗粒类型，并且其中在所述第一生物分子冕和所述第二生物分子冕中测定的蛋白质中的至少70％、至少80％、至少90％或至少95％是相同的。在一些方面中，所述第一颗粒类型和所述第二颗粒类型不同，并且其中在所述第一生物分子冕和所述第二生物分子冕中测定的蛋白质中的不超过70％、不超过80％、不超过90％或不超过95％相同。
在各种方面中，本公开提供了一种分析多种生物流体的高通量方法，所述方法包括：a)使所述多种生物流体中的第一生物流体和第二生物流体与颗粒类型接触；b)在第一体积中，将所述颗粒类型与所述多种生物流体中的第一生物流体分离并且确定与所述颗粒类型对应的第一生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度；以及c)在第二体积中，将所述颗粒类型与所述多种生物流体中的第二生物流体分离并且确定与所述颗粒类型对应的第二生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度，其中所述第一生物流体和所述第二生物流体是不同的生物流体。
在一些方面中，所述多种生物流体中的生物流体选自血浆、血清、尿液、脑脊髓液、滑液、眼泪、唾液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、汗液、沟液、精液、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、流体化的固体、细针抽吸样品、组织匀浆和细胞培养样品。在进一步的方面中，所述生物流体是血浆或血清。在其他方面中，所述生物流体是脑脊髓液。
在一些方面中，在所述颗粒类型与所述样品接触时生物分子冕形成，并且其中所述第一生物分子冕包含蛋白质。在一些方面中，所述生物分子冕包含脂质、核酸、多糖或其任何组合。在一些方面中，所述方法进一步包括在步骤a)之前通过耗尽或分级分离所述样品从所述样品中去除高丰度蛋白。
在一些方面中，所述颗粒类型选自纳米颗粒、微粒、微团、脂质体、铁氧化物颗粒、石墨烯颗粒、二氧化硅颗粒、基于蛋白质的颗粒、聚苯乙烯颗粒、银颗粒、金颗粒、金属颗粒、量子点、超顺磁性颗粒或其任何组合。在一些方面中，所述颗粒类型是超顺磁性颗粒。在一些方面中，所述颗粒类型选自表1。在一些方面中，所述分离包括磁性分离、过滤、重力分离或离心。在一些方面中，所述接触发生在体外。在一些方面中，所述方法进一步包括通过使用经训练的算法处理所述生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度以鉴定生物状态从而鉴定所述生物流体的生物状态。
在一些方面中，从受试者中分离所述生物流体。在进一步的方面中，所述受试者是人类。在其他方面中，所述受试者是非人类动物。在一些方面中，所述受试者有状况。在更进一步的方面中，所述状况是疾病状态。在更进一步的方面中，所述疾病状态是癌症。在更进一步的方面中，所述癌症是前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌或乳癌。在其他方面中，所述疾病状态是阿耳茨海默病。在一些方面中，所述分离包括磁性分离、基于柱的分离、过滤、基于离心柱(spin column)的分离、离心、超离心、基于密度或梯度的离心、重力分离或其任何组合。
在各种方面中，本公开提供了一种分析生物流体的方法，所述方法包括：a)使生物流体在生物流体收集管中与颗粒类型接触，其中血液收集管包含稳定剂，其中所述稳定剂使所述生物流体中的无细胞核酸分子稳定；以及b)将所述生物流体和所述颗粒类型在所述生物流体收集管中一起孵育以允许所述生物流体的蛋白质与所述颗粒类型结合，从而形成包含与所述颗粒类型结合的蛋白质的生物分子冕，其中所述生物分子冕包含蛋白质群体，当所述颗粒类型被孵育在存储于EDTA中的生物流体中并且被允许形成对照生物分子冕时，也检测到所述蛋白质群体；并且其中在所述生物流体收集管中在约20℃至约35℃孵育所述生物流体和所述颗粒类型，并且其中所述生物分子冕的蛋白质群体中的50％以上在所述对照生物分子冕中也是能够检测到的。
在一些方面中，所述生物分子冕的蛋白质群体中的60％以上、70％以上、80％以上、或者90％以上在所述对照生物分子冕中也是能够检测到的。在一些方面中，与当在存储于EDTA中的生物流体中孵育所述颗粒类型时相比，以较高丰度检测到至少所述蛋白质群体中的子集。在一些方面中，与当在存储于EDTA中的生物流体中孵育所述颗粒类型时相比，以较高丰度检测到所述蛋白质群体中的至少5％。在一些方面中，与当在存储于EDTA中的生物流体中孵育所述颗粒类型时相比，以较高丰度检测到所述蛋白质群体中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。
在一些方面中，所述方法进一步包括与当在存储于EDTA中的生物流体中孵育所述颗粒类型时相比，以较低检测限测定所述生物分子冕中的蛋白质。在一些方面中，所述孵育包括在室温下孵育。在一些方面中，所述孵育包括孵育多达14天、多达13天、多达12天、多达11天、多达10天、多达9天、多达8天、多达7天、多达6天、多达5天、多达4天或多达3天。在一些方面中，所述孵育包括孵育多达14天。在一些方面中，所述生物分子冕包含所述对照生物分子冕中不存在的独特蛋白质。在一些方面中，所述生物分子冕包含至少100种不同的蛋白质、至少200种不同的蛋白质、至少300种不同的蛋白质、至少400种不同的蛋白质、至少500种不同的蛋白质、至少1000种不同的蛋白质、至少2000种不同的蛋白质、或者至少5000种不同的蛋白质。在一些方面中，所述颗粒类型结合100种以上不同的蛋白质。
在进一步的方面中，所述生物流体包括血浆、血清、尿液、脑脊髓液、滑液、眼泪、唾液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、汗液、沟液、精液、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、流体化的固体、细针抽吸样品、组织匀浆或细胞培养样品。在进一步的方面中，所述生物流体是血浆、血清、尿液、脑脊髓液、滑液、眼泪、唾液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、汗液、沟液、精液、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、流体化的固体、细针抽吸样品、组织匀浆或细胞培养样品。
在一些方面中，所述方法进一步包括将所述颗粒类型与所述生物流体分离。在一些方面中，分离包括磁性分离、过滤、重力分离或离心。在一些方面中，所述方法进一步包括确定所述生物分子冕中的蛋白质的组成和浓度。在一些方面中，所述方法进一步包括确定所述对照生物分子冕中的蛋白质的组成和浓度。在一些方面中，确定蛋白质的组成和浓度包括质谱分析法、凝胶电泳或液相色谱法。
在一些方面中，所述稳定剂包括代谢抑制剂、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、核酸酶抑制剂、防腐剂或其组合。在一些方面中，所述代谢抑制剂包括甘油醛、二羟丙酮磷酸、3-磷酸甘油醛、1,3-二磷酸甘油酸、3-磷酸甘油酸酯、2-磷酸甘油酸酯、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸和甘油酸二羟基乙酸、氟化钠或K2C2O4。在一些方面中，所述蛋白酶抑制剂包括抗痛素、抑肽酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、苯甲基磺酰氟(PMSF)、APMSF、TLCK、TPCK、亮抑酶肽、大豆胰蛋白酶抑制剂、吲哚乙酸(IAA)、E-64、EDTA、胃酶抑素、VdLPFFVdL、1,10-邻二氮杂菲、膦酰二肽(phosphoramodon)、氨肽酶抑制剂、苯丁抑制素、抑二肽素A、抑二肽素B、α-2-巨球蛋白、利马豆胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、或者蛋清卵固蛋白(ovostatin)蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
在一些方面中，所述磷酸酶抑制剂包括花萼海绵诱癌素A、节球藻毒素、NIPP-1、微囊藻素LR、变构霉素、冈田酸、斑蝥素、微囊藻素LR、冈田酸、福司曲星、变构霉素、斑蝥素、草藻灭、节球藻毒素、环孢菌素A、FK 506/免疫亲和素复合物、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、bpV(phen)、脱磷素(dephostatin)、mpV(pic)DMHV或原钒酸钠。在一些方面中，所述核酸酶抑制剂包括焦碳酸二乙酯、乙醇、金精三羧酸(ATA)、甲酰胺、氧钒核糖核苷复合物、硅藻土、乙二胺四乙酸(EDTA)、蛋白酶K、肝素、羟胺-氧-铜离子、皂土、硫酸铵、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫赤藓醇、三(2-羧乙基)磷杂环戊二烯盐酸盐、或者二价阳离子诸如Mg+2、Mn+2、Zn+2、Fe+2、Ca+2或Cu+2。
在一些方面中，所述防腐剂包括重氮烷基脲、咪唑烷基脲、二羟甲基(dimethoylol)-5,5-二甲基乙内酰脲、二羟甲基脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、噁唑烷、羟甲基甘氨酸钠、5-羟基甲氧基甲基-1-1氮杂3,7-二氧杂双环[3.3.0]辛烷、5-羟甲基-1-1氮杂3,7二氧杂双环[3.3.0]辛烷、5-羟基聚[亚甲基氧基]甲基-1-1氮杂3,7二氧杂双环[3.3.0]辛烷、或金刚烷季铵盐(quaternary adamantine)。在一些方面中，所述生物流体收集管是血液收集管。在一些方面中，所述颗粒类型是纳米颗粒或微粒。
在一些方面中，所述颗粒类型选自纳米颗粒、微粒、微团、脂质体、铁氧化物颗粒、石墨烯颗粒、二氧化硅颗粒、基于蛋白质的颗粒、聚苯乙烯颗粒、银颗粒、金颗粒、金属颗粒、量子点、超顺磁性颗粒及其任何组合。在一些方面中，所述颗粒类型选自表1。
在一些方面中，所述方法进一步包括使所述生物流体与一种或多种额外的颗粒类型接触，将所述生物流体与所述一种或多种额外的颗粒类型一起孵育以允许所述生物流体的蛋白质与所述一种或多种额外颗粒类型结合，从而形成包含与所述一种或多种额外的颗粒类型结合的蛋白质的一种或多种额外的生物分子冕。在一些方面中，所述一种或多种额外的颗粒类型结合蛋白质群体，所述蛋白质群体与所述颗粒类型的生物分子蛋白质中的蛋白质群体不同但重叠。在一些方面中，使所述生物流体与所述一种或多种额外的颗粒类型接触在使所述生物流体与所述颗粒类型接触之后发生。
本公开分析来自纳米颗粒与多样化的流体(诸如CSF、尿液、眼泪和唾液)相互作用的蛋白质冕。各种生物流体(包括CSF、尿液、眼泪和唾液)用于与纳米颗粒一起孵育。分离所得的蛋白质冕并用质谱分析法对其进行分析。本公开提供来自多样化的生物流体的蛋白质如何与纳米颗粒相互作用。从这些蛋白质冕鉴定的蛋白质(或生物标志)可以用于发现先进的诊断工具和治疗性靶。
在一些方面中，本公开提供一种分析多种生物流体的方法，所述方法包括：(a)分别使所述多种生物流体中的每种生物流体与纳米颗粒接触；(b)分离第一纳米颗粒并且分析与所述多种生物流体中的第一生物流体对应的第一蛋白质冕；以及(c)分离第二纳米颗粒并且分析与所述多种生物流体中的第二生物流体对应的第二蛋白质冕，其中步骤(b)和步骤(c)同时发生。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述多种生物流体与第三纳米颗粒接触。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述多种生物流体与第四纳米颗粒接触。在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述多种生物流体与第五纳米颗粒接触。在一些实施方案中，所述第一纳米颗粒和所述第二纳米颗粒相同。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述多种生物流体与多达10种不同的纳米颗粒接触。
在一些实施方案中，所述纳米颗粒由选自脂质、聚合物、金属或其任何组合中的材料制成。在一些实施方案中，所述聚合物包括PS、PLA、PGA、PLGA或PVP。在一些实施方案中，所述脂质包括EPC、DOPC、DOPG或DPPG。在一些实施方案中，所述金属包括铁氧化物、金或银。在一些实施方案中，所述纳米颗粒包含表面正电荷。在一些实施方案中，所述纳米颗粒包含表面负电荷。在一些实施方案中，所述纳米颗粒包含表面中性电荷。
在一些实施方案中，所述纳米颗粒包括1-400nm的尺寸。
在一些实施方案中，所述生物流体包括血浆、血清、CSF、尿液、眼泪或唾液。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述第一蛋白质冕与通过使所述第一生物流体与所述第一纳米颗粒接触而鉴定的第一对照蛋白质冕进行比较。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述第二蛋白质冕与通过使所述第二生物流体与所述第二纳米颗粒接触而鉴定的第二对照蛋白质冕进行比较。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述第一蛋白质冕与第一生物状态相关联。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将所述第二蛋白质冕与第二生物状态相关联。
本公开提供用于分析多样化的蛋白质组学的方法和系统。如本文中公开的，通过分级分离或通过纳米颗粒耗尽而首先去除丰富蛋白质，从而产生被耗尽的样品。然后，将被耗尽的样品与纳米颗粒一起孵育，由此导致形成具有高亲和力低丰度蛋白的蛋白质冕。本文中公开的方法和系统提供多样化的蛋白质冕谱图，其可以用于发现先进的诊断工具以及治疗性靶。
在一些方面中，本公开提供一种鉴定受试者的样品的生物状态的方法，所述方法包括：将所述样品与耗尽纳米颗粒一起孵育，从而产生被耗尽的样品；将所述被耗尽的样品与第一纳米颗粒一起孵育以产生蛋白质冕；生成与所述第一纳米颗粒相关联的对应于蛋白质冕中的蛋白质的蛋白质数据；以及利用经训练的算法处理所述蛋白质数据以鉴定所述受试者的生物状态。
在一些实施方案中，将样品与耗尽纳米颗粒一起孵育包括将样品与耗尽纳米颗粒一起孵育至少约30分钟并且从样品提取耗尽纳米颗粒。在一些实施方案中，通过将所述样品与耗尽纳米颗粒一起孵育至少约30min并且从样品提取耗尽纳米颗粒而从所述样品去除至少约80％的高丰度蛋白。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括分析与耗尽纳米颗粒相关的蛋白质冕。在一些实施方案中，将样品与耗尽纳米颗粒一起孵育包括将样品与耗尽纳米颗粒一起孵育至少约60分钟并且从样品提取耗尽纳米颗粒至少两次。在一些实施方案中，通过将样品与耗尽纳米颗粒一起孵育至少约60分钟并且从样品提取耗尽纳米颗粒至少两次而去除99％的高丰度蛋白。
在一些实施方案中，耗尽纳米颗粒包括至少一种与第一纳米颗粒不同的物理化学性质。所述不同的物理化学性质可以包括尺寸、表面电荷或化学部分。
在一些实施方案中，处理蛋白质数据包括分析蛋白质冕、在耗尽之前分析样品、或者分析被耗尽的样品。
在一些方面中，本公开提供一种鉴定来自受试者的蛋白质样品的生物状态的方法，所述方法包括：分级分离所述蛋白质样品，从而产生包含所述蛋白质样品中的蛋白质子集的经分级的样品；将被耗尽的样品与第一纳米颗粒一起孵育以产生蛋白质冕；生成与所述第一纳米颗粒相关联的对应于蛋白质冕的蛋白质的蛋白质数据；以及利用经训练的算法处理所述蛋白质数据以鉴定所述受试者的生物状态，其中分级分离样品包括利用选自孔恩氏方法、柱色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、离心、过滤、超过滤和冷沉淀的方法分离高丰度蛋白。
在一些实施方案中，处理蛋白质数据包括分析蛋白质冕、在分级分离之前分析蛋白质样品，或者分析经分级的样品。
在本文公开的方法的一些实施方案中，在被耗尽的样品中第一纳米颗粒的浓度是1-50mg/mL。在一些实施方案中，生成与第一纳米颗粒相关联的对应于蛋白质冕中的蛋白质的蛋白质数据包括确定所述蛋白质冕中的每种独特蛋白质的浓度并且将所述蛋白质冕中的每种独特蛋白质的浓度与所述生物状态相关联。在一些实施方案中，利用经训练的算法处理所述蛋白质数据以鉴定所述受试者的生物状态包括将所述生物状态与生物分子指纹相关联。在一些实施方案中，所述样品是血浆或血清。
在一些方面中，本公开提供一种测定生物样品的方法，该方法包括：(a)获得包含多种生物分子的生物样品，所述多种生物分子包括蛋白质；(b)基于选自尺寸、电荷、疏水性、结构和亲和性中的一种或多种特征而富集所述生物样品以产生经加工的生物样品；(c)借助于一种或多种纳米颗粒而从(b)的经加工的生物样品产生至少第一子集的生物分子和第二子集的生物分子，其中所述第一子集的生物分子与所述一种或多种纳米颗粒相关联而所述第二子集的生物分子不与所述一种或多种纳米颗粒相关联；以及(d)分别对至少所述第一子集的生物分子或所述第二子集的生物分子进行一种或多种测定。
在一些实施方案中，所述方法进一步包括(e)将所述第一子集的生物分子与所述第二子集的生物分子分离。
在一些实施方案中，所述一种或多种测定包括选自质谱分析法和酶联免疫吸附测定(ELISA)中的测定。在一些实施方案中，所述一种或多种测定包括质谱分析法。
在一些实施方案中，富集所述生物样品包括分级分离以产生所述经加工的生物样品。在一些实施方案中，所述分级分离包括利用选自孔恩氏方法、柱色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、离心、过滤、超过滤和冷沉淀中的方法分离高丰度蛋白。在一些实施方案中，富集所述生物样品以产生所述经加工的生物样品包括耗尽一种或多种蛋白质。
在一些实施方案中，在(b)中，一种或多种耗尽纳米颗粒用于产生经加工的生物样品。在一些实施方案中，(b)的所述一种或多种耗尽纳米颗粒与(c)的所述一种或多种纳米颗粒不同。
在一些实施方案中，对所述第一子集进行一种或多种测定，所述测定是ELISA。
在一些实施方案中，所述生物样品是选自以下中的生物流体：血浆、血清、尿液、脑脊髓液、滑液、眼泪、唾液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、汗液、沟液、精液、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、流体化的固体、细针抽吸样品、组织匀浆和细胞培养样品。
在一些实施方案中，所述一种或多种测定产生蛋白质组学数据，并且进一步包括处理所述蛋白质组学数据以预测生物状态。在一些实施方案中，处理所述蛋白质组学数据包括使用经训练的算法，所述经训练的算法是利用独立组的生物样品进行训练。
在一些实施方案中，当与所述一种或多种纳米颗粒一起孵育以形成蛋白质冕时所述第一子集的生物分子与所述一种或多种纳米颗粒相关联。
在一些实施方案中，在(a)之前耗尽所述生物样品。
在一些实施方案中，所述第一子集的生物分子和所述第二子集的生物分子包含蛋白质。
通过引用并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都以相同的程度通过引用并入本文，就如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地指出通过引用的方式并入一样。
附图说明
本专利或申请文件包含至少一幅彩色附图。在请求并且支付必要的费用后，具有一个或多个彩色附图的本专利或专利申请公开的副本将由专利局提供。本公开的新颖特征在所附的权利要求书中具体阐述。通过参考以下阐述其中利用了本发明的原理的说明性实施例以及附图的详细描述，可以更好地理解本发明的特征和优点，所述附图：
图1显示在不同脑脊髓液(“CSF”)样品中鉴定的蛋白质的总数。使一组10个单独的CSF样品与P39接触以产生10种蛋白质冕以供质谱分析法分析。对每个样品计数鉴定的独特蛋白质的总数。
图2A和图2B显示CSF蛋白质冕和血浆/血清蛋白质冕的热图聚类分析，表明两种类型的样品的良好分离，以至观察到CSF和血浆/血清的分离图谱。血清或血浆蛋白质冕的四个样品聚类在热图的左侧四个节点上。所有的CSF蛋白质冕聚类在热图的右侧上。
图3显示与CSF蛋白质冕和血浆蛋白质冕相关联的光谱计数。所示的蛋白质具有与神经病的已知关联性。对于列出的许多蛋白质，血浆蛋白质冕的光谱计数沿着x-轴下降(以红色中空圆示出)。CSF血浆蛋白质冕的光谱计数以实心黑点示出。
图4显示在来源于不同颗粒的CSF蛋白质冕中鉴定的蛋白质的总数。将合并的CSF样品用于所有颗粒。用所有颗粒鉴定了超过1000种独特蛋白质。
图5显示在不同尿样中鉴定的蛋白质的总数。使一组10个单独的尿样(U1至U10)和1个对照血浆样品(PC)与P39相互作用以产生11种蛋白质谱图以供质谱分析。在每个尿样中，在尿液中鉴定的蛋白质的总数都高于在血浆样品中鉴定的蛋白质的总数。
图6A和图6B显示从对来源于颗粒P39、HX42和HX56的蛋白质冕的多路复用测量鉴定出的蛋白质。在此实验中合并的TE缓冲液5×稀释的血浆样品用于颗粒和颗粒组合。图6A显示在不同条件下鉴定的蛋白质的总数。在单个颗粒蛋白质冕(P39、HX42和HX56)的情况下，对于三种颗粒而言，可以分别鉴定出234、303和353种独特蛋白质。当全部颗粒分别运行时，鉴定出总计411种独特蛋白质，如标记有“P39+HX42+HX56”的柱中所示。在颗粒以较高浓度混合(“3NP_8”，最终总NP浓度8mg/mL)和以较低浓度混合(“3NP_3”，最终总NP浓度3mg/mL)的情况下，鉴定出305种和284种独特蛋白质。在消化后混合所有三种蛋白质冕(“3NP_PM”的情况下，鉴定出303种独特蛋白质。图6B显示在颗粒分别运行(“P39+HX42+HX56”)、颗粒混合(“P39+HX42+HX56 NP混合”)与消化后混合(“P39+HX42+HX56消化后混合”)之间的蛋白质的重叠。
图7A显示生物流体中的蛋白质组的宽范围。这表明广泛探询是困难且缓慢的。基于摘录自如Geyer等人，Mol Syst Biol 13,942–15(2017)(通过援引以其整体并入本文中)中所述的血浆蛋白质组项目的从血浆或血清鉴定的蛋白质的浓度排列蛋白质。图7B显示本公开的颗粒生物传感器(列出于X-轴标记和图7B右侧的图例中)能够以深度、广度和效率探询蛋白质组。每个点代表相应颗粒的冕中鉴定的蛋白质以及文献中查到的该蛋白质的血浆浓度。可以在多种不同颗粒类型的蛋白质冕中以宽浓度范围鉴定出蛋白质。颗粒生物传感器在其宽动态范围中(例如，通过测定以约0.001ug/ml至多达几乎105μg/ml的浓度存在的蛋白质)快速地探询蛋白质组。
图8A–图8G说明本文公开的耗尽方法的各种工作流程。图8A说明用颗粒串行探询样品的工作流程。可以利用相同或不同的颗粒类型重复探询样品。图8B说明包括用第一颗粒类型和第二颗粒类型串行探询样品的工作流程。在探询后，对每种颗粒类型的冕进行分析。图8C说明包括用第一颗粒类型、第二颗粒类型和第三颗粒类型串行探询样品的工作流程。在探询后，对每种颗粒类型的冕进行分析。图8D说明包括用第一颗粒类型、第二颗粒类型、第三颗粒类型和第四颗粒类型串行探询样品的工作流程。在探询后，对每种颗粒类型的冕进行分析。图8E说明包括用颗粒类型第一次和第二次串行探询样品的工作流程。在每次探询后，对每种颗粒类型的冕进行分析。图8F说明包括用颗粒类型第一次、第二次和第三次串行探询样品的工作流程。在每次探询后，对每种颗粒类型的冕进行分析。图8G说明包括用颗粒类型第一次、第二次、第三次和第四次串行探询样品的工作流程。在每次探询后，对每种颗粒类型的冕进行分析。
图9显示已用颗粒串行探询的血浆样品的凝胶。用P39颗粒探询样品，提取颗粒，并在凝胶上运行所得的冕(P39冕1)。用P39颗粒第二次和第三次探询上清液，每次都提取颗粒，并所得的冕在凝胶上运行(P39冕2和P39冕3)。然后，用HX-42颗粒探询上清液，提取颗粒，并在凝胶上运行所得的冕(P39和HX-42冕4)。分别地，用HX-42颗粒探询样品，提取颗粒，并在凝胶上运行所得的冕(HX-42冕1)。用HX-42颗粒第二次和第三次探询上清液，每次都提取颗粒，并在凝胶上运行所得的冕(HX-42冕2和HX-42冕3)。然后，用P39颗粒探询上清液，提取颗粒，并在凝胶上运行所得的冕(HX-42和P39冕4)。用8M尿素处理分离的颗粒以便从颗粒释放要在凝胶上运行的蛋白质。用8M尿素(HP1尿素)变性的血浆作为对照运行。
图10显示基于凝胶图像来源于未被耗尽的和被耗尽的血浆的蛋白质冕具有与颗粒结合的不同蛋白质。用P39颗粒探询未被耗尽的或被耗尽的血浆样品，并且测定蛋白质冕。红色箭头指示来源于未被耗尽的血浆样品相比于被耗尽的血浆样品的蛋白质冕中有差异的蛋白质(以条带示例)。用8M尿素处理颗粒以从颗粒释放要在凝胶上运行的蛋白质。
图11显示用九种不同颗粒测定的单个滑液(SF)样品的冕分析实验结果。具体的颗粒处理示于x-轴上。还使用尚未与颗粒接触的滑液(“纯SF”)作为对照进行冕分析(“Proteograph”)测定。还绘制了通过所有九种颗粒鉴定的独特蛋白质的数量(“所有NP”)。
图12显示用颗粒测定的两种类型的样品的冕分析实验结果。使用1mL注射器和25G针制备细针抽吸(FNA)样品。在冕分析之前，用哺乳动物蛋白质提取试剂(M-PER)对FNA样品进行细胞溶解并用缓冲液将其交换至TE缓冲液中。由于FNA提供的小质量，单种颗粒(P-039)用于评估FNA-冕。在冕分析之前，也用M-PER对组织样品进行细胞溶解并用缓冲液将其交换至TE缓冲液中。将100μL组织样品与100μL颗粒一起孵育以形成组织-颗粒冕。在Orbitrap Lumos仪器上以1小时液相色谱(LC)梯度运行肽。还对作为对照的尚未与颗粒接触的纯组织样品(“纯组织”)进行了冕分析。
图13显示用颗粒测定的匹配成对的血浆和血清样品的冕分析实验结果。测试了5×稀释的血浆和血清(分别“血浆5×”和“血清5×”)和未稀释的血浆和血清(分别“未稀释的血浆”和“未稀释的血清”)。每种颗粒处理的棒从左向右对应于血浆5×、纯血浆、血清5×、纯血清和被耗尽的血浆。此外，将血浆样品的试样用IgY14和Supermix柱进行深度耗尽并且用纯样品和稀释的样品进行测试。在单独的孔中用七种颗粒的每种测定每种样品。还对一组无颗粒的样品(“无NP”)作为对照进行测试。
图14显示比较在EDTA血液收集管(“EDTA”)中收集的血液样品与Streck血液收集管(“STRECK”)中收集的样品的实验结果。Streck样品处理被设计为模拟在环境温度下样品的过夜运输。对从三位患者(#1、#2和#3)收集的血液样品进行回收肽质量分析。在有颗粒(“P39冕”)和无颗粒(“纯血浆”)的情况下测定每个样品。棒高度指示在每个样品中回收的平均蛋白质量。未观察到EDTA与STRECK血浆冕之间肽产量的差异。
图15显示通过对图14中测定的样品进行的冕分析实验鉴定的蛋白质的平均数量。棒高度指示在每个样品中鉴定的蛋白质的平均数量。未观察到EDTA与STRECK血浆冕之间鉴定的蛋白质数量的差异。
图16显示通过对图14-图15中测定的样品进行的冕分析实验检测的肽的平均数量。棒高度指示在每个样品中鉴定的肽的平均数量。未观察到EDTA与STRECK血浆冕之间鉴定的肽数的差异。
图17显示通过对图14-图16中测定的样品进行的冕分析实验鉴定的特征的平均数量。棒高度指示在每个样品中鉴定的特征的平均数量。未观察到EDTA与STRECK血浆冕之间的特征数量的差异。
图18显示图14-图17中所示的实验结果的总结。圆圈代表在所示的条件下在每个样品中鉴定的蛋白质。圆圈的重叠区指示在相应的EDTA样品和Streck样品二者中鉴定的蛋白质。圆圈的非重叠区指示在相应的条件下测定的仅EDTA样品或仅Streck样品中鉴定的蛋白质。在每对中朝向左的圆圈代表EDTA样品，而在每对中朝向右的圆圈代表Streck样品。
图19显示在图14-图18中测定的每个患者样品中通过冕分析鉴定的所选蛋白质类型的各个蛋白质的数量。绘制了在三位患者样品的每个中在用颗粒测定的仅Streck样品(“Streck”)或用颗粒测定的仅EDTA样品(“EDTA”)中鉴定的所选蛋白质类型的蛋白质数量。还绘制了在三位患者样品的每个中在用颗粒测定的Streck样品和用颗粒测定的EDTA样品二者中鉴定的所选蛋白质类型的蛋白质数量(“重叠”)。
图20显示在图14-图19中测定的每个样品的蛋白质群组强度的分布。
图21显示在图14-图20中测定的每个样品的蛋白质群组强度的变异系数百分比(％CV)。
图22A和图22B显示在图14-图21中在颗粒存在下测定的每个样品中鉴定的共同和独特蛋白质的数量。每个圆圈的重叠区中的数值指示在每个样品中鉴定的由重叠圆圈表示的蛋白质。图22A显示在EDTA血液收集管中收集的每个患者样品中鉴定的共同和独特蛋白质的数量，而图22B显示在Streck血液收集管中收集的每个患者样品中鉴定的共同和独特蛋白质的数量。
图23显示在图14-图22中测定的每个样品的蛋白质组强度的变异系数(CV)，如图21中绘制的。
图24显示在图14-图23中在Streck血液收集管和EDT血液收集管二者中收集的样品中鉴定的共同蛋白质群组的强度的图。Streck样品的蛋白质组强度绘制于x-轴上。EDTA样品的蛋白质组强度绘制于y-轴上。针对在存在(左图，“类型＝P39冕”)或不存在(右图，“类型＝纯血浆”)颗粒下测定的每个样品绘制了患者样品#1(上图)、#2(中间图)和#3(下图)的蛋白质群组强度。在每个图的右下角中提供线性拟合的R2值(“Rsq”)。
图25A和图25B显示在图14-图24中在Streck血液收集管和EDT血液收集管二者中收集的样品中鉴定的蛋白质组的数量。图25A显示在每个样品中鉴定的包含至少一种血浆蛋白质的蛋白质组的数量。图25B显示在每个样品中鉴定的不包含在每个样品中鉴定的至少一种血浆蛋白质的蛋白质群组的数量。蛋白质分类为血浆蛋白质是基于由Keshishian等人(Mol.Cell Proteomics 14,2375–2393(2015))鉴定的5,304种血浆蛋白质的集合，其通过引用整体并入本文中。
图26显示在收集于EDTA样品收集管(“EDTA”)或Streck样品收集管(“Streck”)中的生物样品中在实验上鉴定的蛋白质的重叠。
图27显示在收集于EDTA样品收集管中的样品和收集于Streck样品收集管中的样品中鉴定的蛋白质的平均蛋白质群组强度。针对Carr血浆蛋白质组数据库中存在的蛋白质以及在收集于EDTA样品收集管中的样品(y-轴)和收集于Streck样品收集管中的样品(x-轴)二者中都鉴定出的蛋白质绘制蛋白质群组强度。
图28A和图28B显示在图27中鉴定的115个蛋白质群组之间的斯皮尔曼(图28A)和皮尔森(图28B)相关系数。
图29显示被编程为或以其他方式被配置为实施本文中提供的方法的计算机系统。
图30A-图30C显示在收集于EDT血液收集管中的血浆样品(x-轴)与收集于Streck样品收集管中的血浆样品(y-轴)之间通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量的三种蛋白质浓度的相关性。图30A显示C-反应性蛋白质(CRP)的相关性。图30B显示钙粒蛋白A和B异二聚体(“S100”)的相关性。图30C显示MUC16/CA125(“CA125”)的相关性。
图31显示在收集于EDT血液收集管或Streck血液收集管中的血浆样品中通过ELISA检测的蛋白质浓度的CRP(左侧两个方框和触须线)、S100(中间两个方框和触须线)和CA125(右侧两个方框和触须线)的变异系数百分比(％CV)。
图32显示对于CRP(左图)、S100(中间图)和CA125(右图)，在收集于EDT血液收集管或Streck血液收集管中的样品中通过ELISA检测的蛋白质浓度的匹配配对差异。
图33图示说明加工收集于EDTA样品收集管(左侧)或包含核酸稳定剂的样品收集管(右侧)中的生物样品的方法的实例。
图34显示颗粒冕蛋白质和血浆蛋白质的最大强度与相同蛋白质的公布浓度之间的相关性。蓝色绘制线是数据的线性回归模型，阴影区表示该模型拟合的标准误差。用颗粒(“S-003”、“S-007”和“S-011”)测定的样品的动态范围表现出相比于未用颗粒测定的血浆样品(“血浆”)的压缩的动态范围，如线性拟合的斜率降低所示。对于无颗粒的血浆、具有S-003颗粒的血浆、具有S-007颗粒的血浆和具有S-011颗粒的血浆，每个图的斜率分别为0.47、0.19、0.22和0.18。
图35显示相比于在未形成颗粒冕的情况下的质谱分析法，用质谱分析法进行的蛋白质冕分析的动态范围压缩。相对于通过无颗粒的血浆的质谱分析法鉴定的蛋白质强度(“血浆MS ln强度”)绘制了在图34中测定的血浆样品中在颗粒冕中鉴定的共同蛋白质的蛋白质强度(“纳米颗粒MS ln强度”)。最浅的虚线显示斜率1，表示在无颗粒的情况下质谱分析法的动态范围。对于S-003、S-007和S-011颗粒，针对蛋白质强度的线性拟合的斜率分别为0.12、0.36和0.093。灰色区域指示回归拟合的标准误差区。
具体实施方式
本文中提供了可以与各种生物样品一起孵育的颗粒的组合物。各种颗粒类型单独地或组合地可以与各种各样的生物样品一起孵育以基于与颗粒表面结合形成蛋白质冕分析所述生物样品中存在的蛋白质。单个颗粒类型可以用于测定特定生物样品中的蛋白质，或者多个颗粒类型可以一起用于测定生物样品中的蛋白质。可以通过使生物样品与多个颗粒接触，将生物样品与多个颗粒一起孵育以形成蛋白质冕，将颗粒与生物样品分离，并且分析蛋白质冕以确定蛋白质冕的组成来对生物样品(例如，生物流体)进行蛋白质冕分析。在一些实施方案中，分析蛋白质冕是利用质谱分析法进行。在本文中用多个颗粒探询样品之后分析在多个颗粒上形成的蛋白质冕可以被称为“蛋白质冕分析”。可以利用一个或多个颗粒类型探询生物样品。可以对每个颗粒类型的蛋白质冕进行单独分析。在一些实施方案中，可以对一个或多个颗粒类型的蛋白质冕进行组合分析。
本公开提供了可以利用本文公开的颗粒和本文提供的方法测定的若干生物样品。例如，生物样品可以是生物流体样品，诸如脑脊髓液(CSF)、滑液(SF)、尿液、血浆、血清、眼泪、沟液、精液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、汗液或唾液。生物流体可以是流体化的固体，例如组织匀浆，或者从生物样品提取的流体。生物样品可以是，例如，组织样品或细针抽吸(FNA)样品。在一些实施方案中，生物样品可以是细胞培养样品。在一些实施方案中，生物流体是流体化的生物样品。例如，生物流体可以是流体化的细胞培养提取物。
本文中还提供了耗尽高丰度蛋白的样品的方法以及用于该方法的组合物。在一些实施方案中，耗尽可以包括使用一种或多种颗粒来耗尽生物样品的高丰度蛋白(例如，生物流体)。用颗粒耗尽样品可以包括用一个或多个颗粒类型(例如，具有独特的材料组成的颗粒)一轮或多轮地耗尽样品。在其他情况中，去血浆法试剂盒、柱、色谱法、离心或其他系统可以用于耗尽生物样品的高丰度蛋白。如本文中公开的，这些耗尽方法中的任一种都可以后随通过使用本文公开的各种颗粒类型串行探询样品以及对各种颗粒类型的冕分析。
本公开的示例性工作流程示于图8A-图8G中。图8A示出用颗粒串行探询样品的工作流程。可以利用相同或不同的颗粒类型重复地探询样品(例如，生物样品)。任选地，在串行探询之前，可以耗尽或分级分离样品。使用相同颗粒类型或不同颗粒类型探询样品可以重复2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多次。在一些实施方案中，任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种以上颗粒类型可以是相同的颗粒类型。在一些实施方案中，任何2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20种以上颗粒类型可以是不同的颗粒类型。通过将样品与颗粒一起孵育以在颗粒上形成生物分子冕，可以用颗粒类型探询样品。在用颗粒类型探询样品之后，可以将包含生物分子冕的颗粒与样品分离(例如，利用磁性分离、离心、过滤或重力分离)。可以对分离的颗粒上的生物分子冕(例如，通过质谱分析法、凝胶电泳、色谱法、光谱法或免疫测定)进行分析。相比于总蛋白分析方法，对生物分子冕的蛋白质冕分析可以压缩该分析的动态范围。
图8B中提供了工作流程的第一实例。图8B图示说明包括用第一颗粒类型和第二颗粒类型串行探询样品的工作流程。第一颗粒类型可以是选自表1的颗粒。第二颗粒类型可以是选自表1的颗粒。在探询后，对每种颗粒类型的冕进行分析。任选地，在探询之前，耗尽或分级分离样品。
图8B中提供了工作流程的第二实例。图8C图示说明包括用第一颗粒类型、第二颗粒类型和第三颗粒类型串行探询样品的工作流程。第一颗粒类型可以是选自表1的颗粒。第二颗粒类型可以是选自表1的颗粒。第三颗粒类型可以是选自表1的颗粒。在探询后，对每种颗粒类型的冕进行分析。任选地，在探询之前，耗尽或分级分离样品。
图8B中提供了工作流程的第三实例。图8D图示说明包括用第一颗粒类型、第二颗粒类型、第三颗粒类型和第四颗粒类型串行探询样品的工作流程。第一颗粒类型可以是选自表1的颗粒。第二颗粒类型可以是选自表1的颗粒。第三颗粒类型可以是选自表1的颗粒。第四颗粒类型可以是选自表1的颗粒。在探询后，对每种颗粒类型的冕进行分析。任选地，在探询之前，耗尽或分级分离样品。
图8B中提供了工作流程的第四实例。图8E图示说明包括用颗粒类型第一次和第二次串行探询样品的工作流程。颗粒类型可以是选自表1的颗粒。在每次探询后，对颗粒类型的冕进行分析。任选地，在探询之前，耗尽或分级分离样品。
图8B中提供了工作流程的第五实例。图8F图示说明包括用颗粒类型第一次、第二次和第三次串行探询样品的工作流程。颗粒类型可以是选自表1的颗粒。在每次探询后，对颗粒类型的冕进行分析。任选地，在探询之前，耗尽或分级分离样品。
图8B中提供了工作流程的第六实例。图8G图示说明包括用颗粒类型第一次、第二次、第三次和第四次串行探询样品的工作流程。颗粒类型可以是选自表1的颗粒。在每次探询后，对颗粒类型的冕进行分析。
虽然在图8B-图8G中提供了工作流程的实例，样品的串行探询可以用任何数量或类型的颗粒类型进行任何次数。串行探询可以用相同颗粒类型和不同颗粒类型的组合以任何顺序进行。
本公开还提供用于分级分离生物样品例如生物流体的方法和组合物。可以通过相继地使流体或流体的上清液与不同类型的颗粒接触而使生物流体分离成级分。生物流体可以接触第一颗粒类型，并且(例如，通过离心或磁性分离)可以将第一颗粒类型连同与第一颗粒类型结合的任何生物分子(例如，蛋白质)一起与生物样品分离。分离的第一颗粒类型和结合的生物分子可以构成第一级分。可以使剩余的生物流体(例如，上清液)与第二颗粒类型接触，并且可以将第二颗粒类型连同与第二颗粒类型结合的任何生物分子一起与生物样品分离。可以用额外的颗粒类型重复此过程，从而分级分离生物流体。在一些实施方案中，可以利用色谱法、离心、沉淀、电泳或任何其他生物化学分离方法分级分离生物样品。在分级分离样品之后，可以利用用各种颗粒类型串行探询的方法测定样品的蛋白质，如本文公开的。
本文公开的颗粒、组合物和方法与各种样品收集和稳定化方法和组合物相容。可以对稳定化的生物样品进行本文提供的蛋白质冕分析方法。稳定化的生物样品可以包括已经用稳定剂(例如，防腐剂)处理的生物样品(例如，生物流体)。在一些实施方案中，生物样品可以用维持细胞抗原表达的液体防腐剂进行处理。稳定剂可以被包含于样品收集容器(例如，血液收集管)内。可以利用本文公开的任何颗粒、组合物或方法对稳定化的生物样品进行蛋白质冕分析。在一些实施方案中，在蛋白质冕分析之前，可以不冷藏存储稳定化的生物样品。
颗粒类型
与本文公开的方法相一致的颗粒类型可以由各种材料制成。例如，与本公开相一致的颗粒材料包括金属、聚合物、磁性材料和脂质。磁性颗粒可以是铁氧化物颗粒。金属材料的实例包括金、银、铜、镍、钴、钯、铂、铱、锇、铑、钌、铼、钒、铬、锰、铌、钼、钨、钽、铁和镉中的任何一种或任何组合，或US7749299中描述的任何其他材料。在一些实施方案中，颗粒可以是超顺磁性铁氧化物纳米颗粒(SPION)。
聚合物的实例包括如下任何一种或任何组合：聚乙烯、聚碳酸酯、聚酸酐、聚羟基酸、聚富马酸丙酯、聚己内酯、聚酰胺、聚缩醛、聚醚、聚酯、聚(原酸酯)、聚氰基丙烯酸酯、聚乙烯醇、聚氨酯、聚磷腈、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、聚氰基丙烯酸酯、聚脲、聚苯乙烯或聚胺、聚亚烷基二醇(例如聚乙二醇(PEG))、聚酯(例如聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)、聚乳酸或聚己内酯)、聚苯乙烯、或两种或更多种聚合物的共聚物，例如聚亚烷基二醇(例如，PEG)和聚酯(例如PLGA)的共聚物。在一些实施方案中，聚合物是脂质封端的聚亚烷基二醇和聚酯，或US9549901中公开的任何其他材料。
可用于形成本公开的颗粒的脂质的示例包括阳离子、阴离子和带中性电荷的脂质。例如，颗粒可以由以下中的任一种或以下中的任何组合制成：二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇、脑苷脂和二酰基甘油、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、和二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺、赖氨酰磷脂酰甘油、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、卵磷脂、溶血卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰乙醇胺、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷脂乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、16-O-一甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)、1-硬脂酰-2-油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、双十六烷基磷酸和胆固醇，或US9445994(其通过引用整体并入本文)中列出的任何其他材料。
表1中提供了本公开的颗粒的实例。
表1-本公开的颗粒的实例
Figure BDA0003375593420000271
Figure BDA0003375593420000281
本公开的颗粒可以是合成的，或者本公开的颗粒可以购自商业供应商。例如，与本公开相一致的颗粒可以购自商业供应商，包括Sigma-Aldrich、Life Technologies、FisherBiosciences、nanoComposix、Nanopartz、Spherotech及其他商业供应商。在一些实施方案中，本公开的颗粒可以购自商业供应商，并进一步被修饰、涂覆或官能化。
与本公开相一致的颗粒可被制备并用于在生物流体中以宽范围的尺寸孵育后形成蛋白质冕的方法中。在一些实施方案中，本公开的颗粒可以是纳米颗粒。在一些实施方案中，本公开的纳米颗粒的直径可以是约10nm至约1000nm。例如，本文公开的纳米颗粒的直径可以是至少10nm、至少100nm、至少200nm、至少300nm、至少400nm、至少500nm、至少600nm、至少700nm、至少800nm、至少900nm、10nm至50nm、50nm至100nm、100nm至150nm、150nm至200nm、200nm至250nm、250nm至300nm、300nm至350nm、350nm至400nm、400nm至450nm、450nm至500nm、500nm至550nm、550nm至600nm、600nm至650nm、650nm至700nm、700nm至750nm、750nm至800nm、800nm至850nm、850nm至900nm、100nm至300nm、150nm至350nm、200nm至400nm、250nm至450nm、300nm至500nm、350nm至550nm、400nm至600nm、450nm至650nm、500nm至700nm、550nm至750nm、600nm至800nm、650nm至850nm、700nm至900nm或10nm至900nm。在一些实施方案中，纳米颗粒的直径可以是小于1000nm。
在一些实施方案中，本公开的颗粒可以是微粒。微粒可以是直径为约1μm至约1000μm的颗粒。例如，本文公开的微粒可以是直径至少1μm、至少10μm、至少100μm、至少200μm、至少300μm、至少400μm、至少500μm、至少600μm、至少700μm、至少800μm、至少900μm、10μm至50μm、50μm至100μm、100μm至150μm、150μm至200μm、200μm至250μm、250μm至300μm、300μm至350μm、350μm至400μm、400μm至450μm、450μm至500μm、500μm至550μm、550μm至600μm、600μm至650μm、650μm至700μm、700μm至750μm、750μm至800μm、800μm至850μm、850μm至900μm、100μm至300μm、150μm至350μm、200μm至400μm、250μm至450μm、300μm至500μm、350μm至550μm、400μm至600μm、450μm至650μm、500μm至700μm、550μm至750μm、600μm至800μm、650μm至850μm、700μm至900μm，或者10μm至900μm。在一些实施方案中，微粒的直径可以是小于1000μm。
本公开的颗粒可以与生物样品(例如，生物流体)接触以形成生物分子冕。颗粒和生物分子冕可以通过例如离心、磁性分离、过滤或重力分离而与生物样品分离。颗粒类型和生物分子冕可以通过利用多种分离技术而与生物样品分离。分离技术的非限制性实例包括磁性分离、基于柱的分离、过滤、基于离心柱的分离、离心、超离心、基于密度或梯度的离心、重力分离或其任何组合。可以对分离的颗粒和生物分子冕进行蛋白质冕分析。蛋白质冕分析可以包括通过例如质谱分析法鉴定生物分子冕中的一种或多种蛋白质。在一些实施方案中，单个颗粒类型(例如，表1中列出的颗粒类型)可以与生物样品接触。在一些实施方案中，多个颗粒类型(例如，表1中提供的多个颗粒类型)可以与生物样品接触。多个颗粒类型可以被组合并且与单个样品体积的生物样品接触。多个颗粒类型可以相继地与生物样品接触，并且在使后续颗粒类型接触生物样品之前与生物样品分离。与总蛋白分析方法相比，生物分子冕的蛋白质冕分析可以压缩该分析的动态范围。
本公开的颗粒可以用于串行探询样品，通过将第一颗粒类型与样品一起孵育以在第一颗粒类型上形成生物分子冕，分离第一颗粒类型，将第二颗粒类型与样品一起孵育以在第二颗粒类型上形成生物分子冕，分离第二颗粒类型，并且对于任何数量的颗粒类型(通过与样品一起孵育)重复探询和分离。在一些实施方案中，可以通过蛋白质冕分析对用于串行探询样品的每种颗粒类型上的生物分子冕进行分析。在一些实施方案中，在用一个或多个颗粒类型串行探询之后可以对上清液的生物分子含量进行分析。
在一些实施方案中，本公开的颗粒类型可以用于串行探询样品，然后对在颗粒类型和样品一起孵育时形成的蛋白质冕中的蛋白质进行冕分析。可以用两种颗粒类型以逐轮的方式进行串行探询。串行探询还可以包括用额外颗粒多次进行后续探询。在一些实施方案中，本公开的颗粒可以在上述串行探询方法之前用于耗尽样品。颗粒类型可以接触样品以在颗粒类型的表面上形成生物分子冕，并且颗粒可以与样品分离，从而耗尽样品。此策略可以用于从样品中耗尽一种或多种蛋白质(例如，一种或多种高丰度蛋白)。在一些实施方案中，可以对被耗尽的样品的上清液的生物分子含量分析。在一些实施方案中，被耗尽的样品的上清液可以用于本文公开的任何蛋白质冕分析方法中。
本公开的颗粒类型的实例可以是羧酸盐(柠檬酸盐)超顺磁性铁氧化物纳米颗粒(SPION)、苯酚-甲醛涂覆的SPION、二氧化硅-涂覆的SPION、聚苯乙烯涂覆的SPION、羧化聚(苯乙烯-共-甲基丙烯酸)涂覆的SPION、N-(3-三甲氧基甲硅烷基丙基)二亚乙基三胺涂覆的SPION、聚(N-(3-(二甲基氨基)丙基)甲基丙烯酰胺)(PDMAPMA)-涂覆的SPION、1,2,4,5-苯四甲酸涂覆的SPION、聚(氯化乙烯基苄基三甲基铵)(PVBTMAC)涂覆的SPION、羧酸盐、PAA涂覆的SPION、聚(低聚(乙二醇)甲基醚甲基丙烯酸酯)(POEGMA)-涂覆的SPION、羧酸盐微粒、羧基官能化的聚苯乙烯颗粒、羧酸涂覆的颗粒、二氧化硅颗粒、直径约150nm的羧酸颗粒、直径约0.4-0.6μm的氨基表面微粒、直径约0.1-0.39μm的二氧化硅氨基官能化的微粒、直径约0.1-0.39μm的Jeffamine表面颗粒、直径约2.0-2.9μm的聚苯乙烯微粒、二氧化硅颗粒、直径约50nm的具有原始涂层的羧化颗粒、直径约0.13μm的葡聚糖基涂料涂覆的颗粒或低酸性的二氧化硅硅醇涂覆的颗粒。
样品收集和提取方法
可以根据本公开的方法和组合物对各种样品进行测定。在用各种颗粒类型串行探询样品之后可以对本文公开的样品进行蛋白质冕分析。在一些实施方案中，在蛋白质冕分析之前，可以分级分离样品。在一些实施方案中，在蛋白质冕分析之前，可以耗尽样品。在一些实施方案中，本公开的方法可以包括使样品与一个或多个颗粒类型接触以及对样品进行蛋白质冕分析。
样品可以是生物样品。例如，生物样品可以是生物流体样品，例如脑脊髓液(CSF)、滑液(SF)、尿液、血浆、血清、眼泪、沟液、精液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、汗液或唾液。生物流体可以是流体化的固体、例如组织匀浆或从生物样品提取的流体。生物样品可以是，例如，组织样品或细针抽吸(FNA)样品。在一些实施方案中，生物样品可以是细胞培养样品。例如，可用于本文公开的方法中的样品可以包括细胞培养中生长的细胞，或可以包括从细胞培养获取的无细胞材料。在一些实施方案中，生物流体是流体化的生物样品。例如，生物流体可以是流体化的细胞培养提取物。在一些实施方案中，样品可以提取自流体样品，或者样品可以提取自固体样品。例如，样品可以包含从流体化的固体提取的气态分子(例如，挥发性有机化合物)。
本文所述的蛋白质冕分析方法可以包括在整个宽动态范围测定本公开的样品中的蛋白质。在样品中测定的蛋白质的动态范围可以是通过用于样品内含有的蛋白质的测定方法(例如，质谱分析法、色谱法、凝胶电泳、光谱法或免疫测定)测量的蛋白质丰度的测得信号的范围。例如，能够在整个宽动态范围检测蛋白质的测定可以能够检测极低丰度蛋白至极高丰度蛋白。测定的动态范围可以与作为蛋白质丰度的函数的测定信号强度的斜率直接相关。例如，具有低动态范围的测定可以具有作为蛋白质丰度的函数的测定信号强度的低(但是正)斜率，例如，对于具有低动态范围的测定而言，对高丰度蛋白检测到的信号的比率到对低丰度蛋白检测到的信号的比率可能比具有高动态范围的测定低。本文所述的蛋白质冕分析方法可以压缩测定的动态范围。如果作为蛋白质丰度的函数的测定信号强度的斜率比另一测定的斜率低，则可以相对于另一测定压缩测定的动态范围。例如，与直接在样品上单独使用质谱分析法测定的血浆样品相比，或者与数据库中(例如，在Keshishian等人，Mol.Cell Proteomics 14,2375–2393(2015)中提供的数据库，本文中也称为“Carr数据库”)提供的血浆蛋白质的丰度值相比，利用蛋白质冕分析以及质谱分析法测定的血浆样品可以具有压缩的动态范围，如图34和图35中所示。与单独使用质谱分析法相比，压缩的动态范围可以实现利用蛋白质冕分析以及质谱分析法检测血浆样品中更低丰度蛋白质。
测定的动态范围的压缩可以实现利用本文公开的方法(例如，用颗粒串行探询，随后进行用于定量蛋白质丰度的测定例如质谱分析法)检测低丰度蛋白。例如，测定(例如，质谱分析法)可以能够检测3个数量级的动态范围。在包含5种蛋白质A、B、C、D和E(丰度分别为1ng/mL、10ng/mL、100ng/mL、1,000ng/mL和10,000ng/mL)的样品中，该测定(例如，质谱分析法)可以检测到蛋白质B、C、D和E。但是，通过使用本文公开的方法将样品与颗粒一起孵育，蛋白质A、B、C、D和E可具有针对颗粒表面不同的亲和性并且可以吸附于颗粒的表面从而在与样品中存在的丰度不同的丰度下形成生物分子冕。例如，蛋白质A、B、C、D和E可以分别以1ng/mL、231ng/mL、463ng/mL、694ng/mL和926ng/mL的丰度存在于生物分子冕中。因此，在探询样品的方法中使用本文公开的颗粒导致将动态范围压缩至2个数量级，并且所得的测定(例如，质谱分析法)可以检测所有五种蛋白质。
通过利用本公开的方法和组合物可以并行地处理多种生物流体。通过对多个生物样品同时进行蛋白质冕分析测定的每一步骤，可以对多个生物样品并行地进行蛋白质冕分析。例如，通过对多个生物样品同时进行蛋白质冕分析的第一步骤，对多个生物样品同时进行蛋白质冕分析的第二步骤，以及对多个生物样品同时进行蛋白质冕分析的第三步骤，可以对多个生物样品并行地进行蛋白质冕分析。可以重复对多个生物样品同时进行蛋白质冕分析的每一步骤，直至已经对多个生物样品进行蛋白质冕分析的所有步骤。在一些情况中，可以从同一受试者获得多个生物样品。这些样品可以是从受试者获得的样品的部分(例如，血浆样品的多个试样)。这些样品可以是从同一受试者收集的不同生物流体。
在一些实施方案中，通过对多个生物样品中的每个样品相继地进行蛋白质冕分析的第一步骤，对多个生物样品中的每个样品相继地进行蛋白质冕分析的第二步骤，以及对多个生物样品中的每个样品相继地进行蛋白质冕分析的第三步骤，可以对多个生物样品并行地进行蛋白质冕分析。可以重复可以对多个生物样品中的每个样品相继地进行蛋白质冕分析的每一步骤，直至已经对多个生物样品中的每个生物样品进行蛋白质冕分析的所有步骤。
相对于未经处理的样品(例如，未用颗粒测定的样品)，感兴趣的蛋白质(例如，低丰度蛋白)可以富集在生物分子冕中。在一些实施方案中，与未经处理的样品相比，富集的水平可以是，相对于生物分子冕中的总蛋白质浓度，感兴趣的蛋白质的浓度的百分比增高或成倍增高。与尚未与颗粒接触的样品相比，可以通过增大生物分子冕中的感兴趣的蛋白质的浓度而在生物分子冕中富集感兴趣的蛋白质。与尚未与颗粒接触的样品相比，可以通过降低生物分子冕中的高丰度蛋白的浓度而在生物分子冕中富集感兴趣的蛋白质。蛋白质冕分析可以用于快速地鉴定生物样品(例如，生物流体)中的低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使生物样品与颗粒接触起不超过约8小时内鉴定生物样品中的至少约500种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使生物样品与颗粒接触起不超过约8小时内鉴定生物样品中的至少约1000种低丰度蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使生物样品与颗粒接触起不超过约4小时内鉴定生物样品中的至少约500种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使生物样品与颗粒接触起不超过约4小时内鉴定生物样品中的至少约1000种低丰度蛋白。
生物样品可以被收集于包含稳定剂的样品收集管中。稳定剂可以使生物流体样品中的有核细胞或生物流体样品中的其他生物分子例如蛋白质或核酸(例如，RNA或DNA，包括无细胞RNA或DNA)稳定。在一些实施方案中，样品收集管可以包含代谢抑制剂、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、核酸酶抑制剂、防腐剂、聚酰胺或其组合。代谢抑制剂可以包括甘油醛、二羟丙酮磷酸、甘油醛3-磷酸、1,3-二磷酸甘油酸、3-磷酸甘油酸酯、2-磷酸甘油酸酯、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸和甘油酸二羟基乙酸、氟化钠或K2C2O4。蛋白酶抑制剂可以包括抗痛素、抑肽酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、苯甲基磺酰氟(PMSF)、APMSF、TLCK、TPCK、亮抑酶肽、大豆胰蛋白酶抑制剂、吲哚乙酸(IAA)、E-64、EDTA、胃酶抑素、VdLPFFVdL、1,10-邻二氮杂菲、膦酰二肽(phosphoramodon)、氨肽酶抑制剂、苯丁抑制素、抑二肽素A、抑二肽素B、α-2-巨球蛋白、利马豆胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂或蛋清卵固蛋白蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制剂。磷酸酶抑制剂可以包括花萼海绵诱癌素A、节球藻毒素、NIPP-1、微囊藻素LR、变构霉素、冈田酸、斑蝥素、微囊藻素LR、冈田酸、福司曲星、变构霉素、斑蝥素、草藻灭、节球藻毒素、环孢菌素A、FK 506/免疫亲和素复合物、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、bpV(phen)、脱磷素(dephostatin)、mpV(pic)DMHV或原钒酸钠。核酸酶抑制剂可以包括焦碳酸二乙酯、乙醇、金精三羧酸(ATA)、甲酰胺、氧钒核糖核苷复合物、硅藻土、乙二胺四乙酸(EDTA)、蛋白酶K、肝素、羟胺-氧-铜离子、皂土、硫酸铵、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫赤藓醇、三(2-羧乙基)磷杂环戊二烯盐酸盐或二价阳离子例如Mg+2、Mn+2、Zn+2、Fe+2、Ca+2或Cu+2。防腐剂可以包括重氮烷基脲、咪唑烷基脲、二羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲、二羟甲基脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、噁唑烷、羟甲基甘氨酸钠、5-羟基甲氧基甲基-1-1氮杂3,7-二氧杂双环[3.3.0]辛烷、5-羟甲基-1-1氮杂3,7二氧杂双环[3.3.0]辛烷、5-羟基聚[亚甲基氧基]甲基-1-1氮杂3,7二氧杂双环[3.3.0]辛烷或金刚烷季铵盐。样品收集管可以包含美国专利号：8,304,187、8,586,306、9,657,227、9,926,590、10,144,955和10,294,513以及美国申请号16/377,344中公开的稳定剂，它们各自通过引用整体并入本文中，以及其他蛋白质分离技术。
脑脊髓液(CSF)样品.本公开提供通过利用本文公开的一种或多种颗粒(例如，表1中公开的一种或多种颗粒)来测定脑脊髓液样品中的蛋白质的方法。CSF中相对低丰度蛋白可以使采用传统方法(例如，ELISA、免疫荧光法、凝胶电泳或色谱法)的蛋白质检测混淆。本文公开的方法和组合物可以非常适合用于检测具有低蛋白质浓度的样品中的蛋白质。例如，本文公开的蛋白质冕分析可以能够检测具有不超过约1.0mg/mL、不超过约0.9mg/mL、不超过约0.8mg/mL、不超过约0.7mg/mL、不超过约0.6mg/mL、不超过约0.5mg/mL、不超过约0.4mg/mL、不超过约0.3mg/mL、不超过约0.2mg/mL或不超过约0.1mg/mL总蛋白质浓度的样品中的蛋白质。
CSF的样品收集体积可能较小，约1mL至约10mL，限制了每个样品可进行测定的数量。本文公开的方法和组合物可以非常适合用于检测小体积样品中的蛋白质。例如，本文公开的蛋白质冕分析可以能够检测不超过约1000μL、不超过约900μL、不超过约800μL、不超过约700μL、不超过约600μL、不超过约500μL、不超过约400μL、不超过约300μL、不超过约200μL、不超过约100μL、不超过约50μL、不超过约20μL、不超过约10μL、不超过约5μL、不超过约2μL或不超过约1μL样品体积中的蛋白质。
蛋白质冕分析可以用于快速地鉴定CSF样品中的低丰度蛋白。蛋白质冕分析可以在从第一次使CSF样品与颗粒接触起不超过约2小时、不超过约2.5小时、不超过约3小时、不超过约3.5小时、不超过约4小时、不超过约4.5小时、不超过约5小时、不超过约5.5小时、不超过约6小时、不超过约6.5小时、不超过约7小时、不超过约7.5小时、不超过约8小时、不超过约8.5小时、不超过约9小时、不超过约9.5小时或不超过约10小时内鉴定CSF样品中的低丰度蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使生物样品与颗粒接触起不超过约8小时内鉴定CSF样品中的至少约500种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使CSF样品与颗粒接触起不超过约8小时内鉴定CSF样品中的至少约1000种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使CSF样品与颗粒接触起不超过约4小时内鉴定CSF样品中的至少约500种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使CSF样品与颗粒接触起不超过约4小时内鉴定CSF样品中的至少约1000种低丰度蛋白。
本文公开的方法优异于测定CSF中的蛋白质的其他方法，并且在短时间段中在整个宽动态范围提供对CSF中的蛋白质的取样。在一些实施方案中，本文公开的方法利用一种或多种颗粒快速地富集CSF样品中的蛋白质。例如，在一些实施方案中，本文公开的一个或多个颗粒类型可以用于测定CSF样品中的感兴趣的蛋白质(高丰度蛋白、中等丰度蛋白质或低丰度蛋白)的方法中，该方法包括将一个或多个颗粒类型在CSF样品中孵育以允许在颗粒上形成生物分子冕并且富集CSF样品中的蛋白质，将颗粒(例如，通过磁性分离)与CSF样品中的未结合的生物分子分离，以及进行胰蛋白酶解并针对感兴趣的蛋白质分析冕中的生物分子。另外，使用所述方法允许感兴趣的蛋白质有效富集于围绕颗粒类型形成的生物分子冕中。相对于尚未与颗粒接触的CSF样品，感兴趣的蛋白质可以至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％地富集于生物分子冕中。相对于尚未与颗粒接触的CSF样品，感兴趣的蛋白质可以至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍或至少约100倍富集于生物分子冕中。在一些实施方案中，本文公开的任何一种或多种颗粒(例如，表1中公开的任何一个或多个颗粒类型)可以导致从CSF样品中捕获至少约500种、至少约600种、至少约650种、至少约700种、至少约750种、至少约800种、至少约850种、至少约900种、至少约950种、至少约1000种蛋白质、至少约1050种蛋白质、至少约1100种蛋白质、至少约1150种蛋白质或至少约1200种不同的蛋白质。
滑液样品.本公开提供通过利用本文公开的一种或多种颗粒(例如，表1中公开的一种或多种颗粒)测定滑液样品中的蛋白质的方法。SF中相对于总蛋白质而言相对高浓度的高丰度蛋白(例如，白蛋白)可以使采用传统方法(例如，ELISA、免疫荧光法、凝胶电泳或色谱法)的蛋白质检测混淆。本文公开的方法和组合物可以非常适合用于检测具有高浓度的高丰度蛋白的样品中的低丰度蛋白。例如，本文公开的蛋白质冕分析可以能够在具有相对于总蛋白质含量以重量计至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％或至少约70％的高丰度蛋白的样品中检测出低丰度蛋白。在一些实施方案中，在无需额外的分级分离或耗尽步骤的情况下，可以对包含相对高浓度的高丰度蛋白的样品进行本文公开的蛋白质冕分析。
SF的样品收集体积可能较小，约2mL至约20mL，限制了每个样品可进行测定的数量。本文公开的方法和组合物可以非常适合用于检测小体积样品中的蛋白质。例如，本文公开的蛋白质冕分析可以能够在不超过约1000μL、不超过约900μL、不超过约800μL、不超过约700μL、不超过约600μL、不超过约500μL、不超过约400μL、不超过约300μL、不超过约200μL、不超过约100μL、不超过约50μL或不超过约20μL、不超过约10μL、不超过约5μL、不超过约2μL或不超过约1μL的样品体积中检测蛋白质。
蛋白质冕分析可以用于快速地鉴定SF样品中的低丰度蛋白。蛋白质冕分析可以在从第一次使SF样品与颗粒接触起不超过约2小时、不超过约2.5小时、不超过约3小时、不超过约3.5小时、不超过约4小时、不超过约4.5小时、不超过约5小时、不超过约5.5小时、不超过约6小时、不超过约6.5小时、不超过约7小时、不超过约7.5小时、不超过约8小时、不超过约8.5小时、不超过约9小时、不超过约9.5小时或不超过约10小时内鉴定SF样品中的低丰度蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使生物样品与颗粒接触起不超过约8小时内鉴定SF样品中的至少约500种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使SF样品与颗粒接触起不超过约8小时内鉴定SF样品中的至少约1000种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使SF样品与颗粒接触起不超过约4小时内鉴定SF样品中的至少约500种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使SF样品与颗粒接触起不超过约4小时内鉴定SF样品中的至少约1000种低丰度蛋白。
本文公开的方法优异于测定滑液中的蛋白质的其他方法，并且在短时间段中在整个宽动态范围提供对滑液中的蛋白质的取样。在一些实施方案中，本文公开的方法利用一种或多种颗粒快速地富集滑液样品中的蛋白质。例如，在一些实施方案中，本文公开的一个或多个颗粒类型可以用于测定滑液样品中的感兴趣的蛋白质(高丰度蛋白、中等丰度蛋白质或低丰度蛋白)的方法中，该方法包括将一个或多个颗粒类型在滑液样品中孵育以允许在颗粒上形成生物分子冕并且富集滑液样品中的蛋白质，将颗粒与滑液样品中的未结合的生物分子分离(例如，通过磁性分离)，以及胰蛋白酶解并针对感兴趣的蛋白质分析冕中的生物分子。另外，使用所述方法允许感兴趣的蛋白质有效富集于围绕颗粒类型形成的生物分子冕中。相对于尚未与颗粒接触的SF样品，感兴趣的蛋白质可以至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％地富集于生物分子冕中。相对于尚未与颗粒接触的SF样品，感兴趣的蛋白质可以至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍或至少约100倍富集于生物分子冕中。在一些实施方案中，本文公开的任何一种或多种颗粒(例如，表1中公开的任何一个或多个颗粒类型)可以导致从滑液样品富集至少约500、至少约600、至少约700、至少约800、至少约900、至少约1000、至少约1100、至少约1200、至少约1300、至少约1400、至少约1500、至少约1600、至少约1700、至少约1800、至少约1900、至少约2000、至少约2100、至少约2200、至少约2300、至少约2400、至少约2500、至少约2750、至少约3000、至少约3250、至少约3500、至少约3750或至少约4000。
尿样.本公开提供通过利用本文公开的一种或多种颗粒(例如，表1中公开的一种或多种颗粒)测定尿样中的蛋白质的方法。尿液中相对低丰度蛋白可以使采用传统方法(例如，ELISA、免疫荧光法、凝胶电泳或色谱法)的蛋白质检测混淆。本文公开的方法和组合物可以非常适合用于检测具有低蛋白质浓度的样品中的蛋白质。例如，本文公开的蛋白质冕分析可以能够检测具有不超过约10mg/mL、不超过约5.0mg/mL、不超过约4.0mg/mL、不超过约3.0mg/mL、不超过约2.0mg/mL、不超过约1.0mg/mL、不超过约0.9mg/mL、不超过约0.8mg/mL、不超过约0.7mg/mL、不超过约0.6mg/mL、不超过约0.5mg/mL、不超过约0.4mg/mL、不超过约0.3mg/mL、不超过约0.2mg/mL、不超过约0.1mg/mL、不超过约0.05mg/mL,或不超过约0.02mg/mL的总蛋白质浓度的样品中的蛋白质。
尿液中相对于总蛋白质而言相对高浓度的高丰度蛋白(例如，白蛋白)可以使采用传统方法的蛋白质检测混淆。本文公开的方法和组合物可以非常适合用于检测具有高浓度的高丰度蛋白的样品中的低丰度蛋白。例如，本文公开的蛋白质冕分析可以能够在具有相对于总蛋白质含量以重量计至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或至少约95％的高丰度蛋白的样品中检测出低丰度蛋白。在一些实施方案中，在无需额外的分级分离或耗尽步骤的情况下，可以对包含相对高浓度的高丰度蛋白的样品进行本文公开的蛋白质冕分析。
蛋白质冕分析可以用于快速地鉴定尿样中的低丰度蛋白。蛋白质冕分析可以在从第一次使尿样与颗粒接触起不超过约2小时、不超过约2.5小时、不超过约3小时、不超过约3.5小时、不超过约4小时、不超过约4.5小时、不超过约5小时、不超过约5.5小时、不超过约6小时、不超过约6.5小时、不超过约7小时、不超过约7.5小时、不超过约8小时、不超过约8.5小时、不超过约9小时、不超过约9.5小时,或不超过约10小时内鉴定尿样中的低丰度蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使生物样品与颗粒接触起不超过约8小时内鉴定尿样中的至少约500种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使尿样与颗粒接触起不超过约8小时内鉴定尿样中的至少约1000种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使尿样与颗粒接触起不超过约4小时内鉴定尿样中的至少约500种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使尿样与颗粒接触起不超过约4小时内鉴定尿样中的至少约1000种低丰度蛋白。
本文公开的方法优异于测定尿液中的蛋白质的其他方法，并且在短时间段中在整个宽动态范围提供对尿液中的蛋白质的取样。在一些实施方案中，本文公开的方法利用一种或多种颗粒快速地富集尿样中的蛋白质。例如，在一些实施方案中，本文公开的一个或多个颗粒类型可以用于测定尿样中的感兴趣的蛋白质(高丰度蛋白、中等丰度蛋白质或低丰度蛋白)的方法中，该方法包括将一个或多个颗粒类型在尿样中孵育以允许在颗粒上形成生物分子冕并且富集尿样中的蛋白质，将颗粒(例如，通过磁性分离)与尿样中的未结合的生物分子分离，以及进行胰蛋白酶解且针对感兴趣的蛋白质分析冕中的生物分子。另外，使用所述方法允许感兴趣的蛋白质有效富集于围绕颗粒类型形成的生物分子冕中。相对于尚未与颗粒接触的尿样，感兴趣的蛋白质可以至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％地富集于生物分子冕中。相对于尚未与颗粒接触的尿样，感兴趣的蛋白质可以至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍或至少约100倍富集于生物分子冕中。在一些实施方案中，本文公开的任何一种或多种颗粒(例如，表1中公开的任何一个或多个颗粒类型)可以导致从尿样富集至少约291、至少约294、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约470、至少约500、至少约550、至少约600、至少约618、至少约650、至少约700、至少约709、至少约718、至少约750、至少约800、至少约838、至少约840、至少约847、至少约850、至少约900、至少约950、至少约984、至少约1000、至少约1050、至少约1100、至少约1150或至少约1200。
流体化的固体样品.本公开提供通过利用本文公开的一种或多种颗粒(例如，表1中公开的一种或多种颗粒)测定流体化的固体样品中的蛋白质的方法。流体化的固体(例如，组织匀浆)可能包括不均一性，其可能使采用传统方法(例如，ELISA、免疫荧光法、凝胶电泳或色谱法)的蛋白质检测混淆。本文公开的方法和组合物可以非常适合用于检测不均一的样品中的蛋白质。例如，在无需额外的纯化、分级分离或耗尽步骤的情况下，可以对流体化的固体进行本文公开的蛋白质冕分析。
本文公开的方法优异于测定流体化的固体中的蛋白质的其他方法，并且在短时间段中在整个宽动态范围提供对流体化的固体中的蛋白质的取样。在一些实施方案中，本文公开的方法利用一种或多种颗粒快速地富集流体化的固体样品中的蛋白质。例如，在一些实施方案中，本文公开的一个或多个颗粒类型可以用于测定流体化的固体样品中的感兴趣的蛋白质(高丰度蛋白、中等丰度蛋白质或低丰度蛋白)的方法中，该方法包括将一个或多个颗粒类型在流体化的固体样品中孵育以允许在颗粒上形成生物分子冕并且富集流体化的固体样品中的蛋白质，将颗粒(例如，通过磁性分离)与流体化的固体样品中的未结合的生物分子分离，以及进行胰蛋白酶解且针对感兴趣的蛋白质分析冕中的生物分子。另外，使用所述方法允许感兴趣的蛋白质有效富集于围绕颗粒类型形成的生物分子冕中。相对于尚未与颗粒接触的流体化的固体样品，感兴趣的蛋白质可以至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％富集于生物分子冕中。相对于尚未与颗粒接触的流体化的固体样品，感兴趣的蛋白质可以至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍或至少约100倍富集于生物分子冕中。在一些实施方案中，本文公开的任何一种或多种颗粒(例如，表1中公开的任何一个或多个颗粒类型)可以导致从流体化的固体样品富集至少约291、至少约294、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约470、至少约500、至少约550、至少约600、至少约618、至少约650、至少约700、至少约709、至少约718、至少约750、至少约800、至少约838、至少约840、至少约847、至少约850、至少约900、至少约950、至少约984、至少约1000、至少约1100、至少约1200、至少约1300、至少约1400、至少约1500、至少约1600、至少约1700、至少约1800、至少约1900、至少约2000、至少约2100、至少约2200、至少约2300、至少约2400、至少约2500、至少约2750、至少约3000、至少约3250、至少约3500、至少约3750或至少约4000。
蛋白质冕分析可以用于快速地鉴定流体化的固体样品中的低丰度蛋白。蛋白质冕分析可以在从第一次使流体化的固体样品与颗粒接触起不超过约2小时、不超过约2.5小时、不超过约3小时、不超过约3.5小时、不超过约4小时、不超过约4.5小时、不超过约5小时、不超过约5.5小时、不超过约6小时、不超过约6.5小时、不超过约7小时、不超过约7.5小时、不超过约8小时、不超过约8.5小时、不超过约9小时、不超过约9.5小时或不超过约10小时内鉴定流体化的固体样品中的低丰度蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使生物样品与颗粒接触起不超过约8小时内鉴定流体化的固体样品中的至少约500种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使流体化的固体样品与颗粒接触起不超过约8小时内鉴定流体化的固体样品的至少约1000种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使流体化的固体样品与颗粒接触起不超过约4小时内鉴定流体化的固体样品中的至少约500种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使流体化的固体样品与颗粒接触起不超过约4小时内鉴定流体化的固体样品中的至少约1000种低丰度蛋白。
细胞培养样品.本公开提供通过利用本文公开的一种或多种颗粒(例如，表1中公开的一种或多种颗粒)测定细胞培养样品(细胞样品、细胞渗透样品或细胞外样品)中的蛋白质的方法。细胞培养样品可能包括不均一性，其可能使采用传统方法(例如，ELISA、免疫荧光法、凝胶电泳或色谱法)的蛋白质检测混淆。本文公开的方法和组合物可以非常适合用于检测不均一样品中的蛋白质。例如，在无需额外的纯化、分级分离或耗尽步骤的情况下，可以对细胞培养样品进行本文公开的蛋白质冕分析。
本文公开的方法优异于测定细胞培养样品(细胞样品、细胞渗透样品或细胞外样品)中的蛋白质的其他方法，并且在短时间段中在整个宽动态范围提供对细胞培养样品(细胞样品、细胞渗透样品或细胞外样品)中的蛋白质的取样。在一些实施方案中，本文公开的方法利用一种或多种颗粒快速地富集细胞培养样品(细胞样品、细胞渗透样品或细胞外样品)中的蛋白质。例如，在一些实施方案中，本文公开的一个或多个颗粒类型可以用于测定细胞培养样品(细胞样品、细胞渗透样品或细胞外样品)中的感兴趣的蛋白质(高丰度蛋白、中等丰度蛋白质或低丰度蛋白)的方法中，该方法包括将一个或多个颗粒类型在细胞培养样品(细胞样品、细胞渗透样品或细胞外样品)中孵育以允许在颗粒上形成生物分子冕并且富集细胞培养样品(细胞样品、细胞渗透样品或细胞外样品)中的蛋白质，将颗粒(例如，通过磁性分离)与细胞培养样品(细胞样品、细胞渗透样品或细胞外样品)中的未结合的生物分子分离，以及进行胰蛋白酶解且针对感兴趣的蛋白质分析冕中的生物分子。另外，使用所述方法允许感兴趣的蛋白质有效富集于围绕颗粒类型形成的生物分子冕中。相对于尚未与颗粒接触的细胞培养样品，感兴趣的蛋白质可以至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约100％富集于生物分子冕中。相对于尚未与颗粒接触的细胞培养样品，感兴趣的蛋白质可以至少约1.1倍、至少约1.2倍、至少约1.3倍、至少约1.4倍、至少约1.5倍、至少约2倍、至少约2.5倍、至少约3倍、至少约3.5倍、至少约4倍、至少约4.5倍、至少约5倍、至少约5.5倍、至少约6倍、至少约6.5倍、至少约7倍、至少约7.5倍、至少约8倍、至少约8.5倍、至少约9倍、至少约9.5倍、至少约10倍、至少约20倍、至少约30倍、至少约40倍、至少约50倍、至少约60倍、至少约70倍、至少约80倍、至少约90倍或至少约100倍富集于生物分子冕中。在一些实施方案中，本文公开的任何一种或多种颗粒(例如，表1中公开的任何一个或多个颗粒类型)可以导致当与细胞培养样品一起孵育时在颗粒类型的表面上形成的冕中捕获至少约100、至少约200、至少约300、至少约350、至少约400、至少约450、至少约470、至少约500、至少约550、至少约600、至少约618、至少约650、至少约700、至少约709、至少约718、至少约750、至少约800、至少约838、至少约840、至少约847、至少约850、至少约900、至少约950、至少约984、至少约1000、至少约1100、至少约1200、至少约1300、至少约1400、至少约1500、至少约1600、至少约1700、至少约1800、至少约1900、至少约2000、至少约2100、至少约2200、至少约2300、至少约2400、至少约2500、至少约2750、至少约3000、至少约3250、至少约3500、至少约3750或至少约4000种来自细胞培养样品(细胞样品、细胞渗透样品或细胞外样品)的蛋白质。
蛋白质冕分析可以用于快速地鉴定细胞培养样品中的低丰度蛋白。蛋白质冕分析可以在从第一次使细胞培养样品与颗粒接触起不超过约2小时、不超过约2.5小时、不超过约3小时、不超过约3.5小时、不超过约4小时、不超过约4.5小时、不超过约5小时、不超过约5.5小时、不超过约6小时、不超过约6.5小时、不超过约7小时、不超过约7.5小时、不超过约8小时、不超过约8.5小时、不超过约9小时、不超过约9.5小时,或不超过约10小时内鉴定细胞培养样品中的低丰度蛋白。
在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使生物样品与颗粒接触起不超过约8小时内鉴定细胞培养样品中的至少约500种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使细胞培养样品与颗粒接触起不超过约8小时内鉴定细胞培养样品中的至少约1000种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使细胞培养样品与颗粒接触起不超过约4小时内鉴定细胞培养样品中的至少约500种低丰度蛋白。在一些实施方案中，蛋白质冕分析可以在从第一次使细胞培养样品与颗粒接触起不超过约4小时内鉴定细胞培养样品中的至少约1000种低丰度蛋白。
可以通过许多不同的技术收集本公开的生物样品。可以通过活检、解剖、细针抽吸或手术切除收集组织样品。可以通过例如均质化或离心流体化组织样品。流体样品(例如，血液、血清、血浆、尿液或精液)可以被收集于样品收集管中。可商购的收集管可以用于收集流体样品。例如，可用于收集本公开的样品的可商购的收集管包括EDTA收集管，包含核酸稳定剂的收集管(例如，Streck管)，血清分离管(SST)、柠檬酸钠收集管，柠檬酸盐、茶碱、腺苷和潘生丁(CTAD)收集管，锂/钠肝素收集管，氟化钠收集管，柠檬酸葡萄糖(ACD)收集管或聚茴香脑磺酸钠(SPS)收集管。
在一些实施方案中，生物流体可以被收集于包含稳定剂(例如，防腐剂、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂或交联剂)的样品收集管。稳定剂可以使未冷藏存储的生物流体稳定。生物流体可以在环境温度、室温或0℃至37℃的任何温度下储藏。例如，收集于包含稳定剂的样品收集管中的生物流体可以未冷藏地(例如，在0℃至37℃的温度)存储多达1、多达2、多达3、多达4、多达5、多达6、多达7、多达8、多达9、多达10、多达11、多达12、多达13或多达14天。在室温下储藏之后，可以对生物流体进行分析(例如，冕分析)或冷藏以供以后使用。例如，生物流体样品可以被收集于包含核酸稳定剂的收集管(例如，Streck管)中并且在室温下过夜储藏，或者生物流体样品可以被收集于包含核酸稳定剂的血液收集管中并且在无冰或干冰的情况下被运输。可以在与收集样品之处分隔开的设施中加工未冷藏的生物流体。
被收集于收集管中并且未冷藏存储的生物流体可以适合于通过蛋白质冕分析进行分析。在0℃至37℃的温度下储藏之后，可以利用冕分析在生物流体中检测出至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400或至少1500种蛋白质。在一些实施方案中，在0℃至37℃的温度下储藏之后，可以利用冕分析在生物流体中检测出至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400、至少1500、至少1600、至少1700、至少1800、至少1900、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000、至少4500或至少5000种肽。在一些实施方案中，在0℃至37℃的温度下储藏之后，可以利用冕分析在生物流体中检测出至少5000、至少6000、至少7000、至少7100、至少7200、至少7300、至少7400、至少7500、至少7600、至少7700、至少7800、至少7900、至少8000、至少8500或至少9000种蛋白质特征。冷藏的生物流体可以在冰上、在干冰上或与液氮一起进行运输。可以在与收集样品之处分隔开的设施中解冻并且加工冷藏的生物流体。例如，生物流体可以在医疗设施处被收集于包含核酸稳定剂的管(例如，Streck管)中并且在环境条件下被运输至研究设施以供冕分析。
在一些实施方案中，生物流体可以被收集于样品收集管中并且被冷藏。生物流体可以在约10分钟、约20分钟、约30分钟、约40分钟、约50分钟、约60分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时或约6小时内被冷冻。已被收集于样品收集管中并且被冷冻的生物流体可以适合于通过蛋白质冕分析进行分析。在冷冻储藏(例如，在低于0℃的温度下储藏)之后，可以利用冕分析在生物流体中检测出至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少600、至少700、至少800、至少900、至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400或至少1500种蛋白质。在一些实施方案中，在低于0℃的温度下储藏之后，可以利用冕分析在生物流体中检测出至少1000、至少1100、至少1200、至少1300、至少1400、至少1500、至少1600、至少1700、至少1800、至少1900、至少2000、至少2500、至少3000、至少3500、至少4000、至少4500或至少5000种肽。在一些实施方案中，在低于0℃的温度下储藏之后，可以利用冕分析在生物流体中检测出至少5000、至少6000、至少7000、至少7100、至少7200、至少7300、至少7400、至少7500、至少7600、至少7700、至少7800、至少7900、至少8000、至少8500或至少9000种蛋白质特征。
在一些实施方案中，本文公开的方法提供了将生物流体收集于Streck血液收集管中，与颗粒一起孵育以形成冕，然后在后续的时间点(例如，在所述样品在室温下在Streck血液收集管中孵育之后多达14天)对冕中的蛋白质进行分析。
生物样品中的蛋白质冕分析
本文公开的颗粒和方法的使用可以结合生物样品(例如，生物流体)中的多种独特蛋白质。可利用本文所述的蛋白质冕分析方法来分析的生物样品的非限制性实例包括生物流体样品(例如，脑脊髓液(CSF)、滑液(SF)、尿液、血浆、血清、眼泪、精液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、汗液或唾液)、流体化的固体(例如，组织匀浆)、或者来源于细胞培养物的样品。例如，本文公开的颗粒可以与本文公开的任何生物样品一起孵育以形成蛋白质冕，该蛋白质冕包含至少100种独特蛋白质、至少120种独特蛋白质、至少140种独特蛋白质、至少160种独特蛋白质、至少180种独特蛋白质、至少200种独特蛋白质、至少220种独特蛋白质、至少240种独特蛋白质、至少260种独特蛋白质、至少280种独特蛋白质、至少300种独特蛋白质、至少320种独特蛋白质、至少340种独特蛋白质、至少360种独特蛋白质、至少380种独特蛋白质、至少400种独特蛋白质、至少420种独特蛋白质、至少440种独特蛋白质、至少460种独特蛋白质、至少480种独特蛋白质、至少500种独特蛋白质、至少520种独特蛋白质、至少540种独特蛋白质、至少560种独特蛋白质、至少580种独特蛋白质、至少600种独特蛋白质、至少620种独特蛋白质、至少640种独特蛋白质、至少660种独特蛋白质、至少680种独特蛋白质、至少700种独特蛋白质、至少720种独特蛋白质、至少740种独特蛋白质、至少760种独特蛋白质、至少780种独特蛋白质、至少800种独特蛋白质、至少820种独特蛋白质、至少840种独特蛋白质、至少860种独特蛋白质、至少880种独特蛋白质、至少900种独特蛋白质、至少920种独特蛋白质、至少940种独特蛋白质、至少960种独特蛋白质、至少980种独特蛋白质、至少1000种独特蛋白质、100至1000种独特蛋白质、150至950种独特蛋白质、200至900种独特蛋白质、250至850种独特蛋白质、300至800种独特蛋白质、350至750种独特蛋白质、400至700种独特蛋白质、450至650种独特蛋白质、500至600种独特蛋白质、200至250种独特蛋白质、250至300种独特蛋白质、300至350种独特蛋白质、350至400种独特蛋白质、400至450种独特蛋白质、450至500种独特蛋白质、500至550种独特蛋白质、550至600种独特蛋白质、600至650种独特蛋白质、650至700种独特蛋白质、700至750种独特蛋白质、750至800种独特蛋白质、800至850种独特蛋白质、850至900种独特蛋白质、900至950种独特蛋白质、950至1000种独特蛋白质。在一些实施方案中，可以单独地或组合地使用若干不同类型的颗粒以鉴定特定生物样品中的多种蛋白质。换言之，可以多路复用颗粒以便结合并鉴定生物样品中的多种蛋白质。相比于总蛋白分析方法，对生物分子冕的蛋白质冕分析可以压缩该分析的动态范围。
本文公开的组合物和方法可以用于鉴定特定生物样品中的各种生物状态。例如，生物状态可以是指特定的蛋白质或蛋白质集合的升高的或低水平。在其他实例中，生物状态可以是指鉴定疾病例如癌症。一个或多个颗粒类型可以与CSF一起孵育以允许形成蛋白质冕。随后可以通过凝胶电泳或质谱分析法对所述蛋白质冕进行分析以便鉴定蛋白质的模式。蛋白质冕(例如，通过质谱分析法或凝胶电泳)的分析可以称为冕分析。蛋白质的模式可以与对对照样品实施的相同方法进行比较。在比较蛋白质的模式时，可以鉴定出第一CSF样品包含升高水平的与特定类型的脑癌对应的标志物。因此，颗粒、方法及其用途可以用于诊断特定的疾病状态。
通过串行探询进行冕分析
本文提供了用于压缩蛋白质组学分析的动态范围以便于相对于高丰度蛋白检测低丰度蛋白的若干方法。如本文中使用的，短语“动态范围”是样品中分子的最高浓度与样品中分子的最低浓度的比率。动态范围可以通过符合评价样品中分子的最高浓度与样品中分子的最低浓度的比率的多种方法进行定量。例如，动态范围可以被定量为样品中前十分位数蛋白质与样品中后十分位数蛋白质的比率。动态范围可以被定量为样品中最高可检测浓度与样品中最低可检测浓度的比率。动态范围可以被定量为样品中蛋白质的四分间距的跨度(第75百分位数与第25百分位数的比率)。动态范围可以通过测量在样品中(例如，使用本文公开的方法例如用颗粒串行探询)检测的蛋白质的所有浓度相对于所述蛋白质的公布浓度(例如，使用血浆蛋白质的Carr数据库)的曲线中的拟合数据的斜率进行定量。动态范围可以通过测量在样品中(例如，使用本文公开的方法例如用颗粒串行探询)检测的蛋白质的浓度相对于所述蛋白质的公布浓度(例如，使用血浆蛋白质的Carr数据库)的曲线中任何两点之间的斜率进行定量。因此，动态范围捕获在样品中可检测的分子的浓度范围或数量级。例如，“动态范围”可以是指样品中蛋白质的最高可检测浓度与样品中另一蛋白质的最低可检测浓度的比率。因此，在此实例中，动态范围捕获样品中可检测的蛋白质的浓度范围或数量级。如本文中使用的，短语“压缩动态范围”或“动态范围的压缩”是指降低样品中分子的最高浓度与样品中分子的最低浓度的比率。因此，当样品中分子可检测到的浓度范围或数量级降低时，动态范围被压缩。例如，本公开的颗粒类型可以用于串行探询样品。当颗粒类型在样品中孵育时，在颗粒类型的表面上生物分子冕形成。如果在不使用所述颗粒类型的情况下直接检测样品中的蛋白质，例如通过样品的直接质谱分析，动态范围可以比如果蛋白质被定向于颗粒类型的表面跨更宽的浓度范围或更多数量级。因此，使用本文公开的颗粒类型压缩了样品中蛋白质的动态范围。不限于理论，由于在颗粒类型的生物分子冕中更多捕获较高亲和性、较低丰度蛋白而在颗粒类型的生物分子冕中更少捕获较低亲和性、较高丰度蛋白，所以可以观察到此效应。蛋白质组学分析测定的动态范围可以是作为样品中蛋白质的总丰度的函数的通过蛋白质组学分析测定测量的蛋白质信号的曲线的斜率。压缩动态范围可以包括，相对于作为样品中蛋白质的总丰度的函数的通过第二蛋白质组学分析测定测量的蛋白质信号的曲线的斜率，降低作为样品中蛋白质的总丰度的函数的通过蛋白质组学分析测定测量的蛋白质信号的曲线的斜率。相对于总蛋白分析方法(例如，质谱分析法、凝胶电泳或液相色谱法)的动态范围，本文公开的蛋白质冕分析可以压缩动态范围。
在一些实施方案中，蛋白质组学分析测定的动态范围可以是由最高丰度蛋白(例如，丰度最高的10％蛋白质)产生的信号与由最低丰度蛋白(例如，丰度最低的10％蛋白质)产生的信号的比率。压缩蛋白质组学分析的动态范围可以包括，相对于第二蛋白质学分析测定的比率，降低第一蛋白质组分析测定的由最高丰度蛋白产生的信号与由最低丰度蛋白产生的信号的比率。相对于总蛋白分析方法(例如，质谱分析法、凝胶电泳或液相色谱法)的动态范围，本文公开的蛋白质冕分析可以压缩动态范围。
压缩蛋白质组学分析的动态范围可以通过串行探询来实现。压缩蛋白质组学分析的动态范围的方法可以包括用颗粒串行探询样品(例如，生物样品)，以及对由颗粒捕获的蛋白质组学数据进行蛋白质冕分析。在一些实施方案中，压缩蛋白质组学分析的动态范围的方法可以包括从样品耗尽高丰度蛋白或富集样品中的低丰度蛋白，用单个颗粒类型多次地或用各种颗粒类型进行串行探询样品，以及进行颗粒的蛋白质冕分析。在一些实施方案中，压缩蛋白质组学分析的动态范围的方法可以包括分级分离样品，以及利用本文公开的用各种颗粒类型串行探询样品的方法对级分进行探询，所述级分富集低丰度蛋白或耗尽高丰度蛋白。在一些实施方案中，可以在样品分级分离或样品耗尽之前、之后或替代样品分级分离或样品耗尽进行样品的串行探询。
本文公开的串行探询方法可以通过蛋白质冕分析而增强低丰度蛋白的检测。例如，串行探询方法可以包括耗尽样品的高丰度蛋白，所述高丰度蛋白影响对低丰度蛋白的测定能力。本文公开的串行探询方法可以通过蛋白质冕分析增强低丰度蛋白的检测，这是因为捕获于蛋白质冕中的蛋白质的压缩的动态范围允许在颗粒表面上局部地浓缩低丰度蛋白，而不是直接在样品中对所述低丰度蛋白进行采样(其中存在混淆高丰度蛋白)。在另一实例中，串行探询方法可以包括在颗粒上形成的生物分子冕中富集低丰度蛋白。可以在耗尽或分级分离之前进行串行探询具有各种样品类型的样品的本文公开的方法。这些耗尽方法可以包括利用耗尽试剂盒的耗尽。这些耗尽方法还可以包括用本文公开的新颖颗粒(例如，表1中的任一种颗粒)的耗尽。
在用各种颗粒类型串行探询样品之后可以对在冕分析之前已被耗尽的生物样品进行冕分析。在用各种颗粒类型串行探询样品之后可以对分级分离的生物样品的单独级分进行冕分析。在用各种颗粒类型串行探询样品之后可以对从串行探询的样品中分离的一个或多个颗粒类型进行冕分析。分级分离可以用于耗尽样品，并且可以对已分级分离的样品进行用各种颗粒类型串行探询样品和冕分析。在冕分析之前生物样品的分级分离或耗尽可以提高冕分析的灵敏度、准确度或特异性。在一些实施方案中，在冕分析之前串行探询、分级分离或耗尽生物样品可以能够检测在直接测定总蛋白质含量(例如，通过凝胶分析或质谱分析法)的样品中无法检测的一种或多种生物分子。用各种颗粒类型串行探询样品以及分级分离的样品的单个级分的冕分析可以能够检测期望的生物分子的子集。样品可以被耗尽，然后用各种颗粒类型被串行探询，然后通过蛋白质冕分析被分析。在另一实例中，样品可以被分级分离，可以用各种颗粒类型对一种或多种级分进行串行探询，然后通过蛋白质冕分析进行分析。
串行探询.可以用本公开的一个或多个颗粒类型串行探询样品(例如，生物样品)。颗粒类型可以与样品中分离，可以进行蛋白质冕分析。串行探询可以包括使样品与颗粒类型接触以在颗粒上形成蛋白质冕，分离颗粒类型，以及对同一样品用相同颗粒类型、不同颗粒类型或其组合一次或多次地重复所述接触和分离。可以对一种或多种分离的颗粒类型进行蛋白质冕分析。样品的串行探询可以非常适合于小样品尺寸。例如，使用一组颗粒类型(例如，一组1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多个颗粒类型)的蛋白质冕分析可以使用低至约不超过约1000μL、不超过约900μL、不超过约800μL、不超过约700μL、不超过约600μL、不超过约500μL、不超过约400μL、不超过约300μL、不超过约200μL、不超过约100μL、不超过约50μL或不超过约20μL、不超过约10μL、不超过约5μL、不超过约2μL或不超过约1μL的样品体积进行。这可以提供优于其他蛋白质冕分析方法的优点在于，该方法涉及包括在接触一个或多个颗粒类型之前划分样品。相比于用单个颗粒类型探询样品，样品的串行探询可以增高通过蛋白质冕分析可以鉴定的蛋白质的数量。
在串行探询期间样品的生物分子组成可以基本上没有变化。例如，在使样品与第一颗粒类型接触之前样品的生物分子组成可以与从样品分离第一颗粒类型之后样品的生物分子组成基本上相同。在一些实施方案中，在使样品与第一颗粒类型接触之前样品的生物分子组成可以与从样品分离第二颗粒类型、第三颗粒类型、第四颗粒类型、第五颗粒类型或更多颗粒类型之后样品的生物分子组成基本上相同。如果总生物分子质量变化不超过约1质量％、不超过约2质量％、不超过约3质量％、不超过约4质量％、不超过约5质量％、不超过约6质量％、不超过约7质量％、不超过约8质量％、不超过约9质量％、不超过约10质量％、不超过约11质量％、不超过约12质量％、不超过约13质量％、不超过约14质量％或不超过约15质量％，则样品的生物分子组成可以是基本上相同的。在一些实施方案中，样品的总生物分子质量的变化可以小于约1质量％。如果生物分子的子集的质量的变化不超过约1质量％、不超过约2质量％、不超过约3质量％、不超过约4质量％、不超过约5质量％、不超过约6质量％、不超过约7质量％、不超过约8质量％、不超过约9质量％、不超过约10质量％、不超过约11质量％、不超过约12质量％、不超过约13质量％、不超过约14质量％或不超过约15质量％，则样品的生物分子组成可以是基本上相同的。在一些实施方案中，生物分子的子集可以包括中等丰度蛋白质。在一些实施方案中，生物分子的子集可以包含低丰度蛋白。
在一些实施方案中，可以通过使样品与第一颗粒类型接触，允许生物分子与第一颗粒类型结合，并且将第一颗粒类型连同结合的生物分子一起与生物流体分离进行串行探询。例如，可以将颗粒利用离心或磁性分离而从生物流体分离。可以通过使流体与第二颗粒类型接触，允许生物分子与第二颗粒类型结合，并且将第二颗粒类型连同结合的生物分子一起与生物流体分离进一步探询生物流体。在一些实施方案中，可以通过相继地使生物样品与相同或不同的颗粒类型接触，允许生物分子与颗粒类型结合并且在加入下一种颗粒类型之前分离每种颗粒类型和结合的生物分子进行串行探询。每种分离的颗粒类型和结合的生物分子可以构成级分。在一些实施方案中，可以用至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20种颗粒类型进行串行探询。在一些实施方案中，可以使用样品颗粒类型重复用颗粒类型的串行探询。在一些实施方案中，可以对串行探询的生物样品的级分进行冕分析。在一些实施方案中，可以对在串行探询之后的生物样品的剩余上清液进行冕分析。
耗尽.本文提供了耗尽样品的高丰度蛋白的方法以及用于如此的组合物。这些耗尽样品的高丰度蛋白的方法可以在本文所述的用各种颗粒类型串行探询样品的方法之前进行，然后利用本文公开的蛋白质冕分析方法对所述颗粒类型进行分析。在一些实施方案中，一种或多种纳米颗粒可以用于耗尽生物样品的高丰度蛋白。用颗粒耗尽样品可以包括逐轮地耗尽样品，其中在每一轮内，不同类型的颗粒(例如，具有独特材料组成的颗粒)可以用于耗尽。在其他情况中，去血浆法试剂盒、柱、色谱法或其他系统可以用于耗尽生物样品的高丰度蛋白。相比于在未被耗尽的样品中实施相同的方法，耗尽后用各种颗粒类型串行探询样品以及蛋白质冕分析可以增大可鉴定的蛋白质数量。但是，耗尽可以是非必要的，并且与如果样品先被耗尽相比，用各种颗粒类型串行探询样品和蛋白质冕分析可以用于在更短的测定时间中鉴定各种蛋白质。
样品耗尽可以包括降低生物流体样品中的至少一种生物分子(例如，蛋白质)的水平。例如，样品耗尽可以包括降低样品中的高丰度蛋白的水平。高丰度蛋白可以是白蛋白、IgG或核醣体蛋白质。在一些实施方案中，可以通过使生物流体与第一颗粒类型接触，允许生物分子与第一颗粒类型结合，并且将第一颗粒类型连同结合的生物分子一起与生物流体分离进行样品耗尽。例如，可以利用离心或磁性分离将颗粒与生物流体分离。，通过使流体与第二颗粒类型接触，允许生物分子与第二颗粒类型结合，并且将第二颗粒类型连同结合的生物分子一起与生物流体分离可以进一步耗尽生物流体。可以以逐轮的方式通过使生物流体与不同的颗粒类型接触并且在使生物流体与下一种颗粒类型接触之前将每种颗粒类型分离对生物流体进行耗尽。在一些实施方案中，可以利用至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20种颗粒类型进行耗尽。在一些实施方案中，可以利用色谱法或电泳进行样品耗尽。
在一些实施方案中，样品耗尽可以包括利用可商购的试剂盒来耗尽样品。可用于耗尽样品的试剂盒可以是基于离心柱的耗尽试剂盒、白蛋白耗尽试剂盒、免疫耗尽试剂盒或丰富蛋白质耗尽试剂盒。可用于耗尽样品的试剂盒的非限制性实例包括PureProteomeTM人白蛋白/免疫球蛋白耗尽试剂盒(EMD Millipore Sigma)、
Figure BDA0003375593420000561
免疫亲和性白蛋白&IgG耗尽试剂盒(Millipore Sigma)、
Figure BDA0003375593420000571
蛋白质耗尽试剂盒(MilliporeSigma)、丰度前12的蛋白质耗尽离心柱(Pierce)或Proteome PurifyTM免疫耗尽试剂盒(R&DSystems)。虽然这些试剂盒作为实例而列出，但是本领域技术人员可以设想到可用于样品耗尽的许多其他试剂盒。
本公开的试剂盒可以包含用于串行探询样品的颗粒类型。试剂盒可以被预包装在分立的试样中。在另一实例中，试剂盒可以包含可用于串行探询样品的多种不同颗粒类型。多个颗粒类型可以被预包装，其中所述多个颗粒类型中的每种颗粒类型被单独地包装。或者，多个颗粒类型可以被包装在一起以将颗粒类型的组合容纳在单个包装中。
耗尽样品可以包括使成分从样品中沉淀出。在一些实施方案中，耗尽样品可以包括使不期望的成分(例如高丰度蛋白)沉淀。可以使不期望的成分沉淀，并且可以进一步处理上清液(例如，通过蛋白质冕分析、串行探询、分级分离或耗尽)。在一些实施方案中，沉淀的不期望的成分可以通过过滤、离心、超离心或重力分离而从上清液去除。使不期望的成分沉淀的方法可以包括冷沉淀或化学沉淀(例如，孔恩氏方法或乙醇沉淀)。在一些实施方案中，耗尽样品可以包括使期望的成分(例如，低丰度蛋白)沉淀。可以使期望的成分沉淀，可以将上清液弃去，并且可以使沉淀物重悬以便进一步处理(例如，用各种颗粒类型串行探询，然后通过蛋白质冕分析、分级分离或耗尽对其进行测定)。在一些实施方案中，沉淀的期望的成分可以通过过滤、离心、超离心或重力分离而与上清液分离。使期望的成分沉淀的方法可以包括冷沉淀或化学沉淀(例如，孔恩氏方法或乙醇沉淀)。在一些实施方案中，未经处理的样品可能包含不期望的沉淀物。不期望的沉淀物可以通过过滤、离心、超离心或重力分离而从上清液去除。
耗尽样品可以包括将不期望的成分与期望的成分分离(例如，将高丰度蛋白从低丰度蛋白分离)。在一些实施方案中，可以基于生化特性(例如，结合亲和力、电荷或尺寸)分离成分。在一些实施方案中，可以利用色谱法或凝胶电泳进行耗尽。在一些实施方案中，可以基于生化特性将样品分离成两个或更多个级分。第一级分可以包含期望的成分而第二级分可以包含不期望的成分。可以进一步处理(例如，通过用各种颗粒类型串行探询和冕分析、进一步分级分离或耗尽)包含期望的成分的级分。可以弃去包含不期望的成分的级分。耗尽方法的非限制性实例可以包括离子交换色谱法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、凝胶电泳或反相色谱法。虽然这些方法作为实例而列出，但是本领域技术人员可以设想到可用于样品耗尽的许多其他方法。
利用本文公开的组合物和方法，耗尽可以导致从生物样品去除至少50％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、100％、5％至20％、5％至100％、10％至95％、15％至90％、20％至85％、25％至80％、30％至75％、35％至70％、40％至65％、45％至60％、50％至55％、60％至70％、60％至80％或50％至90％的高丰度蛋白。在一些实施方案中，本文公开的耗尽方法和用于耗尽样品的组合物可以去除全部或100％的高丰度蛋白。可以对被耗尽的生物样品进行冕分析。
分级分离.本文中提供了将样品(例如，生物样品)的成分分离成级分的方法。第一级分可能在生物分子组成方面不同于第二级分。例如，相对于未经分级的样品，第一级分可能富含高丰度蛋白而第二级分可以富含低丰度蛋白。可以通过利用本文公开的方法和组合物进一步探询级分(例如，串行探询样品，随后对用于串行探询每种颗粒类型进行蛋白质冕分析)。在一些实施方案中，分级分离可以通过将高丰度蛋白与低丰度蛋白分离促进蛋白质冕分析，从而增强对低丰度蛋白的检测。在一些实施方案中，分级分离可以通过将样品分离成非常适合于特定颗粒类型的级分来促进蛋白质冕分析。例如，可以用第一颗粒类型探询第一级分，可以用第二颗粒类型探询第二级分。相比于对未经分级分离的样品的蛋白质冕分析，分级分离后进行蛋白质冕分析可以增加可鉴定的蛋白质的数量。
样品分级分离可以包括分离生物样品的成分。在一些实施方案中，可以基于生化特性(例如，结合亲和力、电荷或尺寸)分离成分。在一些实施方案中，可以利用色谱法或凝胶电泳进行耗尽。可以进一步处理(例如，通过串行探询样品随后对串行探询中的每种颗粒类型进行蛋白质冕分析、进一步分级分离或耗尽)一个或多个级分。分级分离方法的非限制性实例可以包括离子交换色谱法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、凝胶电泳或反相色谱法。虽然这些方法作为实例而列出，但是本领域技术人员可以设想到可用于分级分离样品的许多其他方法。
蛋白质冕分析方法
本文公开的方法包括将一个或多个颗粒类型从一种或一种以上样品(例如，生物样品或串行探询的样品)分离。利用磁性可以将颗粒类型与样品快速地分隔或分离。此外，可以并行地处理空间上分隔开的多个样品。因此，本文公开的方法允许将颗粒类型与样品中的未结合的蛋白质分隔开或分离。可以通过各种方法来分离颗粒类型，包括但不限于磁性分离、离心、过滤或重力分离。在一些实施方案中，颗粒板可以与多个空间上分隔的样品一起进行孵育，其中每个空间上分隔的样品处于孔板(例如，96-孔板)的孔中。在一些实施方案中，在孵育后，通过将整个板放置在磁体上，可以将孔板的每个孔中的颗粒类型与空间上分隔的样品中存在的未结合的蛋白质分离。这同时将颗粒组中的超顺磁性颗粒拉下。可以去除每个孔中的上清液，以去除未结合的蛋白质。可以重复这些步骤(孵育，拉下)，以有效地洗涤颗粒，从而去除可能存在于样品中的残留背景未结合蛋白质。这是一个示例，但是本领域技术人员可以设想许多其他情况，其中同时从一个或一个以上空间上分隔的样品中快速分离超顺磁性颗粒。
在一些实施方案中，本公开的方法和组合物通过消化颗粒表面上形成的冕来处理蛋白质组数据提供了生物样品中特定蛋白质的鉴定和测量。可鉴定和测量的蛋白质的示例包括高丰度蛋白、中等丰度蛋白质和低丰度蛋白。低丰度蛋白可以以等于或低于10ng/mL的浓度存在于样品中。高丰度蛋白可以以等于或高于10μg/mL的浓度存在于样品中。中等丰度的蛋白质可以以约10ng/mL至约10μg/mL的浓度存在于样品中。高丰度蛋白的示例包括白蛋白质、IgG和占血浆质量95％的前14种丰度蛋白质。此外，可以使用本文公开的颗粒组在样品中直接检测可以使用常规耗尽柱纯化的任何蛋白质。蛋白质的示例可以是公开的数据库例如Keshishian等人(Mol Cell Proteomics.2015Sep；14(9):2375-93.doi:10.1074/mcp.M114.046813.Epub 2015Feb 27.)，Farr等人(J Proteomic Res.2014Jan 3；13(1):60-75.doi:10.1021/pr4010037.Epub 2013Dec 6.)，或Pernemalm等人(Expert RevProteomics.2014Aug；11(4):431-48.doi:10.1586/14789450.2014.901157.Epub 2014Mar24.)中列出的任何蛋白质。
在一些实施方案中，可以使用本文公开的方法和组合物测量和鉴定的蛋白质的示例包括白蛋白质、IgG、溶菌酶、CEA、HER-2/neu、膀胱肿瘤抗原、甲状腺球蛋白质、甲胎蛋白质、PSA、CA125、CA19.9、CA 15.3、瘦素、催乳素、骨桥蛋白、IGF-II、CD98、肌成束蛋白、sPigR、14-3-3eta、肌钙蛋白I、B型利钠肽、BRCA1、c-Myc、IL-6、纤维蛋白质原、EGFR、胃泌素、PH、G-CSF、肌间线蛋白、NSE、FSH、VEGF、P21、PCNA、降血钙素、PR、CA125、LH、生长激素抑制素、S100、胰岛素、α-催乳素、ACTH、Bcl-2、ERα、Ki-67、p53、组织蛋白质酶D、β连环蛋白、VWF、CD15、k-ras、半胱天冬酶3、EPN、CD10、FAS、BRCA2、CD30L、CD30、CGA、CRP、凝血酶原、CD44、APEX、转铁蛋白、GM-CSF、E-钙粘蛋白、IL-2、Bax、IFN-γ、β-2-MG、TNFα、c-erbB-2、胰蛋白质酶、细胞周期蛋白D1、MG B、XBP-1、HG-1、YKL-40、S-γ、NESP-55、纺锤蛋白-1(netrin-1)、联会蛋白、GADD45A、CDK-6、CCL21、BrMS1、17βHDI、PDGFRA、Pcaf、CCL5、MMP3、密封蛋白-4和密封蛋白-3。在一些实施方案中，可以使用本文公开的颗粒组测量和鉴定的蛋白质的其他示例是感兴趣的特定疾病指征(例如，前列腺癌、肺癌或阿尔茨海默病)的开放靶数据库中列出的任何蛋白质或蛋白质群组。
可以使用多种不同的分析技术鉴定、测量和定量生物样品的蛋白质组数据。例如，可以使用SDS-PAGE或任何基于凝胶的分离技术来分析蛋白质组数据。也可以使用免疫分析法(如ELISA)鉴定、测量和定量肽和蛋白质。可替代地，可以使用质谱分析法、高效液相色谱、LC-MS/MS、Edman降解、免疫亲和技术、EP3548652、WO2019083856、WO2019133892(每一个通过引用全部并入本文)中公开的方法和其他蛋白质分离技术来鉴定、测量和定量蛋白质组数据。
计算机控制系统
本公开提供被编程以实现本公开的方法的计算机控制系统。图29显示了一种计算机系统，其被编程为或以其他方式配置为实施本文提供的方法。计算机系统901可以控制本文公开的测定的各种方面，其能够被自动化(例如，在基底上移动本文公开的任何试剂)。计算机系统901可以是用户的电子设备，或者相对于该电子设备远程的计算机系统。电子设备可以是移动电子设备。
计算机系统901包括中央处理单元(CPU，本文也称为“处理器”和“计算机处理器”)905，其可以是单核或多核处理器，或者是用于并行处理的多个处理器。计算机系统901还包括存储器或存储器位置910(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)、电子存储单元915(例如，硬盘)、用于与一个或多个其他系统通信的通信接口920(例如，网络适配器)以及外围设备925，诸如高速缓存、其他存储器、数据存储和/或电子显示适配器。存储器910、存储单元915、接口920和外围设备925通过诸如主板等通信总线(实线)而与CPU905通信。存储单元915可以是用于存储数据的数据存储单元(或数据存储库)。计算机系统901可以借助于通信接口920可操作地耦合到计算机网络(“网络”)930。网络930可以是因特网、互联网和/或外联网，或者与因特网通信的内联网和/或外联网。在一些情况中，网络930是电信和/或数据网络。网络930可以包括一个或多个计算机服务器，其可以实现分布式计算，诸如云计算。在一些情况中，网络930可以借助于计算机系统901实现对等网络，这可以使得耦合到计算机系统901的设备能够起到客户端或服务器的作用。
CPU 905可以执行一系列机器可读指令，该机器可读指令可以体现在程序或软件中。指令可以存储在存储位置如存储器910中。指令可以针对CPU 905，该指令随后可以编程或以其他方式配置CPU 905以实现本公开的方法。由CPU 905执行的操作的实例可以包括提取、解码、执行和回写。
CPU 905可以是电路如集成电路的部分。电路中可以包括系统901的一个或多个其他组件。在一些情况中，该电路是专用集成电路(ASIC)。
存储单元915可以存储文件，诸如驱动程序、库和存储的程序。存储单元915可以存储用户数据，例如用户偏好和用户程序。在一些情况中，计算机系统901可以包括一个或多个额外数据存储单元，所述额外数据存储单元位于计算机系统901外部，诸如位于通过内联网或因特网而与计算机系统901通信的远程服务器上。
计算机系统901可通过网络930而与一个或多个远程计算机系统通信。例如，计算机系统901可以与用户的远程计算机系统通信。远程计算机系统的实例包括个人计算机(例如，便携式PC)、平板或平板型PC(例如，
Figure BDA0003375593420000622
iPad、
Figure BDA0003375593420000623
Galaxy Tab)、电话、智能手机(例如，
Figure BDA0003375593420000621
iPhone、支持Android的设备、
Figure BDA0003375593420000624
)或个人数字助理。用户可以经由网络930访问计算机系统901。
本文所述的方法可通过机器(例如，计算机处理器)可执行代码的方式来实现，该机器可执行代码存储在计算机系统901的电子存储位置上，例如存储器910或电子存储单元915上。机器可执行代码或机器可读代码可以以软件的形式提供。在使用期间，该代码可由处理器905执行。在一些情况中，可从存储单元915检索代码并将其存储在存储器910上，以供处理器905迅速存取。在一些情况下，可排除电子存储单元915，并且将机器可执行指令存储在存储器910上。
该代码可以被预编译并配置成由具有适于执行该代码的处理器的机器使用，或者可以在运行期间被编译。代码可以用编程语言提供，可以选择编程语言以使代码能够以预编译或即时编译(as-compiled)的方式执行。
本文提供的系统和方法的各个方面，诸如计算机系统901，可以在编程中体现。该技术的各个方面可以被认为是机器可读介质类型的携带或体现的通常机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式的“产品”或“制造的制品”。机器可执行代码可以存储在电子存储单元如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘上。“存储”型介质可以包括计算机的任何或全部有形存储器、处理器等，或其相关模块，诸如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可以在任何时间为软件编程提供非暂时性存储。软件的全部或部分有时可以通过因特网或各种其他电信网络进行通信。例如，这样的通信可以使软件能够从一台计算机或处理器加载到另一台计算机或处理器中，例如从管理服务器或主机加载到应用服务器的计算机平台中。因此，可以承载软件元素的另一类型的介质包括光波、电波和电磁波，诸如跨本地设备之间的物理接口、通过有线和光学陆线网络以及各种空中链路而使用的。携载此类波的物理元件，诸如有线或无线链路、光学链路等，也可以被视为承载软件的介质。如本文所用，除非仅限于非暂时性有形的“存储”介质，否则计算机或机器“可读介质”等术语是指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，机器可读介质如计算机可执行代码可采取多种形式，包括但不限于有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，诸如任何计算机中的任何存储设备等，诸如可用于实现如附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，诸如这样的计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴缆线、铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的线。载波传输介质可以采取电信号或电磁信号或者声波或光波的形式，诸如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些。因此，计算机可读介质的常见形式包括例如：软盘、柔性盘、硬盘、磁带、任何其他磁性介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡片纸带、任何其他具有孔洞图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或匣盒、传送数据或指令的载波、传送此类载波的电缆或链路，或者计算机可以从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。这些形式的计算机可读介质中的许多介质可以参与将一个或多个指令的一个或多个序列携载到处理器以供执行。
计算机系统901可以包括或与电子显示器935通信，该电子显示器935包括用于提供例如利用本文公开的方法鉴定的蛋白质的读数的用户界面(UI)940。UI的示例包括但不限于图形用户界面(GUI)和基于网页的用户界面。
可以通过一种或多种算法来实现本公开的方法和系统。算法可以在由中央处理单元905执行时通过软件来实现。
确定、分析或统计分类是通过本领域已知的方法来完成的，包括但不限于，例如，多种有监督和无监督的数据分析和聚类方法，诸如层次聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLSDA)、机器学习(也称为随机森林)、逻辑回归、决策树、支持向量机(SVM)、K-最近邻、朴素贝叶斯、线性回归、多项式回归、用于回归的SVM、K-均值聚类和隐马尔可夫模型等。计算机系统可以执行分析本公开的蛋白质集合或蛋白质冕的各个方面，例如，比较/分析多个样品的生物分子冕，以以统计学显著性确定各个生物分子冕之间的共同模式，从而确定与生物状态相关联的蛋白质集合。计算机系统可用于开发分类器，以检测和鉴别不同的蛋白质集合或蛋白质冕(例如，蛋白质冕的组成的特征)。从本文所公开的传感器阵列收集的数据可用于训练机器学习算法，特别是从患者接收阵列测量并从每个患者输出特定生物分子冕组成的算法。在训练算法之前，可以首先对来自阵列的原始数据进行降噪，以减少单个变量中的可变性。
机器学习可以概括为学习机器在经历了学习数据集之后，对新的、未见的示例/任务进行精确执行的能力。机器学习可以包括以下概念和方法。监督学习概念可以包括AODE；人工神经网络，如反向传播、自动编码器、Hopfield网络、玻尔兹曼机器、受限玻尔兹曼机器和尖峰神经网络；贝叶斯统计，如贝叶斯网络、贝叶斯知识库；基于案例推理；高斯过程回归；基因表达式编程；数据分组处理方法(GMDH)；归纳逻辑编程；基于实例的学习；惰性学习；学习自动机；学习矢量定量；逻辑模型树；最小消息长度(决策树、决策图等)，如最近邻算法和类比建模；可能近似正确学习(Probably approximately correct learning,PAC)学习；链波下降规则，知识获取方法；符号机器学习算法；支持向量机；随机森林；分类器的集合，如自助聚集(套袋法)和提升方法(元算法)；有序分类；信息模糊网络(IFN)；条件随机场；ANOVA；线性分类器，如费雪线性判别准则、线性回归、逻辑回归、多项式逻辑回归、朴素贝叶斯分类器、感知机、支持向量机；二次分类器；k近邻算法；提升方法；决策树，如C4.5、随机森林、ID3、CART、SLIQ SPRINT；贝叶斯网络，如朴素贝叶斯；和隐马尔可夫模型。无监督学习概念可能包括；期望最大化算法；矢量定量；生成地形图(Generative topographicmap)；信息瓶颈法；人工神经网络，如自组织映射；关联规则学习，如Apriori算法，Eclat算法，FPgrowth算法；层次聚类，如单点聚类和概念聚类；聚类分析，如K-平均算法、模糊聚类、DBSCAN和OPTICS算法；和离群值检测，如局部离群值因子。半监督学习概念可以包括；生成模型；低密度分离；基于图的方法；和协同训练。强化学习概念可以包括；时间差分学习；Q学习；学习自动机；和SARSA。深度学习概念可能包括；深度信念网络；深度玻尔兹曼机；深度卷积神经网络；深度循环神经网络；和层级时间记忆(Hierarchical temporal memory)。计算机系统可适于实现本文所述的方法。该系统包括中央计算机服务器，所述中央计算机服务器被编程以实现本文所述的方法。该服务器包括中央处理单元(CPU，也称为“处理器”)，其可以是单核处理器、多核处理器或用于并行处理的多个处理器。服务器还包括存储器(例如，随机存取存储器、只读存储器、闪存)；电子存储单元(例如，硬盘)；用于与一个或多个其他系统通信的通信接口(例如，网络适配器)；以及外围设备，所述外围设备可以包括高速缓存、其他存储器、数据存储器和/或电子显示适配器。存储器、存储单元、接口和外围设备通过诸如主板的通信总线(实线)与处理器通信。存储单元可以是用于存储数据的数据存储单元。服务器借助于通信接口可操作地耦合到计算机网络(“网络”)。该网络可以是因特网、内联网和/或与因特网、远程通信或数据网络通信的内联网和/或外联网。在一些情况下，在服务器的帮助下，网络可以实现对等网络，所述对等网络可以使耦合到服务器的设备表现为客户端或服务器。
存储单元可以存储文件(如受试者报告)、和/或与关于个体的数据、或者与本公开相关联的数据的任何方面的通信。
计算机服务器可以通过网络与一个或多个远程计算机系统通信。所述一个或多个远程计算机系统可以是，例如个人计算机、笔记本电脑、平板电脑、电话、智能电话或掌上电脑。
在某些应用中，计算机系统包括单个服务器。在其他情况下，该系统包括通过内联网、外联网和/或因特网彼此通信的多个服务器。
服务器可适于存储本文提供的测量数据或数据库、来自受试者的患者信息，例如病史、家族史、人口统计数据和/或与特定应用潜在相关的其他临床或个人信息。这样的信息可以存储在存储单元或服务器上，并且这样的数据可以通过网络传输。
如本文所述的方法可以通过存储在服务器的电子存储位置(例如，存储器或电子存储单元上)上的机器(或计算机处理器)可执行代码(或软件)来实现。在使用过程中，代码可以由处理器执行。在一些情况下，代码可以从存储单元中检索并存储在存储器上，以供处理器随时访问。在某些情况下，可以排除电子存储单元，而将机器可执行指令存储在存储器中。可替代地，代码可以在第二计算机系统上执行。
本文提供的系统和方法的方面，例如服务器，可以在编程中体现。技术的各个方面可以被认为是机器可读介质类型的携带或体现的通常机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式的“产品”或“制造的制品”。机器可执行代码可以存储在电子存储单元上，如存储器(例如，只读存储器、随机存取存储器、闪存)或硬盘。“存储”型介质可包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器或其相关模块，如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可随时为软件编程提供非瞬时存储。软件的全部或部分有时可以通过因特网或各种其他电信网络进行通信。例如，这类通信可以使软件从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器，例如，从管理服务器或主计算机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元件的另一类型的介质包括光波、电波和电磁波，例如通过有线和光学陆线网络以及通过各种空中链路、跨本地设备之间的物理接口使用的。携带这类波的物理元件，例如有线或无线链路、光链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所使用的，除非限定为非暂时性的有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”之类的术语可以指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
本文描述的计算机系统可以包括用于执行本文描述的任何算法或基于算法的方法的计算机可执行代码。在一些应用中，本文描述的算法将利用包括至少一个数据库的存储器单元。
与本公开有关的数据可以通过网络或连接传输以供接收者接收和/或查看。接收者可以是、但不限于报告所涉及的受试者；或其照料者，例如，健康护理提供者、管理者、其他健康护理专业人员或其他护理者；执行和/或订购分析的人或实体。接收者也可以是用于存储此类报告的本地或远程系统(例如，“云计算”架构的服务器或其他系统)。在一个实施方案中，计算机可读介质包括适于传输使用本文所述方法的生物样品的分析结果的介质。
本文提供的系统和方法的方面可以包含在程序中。技术的各个方面可以被认为是机器可读介质类型的携带或体现的通常机器(或处理器)可执行代码和/或相关数据的形式的“产品”或“制造的制品”。机器可执行代码可以存储在电子存储单元，例如存储器(例如，只读存储器，随机存取存储器，闪存)或硬盘上。“存储”型介质可包括计算机、处理器等的任何或所有有形存储器或其相关模块，如各种半导体存储器、磁带驱动器、磁盘驱动器等，其可随时为软件编程提供非瞬时存储。软件的全部或部分有时可以通过因特网或各种其他电信网络进行通信。例如，这类通信可以使软件从一个计算机或处理器加载到另一个计算机或处理器，例如，从管理服务器或主计算机加载到应用服务器的计算机平台。因此，可以承载软件元件的另一类型的介质包括光波、电波和电磁波，例如通过有线和光学陆线网络以及通过各种空中链路、跨本地设备之间的物理接口使用的。携带这类波的物理元件，例如有线或无线链路、光链路等，也可以被认为是承载软件的介质。如本文所使用的，除非限定为非暂时性的有形“存储”介质，否则诸如计算机或机器“可读介质”之类的术语可以指参与向处理器提供指令以供执行的任何介质。
因此，诸如计算机可执行代码的机器可读介质可以采用许多形式，包括但不限于，有形存储介质、载波介质或物理传输介质。非易失性存储介质包括例如光盘或磁盘，如任何计算机等中的任何存储设备，如可用于实现附图中所示的数据库等。易失性存储介质包括动态存储器，例如这类计算机平台的主存储器。有形传输介质包括同轴电缆；铜线和光纤，包括构成计算机系统内的总线的线。载波传输介质可以采用电信号或电磁信号，或声波或光波的形式，例如在射频(RF)和红外(IR)数据通信期间产生的那些。因此，计算机可读介质的常见形式例如包括：软盘(floppy disk)、软磁盘(flexible disk)、硬盘、磁带、任何其他磁介质、CD-ROM、DVD或DVD-ROM、任何其他光学介质、穿孔卡纸带、任何其他带孔图案的物理存储介质、RAM、ROM、PROM和EPROM、FLASH-EPROM、任何其他存储器芯片或盒式磁带、传输数据或指令的载波、传输此类载波的电缆或链路、或计算机可从中读取编程代码和/或数据的任何其他介质。许多这些形式的计算机可读介质可涉及将一个或多个指令的一个或多个序列传送到处理器以供执行。
基于机器学习的蛋白质冕分类
确定与所述疾病或病症和/或疾病状态相关的蛋白质集的方法包括分析所述至少两个样品的冕。该确定、分析或统计分类通过本领域已知的方法来完成，包括但不限于，例如，多种有监督和无监督的数据分析、机器学习、深度学习和聚类方法，包括层次聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、随机森林、逻辑回归、决策树、支持向量机(SVM)、K-最近邻、朴素贝叶斯、线性回归、多项式回归、用于回归的SVM、K-最近邻和隐马尔可夫模型等。换句话说，对每个样品的冕中的蛋白质彼此进行比较/分析，以统计学显著性确定各个冕之间的共同模式，从而确定与疾病或病症或疾病状态相关联的蛋白质集合。
通常，机器学习算法用于基于描述示例的输入特征来构造准确地将类别标签分配给示例的模型。在一些情况下，对于本文描述的方法采用机器学习和/或深度学习方法可能是有利的。例如，可以使用机器学习将蛋白质冕与各种疾病状态(例如，没有疾病、疾病的前兆、患有疾病的早期或晚期等)相关联。例如，在一些情况下，结合本发明的方法使用一个或多个机器学习算法来分析由蛋白质冕和由其衍生的蛋白质集检测和获得的数据。例如，在一个实施方案中，机器学习可以与本文所述的传感器阵列耦合，用于不仅确定受试者是否患有前期癌症、患有癌症或没有癌症或会发展为癌症，而且还区分癌症的类型。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。如本说明书和随附权利要求书中所用，除非上下文另有明确说明，否则单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。除非另有陈述，否则本文中提及的任何“或”意在涵盖“和/或”。
每当术语“至少”、“大于”或“大于或等于”在两个或更多个数值的系列中的第一数值之前时，该术语“至少”、“大于”或“大于或等于”应用于该数值系列中的每个数值。例如，大于或等于1、2或3等同于大于或等于1、大于或等于2，或大于或等于3。
每当术语“不超过”、“小于”、“小于或等于”或“至多”在两个或更多个数值的系列中的第一数值之前时，该术语“不超过”、“小于”、“小于或等于”或“至多”应用于该数值系列中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1等同于小于或等于3、小于或等于2，或小于或等于1。
在值被描述为范围的情况下，应当理解，此类公开包括此类范围内所有可能的子范围以及落入此类范围内的特定数值的公开，无论特定数值或特定子范围是否被明确陈述。
编号的实施方案
以下实施方案列出本文公开的特征的非限制性排列或组合。特征的其他排列或组合也是预期的。具体而言，与这些编号的实施方案所列的顺序无关，这些编号的实施方案中的每一个都被预期为引用在前或随后编号的实施方案或与之相关。1.一种串行探询样品的方法，所述方法包括：a)使所述样品与第一颗粒类型接触并且将所述第一颗粒类型与所述样品一起孵育以形成第一生物分子冕，其中在所述第一颗粒类型与所述样品孵育时所述第一生物分子冕形成并且其中所述第一生物分子冕包含蛋白质；b)将包含所述第一生物分子冕的所述第一颗粒类型与所述样品分离；c)使所述样品与第二颗粒类型接触并且将所述第二颗粒类型与所述样品一起孵育以形成第二生物分子冕，其中在所述第二颗粒类型与所述样品孵育时所述第二生物分子冕形成，其中所述第二生物分子冕包含蛋白质，并且进一步地其中(i)所述第一颗粒类型和所述第二颗粒类型是相同的颗粒类型，或者(ii)所述第一颗粒类型和所述第二颗粒类型不同；d)将包含所述第二生物分子冕的所述第二颗粒类型与所述样品分离；e)测定所述第一生物分子冕和所述第二生物分子冕以基于所测定的第一生物分子冕和第二生物分子冕而确定所述样品中多种蛋白质的组成和浓度。2.如实施方案1的方法，其中在将所述第一颗粒类型与所述样品一起孵育以形成所述第一生物分子冕时，如通过总蛋白分析方法测量的，相对于所述样品中多种蛋白质的动态范围压缩所述第一生物分子冕中多种蛋白质的动态范围。3.如实施方案2的方法，其中所述第一生物分子冕中多种蛋白质的动态范围是以下a)与b)的第一比率：a)由在所述第一生物分子冕中的所述多种蛋白质中的较高丰度蛋白产生的信号；b)由所述第一生物分子冕中的所述多种蛋白质中的较低丰度蛋白产生的信号。4.如实施方案2的方法，其中所述第一生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是所述第一生物分子冕中的所述多种蛋白质中的最高丰度蛋白的浓度与最低丰度蛋白的浓度的第一比率。5.如实施方案2的方法，其中在所述第一生物分子冕中多种蛋白质的动态范围是在所述第一生物分子冕中在所述多种蛋白质中前十分位数蛋白质与后十分位数蛋白质的第一比率。6.如实施方案2的方法，其中所述第一生物分子冕中多种蛋白质的动态范围是第一比率，所述第一比率包括所述第一生物分子冕中的多种蛋白质中的蛋白质的四分间距的跨度。7.如实施方案2的方法，其中所述第一生物分子冕中多种蛋白质的动态范围是第一比率，所述第一比率包括所述第一生物分子冕中的多种蛋白质中的所有蛋白质浓度相对于所述样品中的相同蛋白质的已知浓度的曲线中的拟合数据的斜率。8.如实施方案7的方法，其中从数据库获得所述样品中相同蛋白质的已知浓度。9.实施方案2-8中的任一方法，其中所述样品中的多种蛋白质的动态范围是以下a)与b)的第二比率：a)如通过总蛋白分析方法测量的由所述样品中的多种蛋白质中的较高丰度蛋白产生的信号；b)如通过总蛋白分析方法测量的由在所述样品中所述多种蛋白质中的较低丰度蛋白产生的信号。10.如实施方案2-8中的任一方法，其中如通过总蛋白分析方法测量的，所述样品中的多种蛋白质的动态范围是所述样品中的多种蛋白质中的最高丰度蛋白的浓度与最低丰度蛋白的浓度的第二比率。11.如实施方案2-8中的任一方法，其中如通过总蛋白分析方法测量的，所述样品中的多种蛋白质的动态范围是所述样品中的多种蛋白质中的前十分位数蛋白质与后十分位数蛋白质的第二比率。12.如实施方案2-8中的任一方法，其中如通过总蛋白分析方法测量的，所述样品中的多种蛋白质的动态范围是第二比率，所述第二比率包括所述样品中的多种蛋白质中的蛋白质的四分间距的跨度。13.如实施方案2-8中的任一方法，其中如通过总蛋白分析方法测量的，所述样品中所述多种蛋白质的动态范围是第二比率，所述第二比率包括所述样品中的所述多种蛋白质中的所有蛋白质浓度相对于所述样品中的相同蛋白质的已知浓度的曲线中的拟合数据的斜率。14.如实施方案13的方法，其中从数据库获得所述样品中的相同蛋白质的已知浓度。15.如实施方案9-14中的任一方法，其中压缩所述动态范围包括相对于所述第二比率降低的第一比率。16.如实施方案15的方法，其中所述降低的第一比率低于所述第二比率至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。17.如实施方案1-16中的任一方法，其中所述方法进一步包括：确定所述第二生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度。18.如实施方案1-17中的任一方法，其中确定所述第一生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度或确定所述第二生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度包括进行质谱分析法。19.如实施方案1-18中的任一方法，所述方法进一步包括用一种或多种额外的颗粒类型重复步骤a)、b)和e)以形成一种或多种额外的生物分子冕。20.如实施方案19的方法，其中所述一种或多种额外的颗粒类型与所述第一颗粒类型或所述第二颗粒类型相同。21.如实施方案19的方法，其中所述一种或多种额外的颗粒类型与所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型，或其组合不同。22.如实施方案19-21中的任一方法，其中所述一种或多种额外的生物分子冕包含来自所述样品的蛋白质。23.如实施方案19-22中的任一方法，其中所述第一生物分子冕、所述第二生物分子冕、所述一种或多种额外的生物分子冕或其任何组合包含至少100种不同的蛋白质。24.如实施方案19-23中的任一方法，其中所述第一生物分子冕、所述第二生物分子冕、所述一种或多种额外的生物分子冕或其任何组合包含至少200种不同的蛋白质、至少300种不同的蛋白质、至少400种不同的蛋白质、至少500种不同的蛋白质、至少1000种不同的蛋白质、至少2000种不同的蛋白质、或至少5000种不同的蛋白质。25.如实施方案19-24中的任一方法，其中所述第一生物分子冕、所述第二生物分子冕、所述一种或多种额外的生物分子冕或其任何组合包含不同组成的蛋白质、不同浓度的蛋白质的子集或其组合。26.如实施方案19-25中的任一方法，其中所述一种或多种额外的颗粒类型与所述样品一起孵育以形成一种或多种额外的生物分子冕时，如通过总蛋白分析方法测量的，相对于所述样品中的多种蛋白质的动态范围，压缩所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围。27.如实施方案26的方法，其中所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是以下a)与b)的额外比率：a)由所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质中的较高丰度蛋白产生的信号；b)由所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质中的较低丰度蛋白产生的信号。28.如实施方案26的方法，其中所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是所述一种或多种生物分子冕中的多种蛋白质中的最高丰度蛋白的浓度与最低丰度蛋白的浓度的额外比率。29.如实施方案26的方法，其中所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是所述一种或多种生物分子冕中的多种蛋白质中的前十分位数蛋白质与后十分位数蛋白质的额外比率。30.如实施方案26的方法，其中所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是额外比率，所述额外比率包括所述一种或多种生物分子冕中的多种蛋白质中的蛋白质的四分间距的跨度。31.如实施方案26的方法，其中所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是额外比率，所述额外比率包括所述一种或多种生物分子冕中的多种蛋白质中的所有蛋白质浓度相对于所述样品中的相同蛋白质的已知浓度的曲线中的拟合数据的斜率。32.如实施方案31的方法，其中从数据库获得所述样品中的相同蛋白质的已知浓度。33.如实施方案27-32中的任一方法，其中压缩所述动态范围包括相对于所述第二比率降低的额外比率。34.如实施方案33的方法，其中所述降低的第一比率低于所述第二比率至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。35.如实施方案2-34中的任一方法，其中所述总蛋白分析方法包括通过质谱分析法、凝胶电泳或液相色谱法直接定量所述样品中的多种蛋白质。36.如实施方案1-35中的任一方法，其中所述样品包括不超过约1000μL、不超过约900μL、不超过约800μL、不超过约700μL、不超过约600μL、不超过约500μL、不超过约400μL、不超过约300μL、不超过约200μL、不超过约100μL、不超过约50μL、不超过约20μL、不超过约10μL、不超过约5μL、不超过约2μL或不超过约1μL的样品体积。37.如实施方案1-36中的任一方法，其中所述样品包括生物样品。38.如实施方案37的方法，其中所述生物样品包括生物流体。39.如实施方案38的方法，其中所述生物流体选自血浆、血清、尿液、脑脊髓液、滑液、眼泪、唾液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、汗液、沟液、精液、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、流体化的固体、细针抽吸样品、组织匀浆和细胞培养样品。40.如实施方案38-39中的任一方法，其中所述生物流体是血浆或血清。41.如实施方案38-39中的任一方法，其中所述生物流体是脑脊髓液。42.如实施方案19-41中的任一方法，其中所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型、所述一种或多种额外的颗粒类型或其任何组合选自表1。43.如实施方案1-42中的任一方法，包括在步骤a)之前通过耗尽或分级分离所述样品从所述样品中去除高丰度蛋白。44.如实施方案19-43中的任一方法，其中所述一种或多种额外的生物分子冕包含蛋白质。45.如实施方案19-44中的任一方法，其中所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型、所述一种或多种额外的颗粒类型或其任何组合包含脂质、核酸、多糖或其任何组合。46.如实施方案19-45中的任一方法，其中所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型或所述一种或多种额外的颗粒类型因至少一种物理化学性质不同。47.如实施方案1-46中的任一方法，其中所述第一颗粒类型和所述第二颗粒类型因至少一种物理化学性质不同，并且其中所述第一生物分子冕相对于所述第二生物分子冕包含不同但重叠的蛋白质子集。48.如实施方案1-47中的任一方法，其中基于所述第一生物分子冕和所述第二生物分子冕中所述不同但重叠的蛋白质子集确定所述多种蛋白质的组成和所述多种蛋白质中的蛋白质的浓度。49.如实施方案19-48中的任一方法，其中所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型、所述一种或多种额外的颗粒类型或其任何组合选自纳米颗粒、微粒、微团、脂质体、铁氧化物颗粒、石墨烯颗粒、二氧化硅颗粒、基于蛋白质的颗粒、聚苯乙烯颗粒、银颗粒、金颗粒、金属颗粒、量子点、超顺磁性颗粒或其任何组合。50.如实施方案1-49中的任一方法，其中所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型、所述一种或多种额外的颗粒类型或其任何组合是超顺磁性颗粒。51.如实施方案1-50中的任一方法，其中所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型、所述一种或多种额外的颗粒类型或其任何组合选自表1。52.如实施方案1-51中的任一方法，其中所述第一颗粒类型和所述第二颗粒类型是相同的颗粒类型，并且其中所述第一生物分子冕和所述第二生物分子冕中测定的蛋白质中的至少70％、至少80％、至少90％或至少95％相同。53.如实施方案1-52中的任一方法，其中所述第一颗粒类型和所述第二颗粒类型不同，并且其中所述第一生物分子冕和所述第二生物分子冕中测定的蛋白质中的不超过70％、不超过80％、不超过90％或不超过95％相同。54.一种分析多种生物流体的高通量方法，所述方法包括：a)使所述多种生物流体中的第一生物流体和第二生物流体与颗粒类型接触；b)在第一体积中，将所述颗粒类型与所述多种生物流体中的第一生物流体中分离并且确定与所述颗粒类型对应的第一生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度；以及c)在第二体积中，将所述颗粒类型与所述多种生物流体中的第二生物流体分离并且确定与所述颗粒类型对应的第二生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度，其中所述第一生物流体和所述第二生物流体是不同的生物流体。55.如实施方案54的方法，其中所述多种生物流体中的生物流体选自血浆、血清、尿液、脑脊髓液、滑液、眼泪、唾液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、汗液、沟液、精液、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、流体化的固体、细针抽吸样品、组织匀浆和细胞培养样品。56.如实施方案55的方法，其中所述生物流体是血浆或血清。57.如实施方案55的方法，其中所述生物流体是脑脊髓液。58.如实施方案54-57中的任一方法，其中在所述颗粒类型与所述样品接触时生物分子冕形成，并且其中所述第一生物分子冕包含蛋白质。59.如实施方案58的方法，其中所述生物分子冕包含脂质、核酸、多糖或其任何组合。60.如实施方案54-59中的任一方法，包括在步骤a)之前通过耗尽或分级分离所述样品从所述样品中去除高丰度蛋白。61.如实施方案54-60中的任一方法，其中所述颗粒类型选自纳米颗粒、微粒、微团、脂质体、铁氧化物颗粒、石墨烯颗粒、二氧化硅颗粒、基于蛋白质的颗粒、聚苯乙烯颗粒、银颗粒、金颗粒、金属颗粒、量子点、超顺磁性颗粒或其任何组合。62.如实施方案54-61中的任一方法，其中所述颗粒类型是超顺磁性颗粒。63.如实施方案54-62中的任一方法，其中所述颗粒类型选自表1。64.如实施方案1-63中的任一方法，其中所述分离包括磁性分离、过滤、重力分离或离心。65.如实施方案1-64中的任一方法，其中所述接触发生在体外。66.如实施方案38-53或55-65中的任一方法38-53或55-65，其中所述方法进一步包括通过使用经训练的算法处理在所述生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度以鉴定所述生物状态，从而鉴定所述生物流体的生物状态。67.如实施方案38-53或55-66中的任一方法，其中从受试者中分离所述生物流体。68.如实施方案67的方法，其中所述受试者是人类。69.如实施方案67的方法，其中所述受试者是非人类动物。70.如实施方案67-69中的任一方法，其中所述受试者具有状况。71.如实施方案70的方法，其中所述状况是疾病状态。72.如实施方案71的方法，其中所述疾病状态是癌症。73.如实施方案72的方法，其中所述癌症是前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌或乳癌。74.如实施方案71的方法，其中所述疾病状态是阿耳茨海默病。75.如实施方案1-74中的任一方法，其中其中所述分离包括磁性分离、基于柱的分离、过滤、基于离心柱的分离、离心、超离心、基于密度或梯度的离心、重力分离或其任何组合。76.一种分析生物流体的方法，所述方法包括：a)使生物流体在生物流体收集管中与颗粒类型接触，其中血液收集管包含稳定剂，其中所述稳定剂使所述生物流体中的无细胞核酸分子稳定；以及b)将所述生物流体和所述颗粒类型在所述生物流体收集管中一起孵育以允许所述生物流体的蛋白质与所述颗粒类型结合，从而形成包含与所述颗粒类型结合的蛋白质的生物分子冕，其中所述生物分子冕包含蛋白质群体，当所述颗粒类型在存储于EDTA中的生物流体中被孵育并且被允许形成对照生物分子冕时，也检测到所述蛋白质群体；并且其中在所述生物流体收集管中在约20℃至约35℃孵育所述生物流体和所述颗粒类型，并且其中所述生物分子冕的所述蛋白质群体中的50％以上在所述对照生物分子冕中也是能够检测的。77.如实施方案76的方法，其中所述生物分子冕的所述蛋白质群体中的60％以上、70％以上、80％以上、或者90％以上在所述对照生物分子冕中也是能够检测的。78.如实施方案76-77中的任一方法，其中与当在存储于EDTA中的所述生物流体中孵育所述颗粒类型时相比，以较高丰度检测所述蛋白质群体中的至少一个子集。79.如实施方案76-78中的任一方法，其中与当在存储于EDTA中的所述生物流体中孵育所述颗粒类型时相比，以较高丰度检测所述蛋白质群体中的至少5％。80.如实施方案76-79中的任一方法，其中与当所述颗粒类型在存储于EDTA中的所述生物流体中孵育时相比，以较高丰度检测到所述蛋白质群体中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。81.如实施方案76-80中的任一方法，进一步包括与当在存储于EDTA中的生物流体中孵育所述颗粒类型时相比，以较低检测限测定所述生物分子冕中的蛋白质。82.如实施方案76-81中的任一方法，其中所述孵育包括在室温下孵育。83.如实施方案76-82中的任一方法，其中所述孵育包括孵育多达14天、多达13天、多达12天、多达11天、多达10天、多达9天、多达8天、多达7天、多达6天、多达5天、多达4天或多达3天。84.如实施方案76-83中的任一方法，其中所述孵育包括孵育多达14天。85.如实施方案76-84中的任一方法，其中所述生物分子冕包含所述对照生物分子冕中不存在的独特蛋白质。86.如实施方案76-85中的任一方法，其中所述生物分子冕包含至少100种不同的蛋白质、至少200种不同的蛋白质、至少300种不同的蛋白质、至少400种不同的蛋白质、至少500种不同的蛋白质、至少1000种不同的蛋白质、至少2000种不同的蛋白质、或者至少5000种不同的蛋白质。87.如实施方案76-86中的任一方法，其中所述颗粒类型与100种以上不同的蛋白质结合。88.实施方案86-87中的任一方法，其中所述生物流体包括血浆、血清、尿液、脑脊髓液、滑液、眼泪、唾液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、汗液、沟液、精液、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、流体化的固体、细针抽吸样品、组织匀浆或细胞培养样品。89.如实施方案86-88中的任一方法，其中所述生物流体是血浆、血清、尿液、脑脊髓液、滑液、眼泪、唾液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、汗液、沟液、精液、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、流体化的固体、细针抽吸样品、组织匀浆或细胞培养样品。90.如实施方案76-89中的任一方法，进一步包括将所述颗粒类型与所述生物流体分离。91.如实施方案90的方法，其中分离包括磁性分离、过滤、重力分离或离心。92.如实施方案76-91中的任一方法，进一步包括确定所述生物分子冕中的蛋白质的组成和浓度。93.如实施方案76-92中的任一方法，进一步包括确定所述对照生物分子冕中的蛋白质的组成和浓度。94.如实施方案76-93中的任一方法，其中确定蛋白质的组成和浓度包括质谱分析法、凝胶电泳或液相色谱法。95.如实施方案76-94中的任一方法，其中所述稳定剂包括代谢抑制剂、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、核酸酶抑制剂、防腐剂或其组合。96.实施方案95的方法，其中所述代谢抑制剂包括甘油醛、二羟丙酮磷酸、甘油醛3-磷酸、1,3-二磷酸甘油酸、3-磷酸甘油酸酯、2-磷酸甘油酸酯、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸和甘油酸二羟基乙酸、氟化钠或K2C2O4。97.如实施方案95或96的方法，其中所述蛋白酶抑制剂包括抗痛素、抑肽酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、苯甲基磺酰氟(PMSF)、APMSF、TLCK、TPCK、亮抑酶肽、大豆胰蛋白酶抑制剂、吲哚乙酸(IAA)、E-64、EDTA、胃酶抑素、VdLPFFVdL、1,10-邻二氮杂菲、膦酰二肽(phosphoramodon)、氨肽酶抑制剂、苯丁抑制素、抑二肽素A、抑二肽素B、α-2-巨球蛋白、利马豆胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、或者蛋清卵固蛋白蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制剂。98.如实施方案95-97中的任一方法，其中所述磷酸酶抑制剂包括花萼海绵诱癌素A、节球藻毒素、NIPP-1、微囊藻素LR、变构霉素、冈田酸、斑蝥素、微囊藻素LR、冈田酸、福司曲星、变构霉素、斑蝥素、草藻灭、节球藻毒素、环孢菌素A、FK 506/免疫亲和素复合物、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、bpV(phen)、脱磷素(dephostatin)、mpV(pic)DMHV或原钒酸钠。99.如实施方案95-98中的任一方法，其中所述核酸酶抑制剂包括焦碳酸二乙酯、乙醇、金精三羧酸(ATA)、甲酰胺、氧钒核糖核苷复合物、硅藻土、乙二胺四乙酸(EDTA)、蛋白酶K、肝素、羟胺-氧-铜离子、皂土、硫酸铵、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫赤藓醇、三(2-羧乙基)磷杂环戊二烯盐酸盐、或者二价阳离子诸如Mg+2、Mn+2、Zn+2、Fe+2、Ca+2或Cu+2。100.如实施方案95-99中的任一方法，其中所述防腐剂包括重氮烷基脲、咪唑烷基脲、二羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲、二羟甲基脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、噁唑烷、羟甲基甘氨酸钠、5-羟基甲氧基甲基-1-1氮杂3,7-二氧杂双环[3.3.0]辛烷、5-羟甲基-1-1氮杂3,7二氧杂双环[3.3.0]辛烷、5-羟基聚[亚甲基氧基]甲基-1-1氮杂3,7二氧杂双环[3.3.0]辛烷、或金刚烷季铵盐。101.如实施方案76-100中的任一方法，其中所述生物流体收集管是血液收集管。102.如实施方案76-101中的任一方法，其中所述颗粒类型是纳米颗粒或微粒。103.如实施方案76-102中的任一方法，其中所述颗粒类型选自纳米颗粒、微粒、微团、脂质体、铁氧化物颗粒、石墨烯颗粒、二氧化硅颗粒、基于蛋白质的颗粒、聚苯乙烯颗粒、银颗粒、金颗粒、金属颗粒、量子点、超顺磁性颗粒及其任何组合。104.如实施方案76-103中的任一方法，其中所述颗粒类型选自表1。105.如实施方案76-104中的任一方法，进一步包括使所述生物流体与一种或多种额外的颗粒类型接触，将所述生物流体与所述一种或多种额外的颗粒类型一起孵育以允许所述生物流体的蛋白质与所述一种或多种额外颗粒类型结合，从而形成包含与所述一种或多种额外的颗粒类型结合的蛋白质的一种或多种额外的生物分子冕。106.如实施方案105的方法，其中所述一种或多种额外的颗粒类型结合与所述颗粒类型的生物分子蛋白质中的蛋白质群体不同但重叠的蛋白质群体。107.如实施方案105-106中的任一方法，其中使所述生物流体与所述一种或多种额外的颗粒类型接触在使所述生物流体与所述颗粒类型接触之后发生。1.一种分析多种生物流体的方法，所述方法包括：(a)分别使所述多种生物流体中的每种生物流体与纳米颗粒接触；(b)分离第一纳米颗粒并且与对所述多种生物流体中的第一生物流体对应的第一蛋白质冕进行分析；以及(c)分离第二纳米颗粒并且对与所述多种生物流体中的第二生物流体对应的第二蛋白质冕进行分析，其中步骤(b)和步骤(c)同时发生。2.如实施方案1的方法，所述方法进一步包括使所述多种生物流体与第三纳米颗粒接触。3.如实施方案1-2中的任一方法，所述方法进一步包括使所述多种生物流体与第四纳米颗粒接触。4.如实施方案1-3中的任一方法，所述方法进一步包括使所述多种生物流体与第五纳米颗粒接触。5.如实施方案1的方法，其中所述第一纳米颗粒和所述第二纳米颗粒相同。6.如实施方案1的方法，所述方法进一步包括使所述多种生物流体与多达10种不同的纳米颗粒接触。7.如实施方案1的方法，其中所述纳米颗粒由选自脂质、聚合物、金属或其任何组合中的材料制成。8.如实施方案7的方法，其中所述聚合物包括PS、PLA、PGA、PLGA或PVP。9.如实施方案7的方法，其中所述脂质包括EPC、DOPC、DOPG或DPPG。10.如实施方案7的方法，其中所述金属包括铁氧化物、金或银。11.如实施方案1的方法，其中所述纳米颗粒包含表面正电荷。12.如实施方案1的方法，其中所述纳米颗粒包含表面负电荷。13.如实施方案1的方法，其中所述纳米颗粒包含表面中性电荷。14.如实施方案1的方法，其中所述纳米颗粒包括1-400nm的尺寸。15.如实施方案1的方法，其中生物流体包括血浆、血清、CSF、尿液、眼泪或唾液。16.如实施方案1的方法，其中所述方法进一步包括对所述第一蛋白质冕与通过使所述第一生物流体与所述第一纳米颗粒接触鉴定的第一对照蛋白质冕进行比较。17.如实施方案1的方法，其中所述方法进一步包括对所述第二蛋白质冕与通过使所述第二生物流体与所述第二纳米颗粒接触鉴定的第二对照蛋白质冕进行比较。18.如实施方案1的方法，其中所述方法进一步包括将所述第一蛋白质冕与第一生物状态相关联。19.如实施方案1的方法，其中所述方法进一步包括将所述第二蛋白质冕与第二生物状态相关联。1.一种鉴定受试者的样品的生物状态的方法，所述方法包括：将所述样品与耗尽纳米颗粒一起孵育，从而产生被耗尽的样品；将所述被耗尽的样品与第一纳米颗粒一起孵育以产生蛋白质冕；生成与所述第一纳米颗粒相关联的对应于蛋白质冕中的蛋白质的蛋白质数据；以及利用经训练的算法处理所述蛋白质数据以鉴定所述受试者的生物状态。2.一种鉴定来自受试者的蛋白质样品的生物状态的方法，所述方法包括：分级分离所述蛋白质样品，从而产生包含所述蛋白质样品中的蛋白质子集的经分级的样品；将被耗尽的样品与第一纳米颗粒一起孵育以产生蛋白质冕；生成与所述第一纳米颗粒相关联的对应于蛋白质冕的蛋白质的蛋白质数据；以及利用经训练的算法处理所述蛋白质数据以鉴定所述受试者的生物状态，其中分级分离样品包括利用选自孔恩氏方法、柱色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、离心、过滤、超过滤和冷沉淀中的方法分离高丰度蛋白。3.如实施方案1的方法，其中将样品与耗尽纳米颗粒一起孵育包括将样品与耗尽纳米颗粒一起孵育至少约30分钟并且从样品提取耗尽纳米颗粒。4.如实施方案3的方法，其中通过将所述样品与耗尽纳米颗粒一起孵育至少约30min并且从样品提取耗尽纳米颗粒而从所述样品去除至少约80％的高丰度蛋白。5.如实施方案1的方法，进一步包括对与耗尽纳米颗粒相关的蛋白质冕进行分析。6.如实施方案1的方法，其中将样品与耗尽纳米颗粒一起孵育包括将样品与耗尽纳米颗粒一起孵育至少约60分钟并且从样品提取耗尽纳米颗粒至少两次。7.如实施方案6的方法，其中通过将样品与耗尽纳米颗粒一起孵育至少约60分钟并且从样品提取耗尽纳米颗粒至少两次而去除99％的高丰度蛋白。8.如实施方案1或2的方法，其中在被耗尽的样品中第一纳米颗粒的浓度是1-50mg/mL。9.如实施方案1或2的方法，其中在被耗尽的样品中第一纳米颗粒的浓度是2.5-10mg/mL。10.如实施方案1的方法，其中耗尽纳米颗粒包括至少一种与第一纳米颗粒不同的物理化学性质。11.如实施方案10的方法，其中所述不同的物理化学性质包括尺寸、表面电荷或化学部分。12.如实施方案1或2的方法，其中生成与第一纳米颗粒相关联的对应于蛋白质冕中的蛋白质的蛋白质数据包括确定所述蛋白质冕中的每种独特蛋白质的浓度并且将所述蛋白质冕中的每种独特蛋白质的浓度与所述生物状态相关联。13.如实施方案1或2的方法，其中利用经训练的算法处理所述蛋白质数据以鉴定所述受试者的生物状态包括将所述生物状态与生物分子指纹相关联。14.如实施方案1或2的方法，其中所述样品是血浆或血清。15.如实施方案1的方法，其中处理蛋白质数据包括分析蛋白质冕、在耗尽之前分析样品，或者分析被耗尽的样品。16.实施方案2的方法，其中处理蛋白质数据包括分析蛋白质冕、在分级分离之前分析蛋白质样品，或者分析经分级的样品。17.一种测定生物样品的方法，包括：(a)获得包含多种生物分子的生物样品，所述多种生物分子包含蛋白质；(b)基于选自尺寸、电荷、疏水性、结构和亲和性中的一种或多种特征富集所述生物样品以产生经加工的生物样品；(c)借助于一种或多种纳米颗粒从(b)的所述经加工的生物样品产生至少第一子集的生物分子和第二子集的生物分子，其中所述第一子集的生物分子与所述一种或多种纳米颗粒相关联，而所述第二子集的生物分子不与所述一种或多种纳米颗粒相关联；以及(d)分别对至少所述第一子集的生物分子或所述第二子集的生物分子进行一种或多种测定。18.如实施方案17的方法，进一步包括(e)将所述第一子集的生物分子与所述第二子集的生物分子分离。19.如实施方案17的方法，其中所述一种或多种测定包括选自质谱分析法和酶联免疫吸附测定(ELISA)中的测定。20.如实施方案17的方法，其中所述一种或多种测定包括质谱分析法。21.如实施方案17的方法，其中富集所述生物样品包括分级分离以产生所述经加工的生物样品。22.如实施方案21的方法，其中所述分级分离包括利用选自孔恩氏方法、柱色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、尺寸排阻色谱法、离心、过滤、超过滤和冷沉淀中的方法分离高丰度蛋白。23.如实施方案17的方法，其中富集所述生物样品以产生所述经加工的生物样品包括耗尽一种或多种蛋白质。24.如实施方案17的方法，其中(b)的一种或多种耗尽纳米颗粒用于产生所述经加工的生物样品。25.如实施方案24的方法，其中(b)的所述一种或多种耗尽纳米颗粒不同于(c)的所述一种或多种纳米颗粒。26.如实施方案17的方法，其中对所述第一子集进行一种或多种测定，所述测定是ELISA。27.如实施方案17的方法，其中所述生物样品是选自以下中的生物流体：血浆、血清、尿液、脑脊髓液、滑液、眼泪、唾液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、汗液、沟液、精液、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、流体化的固体、细针抽吸样品、组织匀浆和细胞培养样品。28.如实施方案17的方法，其中所述一种或多种测定产生蛋白质组学数据，并且进一步包括处理所述蛋白质组学数据以预测生物状态。29.如实施方案28的方法，其中处理所述蛋白质组学数据包括使用经训练的算法，所述经训练的算法是利用独立组的生物样品进行训练。30.如实施方案17的方法，其中所述第一子集的生物分子当与所述一种或多种纳米颗粒一起孵育以形成蛋白质冕时与所述一种或多种纳米颗粒相关联。31.如实施方案17的方法，其中在(a)之前耗尽所述生物样品。32.如实施方案17的方法，所述第一子集的生物分子和所述第二子集的生物分子包含蛋白质。
实施例
以下实施例是说明性的并且不限于本文中所述的装置、方法、系统和试剂盒的范围。
实施例1
鉴定脑脊髓液(CSF)蛋白质冕中的蛋白质
此实施例描述脑脊髓液(CSF)蛋白质冕中的蛋白质的鉴定。
为了从脑脊髓液(CSF)样品产生蛋白质冕，在微量滴定板中混合约100μL的P39颗粒与约100μL的纯CSF。所述板被密封并且在约37℃伴随着在300rpm振荡被孵育约1小时。在孵育之后，将所述板置于磁性收集器上约5分钟以形成颗粒。吸出生物样品中的未结合的蛋白质。使用磁性分离用约200μL的PBS进一步洗涤蛋白质冕三次。
为了消化结合于颗粒上的蛋白质，根据提供的操作规程使用胰蛋白酶消化试剂盒(iST 96X,PreOmics,德国)。简言之，在最后一轮洗涤之后，从所述板吸出缓冲液，向每个孔添加约50μL的溶解缓冲液并且伴随着搅拌在约95℃加热样品约10分钟。在将所述板冷却至室温之后，添加胰蛋白酶消化缓冲液并且在约37℃伴随振荡孵育所述板约3小时。用停止缓冲液停止消化过程。上清液通过磁性收集器与颗粒分离，并且通过试剂盒中包含的肽清理盒被进一步清理。用约75μL的洗脱缓冲液洗脱肽两次并进行合并。通过来自Pierce的定量比色肽测定试剂盒测量肽浓度。
将肽洗脱物冻干并在约0.1％TFA中复原。通过配有与ThermoFisher FusionLumos接口连接的Waters NanoAcquity HPLC系统的纳米级LC/MS/MS对约2μg试样(基于提交的蛋白质量值)进行分析。将肽加载于捕获柱上并且在75μm分析柱上以350nL/min进行洗脱；两个柱都填装有Luna C18树脂(Phenomenex)。除了也用1小时梯度获取的样品33295之外，在所有情况中都使用2小时梯度。质谱仪在数据依赖性模式下操作，在Orbitrap中分别以60,000FWHM分辨率和15,000FWHM分辨率进行MS和MS/MS。打开APD。对于MS和MS/MS，以3秒循环运行该仪器。通过MaxQuant软件v1.6.0.16处理质谱数据。Swissprot用于以1％蛋白质和肽错误发现率(FDR)搜索蛋白质鉴定。针对检测的肽计算峰面积。将MaxQuant结果解析至Scaffold软件中以便可视化。
图1显示在不同CSF样品中鉴定的蛋白质的总数。使一组10个单独的CSF样品与P39相互作用以产生10种蛋白质冕以供质谱分析法分析。对于每种样品，计算鉴定的蛋白质的总数：对于CSF1-约710种蛋白质；对于CSF2-约850种蛋白质；对于CSF3-约620种蛋白质；对于CSF4-约760种蛋白质；对于CSF5-约700种蛋白质；对于CSF6-约620种蛋白质；对于CSF7-约690种蛋白质；对于CSF8-约760种蛋白质；对于CSF9-约710种蛋白质；对于CSF10-约640种蛋白质。数据显示，与在血浆中用相同颗粒获得的相比，蛋白质数量显著更高。CSF蛋白质簇集在一起因为其大多数在血浆中是不能够测量的。
如图2A和图2B中所示，CSF和血浆/血清蛋白质冕表现出两种类型的样品的良好分离。血清或血浆蛋白质冕的四个样品簇集在热图的左侧四个节点上。所有的CSF蛋白质冕簇集在热图的右侧上。另外，图3显示与CSF蛋白质冕和血浆蛋白质冕相关的光谱计数。
图4显示来源于不同颗粒的CSF蛋白质冕中鉴定的蛋白质的总数。合并的CSF样品用于所有颗粒。用所有颗粒鉴定了超过1000种独特蛋白质。
实施例2
鉴定尿液蛋白质冕中的蛋白质
此实施例描述了尿液蛋白质冕中的蛋白质的鉴定。
为了从尿样产生蛋白质冕，在微量滴定板中混合约100μL的P39颗粒与约100μL的纯尿样。所述板被密封并且在约37℃伴随300rpm振荡被孵育约1小时。以与CSF蛋白质冕相同的方式进行测定的其余部分，如实施例1中所述。
如图5中所示，在每个尿样中鉴定出大量的蛋白质。在图5中，使一组10个单独的尿样(U1至U10)和1个对照血浆样品(PC)与P39相互作用以产生11种蛋白质冕以供质谱分析。对于测试的每个尿样，在每个尿样中鉴定的被鉴定的蛋白质的总数都高于在血浆中鉴定的蛋白质的数量。
实施例3
用于鉴定肽冕的样品制备以
此实施例描述用于鉴定肽冕的样品制备。
为了从肽冕生成蛋白质组学数据，血浆样品首先被变性并且在用胰蛋白酶消化之前被浓缩。在微量滴定板中孵育所得的肽与约100μL的顺磁性颗粒。所述板被密封并且在约37℃伴随300rpm振荡被孵育约1小时。使用磁性分离用TE缓冲液洗涤肽冕3次。用1％TFA/50％乙腈洗脱已结合的肽。肽洗脱物被冻干并且在0.1％TFA中被复原，之后送交以进行质谱分析。
实施例4
蛋白质冕的多路复用测量
此实施例描述蛋白质冕的多路复用测量。
可以以两种不同的方式多路复用蛋白质冕：颗粒混合和消化后混合。
对于颗粒混合，颗粒以大约相等的浓度被制备并且被预混合，然后以约100μL被接种于微量滴定板。按照常规制备生物样品并且通过上下吸取混合物至少约10次将其与颗粒完全混合。所述板被密封并且在约37℃伴随300rpm振荡被孵育约1小时。以与CSF蛋白质冕相同的方式进行该测定的其余部分，如实施例1中所述。
对于消化后混合，以与CSF蛋白质冕相同的方式进行蛋白质冕测定，如上所述。在消化的肽被洗脱出之后，来源于不同颗粒的肽被合并并被混合，然后被冻干。肽洗脱物被冻干并且在0.1％TFA中被复原，之后被送交以进行质谱分析。
图6A和图6B显示从来源于颗粒P39、HX42和HX56的蛋白质冕的多路复用测量鉴定的蛋白质。用TE缓冲液5×稀释的合并的血浆样品用于颗粒和颗粒组合的此实验。图6A显示在不同条件下鉴定的蛋白质的总数。在单个颗粒蛋白质冕(P39、HX42和HX56)的情况下，对于三种颗粒而言，可以分别鉴定出234、303和353种独特蛋白质。当全部颗粒分别被运行时，鉴定出总计411种独特蛋白质，如标记有“P39+HX42+HX56”的柱中所示。在颗粒以较高浓度混合(“3NP_8”，最终总NP浓度8mg/mL)和以较低浓度混合(“3NP_3”，最终总NP浓度3mg/mL)的情况下，鉴定出305种和284种独特蛋白质。在消化后混合所有三种蛋白质冕(“3NP_PM”)的情况下，鉴定出303种独特蛋白质。图6B显示颗粒单独运行(“P39+HX42+HX56”)、颗粒混合(“P39+HX42+HX56 NP混合”)与消化后混合(“P39+HX42+HX56消化后混合”)之间蛋白质的重叠。
实施例5
鉴定颗粒蛋白质冕中的各种蛋白质
此实施例描述颗粒蛋白质冕中的各种蛋白质的鉴定。
对23种不同颗粒类型的冕中鉴定的蛋白质与鉴定的蛋白质的细胞浓度进行比较。
图7A显示生物流体中的蛋白质组的宽范围。这表明广泛探询是困难且缓慢的。基于摘录自如Geyer等人，Mol Syst Biol 13,942–15(2017)(其通过引用整体并入本文中)中所述的血浆蛋白质组项目的从血浆或血清鉴定的蛋白质的浓度排列蛋白质。图7B显示本公开的颗粒生物传感器(列出于X-轴标记和图7B右侧的图例中)能够以深度、广度和效率探询蛋白质组。每个点代表相应颗粒的冕中鉴定的蛋白质以及文献中查到的该蛋白质的血浆浓度。可以宽浓度范围鉴定多种不同颗粒类型的蛋白质冕中的蛋白质。颗粒生物传感器在整个蛋白质组的宽动态范围中(例如，通过测定以约0.001ug/ml至多达几乎105μg/ml的浓度存在的蛋白质)快速地探询蛋白质组。
实施例6
基于颗粒的串行探询的程序
此实施例描述基于颗粒的串行探询的程序。
在第一步骤利用各种颗粒探询并且用新的或相同的颗粒串行探询血浆以进一步研究蛋白质-颗粒和/或蛋白质-蛋白质相互作用的细微变化。这种串行探询的工作流程的实例提供于表2中。颗粒类型可以根据实验设计进行改变。
表2-使用颗粒耗尽样品的顺序的实例
步骤 蛋白质来源 颗粒(NP)
1 稀释的血浆 NP1
2 通过NP1探询的血浆 NP1
3 通过NP1-NP1探询的血浆 NP1
4 通过NP1-NP1-NP-1探询的血浆 NP2
图9显示已用颗粒串行探询的血浆样品的凝胶。用P39颗粒探询样品，提取颗粒，并在凝胶上运行所得的冕(P39冕1)。用P39颗粒第二次和第三次探询上清液，每次都提取颗粒，并在凝胶上运行所得的冕(P39冕2和P39冕3)。然后，用HX-42颗粒探询上清液，提取颗粒，并在凝胶上运行所得的冕(P39和HX-42冕4)。分别地，用HX-42颗粒探询样品，提取颗粒，并在凝胶上运行所得的冕(HX-42冕1)。用HX-42颗粒第二次和第三次探询上清液，每次都提取颗粒，并在凝胶上运行所得的冕(HX-42冕2和HX-42冕3)。然后，用P39颗粒探询上清液，提取颗粒，并在凝胶上运行所得的冕(HX-42和P39冕4)。用8M尿素处理分离的颗粒以便从颗粒释放要在凝胶上运行的蛋白质。用8M尿素(HP1尿素)变性的血浆作为对照运行。
如图9中所示，一旦首先去除丰富的蛋白质，多步步骤允许分析更多样化的蛋白质。在串行探询期间产生了不同的冕。即使在血浆样品中高丰度蛋白的情况下，也观察到蛋白质冕上蛋白质丰度的变化。
实施例7
耗尽和串行探询测定
此实施例描述耗尽测定而后用颗粒进行串行探询和测定。
为了耗尽，使用来自EMD Millipore Sigma的PureProteomeTM人白蛋白/免疫球蛋白耗尽试剂盒。去除珠的原始缓冲液，用TE洗涤珠两次，并添加并涡旋4×稀释的血浆。然后，在约室温下伴随旋转孵育珠和血浆约1小时。去除上清液。
在第二测定中，使用抗白蛋白和免疫球蛋白(Ig)的磁珠耗尽血浆样品。将被耗尽的血浆用串联的两个HPLC柱进行耗尽(1)以耗尽最丰富的蛋白质并且(2)耗尽中等丰度的蛋白质。用颗粒探询被耗尽的样品和未被耗尽的样品以形成蛋白质冕。
图10显示基于凝胶图像来源于未被耗尽的血浆和被耗尽的血浆的蛋白质冕具有与颗粒结合的不同蛋白质。用P39颗粒探询未被耗尽的或被耗尽的血浆样品，并且测定蛋白质冕。红色箭头指示来源于未被耗尽的血浆样品相比于被耗尽的血浆样品的蛋白质冕中有差异的蛋白质(以条带示例)。用8M尿素处理颗粒以从颗粒释放要在凝胶上运行的蛋白质。
实施例8
用离心柱耗尽的程序
此实施例描述用离心柱耗尽的程序。
为了用离心柱耗尽，将耗尽离心柱平衡至约室温，向该柱中的树脂浆中直接添加100μL样品，在该柱中伴随着温和的上下颠倒式混合在约室温下孵育该混合物约10分钟，然后以1,000×g离心该混合物约2分钟。然后收集流穿液。
实施例9
滑液样品的蛋白质耗尽和冕分析
此实施例描述滑液样品的蛋白质耗尽和冕分析。
滑液(SF)样品与颗粒一起孵育以形成颗粒蛋白质冕。100μL样品与100μL颗粒一起孵育1小时。在孵育之后，利用磁体而使颗粒成团粒。用移液管去除上清液。团粒被用PBS洗涤并且被重新成团三次。用胰蛋白酶消化试剂盒(iST 96X,PreOmics,德国)按照该试剂盒中提供的操作规程(总结于实施例1中)消化与颗粒结合的蛋白质。通过来自Thermo FisherScientific的定量比色肽测定试剂盒测量肽浓度。按照实施例1中所述的方法对洗脱的肽进行质谱分析。
图11显示用九种不同颗粒测定的单个滑液(SF)样品的冕分析实验结果。具体的颗粒处理示于x-轴上。也使用作为对照的尚未与颗粒接触的滑液(“纯SF”)运行冕分析(“Proteograph”)测定。还绘制了通过所有九种颗粒鉴定的独特蛋白质的数量(“所有NP”)。
如由棒高度指示的，对于每种包含颗粒的冕样品，都检测出大于1000种鉴定的蛋白质。相比之下，在纯SF阴性对照中检测出仅334种鉴定的蛋白质。当将来自9种颗粒每种的冕分析结果合并时，检测出超过3500种蛋白质(“所有NP”)。
实施例10
组织和细针抽吸样品的蛋白质耗尽和冕分析
此实施例描述组织和细针抽吸样品的蛋白质耗尽和冕分析。如实施例9中关于滑液样品所述，针对组织样品和细针抽吸(FNA)样品，制备和分析蛋白质冕。
图12显示用颗粒测定的两种类型的样品的冕分析实验结果。使用1mL注射器和25G针制备细针抽吸(FNA)样品。在冕分析之前，用哺乳动物蛋白质提取试剂(M-PER)对FN样品进行细胞溶解并用缓冲液交换至TE缓冲液中。由于FNA提供的小质量，单一颗粒(P-039)用于评估FNA-冕。在冕分析之前，还用M-PER对组织样品进行细胞溶解并用缓冲液交换至TE缓冲液中。将100μL组织样品与100μL颗粒一起孵育以形成组织-颗粒冕。在Orbitrap Lumos仪器上以1小时液相色谱(LC)梯度运行肽。还对作为对照的尚未与颗粒接触的纯组织样品(“纯组织”)进行冕分析。
实施例11
蛋白质冕分析和蛋白质耗尽
此实施例描述蛋白质冕分析和蛋白质耗尽。如实施例9中关于滑液样品所述，对匹配的血浆样品和血清样品进行蛋白质冕制备和分析。将被耗尽的血浆用串联的两个HPLC柱进行耗尽(1)以耗尽最丰富的蛋白质并且(2)耗尽中等丰度的蛋白质。
图13显示用颗粒测定的匹配成对的血浆和血清样品的冕分析实验结果。测试了5×稀释的血浆和血清(分别“血浆5×”和“血清5×”)和未稀释的血浆和血清(分别“未稀释的血浆”和“未稀释的血清”)。每种颗粒处理的棒从左向右对应于血浆5×、纯血浆、血清5×、纯血清和被耗尽的血浆。此外，血浆样品的试样用IgY14和Supermix柱被深度耗尽并且与纯样品和稀释的样品一起被测试。在单独的孔中针对七种颗粒的每种测定每种样品。还对作为对照的一组无颗粒的样品(“无NP”)进行测试。
实验表明对于大多数颗粒处理而言在被耗尽的血浆样品中鉴定出最大数量的蛋白质。
实施例12
在包含核酸稳定剂的血液收集管中收集的样品的蛋白质冕分析
此实施例描述在包含核酸稳定剂的血液收集管中收集的样品的蛋白质冕分析。
在EDTA血液收集管(BCT，BD Biosciences产品#366643)中收集来自三位患者(#1、#2和#3)的血液样品，在样品收集的一小时内进行离心和冷冻。还在Streck BCT中收集来自所述三位患者的血液样品，伴随着温和的摇动在室温下储存过夜，在其后加工并冷冻血浆。Streck样品处理被设计为模拟在环境温度下样品的过夜运输。图33总结在EDT样品收集管(左)或Streck样品收集管(右)中收集的生物样品的加工方法。
图14显示比较在EDTA血液收集管(“EDTA”)中收集的血液样品与Streck血液收集管(“STRECK”)中收集的样品的实验结果。对从三位患者(#1、#2和#3)收集的血液样品进行回收肽质量分析。在有颗粒(“P39冕”)和无颗粒(“纯血浆”)的情况下测定每个样品。棒高度指示在每个样品中回收的平均蛋白质量。未观察到EDTA与STRECK血浆冕之间的肽产量的差异。尚未与颗粒接触的EDTA和Streck血浆样品产生相似的肽质量。考虑到观察到的肽定量的典型变异系数(约10％至15％)，用颗粒测定的Streck血浆样品也产生与用颗粒测定的EDTA血浆样品相似的肽质量。
然后，利用蛋白质冕分析确定在EDTA BCT或Streck BCT中收集的每个样品中存在的蛋白质、肽和特征的数量。图15显示通过对样品进行的冕分析实验鉴定的蛋白质的平均数量。棒高度指示每个样品中鉴定的蛋白质的平均数量。未观察到EDTA与STRECK血浆冕之间鉴定的蛋白质的数量的差异。在尚未与颗粒接触的EDTA和Streck血浆样品中鉴定出相似的蛋白质的数量。相比于用颗粒测定的EDTA血浆样品，在用颗粒测定的Streck血浆样品中鉴定出更多的蛋白质。
图16显示通过对样品进行的冕分析实验检测的肽的平均数量。棒高度指示每个样品中检测的肽的平均数量。未观察到EDTA与STRECK血浆冕之间鉴定的肽的数量的差异。相比于用颗粒测定的EDTA血浆样品，在用颗粒测定的Streck血浆样品中检测出更多的肽。
图17显示通过对样品进行的冕分析实验鉴定的特征的平均数量。棒高度指示在每个样品中鉴定的特征的平均数量。未观察到EDTA与STRECK血浆冕之间的特征数量的差异。相比于用颗粒测定的EDTA血浆样品，在用颗粒测定的Streck血浆样品中检测出相似特征数量。
图18显示图14-图17中所示的实验结果的总结。圆圈代表在所示的条件下在每个样品中鉴定的蛋白质。圆圈的重叠区指示在相应的EDT样品和Streck样品二者中鉴定的蛋白质。圆圈的非重叠区指示在相应的条件下测定的仅EDT样品或仅Streck样品中鉴定的蛋白质。在每对中朝向左的圆圈代表EDT样品，而在每对中朝向右的圆圈代表Streck样品。每个患者样品(#1、#2和#3)都产生不存在颗粒下测定的Streck样品与不存在颗粒下测定的EDT样品之间的相似数量的共有蛋白质。虽然在每个患者样品中鉴定出在用颗粒测定的Streck样品与用颗粒测定的EDT样品之间的相似数量的共有蛋白质，与用颗粒测定的EDT样品相比，在用颗粒测定的Streck样品中鉴定出更多独特的蛋白质。
图19显示在每个患者样品中通过冕分析鉴定的所选蛋白质类型的单独蛋白质的数量。绘制了在三位患者样品的每个中在用颗粒测定的仅Streck样品(“Streck”)或用颗粒测定的仅EDT样品(“EDTA”)中鉴定的所选蛋白质类型的蛋白质的数量。还绘制了在三位患者样品的每个中在用颗粒测定的Streck样品和用颗粒测定的EDT样品二者中鉴定的所选蛋白质类型的蛋白质的数量(“重叠”)。在显示由Streck样品和EDT样品共有的共同蛋白质的“重叠”数据中，鉴定的糖蛋白类、核相关的蛋白类、DNA相关的蛋白类以及RNA相关的蛋白类的数量最高。
图20显示在图14-图19中绘制的样品的蛋白质群组强度的分布。EDTA和STRECK血浆样品在有或无颗粒的情况下被测定时表现出相似的肽产量、蛋白质计数、肽计数、特征计数和蛋白质类别，表明在蛋白质冕分析测定中在包含核酸稳定剂的样品收集管中收集的样品的适合性。
图21显示在图14-图20中绘制的样品的蛋白质群组强度的变异系数百分比(％CV)。EDTA和STRECK血浆样品在有或无颗粒的情况下被测定时表现出相似的再现性，表明在蛋白质冕分析测定中在包含核酸稳定剂的样品收集管中收集的样品的适合性。
图22A和图22B显示在图14-图21中绘制的在颗粒存在下测定的样品中鉴定的共同和独特蛋白质的数量。每个圆圈的重叠区中的数值指示由重叠圆圈表示的每个样品中鉴定的蛋白质。图22A显示在EDTA血液收集管中收集的每个患者样品中鉴定的共同和独特蛋白质的数量，而图22B显示在Streck血液收集管中收集的每个患者样品中鉴定的共同和独特蛋白质的数量。在Streck血液收集管和EDT血液收集管中收集的样品表现出重复样品中的相似一致性。
图23显示在图14-图22中绘制的样品的蛋白质群组强度的变异系数百分比(％CV)。
图24显示在Streck血液收集管(STRECK产品#218962)和EDT血液收集管二者中收集的样品中鉴定并且绘制于图14-图23中的共同蛋白质群组的强度的图。Streck样品的蛋白质群组强度绘制于x-轴上。EDT样品的蛋白质群组强度绘制于y-轴上。对在存在(左图，“类型＝P39冕”)或不存在(右图，“类型＝纯血浆”)颗粒下测定的样品绘制了针对患者样品#1(上图)、#2(中间图)和#3(下图)的蛋白质群组强度。在每个图的右下角中提供线性拟合的R2值(“Rsq”)。这些结果表明，在所有测试的条件下在Streck血液收集管和EDT血液收集管中收集的样品之间蛋白质群组强度良好地相关联。
图25A和图25B显示在图14-图24中在Streck血液收集管和EDT血液收集管二者中收集的样品中鉴定的蛋白质群组的数量。图25A显示在每个样品中鉴定的包含至少一种血浆蛋白质的蛋白质群组的数量。图25B显示在每个样品中鉴定的不包含每个样品中鉴定的至少一种血浆蛋白质的蛋白质群组的数量。蛋白质分类为血浆蛋白质是基于由Keshishian等人(Mol.Cell Proteomics 14,2375–2393(2015))鉴定的5,304种血浆蛋白质的集合，其通过引用整体并入本文中。
这些测定表明，在来源于包含核酸稳定剂的血液收集管中收集的血浆和EDT血液收集管中收集的血浆的冕中，蛋白质覆盖率基本上相似。与在EDT血液收集管中收集的血浆中相比，在包含核酸稳定剂的血液收集管中收集的血浆中更频繁地鉴定出来自某些蛋白质群组的蛋白质，例如糖蛋白、核相关的蛋白、DNA相关的蛋白以及RNA相关的蛋白。这些结果共同表明，在包含核酸稳定剂的管(例如，Streck管)中收集的样品适合用于蛋白质冕分析。
实施例13
在包含核酸稳定剂的管中收集的肺癌样品的蛋白质冕分析
此实施例描述在包含核酸稳定剂的管中收集的肺癌样品的蛋白质冕分析。
从参与肺癌研究的受试者收集样品。在EDTA血浆收集管和Streck血浆收集管中收集来自每位受试者的样品。加工收集的样品以供蛋白质冕分析。对EDT样品收集管中收集的样品就地进行分析。过夜运输Streck样品收集管中收集的样品并且在远程设备中对其进行分析。用单个颗粒类型对来自20位受试者的样品进行分析。一式三份地测定每个样品。利用TF Lumos以1小时数据-依赖性采集(DDA)运行对每个样品和重复样品进行MS分析。
图26显示在收集于EDT样品收集管(“EDTA”)或Streck样品收集管(“Streck”)中的生物样品中实验鉴定的蛋白质的重叠。虽然在收集于EDTA管中的样品中鉴定出更多的蛋白质，但是在收集于Streck管中的样品中鉴定的蛋白质与在收集于EDTA管中的样品中鉴定的蛋白质几乎完全重叠。
图27显示在收集于EDT样品收集管中的样品和收集于Streck样品收集管中的样品中鉴定的蛋白质的平均蛋白质群组强度。针对Carr血浆蛋白质组数据库中存在的且在收集于EDT样品收集管中的样品(y-轴)和收集于Streck样品收集管中的样品(x-轴)二者中鉴定出的蛋白质绘制蛋白质群组强度。
图28A和图28B显示在图27中鉴定的115个蛋白质群组之间的斯皮尔曼(图28A)和皮尔森(图28B)相关系数。斯皮尔曼和皮尔森相关系数二者都指示收集于EDTA管中的样品与收集于Streck管中的样品之间的蛋白质群组强度的强正相关性。这些结果共同表明，在Streck管中收集生物样品适合于利用颗粒样品制备方法进行大规模蛋白组学谱分析。
实施例14
通过串行探询脑脊髓液样品的冕分析
此实施例描述通过串行探询脑脊髓液样品的冕分析。从受试者收集脑脊髓液样品。选自表1中提供的颗粒中的第一颗粒类型被添加到100μL脑脊髓液样品中并且被孵育以形成蛋白质冕。通过离心或磁性下拉将第一颗粒类型与脑脊髓液样品分离。收集上清液。洗涤并重悬包含所述颗粒的团粒，并且通过质谱分析法对冕进行分析。将选自表1中提供的颗粒中的第二颗粒类型被添加到上清液中并且被孵育以形成蛋白质冕。任选地，第二颗粒类型与第一颗粒类型相同。通过离心或磁性下拉将第二颗粒类型与上清液分离。收集上清液。洗涤并重悬包含所述颗粒的团粒，并且通过质谱分析法对冕进行分析。选自表1中提供的颗粒中的第三颗粒类型被添加到上清液中并且被孵育以形成蛋白质冕。任选地，第三颗粒类型与第一颗粒类型相同。通过离心或磁性下拉将第三颗粒类型与上清液分离。收集上清液。洗涤并重悬包含所述颗粒的团粒，并且通过质谱分析法对冕进行分析。用选自表1中提供的颗粒中的多达10种颗粒类型对上清液进行重新探询，并且通过质谱分析法对每种颗粒类型上形成的蛋白质冕进行分析。从多达10种颗粒类型的每种颗粒上形成的蛋白质冕的质谱分析中鉴定出蛋白质。
实施例15
通过串行探询滑液样品的冕分析
此实施例描述通过串行探询滑液样品的冕分析。从受试者收集滑液样品。选自表1中提供的颗粒中的第一颗粒类型被添加到100μL滑液样品中并且被孵育以形成蛋白质冕。通过离心或磁性下拉将第一颗粒类型与滑液样品分离。收集上清液。洗涤并重悬包含所述颗粒的团粒，并且通过质谱分析法对冕进行分析。选自表1中提供的颗粒中的第二颗粒类型被添加到上清液中并且被孵育以形成蛋白质冕。任选地，第二颗粒类型与第一颗粒类型相同。通过离心或磁性下拉将第二颗粒类型与上清液分离。收集上清液。洗涤并重悬包含所述颗粒的团粒，并且通过质谱分析法对冕进行分析。选自表1中提供的颗粒中的第三颗粒类型被添加上清液中并且被孵育以形成蛋白质冕。任选地，第三颗粒类型与第一颗粒类型相同。通过离心或磁性下拉将第三颗粒类型与上清液分离。收集上清液。洗涤并重悬包含所述颗粒的团粒，并且通过质谱分析法对冕进行分析。用选自表1中提供的颗粒中的多达10种颗粒类型对上清液进行重新探询，并且通过质谱分析法对每种颗粒类型上形成的蛋白质冕进行分析。从多达10种颗粒类型的每种颗粒上形成的蛋白质冕的质谱分析中鉴定出蛋白质。
实施例16
通过串行探询均质组织样品的冕分析
此实施例描述通过串行探询均质组织样品的冕分析。从受试者收集均质组织样品。选自表1中提供的颗粒中的第一颗粒类型被添加到100μL均质组织样品中并且被孵育以形成蛋白质冕。通过离心或磁性下拉将第一颗粒类型与均质组织样品分离。收集上清液。洗涤并重悬包含所述颗粒的团粒，并且通过质谱分析法对冕进行分析。选自表1中提供的颗粒中的第二颗粒类型被添加到上清液中并且被孵育以形成蛋白质冕。任选地，第二颗粒类型与第一颗粒类型相同。通过离心或磁性下拉将第二颗粒类型与上清液分离。收集上清液。洗涤并重悬包含所述颗粒的团粒，并且通过质谱分析法对冕进行分析。选自表1中提供的颗粒中的第三颗粒类型被添加到上清液中并且被孵育以形成蛋白质冕。任选地，第三颗粒类型与第一颗粒类型相同。通过离心或磁性下拉将第三颗粒类型与上清液分离。收集上清液。洗涤并重悬包含所述颗粒的团粒，并且通过质谱分析法对冕进行分析。用选自表1中提供的颗粒中的多达10种颗粒类型对上清液进行重新探询，并且通过质谱分析法对每种颗粒类型上形成的蛋白质冕进行分析。从多达10种颗粒类型的每种颗粒上形成的蛋白质冕的质谱分析中鉴定出蛋白质。
实施例17
通过串行探询血浆样品的冕分析
此实施例描述通过串行探询血浆样品的冕分析。从受试者收集血浆样品。选自表1中提供的颗粒中的第一颗粒类型被添加到100μL滑液样品中并且被孵育以形成蛋白质冕。通过离心或磁性下拉将第一颗粒类型与血浆样品分离。收集上清液。洗涤并重悬包含所述颗粒的团粒，并且通过质谱分析法对冕进行分析。选自表1中提供的颗粒中的第二颗粒类型被添加到上清液中并且被孵育以形成蛋白质冕。任选地，第二颗粒类型与第一颗粒类型相同。通过离心或磁性下拉将第二颗粒类型与上清液分离。收集上清液。洗涤并重悬包含所述颗粒的团粒，并且通过质谱分析法对冕进行分析。选自表1中提供的颗粒中的第三颗粒类型被添加到上清液中并且被孵育以形成蛋白质冕。任选地，第三颗粒类型与第一颗粒类型相同。通过离心或磁性下拉将第三颗粒类型与上清液分离。收集上清液。洗涤并重悬包含所述颗粒的团粒，并且通过质谱分析法对冕进行分析。用选自表1中提供的颗粒中的多达10种颗粒类型对上清液进行重新探询，并且通过质谱分析法对每种颗粒类型上形成的蛋白质冕进行分析。从多达10种颗粒类型的每种颗粒上形成的蛋白质冕的质谱分析中鉴定出蛋白质。
实施例18
通过串行探询尿样的冕分析
此实施例描述通过串行探询尿样的冕分析。从受试者收集尿样。选自表1中提供的颗粒中的第一颗粒类型被添加到100μL尿样中并且被孵育以形成蛋白质冕。通过离心或磁性下拉将第一颗粒类型与尿样分离。收集上清液。洗涤并重悬包含所述颗粒的团粒，并且通过质谱分析法对冕进行分析。选自表1中提供的颗粒中的第二颗粒类型被添加到上清液中并且被孵育以形成蛋白质冕。任选地，第二颗粒类型与第一颗粒类型相同。通过离心或磁性下拉将第二颗粒类型与上清液分离。收集上清液。洗涤并重悬包含所述颗粒的团粒，并且通过质谱分析法对冕进行分析。选自表1中提供的颗粒中的第三颗粒类型被添加到上清液中并且被孵育以形成蛋白质冕。任选地，第三颗粒类型与第一颗粒类型相同。通过离心或磁性下拉将第三颗粒类型与上清液分离。收集上清液。洗涤并重悬包含所述颗粒的团粒，并且通过质谱分析法对冕进行分析。用选自表1中提供的颗粒中的多达10种颗粒类型对上清液进行重新探询，并且通过质谱分析法对每种颗粒类型上形成的蛋白质冕进行分析。从多达10种颗粒类型的每种颗粒上形成的蛋白质冕的质谱分析中鉴定出蛋白质。
实施例19
在收集于包含核酸稳定剂的EDTA收集管或血液收集管中的血浆样品中通过ELISA的蛋白质检测
此实施例描述在收集于包含核酸稳定剂的EDTA收集管或血液收集管中的血浆样品中通过ELISA的蛋白质检测。从人类受试者收集血浆样品于EDTA血液收集管或Streck血液收集管中。为了比较，从20位患者中的每位收集成对的EDTA和Streck样品。在每个样品中通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量三种高度重要的蛋白质C-反应性蛋白质(CRP)、钙粒蛋白A和B(“S100”)和MUC16/CA125(“CA125”)的浓度。CRP是血浆中发现的五聚体蛋白质，响应于炎症其循环浓度升高。CRP的升高水平与任何类型的癌症(肺癌，可能是结肠直肠癌)的未来风险增高相关。钙粒蛋白A和B是钙结合蛋白，其由激活的免疫细胞(诸如单核细胞、粒细胞和嗜中性粒细胞)以异二聚体形式分泌，并且在炎性疾病诸如类风湿性关节炎以及在一些类型的癌症中较大量地表达。CA125是眼睛表面、呼吸道和女性生殖道的成分，并且已被证明通过若干不同机制在促进肿瘤发生和肿瘤增生方面发挥作用。
利用对每种蛋白质特异性的可商购的试剂盒测量蛋白质浓度。利用人C-反应性蛋白质/CRP试剂盒(R&D Systems,Inc.)检测CRP，利用人S100A8/S100A9异二聚体试剂盒(R&DSystems,Inc.)检测S100，利用人CA125/MUC16试剂盒(R&D Systems,Inc.)检测CA125。图30A-图30C显示在收集于EDT血液收集管中的血浆样品(x-轴)与收集于Streck样品收集管中的血浆样品(y-轴)之间的通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量的三种蛋白质浓度的相关性。图30A显示C-反应性蛋白质(CRP)的相关性。图30B显示钙粒蛋白A和B异二聚体(“S100”)的相关性。图30C显示MUC16/CA125(“CA125”)的相关性。一式两份地测量每个样品中蛋白质浓度并且在两个重复样品之间取平均值。CRP、S100和CA125的浓度在收集于EDT血液收集管中的样品与收集于Streck血液收集管中的样品之间充分地相关联。图31显示在收集于EDT血液收集管或Streck血液收集管中的血浆样品中通过ELISA检测的蛋白质浓度的CRP(左侧两个方框和触须线)、S100(中间两个方框和触须线)和CA125(右侧两个方框和触须线)的变异系数百分比(％CV)。收集于EDT血液收集管中的样品与收集于Streck血液收集管中的样品之间的蛋白质浓度的变异系数百分比是一致的。图32显示对于CRP(左图)、S100(中间图)和CA125(右图)收集于EDT血液收集管或Streck血液收集管中的样品中通过ELISA检测到的蛋白质浓度的配对差异。收集于EDTA血液收集管中的样品与收集于Streck血液收集管中的样品的蛋白质浓度的差异低。
实施例20
使用蛋白质冕分析的血浆的动态范围压缩
此实施例描述使用蛋白质冕分析的血浆的动态范围压缩。
为了评估颗粒压缩测量的动态范围的能力，将测量的并鉴定的蛋白质特征强度与相同蛋白质浓度的公布值进行比较。首先，用蛋白质的所有可能特征的最大MS确定强度(使用OpenMS MS数据处理工具提取单同位素峰值)选择每种蛋白质的所得的肽特征，然后针对那些相同蛋白质的公开丰度水平对强度进行建模。图34显示颗粒冕蛋白质和血浆蛋白质的最大强度与相同蛋白质的公布浓度之间的相关性。蓝色绘制线是数据的线性回归模型，阴影区表示该模型拟合的标准误差。如线性拟合的斜率降低所示，与未用颗粒测定的血浆样品(“血浆”)相比，用颗粒(“S-003”、“S-007”和“S-011”)测定的样品的动态范围表现出压缩的动态范围。对于无颗粒的血浆、具有S-003颗粒的血浆、具有S-007颗粒的血浆和具有S-011颗粒的血浆，每个图的斜率分别为0.47、0.19、0.22和0.18。图35显示与在未形成颗粒冕的情况下的质谱分析法相比，使用质谱分析法的蛋白质冕分析测定的动态范围压缩。相对于通过无颗粒的血浆的质谱分析法鉴定的蛋白质强度(“血浆MS ln强度”)绘制在图34中测定的血浆样品中在颗粒冕中鉴定的共同蛋白质的蛋白质强度(“纳米颗粒MS ln强度”)。最浅的虚线显示斜率为1，表示在无颗粒的情况下质谱分析法的动态范围。对于S-003、S-007和S-011颗粒，对蛋白质强度的线性拟合的斜率分别为0.12、0.36和0.093。灰色区域指示回归拟合的标准误差区。
通过比较回归模型斜率和测量数据的强度跨度，颗粒冕以较低丰度(测量或报告)含有比血浆中含有的更多的蛋白质。与血浆测量相比，针对颗粒测量的这些测量值的动态范围被压缩(回归模型的斜率减小)。这与先前的观察一致，即与血浆中的原始动态范围相比，颗粒可以有效地压缩所得的冕中对于丰度的测量的动态范围，这可以归因于蛋白质的绝对浓度、其与颗粒的结合亲和力以及其与邻近蛋白质的相互作用的组合。以上结果表明，多颗粒型蛋白质冕策略有助于广谱血浆蛋白质特别是低丰度的那些血浆蛋白质的鉴定，这对于通过常规蛋白质组学技术的快速检测是具有挑战性的。
实施例21
与并行探询样品相比的串行探询
此实施例描述与使用颗粒的并行探询样品相比的使用颗粒串行探询样品。
用两种或更多个颗粒类型串行探询具有10μL低样品体积的第一样品。使第一颗粒类型与第一样品接触，将第一样品和第一颗粒类型一起孵育以允许在第一颗粒类型上形成第一生物分子冕，将第一颗粒类型与第一样品分离。使第一样品的剩余部分与第二颗粒类型接触，将第一样品的剩余部分与第二颗粒类型一起孵育以允许在第二颗粒类型上形成第二生物分子冕，将第二颗粒类型与第一样品的剩余部分分离。任选地，用额外的颗粒类型重复所述接触、孵育和分离。通过例如质谱分析法测定所述冕中的蛋白质，对第一颗粒类型、第二颗粒类型以及任何额外颗粒类型上的生物分子冕进行分析。
将来自与第一样品相同的来源的第二样品分成多个10μL试样以用两种或更多个颗粒类型进行并行探询。将所述样品分成大于或等于要用于测定蛋白质的方法中的颗粒类型的数量的若干试样。使第一颗粒类型与第一试样接触，将第一试样与第一颗粒类型一起孵育以允许在第一颗粒类型上形成第一生物分子冕，将第一颗粒类型与第一试样分离。并行地，使第二颗粒类型与第二试样接触，将第二试样与第二颗粒类型一起孵育以允许在第二颗粒类型上形成第二生物分子冕，将第二颗粒类型与第二试样分离。在额外试样中用额外颗粒类型进行所述接触、孵育和分离。通过例如质谱分析法测定所述冕中的蛋白质，对第一颗粒类型、第二颗粒类型以及任何额外颗粒类型上的生物分子冕进行分析。
对于蛋白质冕分析用两种或更多个颗粒类型的第一样品的串行探询与第二样品的并行探询相比使用较小的样品体积(总计10μL)，第二样品的并行探询使用每种待测定的颗粒类型10μL样品。即使在使用较少的总样品时，第一样品的串行探询使蛋白质的检测范围可以与通过并行探询检测的范围相当或者比通过并行探询检测的范围更宽。如图9中所示，在颗粒(例如，HX-42)上形成的生物分子冕，当首先接触样品时(“HX-42冕1”)，与当接触样品然后用另一种颗粒类型进行3轮串行探询(“P39&HX-42冕4”)时相比，可以包含不同的蛋白质群体。第一样品的串行探询使低丰度蛋白的检测范围能够与通过并行探询检测的范围类似或者比其更宽。例如，第一样品的串行探询可以在早期几轮探询中导致低丰度高亲和性蛋白质的耗尽，允许将低丰度低亲和性蛋白质吸附于后期几轮探询中使用的颗粒类型的生物分子冕中。
虽然已经示出并在本文中描述了本发明的优选实施方案，对本领域技术人员来说显而易见的是，仅通过举例的方式来提供这样的实施方案。在不脱离本发明的情况下，许多变型、改变和替代对本领域技术人员现在将容易想到。应当理解，在实践本发明时可以采用本文所述的本发明实施例的各种替代方案。所附权利要求旨在限定本发明内容的范围，并且由此覆盖这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。

Claims (107)

1.一种串行探询样品的方法，所述方法包括：
a)使所述样品与第一颗粒类型接触并且将所述第一颗粒类型与所述样品一起孵育以形成第一生物分子冕，其中在所述第一颗粒类型与所述样品一起孵育时所述第一生物分子冕形成，并且其中所述第一生物分子冕包含蛋白质；
b)将包含所述第一生物分子冕的第一颗粒类型与所述样品分离；
c)使所述样品与第二颗粒类型接触并且将所述第二颗粒类型与所述样品一起孵育以形成第二生物分子冕，其中在所述第二颗粒类型与所述样品一起孵育时所述第二生物分子冕形成，其中所述第二生物分子冕包含蛋白质，并且其中(i)所述第一颗粒类型和所述第二颗粒类型是相同的颗粒类型，或者(ii)所述第一颗粒类型和所述第二颗粒类型不同；
d)将包含所述第二生物分子冕的第二颗粒类型与所述样品分离；
e)测定所述第一生物分子冕和所述第二生物分子冕，以基于所测定的第一生物分子冕和第二生物分子冕确定所述样品中的多种蛋白质的组成和浓度。
2.如权利要求1所述的方法，其中在将所述第一颗粒类型与所述样品一起孵育以形成所述第一生物分子冕时，如通过总蛋白分析方法测量的，相对于所述样品中的多种蛋白质的动态范围压缩所述第一生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述第一生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是以下a)与b)的第一比率：
a)由所述第一生物分子冕中的多种蛋白质中的较高丰度蛋白产生的信号；
b)由所述第一生物分子冕中的多种蛋白质中的较低丰度蛋白产生的信号。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述第一生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是所述第一生物分子冕中的多种蛋白质中的最高丰度蛋白的浓度与最低丰度蛋白的浓度的第一比率。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述第一生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是所述第一生物分子冕中的多种蛋白质中的前十分位数蛋白质与后十分位数蛋白质的第一比率。
6.如权利要求2所述的方法，其中所述第一生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是第一比率，所述第一比率包括所述第一生物分子冕中的多种蛋白质中的蛋白质的四分间距的跨度。
7.如权利要求2所述的方法，其中所述第一生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是第一比率，所述第一比率包括所述第一生物分子冕中的多种蛋白质中的所有蛋白质浓度相对于所述样品中的相同蛋白质的已知浓度的曲线中的拟合数据的斜率。
8.如权利要求7所述的方法，其中从数据库获得所述样品中的相同蛋白质的已知浓度。
9.如权利要求2-8中的任一项所述的方法，其中所述样品中的多种蛋白质的动态范围是以下a)与b)的第二比率：
a)如通过总蛋白分析方法测量的，由所述样品中的多种蛋白质中的较高丰度蛋白产生的信号；
b)如通过总蛋白分析方法测量的，由所述样品中的多种蛋白质中的较低丰度蛋白产生的信号。
10.如权利要求2-8中的任一项所述的方法，其中如通过总蛋白分析方法测量的，所述样品中的多种蛋白质的动态范围是所述样品中的多种蛋白质中的最高丰度蛋白的浓度与最低丰度蛋白的浓度的第二比率。
11.如权利要求2-8中的任一项所述的方法，其中如通过总蛋白分析方法测量的，所述样品中的多种蛋白质的动态范围是所述样品中的多种蛋白质中的前十分位数蛋白质与后十分位数蛋白质的第二比率。
12.如权利要求2-8中的任一项所述的方法，其中如通过总蛋白分析方法测量的，所述样品中的多种蛋白质的动态范围是第二比率，所述第二比率包括所述样品中的多种蛋白质中的蛋白质的四分间距的跨度。
13.如权利要求2-8中的任一项所述的方法，其中如通过总蛋白分析方法测量的，所述样品中的多种蛋白质的动态范围是第二比率，所述第二比率包括所述样品中的多种蛋白质中的所有蛋白质浓度相对于所述样品中的相同蛋白质的已知浓度的曲线中的拟合数据的斜率。
14.如权利要求13所述的方法，其中从数据库获得所述样品中的相同蛋白质的已知浓度。
15.如权利要求9-14中的任一项所述的方法，其中压缩所述动态范围包括相对于所述第二比率降低的第一比率。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述降低的第一比率低于所述第二比率至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。
17.如权利要求1-16中的任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括：确定所述第二生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度。
18.如权利要求1-17中的任一项所述的方法，其中确定所述第一生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度或确定所述第二生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度包括进行质谱分析法。
19.如权利要求1-18中的任一项所述的方法，所述方法进一步包括用一种或多种额外的颗粒类型重复步骤a)、b)和e)以形成一种或多种额外的生物分子冕。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述一种或多种额外的颗粒类型与所述第一颗粒类型或所述第二颗粒类型相同。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述一种或多种额外的颗粒类型与所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型或其组合不同。
22.如权利要求19-21中的任一项所述的方法，其中所述一种或多种额外的生物分子冕包含来自所述样品的蛋白质。
23.如权利要求19-22中的任一项所述的方法，其中所述第一生物分子冕、所述第二生物分子冕、所述一种或多种额外的生物分子冕或其任何组合包含至少100种不同的蛋白质。
24.如权利要求19-23中的任一项所述的方法，其中所述第一生物分子冕、所述第二生物分子冕、所述一种或多种额外的生物分子冕或其任何组合包含至少200种不同的蛋白质、至少300种不同的蛋白质、至少400种不同的蛋白质、至少500种不同的蛋白质、至少1000种不同的蛋白质、至少2000种不同的蛋白质、或至少5000种不同的蛋白质。
25.如权利要求19-24中的任一项所述的方法，其中所述第一生物分子冕、所述第二生物分子冕、所述一种或多种额外的生物分子冕或其任何组合包含不同组成的蛋白质、不同浓度的蛋白质的子集或其组合。
26.如权利要求19-25中的任一项所述的方法，其中在所述一种或多种额外的颗粒类型与所述样品一起孵育以形成一种或多种额外的生物分子冕时，如通过总蛋白分析方法测量的，相对于所述样品中的多种蛋白质的动态范围压缩所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是以下a)与b)的额外比率：
a)由所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质中的较高丰度蛋白产生的信号；
b)由所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质中的较低丰度蛋白产生的信号。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是所述一种或多种生物分子冕中的多种蛋白质中的最高丰度蛋白的浓度与最低丰度蛋白的浓度的额外比率。
29.如权利要求26所述的方法，其中所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是所述一种或多种生物分子冕中的多种蛋白质中的前十分位数蛋白质与后十分位数蛋白质的额外比率。
30.如权利要求26所述的方法，其中所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是额外比率，所述额外比率包括所述一种或多种生物分子冕中的多种蛋白质中的蛋白质的四分间距的跨度。
31.如权利要求26所述的方法，其中所述一种或多种额外的生物分子冕中的多种蛋白质的动态范围是额外比率，所述额外比率包括所述一种或多种生物分子冕中的多种蛋白质中的所有蛋白质浓度相对于所述样品中的相同蛋白质的已知浓度的曲线中的拟合数据的斜率。
32.如权利要求31所述的方法，其中从数据库获得所述样品中的相同蛋白质的已知浓度。
33.如权利要求27-32中的任一项所述的方法，其中压缩所述动态范围包括相对于所述第二比率降低的额外比率。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述降低的第一比率低于所述第二比率至少1.1倍、至少1.2倍、至少1.3倍、至少1.4倍、至少1.5倍、至少2倍、至少2.5倍、至少3倍、至少3.5倍、至少4倍、至少5倍或至少10倍。
35.如权利要求2-34中的任一项所述的方法，其中所述总蛋白分析方法包括通过质谱分析法、凝胶电泳或液相色谱法直接定量所述样品中的多种蛋白质。
36.如权利要求1-35中的任一项所述的方法，其中所述样品包括不超过约1000μL、不超过约900μL、不超过约800μL、不超过约700μL、不超过约600μL、不超过约500μL、不超过约400μL、不超过约300μL、不超过约200μL、不超过约100μL、不超过约50μL、不超过约20μL、不超过约10μL、不超过约5μL、不超过约2μL或不超过约1μL的样品体积。
37.如权利要求1-36中的任一项所述的方法，其中所述样品包括生物样品。
38.如权利要求37所述的方法，其中所述生物样品包括生物流体。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述生物流体选自血浆、血清、尿液、脑脊髓液、滑液、眼泪、唾液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、汗液、沟液、精液、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、流体化的固体、细针抽吸样品、组织匀浆和细胞培养样品。
40.如权利要求38-39中的任一项所述的方法，其中所述生物流体是血浆或血清。
41.如权利要求38-39中的任一项所述的方法，其中所述生物流体是脑脊髓液。
42.如权利要求19-41中的任一项所述的方法，其中所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型、所述一种或多种额外的颗粒类型或其任何组合选自表1。
43.如权利要求1-42中的任一项所述的方法，包括在步骤a)之前通过耗尽或分级分离所述样品从所述样品中去除高丰度蛋白。
44.如权利要求19-43中的任一项所述的方法，其中所述一种或多种额外的生物分子冕包含蛋白质。
45.如权利要求19-44中的任一项所述的方法，其中所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型、所述一种或多种额外的颗粒类型或其任何组合包含脂质、核酸、多糖或其任何组合。
46.如权利要求19-45中的任一项所述的方法，其中所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型或所述一种或多种额外的颗粒类型因至少一种物理化学性质而不同。
47.如权利要求1-46中的任一项所述的方法，其中所述第一颗粒类型和所述第二颗粒类型因至少一种物理化学性质而不同，并且其中所述第一生物分子冕相对于所述第二生物分子冕包含不同但重叠的蛋白质子集。
48.如权利要求1-47中的任一项所述的方法，其中基于所述第一生物分子冕和所述第二生物分子冕中的不同但重叠的蛋白质子集确定所述多种蛋白质的组成和所述多种蛋白质中的蛋白质的浓度。
49.如权利要求19-48中的任一项所述的方法，其中所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型、所述一种或多种额外的颗粒类型或其任何组合选自纳米颗粒、微粒、微团、脂质体、铁氧化物颗粒、石墨烯颗粒、二氧化硅颗粒、基于蛋白质的颗粒、聚苯乙烯颗粒、银颗粒、金颗粒、金属颗粒、量子点、超顺磁性颗粒或其任何组合。
50.如权利要求1-49中的任一项所述的方法，其中所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型、所述一种或多种额外的颗粒类型或其任何组合是超顺磁性颗粒。
51.如权利要求1-50中的任一项所述的方法，其中所述第一颗粒类型、所述第二颗粒类型、所述一种或多种额外的颗粒类型或其任何组合选自表1。
52.如权利要求1-51中的任一项所述的方法，其中所述第一颗粒类型和所述第二颗粒类型是相同的颗粒类型，并且其中在所述第一生物分子冕和所述第二生物分子冕中测定的蛋白质中的至少70％、至少80％、至少90％或至少95％相同。
53.如权利要求1-52中的任一项所述的方法，其中所述第一颗粒类型和所述第二颗粒类型不同，并且其中在所述第一生物分子冕和所述第二生物分子冕中测定的蛋白质中的不超过70％、不超过80％、不超过90％或不超过95％相同。
54.一种分析多种生物流体的高通量方法，所述方法包括：
a)使所述多种生物流体中的第一生物流体和第二生物流体与颗粒类型接触；
b)在第一体积中，将所述颗粒类型与所述多种生物流体中的第一生物流体分离，并且确定与所述颗粒类型对应的第一生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度；以及
c)在第二体积中，将所述颗粒类型与所述多种生物流体中的第二生物流体分离，并且确定与所述颗粒类型对应的第二生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度，
其中所述第一生物流体和所述第二生物流体是不同的生物流体。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述多种生物流体中的生物流体选自血浆、血清、尿液、脑脊髓液、滑液、眼泪、唾液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、汗液、沟液、精液、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、流体化的固体、细针抽吸样品、组织匀浆和细胞培养样品。
56.如权利要求55所述的方法，其中所述生物流体是血浆或血清。
57.如权利要求55所述的方法，其中所述生物流体是脑脊髓液。
58.如权利要求54-57中的任一项所述的方法，其中在所述颗粒类型与所述样品接触时生物分子冕形成，并且其中所述第一生物分子冕包含蛋白质。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述生物分子冕包含脂质、核酸、多糖或其任何组合。
60.如权利要求54-59中的任一项所述的方法，包括在步骤a)之前通过耗尽或分级分离所述样品从所述样品中去除高丰度蛋白。
61.如权利要求54-60中的任一项所述的方法，其中所述颗粒类型选自纳米颗粒、微粒、微团、脂质体、铁氧化物颗粒、石墨烯颗粒、二氧化硅颗粒、基于蛋白质的颗粒、聚苯乙烯颗粒、银颗粒、金颗粒、金属颗粒、量子点、超顺磁性颗粒或其任何组合。
62.如权利要求54-61中的任一项所述的方法，其中所述颗粒类型是超顺磁性颗粒。
63.如权利要求54-62中的任一项所述的方法，其中所述颗粒类型选自表1。
64.如权利要求1-63中的任一项所述的方法，其中所述分离包括磁性分离、过滤、重力分离或离心。
65.如权利要求1-64中的任一项所述的方法，其中所述接触发生在体外。
66.如权利要求38-53或55-65中的任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括使用经训练的算法处理所述生物分子冕中的多种蛋白质的组成和浓度以鉴定生物状态从而鉴定所述生物流体的生物状态。
67.如权利要求38-53或55-66中的任一项所述的方法，其中将所述生物流体与受试者分离。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述受试者是人类。
69.如权利要求67所述的方法，其中所述受试者是非人类动物。
70.如权利要求67-69中的任一项所述的方法，其中所述受试者有状况。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述状况是疾病状态。
72.如权利要求71所述的方法，其中所述疾病状态是癌症。
73.如权利要求72所述的方法，其中所述癌症是前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌或乳癌。
74.如权利要求71所述的方法，其中所述疾病状态是阿耳茨海默病。
75.如权利要求1-74中的任一项所述的方法，其中所述分离包括磁性分离、基于柱的分离、过滤、基于离心柱的分离、离心、超离心、基于密度或梯度的离心、重力分离或其任何组合。
76.一种分析生物流体的方法，所述方法包括：
a)使生物流体在生物流体收集管中与颗粒类型接触，其中血液收集管包含稳定剂，其中所述稳定剂使所述生物流体中的无细胞核酸分子稳定；以及
b)将所述生物流体和所述颗粒类型在所述生物流体收集管中一起孵育以允许所述生物流体的蛋白质与所述颗粒类型结合，从而形成包含与所述颗粒类型结合的蛋白质的生物分子冕，
其中所述生物分子冕包含蛋白质群体，当所述颗粒类型被孵育在存储于EDTA中的生物流体中并且被允许形成对照生物分子冕时，也检测到所述蛋白质群体；并且
其中在所述生物流体收集管中在约20℃至约35℃孵育所述生物流体和所述颗粒类型，并且其中所述生物分子冕的蛋白质群体的50％以上在所述对照生物分子冕中也是能够检测到的。
77.如权利要求76所述的方法，其中所述生物分子冕的蛋白质群体的60％以上、70％以上、80％以上、或者90％以上在所述对照生物分子冕中也是能够检测到的。
78.如权利要求76-77中的任一项所述的方法，其中与当在存储于EDTA中的生物流体中孵育所述颗粒类型时相比，以较高丰度检测到所述蛋白质群体中的至少子集。
79.如权利要求76-78中的任一项所述的方法，其中与当在存储于EDTA中的生物流体中孵育所述颗粒类型时相比，以较高丰度检测到所述蛋白质群体中的至少5％。
80.如权利要求76-79中的任一项所述的方法，其中与当在存储于EDTA中的所述生物流体中孵育所述颗粒类型时相比，以较高丰度检测到所述蛋白质群体中的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％。
81.如权利要求76-80中的任一项所述的方法，进一步包括与当在存储于EDTA中的生物流体中孵育所述颗粒类型时相比，以较低检测限测定所述生物分子冕中的蛋白质。
82.如权利要求76-81中的任一项所述的方法，其中所述孵育包括在室温下孵育。
83.如权利要求76-82中的任一项所述的方法，其中所述孵育包括孵育多达14天、多达13天、多达12天、多达11天、多达10天、多达9天、多达8天、多达7天、多达6天、多达5天、多达4天或多达3天。
84.如权利要求76-83中的任一项所述的方法，其中所述孵育包括孵育多达14天。
85.如权利要求76-84中的任一项所述的方法，其中所述生物分子冕包含所述对照生物分子冕中不存在的独特蛋白质。
86.如权利要求76-85中的任一项所述的方法，其中所述生物分子冕包含至少100种不同的蛋白质、至少200种不同的蛋白质、至少300种不同的蛋白质、至少400种不同的蛋白质、至少500种不同的蛋白质、至少1000种不同的蛋白质、至少2000种不同的蛋白质、或者至少5000种不同的蛋白质。
87.如权利要求76-86中的任一项所述的方法，其中所述颗粒类型结合100种以上不同的蛋白质。
88.如权利要求86-87中的任一项所述的方法，其中所述生物流体包括血浆、血清、尿液、脑脊髓液、滑液、眼泪、唾液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、汗液、沟液、精液、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、流体化的固体、细针抽吸样品、组织匀浆或细胞培养样品。
89.如权利要求86-88中的任一项所述的方法，其中所述生物流体是血浆、血清、尿液、脑脊髓液、滑液、眼泪、唾液、全血、乳汁、乳头抽吸物、管灌洗物、阴道分泌物、鼻液、耳液、胃液、胰液、小梁流体、肺灌洗物、汗液、沟液、精液、前列腺液、痰、粪便物、支气管灌洗物、来自拭子的流体、支气管抽吸物、流体化的固体、细针抽吸样品、组织匀浆或细胞培养样品。
90.如权利要求76-89中的任一项所述的方法，进一步包括将所述颗粒类型与所述生物流体分离。
91.如权利要求90所述的方法，其中分离包括磁性分离、过滤、重力分离或离心。
92.如权利要求76-91中的任一项所述的方法，进一步包括确定所述生物分子冕中的蛋白质的组成和浓度。
93.如权利要求76-92中的任一项所述的方法，进一步包括确定所述对照生物分子冕中的蛋白质的组成和浓度。
94.如权利要求76-93中的任一项所述的方法，其中确定蛋白质的组成和浓度包括质谱分析法、凝胶电泳或液相色谱法。
95.如权利要求76-94中的任一项所述的方法，其中所述稳定剂包括代谢抑制剂、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、核酸酶抑制剂、防腐剂或其组合。
96.如权利要求95所述的方法，其中所述代谢抑制剂包括甘油醛、二羟丙酮磷酸、3-磷酸甘油醛、1,3-二磷酸甘油酸、3-磷酸甘油酸酯、2-磷酸甘油酸酯、磷酸烯醇丙酮酸、丙酮酸和甘油酸二羟基乙酸、氟化钠或K2C2O4。
97.如权利要求95或96所述的方法，其中所述蛋白酶抑制剂包括抗痛素、抑肽酶、胰凝乳蛋白酶抑制剂、弹性蛋白酶抑制剂、苯甲基磺酰氟(PMSF)、APMSF、TLCK、TPCK、亮抑酶肽、大豆胰蛋白酶抑制剂、吲哚乙酸(IAA)、E-64、EDTA、胃酶抑素、VdLPFFVdL、1,10-邻二氮杂菲、膦酰二肽、氨肽酶抑制剂、苯丁抑制素、抑二肽素A、抑二肽素B、α-2-巨球蛋白、利马豆胰蛋白酶抑制剂、胰蛋白酶抑制剂、或者蛋清卵固蛋白蛋清半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
98.如权利要求95-97中的任一项所述的方法，其中所述磷酸酶抑制剂包括花萼海绵诱癌素A、节球藻毒素、NIPP-1、微囊藻素LR、变构霉素、冈田酸、斑蝥素、微囊藻素LR、冈田酸、福司曲星、变构霉素、斑蝥素、草藻灭、节球藻毒素、环孢菌素A、FK506/免疫亲和素复合物、氯氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、bpV(phen)、脱磷素、mpV(pic)DMHV或原钒酸钠。
99.如权利要求95-98中的任一项所述的方法，其中所述核酸酶抑制剂包括焦碳酸二乙酯、乙醇、金精三羧酸(ATA)、甲酰胺、氧钒核糖核苷复合物、硅藻土、乙二胺四乙酸(EDTA)、蛋白酶K、肝素、羟胺-氧-铜离子、皂土、硫酸铵、二硫苏糖醇(DTT)、β-巯基乙醇、半胱氨酸、二硫赤藓醇、三(2-羧乙基)磷杂环戊二烯盐酸盐、或者二价阳离子诸如Mg+2、Mn+2、Zn+2、Fe+2、Ca+2或Cu+2。
100.如权利要求95-99中的任一项所述的方法，其中所述防腐剂包括重氮烷基脲、咪唑烷基脲、二羟甲基-5,5-二甲基乙内酰脲、二羟甲基脲、2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇、噁唑烷、羟甲基甘氨酸钠、5-羟基甲氧基甲基-1-1氮杂3,7-二氧杂双环[3.3.0]辛烷、5-羟甲基-1-1氮杂3,7二氧杂双环[3.3.0]辛烷、5-羟基聚[亚甲基氧基]甲基-1-1氮杂3,7二氧杂双环[3.3.0]辛烷、或金刚烷季铵盐。
101.如权利要求76-100中的任一项所述的方法，其中所述生物流体收集管是血液收集管。
102.如权利要求76-101中的任一项所述的方法，其中所述颗粒类型是纳米颗粒或微粒。
103.如权利要求76-102中的任一项所述的方法，其中所述颗粒类型选自纳米颗粒、微粒、微团、脂质体、铁氧化物颗粒、石墨烯颗粒、二氧化硅颗粒、基于蛋白质的颗粒、聚苯乙烯颗粒、银颗粒、金颗粒、金属颗粒、量子点、超顺磁性颗粒及其任何组合。
104.如权利要求76-103中的任一项所述的方法，其中所述颗粒类型选自表1。
105.如权利要求76-104中的任一项所述的方法，进一步包括使所述生物流体与一种或多种额外的颗粒类型接触，将所述生物流体与所述一种或多种额外的颗粒类型一起孵育以允许所述生物流体的蛋白质与所述一种或多种额外颗粒类型结合，从而形成包含与所述一种或多种额外的颗粒类型结合的蛋白质的一种或多种额外的生物分子冕。
106.如权利要求105所述的方法，其中所述一种或多种额外的颗粒类型与蛋白质群体结合，所述蛋白质群体与所述颗粒类型的生物分子蛋白质中的蛋白质群体不同但重叠。
107.如权利要求105-106中的任一项所述的方法，其中使所述生物流体与所述一种或多种额外的颗粒类型接触在使所述生物流体与所述颗粒类型接触之后发生。
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