KR20220011618A - 생체 유체로부터의 단백질 코로나 분석을 위한 조성물, 방법 및 시스템 및 그것들의 용도 - Google Patents

생체 유체로부터의 단백질 코로나 분석을 위한 조성물, 방법 및 시스템 및 그것들의 용도 Download PDF

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Abstract

본 개시는 생체 유체의 생체분자 코로나 분석을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 생체 유체는 나노입자와 접촉되어 생체분자 코로나를 형성할 수 있고, 결과적으로 얻어지는 코로나의 조성이 분석될 수 있다. 또한 연속적인 질문에 의해 코로나 분석을 위한 생체 유체를 제조하는 방법이 제공된다.

Description

생체 유체로부터의 단백질 코로나 분석을 위한 조성물, 방법 및 시스템 및 그것들의 용도
상호 참조
본 출원은 2019년 3월 26일에 출원된 "생체 유체로부터의 단백질 코로나 분석을 위한 조성물, 방법 및 시스템 및 그것들의 용도"의 제목의 62/824,279호 (변리사 문서 번호 53344-711.101), 및 2019년 3월 26일에 출원된 "단백질 코로나 분석을 위한 조성물, 방법 및 시스템 및 그것들의 용도"의 제목의 62/824,284호 (변리사 문서 번호 53344-712.101)의 이익을 주장하며, 이들 출원의 각각은 모든 목적에 대해 그 전문이 참조로 본원에 포함된다.
생체 유체(Biofluids)는 그것의 존재 및 농도가 대상체 건강 상태를 나타낼 수 있는 광범위한 단백질을 함유한다. 고풍부성의 단백질 및 기타 단백질은 검정 신호를 흐리게 할 수 있다. 단백질 코로나(protein corona)는 그것이 단백질을 함유한 생물학적 유체(biological fluid)에 노출될 때 입자 상에 형성될 수 있다. 단백질 코로나에 대한 대부분의 작업은 혈류 (혈장 또는 혈청)로부터의 유체에 대해 수행되었다. 다양한 생체 유체와 입자의 상호작용은 대부분 알려지지 않았다.
분별(분획ation)은 생물학적 유체를 검정할 때 고풍부성 단백질의 신호를 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 현재, 단백질의 분리 및 추출을 용이하게 하는 다양한 분별 방법이 존재한다. 이들 방법은 검출될 검정의 단백질의 상이한 프로파일을 가능하게 한다. 그러나, 보다 다양한 단백질체학의 분석이 여전히 요구된다.
다양한 측면으로, 본 개시는 샘플을 연속적으로 질문하는 방법을 제공하며, 방법은: a) 샘플을 제1 입자 유형과 접촉시키고 제1 입자 유형을 샘플과 인큐베이션하여 제1 생체분자 코로나(biomolecule corona)를 형성하는 단계로, 제1 생체분자 코로나는 제1 입자 유형을 샘플과 인큐베이션할 때 형성되며 제1 생체분자 코로나는 단백질을 포함하는 것인 단계; b) 제1 생체분자 코로나를 포함하는 제1 입자 유형을 샘플로부터 분리하는 단계; c) 샘플을 제2 입자 유형과 접촉시키고 제2 입자 유형을 샘플과 인큐베이션하여 제2 생체분자 코로나를 형성하는 단계로, 제2 생체분자 코로나는 제2 입자 유형을 샘플과 인큐베이션할 때 형성되며, 제2 생체분자 코로나는 단백질을 포함하고, 추가로 (i) 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 동일한 입자 유형이거나 또는 (ii) 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 상이한 것인 단계; d) 제2 생체분자 코로나를 포함하는 제2 입자 유형을 샘플로부터 분리하는 단계; e) 제1 생체분자 코로나 및 제2 생체분자 코로나를 검정하여 검정된 제1 생체분자 코로나 및 제2 생체분자 코로나를 토대로 샘플 중의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계를 포함한다.
일부 측면으로, 제1 생체분자 코로나를 형성하기 위하여 제1 입자 유형을 샘플과 인큐베이션시킬 때, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위(dynamic range)는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위에 비해 압축된다.
일부 측면으로, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는 a) 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 더 높은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호; 및 b) 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 더 낮은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호의 제1 비율이다. 일부 측면으로, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 최고 풍부성 단백질의 농도 대 최저 풍부성 단백질의 농도의 제1 비율이다. 일부 측면으로, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 상위 십분위 대 단백질의 하위 십분위의 제1 비율이다. 일부 측면으로, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 사분위수 범위의 범위를 포함하는 제1 비율이다. 일부 측면으로, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 모든 농도 대비 샘플 중의 동일한 단백질의 공지된 농도의 플롯에서 피팅된 데이터의 기울기를 포함하는 제1 비율이다.
일부 측면으로, 샘플 중의 동일한 단백질의 공지된 농도는 데이터베이스로부터 얻어진다. 일부 측면으로, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위는 a) 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질의 더 높은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호; 및 b) 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질의 더 낮은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호의 제2 비율이다. 일부 측면으로, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질 중의 최고 풍부성 단백질의 농도 대 최저 풍부성 단백질의 농도의 제2 비율이다. 일부 측면으로, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질 중의 단백질의 상위 십분위 대 단백질의 하위 십분위의 제2 비율이다.
일부 측면으로, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질의 단백질의 사분위수 범위의 범위를 포함하는 제2 비율이다. 일부 측면으로, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질 중의 단백질의 모든 농도 대비 샘플 중의 동일한 단백질의 공지된 농도의 플롯에서 피팅된 데이터의 기울기를 포함하는 제2 비율이다. 일부 측면으로, 샘플 중의 동일한 단백질의 공지된 농도는 데이터베이스로부터 얻어진다. 일부 측면으로, 동적 범위를 압축하는 것은 제2 비율에 비해 감소된 제1 비율을 포함한다. 추가의 측면으로, 감소된 제1 비율은 제2 비율보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 더 적다.
일부 측면으로, 방법은 제2 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면으로, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계 또는 제2 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계는 질량 분광분석을 수행하는 것을 포함한다. 일부 측면으로, 방법은 단계 a), b), 및 e)를 하나 이상의 추가 입자 유형으로 반복하여 하나 이상의 추가 생체분자 코로나를 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면으로, 하나 이상의 추가 입자 유형은 제1 입자 유형 또는 제2 입자 유형과 동일하다. 일부 측면으로, 하나 이상의 추가 입자 유형은 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 또는 그것들의 조합과 상이하다.
일부 측면으로, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나는 샘플로부터의 단백질을 포함한다. 일부 측면으로, 제1 생체분자 코로나, 제2 생체분자 코로나, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나, 또는 그것들의 임의의 조합은 적어도 100개의 구별되는 단백질을 포함한다. 일부 측면으로, 제1 생체분자 코로나, 제2 생체분자 코로나, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나, 또는 그것들의 임의의 조합은 적어도 200개의 구별되는 단백질, 적어도 300개의 구별되는 단백질, 적어도 400개의 구별되는 단백질, 적어도 500개의 구별되는 단백질, 적어도 1000개의 구별되는 단백질, 적어도 2000개의 구별되는 단백질, 또는 적어도 5000개의 구별되는 단백질을 포함한다.
일부 측면으로, 제1 생체분자 코로나, 제2 생체분자 코로나, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나, 또는 그것들의 임의의 조합은 단백질의 상이한 조성, 단백질의 하위세트의 상이한 농도, 또는 그것들의 조합을 포함한다. 일부 측면으로, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나를 형성하기 위하여 하나 이상의 추가 입자 유형을 샘플과 인큐베이션시킬 때, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위에 비해 압축된다.
일부 측면으로, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는 a) 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 더 높은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호; 및 b) 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 더 낮은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호의 추가 비율이다.
일부 측면으로, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는 하나 이상의 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 최고 풍부성 단백질의 농도 대 최저 풍부성 단백질의 농도의 추가 비율이다. 일부 측면으로, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는 하나 이상의 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 상위 십분위 대 단백질의 하위 십분위의 추가 비율이다. 일부 측면으로, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는 하나 이상의 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 사분위수 범위의 범위를 포함하는 추가 비율이다.
일부 측면으로, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는 하나 이상의 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 모든 농도 대비 샘플 중의 동일한 단백질의 공지의 농도의 플롯에서 피팅된 데이터의 기울기를 포함하는 추가 비율이다. 일부 측면으로, 샘플 중의 동일한 단백질의 공지된 농도는 데이터베이스로부터 얻어진다. 일부 측면으로, 동적 범위를 압축하는 것은 제2 비율에 비해 감소된 추가 비율을 포함한다. 추가의 측면으로, 감소된 제1 비율은 제2 비율보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 더 적다.
일부 측면으로, 총 단백질 분석 방법은 샘플 중의 복수의 단백질의 질량 분광분석, 겔 전기영동, 또는 액체 크로마토그래피에 의한 직접 정량화를 포함한다. 일부 측면으로, 샘플은 약 1000 μL 이하, 약 900 μL 이하, 약 800 μL 이하, 약 700 μL 이하, 약 600 μL 이하, 약 500 μL 이하, 약 400 μL 이하, 약 300 μL 이하, 약 200 μL 이하, 약 100 μL 이하, 약 50 μL 이하, 약 20 μL 이하, 약 10 μL 이하, 약 5 μL 이하, 약 2 μL 이하, 또는 약 1 μL 이하의 샘플 부피를 포함한다.
일부 측면으로, 샘플은 생물학적 샘플을 포함한다. 일부 측면으로, 생물학적 샘플은 생체 유체를 포함한다. 일부 측면으로, 생체 유체는 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 활액, 눈물, 타액, 전혈, 우유, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액(trabecular fluid), 폐 세척액, 땀, 열구액(crevicular fluid), 정액, 전립선액, 가래, 대변, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 기관지 흡인액, 유동화된 고체, 미세 바늘 흡인 샘플, 조직 균질액, 및 세포 배양 샘플로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 측면으로, 생체 유체는 혈장 또는 혈청이다. 일부 측면으로, 생체 유체는 뇌척수액이다. 일부 측면으로, 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 하나 이상의 추가 입자 유형, 또는 그것들의 임의의 조합은 표 1로부터 선택된다.
일부 측면으로, 방법은 단계 a) 전에 샘플을 고갈시키거나 분별함으로써 고풍부성 단백질을 샘플로부터 제거하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면으로, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나는 단백질을 포함한다. 일부 측면으로, 제1 생체분자 코로나, 제2 생체분자 코로나, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나, 또는 그것들의 임의의 조합은 지질, 핵산, 다당, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 측면으로, 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 또는 하나 이상의 추가 입자 유형은 적어도 하나의 물리화학적 특성이 상이하다. 일부 측면으로, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 적어도 하나의 물리화학적 특성이 상이하고 제1 생체분자 코로나는 제2 생체분자 코로나에 비해 구별되지만 중복되는 단백질 세트를 포함한다. 일부 측면으로, 복수의 단백질의 조성 및 복수의 단백질의 단백질 농도는 제1 생체분자 코로나 및 제2 생체분자 코로나 중의 구별되지만 중복되는 단백질 세트를 토대로 측정된다.
일부 측면으로, 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 하나 이상의 추가 입자 유형, 또는 그것들의 임의의 조합은 나노입자, 마이크로입자, 미셸, 리포솜, 산화 철 입자, 그래핀 입자, 실리카 입자, 단백질-기반 입자, 폴리스티렌 입자, 은 입자, 금 입자, 금속 입자, 양자점, 초상자성 입자, 또는 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 측면으로, 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 하나 이상의 추가 입자 유형, 또는 그것들의 임의의 조합은 초상자성 입자이다.
일부 측면으로, 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 하나 이상의 추가 입자 유형, 또는 그것들의 임의의 조합은 표 1로부터 선택된다. 일부 측면으로, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 동일한 입자 유형이고 제1 생체분자 코로나 및 제2 생체분자 코로나에서 검정된 단백질의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 동일하다. 일부 측면으로, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 상이하고 제1 생체분자 코로나 및 제2 생체분자 코로나에서 검정된 단백질의 70% 이하, 80% 이하, 90% 이하, 또는 95% 이하는 동일하다.
다양한 측면으로, 본 개시는 복수의 생체 유체를 분석하는 고처리량 방법을 제공하며, 방법은: a) 복수의 생체 유체의 제1 생체 유체 및 제2 생체 유체를 입자 유형과 접촉시키는 단계; b) 제1 부피에서, 입자 유형을 복수의 생체 유체의 제1 생체 유체로부터 분리하고 입자 유형에 상응하는 제1 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계; 및 c) 제2 부피에서, 입자 유형을 복수의 생체 유체의 제2 생체 유체로부터 분리하고 입자 유형에 상응하는 제2 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 생체 유체 및 제2 생체 유체는 상이한 생체 유체이다.
일부 측면으로, 복수의 생체 유체의 생체 유체는 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 활액, 눈물, 타액, 전혈, 우유, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액, 폐 세척액, 땀, 열구액, 정액, 전립선액, 가래, 대변, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 기관지 흡인액, 유동화된 고체, 미세 바늘 흡인 샘플, 조직 균질액, 및 세포 배양 샘플로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 추가의 측면으로, 생체 유체는 혈장 또는 혈청이다. 다른 측면으로, 생체 유체는 뇌척수액이다.
일부 측면으로, 생체분자 코로나는 입자 유형을 샘플과 접촉시킬 때 형성되며 이때 제1 생체분자 코로나는 단백질을 포함한다. 일부 측면으로, 생체분자 코로나는 지질, 핵산, 다당, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 측면으로, 방법은 단계 a) 전에 샘플을 고갈시키거나 분별함으로써 샘플로부터 고풍부성 단백질을 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 측면으로, 입자 유형은 나노입자, 마이크로입자, 미셸, 리포솜, 산화 철 입자, 그래핀 입자, 실리카 입자, 단백질-기반 입자, 폴리스티렌 입자, 은 입자, 금 입자, 금속 입자, 양자점, 초상자성 입자, 또는 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 측면으로, 입자 유형은 초상자성 입자이다. 일부 측면으로, 입자 유형은 표 1로부터 선택된다. 일부 측면으로, 분리는 자기 분리, 여과, 중력 분리, 또는 원심분리를 포함한다. 일부 측면으로, 접촉은 시험관내에서 일어난다. 일부 측면으로, 방법은 생물학적 상태를 확인하기 위한 훈련된 알고리즘을 사용하여 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 처리하는 생체 유체의 생물학적 상태를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 측면으로, 생체 유체는 대상체로부터 분리된다. 추가의 측면으로, 대상체는 인간이다. 다른 측면으로, 대상체는 비인간 동물이다. 일부 측면으로, 대상체는 상태를 가진다. 추가의 측면으로, 상태는 질환 상태이다. 여전히 추가의 측면으로, 질환 상태는 암이다. 여전히 추가의 측면으로, 암은 전립선암, 대장암, 폐암, 또는 유방암이다. 다른 측면으로, 질환 상태는 알츠하이머병이다. 일부 측면으로, 분리는 자기 분리, 칼럼-기반 분리, 여과, 회전 칼럼-기반 분리, 원심분리, 초원심분리, 밀도 또는 구배-기반 원심분리, 중력 분리, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함한다.
다양한 측면으로, 본 개시는 생체 유체를 분석하는 방법을 제공하며, 방법은: a) 생체 유체 수집 튜브에서 생체 유체를 입자 유형과 접촉시키는 단계로, 혈액 수집 튜브는 안정화 시약을 포함하고, 안정화 시약은 생체 유체의 세포 유리 핵산 분자를 안정화시키는 것인 단계; 및 b) 생체 유체 및 입자 유형을 생체 유체 수집 튜브에서 인큐베이션하여 생체 유체의 단백질의 입자 유형에의 결합을 허용함으로써, 입자 유형에 결합된 단백질을 포함하는 생체분자 코로나를 형성하는 단계로, 생체분자 코로나는 EDTA에서 보관되고 대조군 생체분자 코로나를 형성하는 것이 허용된 경우에 입자 유형이 생체 유체에서 인큐베이션될 때 또한 검출되는 단백질 집단을 포함하는 것인 단계를 포함하고; 생체 유체 및 입자 유형은 약 20℃ 내지 약 35℃의 생체 유체 수집 튜브에서 인큐베이션되며 생체분자 코로나의 단백질 집단의 50% 이상은 또한 대조군 생체분자 코로나에서 검출될 수 있다.
일부 측면으로, 생체분자 코로나의 단백질 집단의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상이 또한 대조군 생체분자 코로나에서 검출될 수 있다. 일부 측면으로, 단백질 집단의 적어도 하위세트는 입자 유형이 EDTA에서 보관된 경우 생체 유체에서 인큐베이션될 때보다 더 높은 풍부성에서 검출된다. 일부 측면으로, 단백질 집단의 적어도 5%는 입자 유형이 EDTA에서 보관된 경우 생체 유체에서 인큐베이션될 때보다 더 높은 풍부성에서 검출된다. 일부 측면으로, 단백질 집단의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%가 입자 유형이 EDTA에서 보관된 경우 생체 유체에서 인큐베이션될 때보다 더 높은 풍부성에서 검출된다.
일부 측면으로, 방법은 입자 유형이 EDTA에서 보관된 경우 생체 유체에서 인큐베이션될 때보다 더 낮은 검출 한계에서 생체분자 코로나의 단백질을 검정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면으로, 인큐베이션은 실온에서 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 측면으로, 인큐베이션은 최대 14일, 최대 13일, 최대 12일, 최대 11일, 최대 10일, 최대 9일, 최대 8일, 최대 7일, 최대 6일, 최대 5일, 최대 4일, 또는 최대 3일 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 측면으로, 인큐베이션하는 것은 최대 14일 동안 인큐베이션하는 것을 포함한다. 일부 측면으로, 생체분자 코로나는 대조군 생체분자 코로나에 없는 독특한 단백질을 포함한다. 일부 측면으로, 생체분자 코로나는 적어도 100개의 구별되는 단백질, 적어도 200개의 구별되는 단백질, 적어도 300개의 구별되는 단백질, 적어도 400개의 구별되는 단백질, 적어도 500개의 구별되는 단백질, 적어도 1000개의 구별되는 단백질, 적어도 2000개의 구별되는 단백질, 또는 적어도 5000개의 구별되는 단백질을 포함한다. 일부 측면으로, 입자 유형은 100개 이상의 구별되는 단백질에 결합한다.
추가의 측면으로, 생체 유체는 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 활액, 눈물, 타액, 전혈, 우유, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액, 폐 세척액, 땀, 열구액, 정액, 전립선액, 가래, 대변, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 기관지 흡인액, 유동화된 고체, 미세 바늘 흡인 샘플, 조직 균질액, 또는 세포 배양 샘플을 포함한다. 추가의 측면으로, 생체 유체는 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 활액, 눈물, 타액, 전혈, 우유, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액, 폐 세척액, 땀, 열구액, 정액, 전립선액, 가래, 대변, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 기관지 흡인액, 유동화된 고체, 미세 바늘 흡인 샘플, 조직 균질액, 또는 세포 배양 샘플이다.
일부 측면으로, 방법은 생체 유체로부터 입자 유형을 분리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면으로, 분리는 자기 분리, 여과, 중력 분리, 또는 원심분리를 포함한다. 일부 측면으로, 방법은 생체분자 코로나 중의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면으로, 방법은 대조군 생체분자 코로나 중의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면으로, 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 것은 질량 분광분석, 겔 전기영동, 또는 액체 크로마토그래피를 포함한다.
일부 측면으로, 안정화 시약은 대사 억제제, 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, 뉴클레아제 억제제, 보존제, 또는 그것들의 조합을 포함한다. 일부 측면으로, 대사 억제제는 글리세르알데하이드, 다이하이드록시아세톤 포스페이트, 글리세르알데하이드 3-포스페이트, 1,3-비스포스포글리세레이트, 3-포스포글리세레이트, 2-포스포글리세레이트, 포스포에놀피루베이트, 피루베이트 및 글리세레이트 다이하이드록시아세테이트, 불화 나트륨, 또는 K2C2O4를 포함한다. 일부 측면으로, 프로테아제 억제제는 안티펜(antipain), 아프로티닌, 카이모스타틴, 엘라스타티날, 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF), APMSF, TLCK, TPCK, 류펩틴, 대두 트립신 억제제, 인돌아세트산 (IAA), E-64, EDTA, 펩스타틴, VdLPFFVdL, 1,10-페난트롤린, 포스포라모돈, 아마스타틴, 베스타틴, 다이프로틴 A, 다이프로틴 B, 알파-2-마크로글로불린, 리마콩 트립신 억제제, 췌장 프로테아제 억제제, 또는 난백 오보스타틴 난백 시스타틴을 포함한다.
일부 측면으로, 포스파타제 억제제는 칼리쿨린 A, 노둘라린, NIPP-1, 마이크로시스틴 LR, 토토마이신, 오카다산, 칸타리딘, 마이크로시스틴 LR, 오카다산, 포스트리에신, 토토마이신, 칸타리딘, 엔도탈, 노둘라린, 사이클로스포린 A, FK 506/면역필린 복합체, 사이퍼메트린, 델타메트린, 펜발레레이트, bpV(phen), 데포스타틴, mpV(pic) DMHV, 또는 나트륨 오르토바나데이트를 포함한다. 일부 측면으로, 뉴클레아제 억제제는 다이에틸 피로카보네이트, 에탄올, 아우린트라이카르복실산 (ATA), 포름아미드, 바나딜-리보뉴클레오사이드 복합체, 마칼로이드, 에틸렌다이아민 테트라아세트산 (EDTA), 단백질 분해효소 K, 헤파린, 하이드록시아민-산소-제2 구리 이온, 벤토나이트, 암모늄 설페이트, 다이티오트레이톨 (DTT), 베타-머캡토에탄올, 시스테인, 다이티오에리트리톨, 트리스(2-카르복시에틸) 포스펜 염산염, 또는 Mg+2, Mn+2, Zn+2, Fe+2, Ca+2, 또는 Cu+2와 같은 이가 양이온을 포함한다.
일부 측면으로, 보존제는 다이아졸리디닐 우레아, 이미다졸리디닐 우레아, 다이메토일롤-5,5-다이메틸히단토인, 다이메틸롤 우레아, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-다이올, 옥사졸리딘, 나트륨 하이드록시메틸 글리시네이트, 5-하이드록시메톡시메틸-1-1아자-3,7-다이옥사비시클로[3.3.0]옥탄, 5-하이드록시메틸-1-1아자-3,7다이옥사비시클로[3.3.0]옥탄, 5-하이드록시폴리[메틸렌옥시]메틸-1-1아자-3,7다이옥사비시클로[3.3.0]옥탄, 또는 사차 아다만틴을 포함한다. 일부 측면으로, 생체 유체 수집 튜브는 혈액 수집 튜브이다. 일부 측면으로, 입자 유형은 나노입자 또는 마이크로입자이다.
일부 측면으로, 입자 유형은 나노입자, 마이크로입자, 미셸, 리포솜, 산화 철 입자, 그래핀 입자, 실리카 입자, 단백질-기반 입자, 폴리스티렌 입자, 은 입자, 금 입자, 금속 입자, 양자점, 초상자성 입자, 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 측면으로, 입자 유형은 표 1로부터 선택된다.
일부 측면으로, 방법은 생체 유체를 하나 이상의 추가 입자 유형과 접촉시키는 단계, 생체 유체를 하나 이상의 추가 입자 유형과 함께 인큐베이션하여 생체 유체의 단백질의 하나 이상의 추가 입자 유형에의 결합을 허용하고, 그로써 하나 이상의 추가 입자 유형에 결합된 단백질을 포함하는 하나 이상의 추가 생체분자 코로나를 형성하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 측면으로, 하나 이상의 추가 입자 유형은 입자 유형의 생체분자 단백질 중의 단백질 집단과 구별되지만 중복되는 단백질 집단에 결합한다. 일부 측면으로, 생체 유체를 하나 이상의 추가 입자 유형과 접촉시키는 것은 생체 유체를 입자 유형과 접촉시키는 단계 후에 일어난다.
본 개시는 나노입자와 CSF, 소변, 눈물 및 타액과 같은 다양한 유체의 상호작용으로부터 단백질 코로나를 분석한다. 다양한 생체 유체, 이를테면 CSF, 소변, 눈물 및 타액은 나노입자와 함께 인큐베이션하기 위해 사용된다. 결과적으로 얻어진 단백질 코로나는 분리되고 질량 분광분석으로 분석되었다. 본 개시는 다양한 생체 유체로부터의 단백질이 나노입자와 상호작용하는 방법을 제공한다. 이들 단백질 코로나로부터 확인된 단백질 (또는 바이오마커)은 치료 표적뿐만 아니라 진전된 진단 도구의 개발에 사용될 수 있다.
일부 측면으로, 본 개시는 복수의 생체 유체를 분석하는 방법을 제공하며, 방법은: (a) 복수의 생체 유체의 각각의 생체 유체를 나노입자와 별도로 접촉시키는 단계; (b) 제1 나노입자를 분리하고 복수의 생체 유체의 제1 생체 유체에 상응하는 제1 단백질 코로나를 분석하는 단계; 및 (c) 제2 나노입자를 분리하고 복수의 생체 유체의 제2 생체 유체에 상응하는 제2 단백질 코로나를 분석하는 단계를 포함하고, 여기서 단계 (b) 및 단계 (c)는 동시에 일어난다.
일부 구체예에서, 방법은 복수의 생체 유체를 제3 나노입자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 복수의 생체 유체를 제4 나노입자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 복수의 생체 유체를 제5 나노입자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 제1 나노입자 및 제2 나노입자는 동일하다.
일부 구체예에서, 방법은 복수의 생체 유체를 최대 10개의 상이한 나노입자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 나노입자는 지질, 중합체, 금속, 또는 그것들의 임의의 조합으로부터 선택된 물질로 만들어진다. 일부 구체예에서, 중합체는 PS, PLA, PGA, PLGA, 또는 PVP를 포함한다. 일부 구체예에서, 지질은 EPC, DOPC, DOPG, 또는 DPPG를 포함한다. 일부 구체예에서, 금속은 산화 철, 금, 또는 은을 포함한다. 일부 구체예에서, 나노입자는 양의 표면 전하를 포함한다. 일부 구체예에서, 나노입자는 음의 표면 전하를 포함한다. 일부 구체예에서, 나노입자는 중성 표면 입자를 포함한다.
일부 구체예에서, 나노입자는 1-400 nm의 크기를 포함한다.
일부 구체예에서, 생체 유체는 혈장, 혈청, CSF, 소변, 눈물, 또는 타액을 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 제1 생체 유체를 제1 나노입자와 접촉시킴으로써 확인된 제1 대조군 단백질 코로나에 제1 단백질 코로나를 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 제2 생체 유체를 제2 나노입자와 접촉시킴으로써 확인된 제2 대조군 단백질 코로나에 제2 단백질 코로나를 비교하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 제1 단백질 코로나를 제1 생물학적 상태에 연관시키는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 제2 단백질 코로나를 제2 생물학적 상태에 연관시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 개시는 다양한 단백질체학을 분석하기 위한 방법 및 시스템을 제공한다. 본원에서 개시되는 것과 같이, 풍부한 단백질은 먼저 분별에 의해 또는 나노입자 고갈에 의해 제거되고, 그로써 고갈된 샘플이 생성된다. 고갈된 샘플은 그런 후 나노입자와 함께 인큐베이션되어 고친화성 저풍부성 단백질을 가진 단백질 코로나의 형성이 유도된다. 본원에 개시된 방법 및 시스템은 치료 표적뿐만 아니라 진전된 진단 도구의 개발에 사용될 수 있는 다양한 단백질 코로나 프로파일을 제공하였다.
일부 측면으로, 본 개시는 대상체의 샘플의 생물학적 상태를 확인하는 방법을 제공하며, 방법은: 샘플을 고갈 나노입자와 인큐베이션함으로써, 고갈된 샘플을 생성하는 단계; 고갈된 샘플을 제1 나노입자와 인큐베이션하여 단백질 코로나를 생성하는 단계; 제1 나노입자와 관련된 단백질 코로나 중의 단백질에 상응하는 단백질 데이터를 생성하는 단계; 및 훈련된 알고리즘을 사용하여 단백질 데이터를 처리하여 대상체의 생물학적 상태를 확인하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 샘플을 고갈 나노입자와 인큐베이션하는 것은 샘플을 고갈 나노입자와 적어도 약 30분 동안 인큐베이션하고 샘플로부터 고갈 나노입자를 추출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플을 고갈 나노입자와 적어도 약 30분 동안 인큐베이션하고 고갈 나노입자를 샘플로부터 추출하는 것은 샘플로부터 적어도 약 80%의 고풍부성 단백질을 제거한다.
일부 구체예에서, 방법은 고갈 나노입자와 관련된 단백질 코로나를 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플을 고갈 나노입자와 인큐베이션하는 것은 샘플을 고갈 나노입자와 적어도 약 60분 동안 인큐베이션하고 고갈 나노입자를 샘플로부터 적어도 2회 추출하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플을 고갈 나노입자와 적어도 약 60분 동안 인큐베이션하고 고갈 나노입자를 샘플로부터 적어도 2회 추출하는 것은 99%의 고풍부성 단백질을 제거한다.
일부 구체예에서, 고갈 나노입자는 제1 나노입자와 적어도 하나의 상이한 물리화학적 특성을 포함한다. 상이한 물리화학적 특성은 크기, 표면 전하, 또는 화학적 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 단백질 데이터를 처리하는 것은 단백질 코로나를 분석하는 것, 고갈 전에 샘플을 분석하는 것, 또는 고갈된 샘플을 분석하는 것을 포함한다.
일부 측면으로, 본 개시는 대상체로부터 단백질 샘플의 생물학적 상태를 확인하는 방법을 제공하며, 방법은: 단백질 샘플을 분별함으로써, 단백질 샘플에 단백질의 하위세트를 포함하는 분별된 샘플을 생성하는 단계; 고갈된 샘플을 제1 나노입자와 인큐베이션하여 단백질 코로나를 생성하는 단계; 제1 나노입자와 관련된 단백질 코로나의 단백질에 상응하는 단백질 데이터를 생성하는 단계; 및 훈련된 알고리즘을 사용하여 단백질 데이터를 처리하여 대상체의 생물학적 상태를 확인하는 단계를 포함하며, 샘플을 분별하는 단계는 콘의 방법(Cohn's method), 칼럼 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 원심분리, 여과, 한외여과 및 및 극저온 침전으로 이루어지는 군으로부터 선택된 방법으로 고풍부성 단백질을 분리하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 단백질 데이터를 처리하는 것은 단백질 코로나를 분석하는 것, 분별 전에 단백질 샘플을 분석하는 것, 또는 분별된 샘플을 분석하는 것을 포함한다.
본원에 개시된 방법에 대한 일부 구체예에서, 고갈된 샘플 중의 제1 나노입자의 농도는 1-50 mg/mL이다. 일부 구체예에서, 제1 나노입자와 관련된 단백질 코로나 중의 단백질에 상응하는 단백질 데이터를 생성하는 것은 단백질 코로나 중의 각각의 독특한 단백질의 농도를 측정하고 단백질 코로나 중의 각각의 독특한 단백질의 농도를 생물학적 상태에 연관시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 대상체의 생물학적 상태를 확인하기 위하여 훈련된 알고리즘을 사용하여 단백질 데이터를 처리하는 것은 생물학적 상태를 생체분자 핑거프린트에 연관시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플은 혈장 또는 혈청이다.
일부 측면으로, 본 개시는 (a) 복수의 생체분자를 포함하는 생물학적 샘플을 얻는 단계로, 복수의 생체분자는 단백질을 포함하는 것인 단계; (b) 크기, 전하, 소수성, 구조 및 친화성으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 토대로 상기 생물학적 샘플을 풍부화하여 처리된 생물학적 샘플을 얻는 단계; (c) (b)의 상기 처리된 생물학적 생믈로부터 하나 이상의 나노입자의 도움으로 생체분자의 적어도 제1 하위세트 및 생체분자의 제2 하위세트를 생성하는 단계로, 생체분자의 상기 제1 하위세트는 상기 하나 이상의 나노입자와 관련되고 생체분자의 상기 제2 하위세트는 상기 하나 이상의 나노입자와 관련되지 않는 것인 단계; 및 (d) 생체분자의 적어도 상기 제1 하위세트 또는 생체분자의 제2 하위세트에 대해 별도로 하나 이상의 검정을 수행하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플을 검정하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 방법은 (e) 생체분자의 상기 제1 하위세트를 생체분자의 상기 제2 하위세트로부터 분리하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 검정은 질량 분광분석 및 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)로 이루어지는 군으로부터 선택된 검정을 포함한다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 검정은 질량 분광분석을 포함한다.
일부 구체예에서, 상기 생물학적 샘플을 풍부화하는 것은 상기 처리된 생물학적 샘플을 얻기 위한 분별을 포함한다. 일부 구체예에서, 분별은 콘의 방법, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 원심분리, 여과, 한외여과 및 극저온 침전으로 이루어지는 군으로부터 선택된 방법으로 고풍부성 단백질을 분리하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 처리된 생물학적 샘플을 얻기 위하여 상기 생물학적 샘플을 풍부화하는 것은 하나 이상의 단백질을 고갈시키는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, (b)에서, 하나 이상의 고갈 나노입자는 상기 처리된 생물학적 샘플을 얻기 위해 사용된다. 일부 구체예에서, (b)의 하나 이상의 고갈 나노입자는 (c)의 상기 하나 이상의 나노입자와 상이하다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 검정은 상기 제1 하위세트에 대해 수행되고, 검정은 ELISA이다.
일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 눈물, 타액, 전혈, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액, 폐 세척액, 땀, 플라즘세르비큘라액(plasmcervicular fluid), 정액, 전립선액, 가래, 활액, 대변, 섬유주액, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 및 기관지 흡인액으로 이루어지는 군으로부터 선택된 생체 유체이다.
일부 구체예에서, 하나 이상의 검정은 단백질체학 데이터를 산출하며, 생물학적 상태를 예측하기 위하여 상기 단백질체학 데이터를 처리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 단백질체학 데이터를 처리하는 것은 훈련된 알고리즘의 사용을 포함하며, 훈련된 알고리즘은 생물학적 샘플의 독립적인 세트를 사용하여 훈련된다.
일부 구체예에서, 생체분자의 제1 하위세트는 상기 하나 이상의 나노입자와 인큐베이션될 때 상기 하나 이상의 나노입자와 회합되어 단백질 코로나를 형성한다.
일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 (a) 전에 고갈된다.
일부 구체예에서, 생체분자의 제1 하위세트 및 생체분자의 상기 제2 하위세트는 단백질을 포함한다.
참조에 의한 포함
본 명세서에서 언급된 모든 출판물, 특허, 및 특허 출원은 각각의 개별 출판물, 특허, 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조에 의해 포함되는 것으로 표시되는 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
특허 또는 출원 파일은 칼라로 그려진 적어도 하나의 도면을 포함한다. 칼라 도면(들)을 포함한 본 특허 또는 특허 출원 공보의 사본은 요청 및 필요한 비용의 지불시에 기관에 의해 제공될 것이다. 개시의 신규한 특징은 첨부된 청구범위에서 구체적으로 제시된다. 본 개시의 특징 및 장점에 대한 더 나은 이해는 개시의 원리가 활용되는 예시적인 구체예를 제시하는 다음의 상세한 설명, 및 첨부되는 도면을 참조하여 얻어질 것이다:
도 1은 상이한 뇌척수액 ("CSF") 샘플에서 확인된 단백질의 총 수를 도시한다. 질량 분광분석 분석을 위해 10개의 개별 CSF 샘플의 세트가 P39와 접촉되어 10개의 단백질 코로나가 생성된다. 확인된 독특한 단백질의 총 수는 각 샘플에 대해 계수되었다.
도 2A 및 도 2B는 CSF 및 혈장/혈청에 대한 별도의 프로파일이 관찰되도록 두 유형의 샘플의 양호한 분리를 입증한 CSF 단백질 코로나 및 혈장/혈청 단백질 코로나의 열지도 클러스터링(heatmap clustering)을 도시한다. 혈청 또는 혈장 단백질 코로나의 4개 샘플이 열지도의 좌측 4개의 노드 상에서 클러스터링되었다. 모든 CSF 단백질 코로나는 열지도의 우측에서 클러스터링되었다.
도 3은 CSF 단백질 코로나 및 혈장 단백질 코로나와 관련된 스펙트럼 카운트를 도시한다. 도시된 단백질은 신경계 질환과 관련된 것으로 알려졌다. 혈장 단백질 코로나에 대한 스펙트럼 카운트는 열거된 많은 단백질에 대해 x-축을 따라 떨어진다 (중공 적색 원형으로 도시됨). CSF 혈장 단백질 코로나에 대한 스펙트럼 카운트는 진한 흑색 점으로 도시된다.
도 4는 상이한 입자로부터 유래된 CSF 단백질 코로나에서 확인된 단백질의 총 수를 도시한다. 모아진 CSF 샘플은 모든 입자에 대해 사용되었다. 1000개 이상의 독특한 단백질이 모든 입자로 확인되었다.
도 5는 상이한 소변 샘플에서 확인된 단백질의 총 수를 도시한다. 10개의 개별 소변 샘플 (U1 내지 U10) 세트 및 1개의 대조군 혈장 샘플 (PC)이 P39 입자와 상호작용하여 질량 분광분석 분석으로부터 11개의 프로파일이 생성되었다. 각각의 소변 샘플에서, 소변에서 확인된 단백질의 총 수는 혈장 샘플에서 확인된 단백질의 총 수보다 컸다.
도 6A 및 도 6B는 입자 P39, HX42 및 HX56으로부터 유래된 단백질 코로나의 다중 측정으로부터 확인된 단백질을 도시한다. TE 완충액으로 5배 희석된 모아진 혈장 샘플이 입자 및 입자 조합에 대한 이 실험에서 사용되었다. 도 6A는 상이한 조건으로 확인된 단백질의 총 수를 도시한다. 단일 입자 단백질 코로나 (P39, HX42 및 HX56)로, 3개 입자에 대해 각각 234, 303 및 353개의 독특한 단백질이 확인될 수 있다. "P39+HX42+HX56"으로 표지된 칼럼에서 알 수 있는 것과 같이, 모든 입자를 별도로 실행시켰을 때 총 411개의 독특한 단백질이 확인되었다. 더 높은 농도 ("3NP_8", 8 mg/mL의 최종 총 NP 농도) 및 더 낮은 농도 ("3NP_3", 3 mg/mL의 최종 총 NP 농도)에서의 입자 혼합으로, 305 및 284개의 독특한 단백질이 확인되었다. 전부 3개의 단백질 코로나의 소화후 혼합 ("3NP_PM")으로, 303개의 독특한 단백질이 확인되었다. 도 6B는 별도로 실행된 입자 ("P39+HX42+HX56"), 입자 혼합 ("P39+HX42+HX56 NP 혼합"), 및 소화후 혼합 ("P39+HX42+HX56 소화 후 혼합") 사이의 단백질의 중복을 도시한다.
도 7A는 생체 유체에서의 단백질체의 광범위한 범위를 도시한다. 이것은 광범위한 질문(interrogation)이 어렵고 느린 것을 보여준다. 단백질은 Geyer, et al. Mol Syst Biol 13, 942-15 (2017) (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 것과 같이 혈장 단백질체 프로젝트(Plasma Proteome Project)로부터 추출된 혈장 또는 혈청으로부터 확인된 단백질의 농도를 토대로 순위가 매겨진다. 도 7B는 본 개시의 입자 바이오센서 (X-축 표지 상에 및 도 7B의 우측의 설명에서 열거됨)가 깊이, 폭, 및 효율로 단백질체를 질문할 수 있음을 보여준다. 각각의 점은 상응하는 입자의 코로나에서 확인된 단백질 및 문헌에서 본 것과 같은 그 단백질의 혈장 농도를 나타낸다. 단백질은 많은 상이한 입자 유형의 단백질 코로나에서 광범위한 농도에서 확인될 수 있다. 입자 바이오센서는 그것의 넓은 동적 범위를 가로질러 단백질체를 신속하게 질문한다 (예컨대, 약 0.001 ug/ml 내지 거의 105 μg/ml의 농도에서 존재하는 단백질을 검정함으로써).
도 8A - 도 8G는 본원에서 개시된 고갈 방법에 대한 다양한 작업흐름을 도시한다. 도 8A는 입자가 있는 샘플의 연속적인 질문에 대한 작업 흐름을 도시한다. 샘플은 동일하거나 상이한 입자 유형을 사용하여 반복적으로 질문될 수 있다. 도 8B는 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형으로 샘플의 연속적인 질문을 포함하는 작업 흐름을 도시한다. 각 입자 유형의 코로나는 질문 다음에 분석된다. 도 8C는 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 및 제3 입자 유형으로 샘플의 연속적인 질문을 포함하는 작업 흐름을 도시한다. 각 입자 유형의 코로나는 질문 다음에 분석된다. 도 8D는 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 제3 입자 유형, 및 제4 입자 유형으로 샘플의 연속적인 질문을 포함하는 작업 흐름을 도시한다. 각 입자 유형의 코로나는 질문 다음에 분석된다. 도 8E는 첫 번째 및 두 번째로 입자 유형으로 샘플의 연속적인 질문을 포함하는 작업 흐름을 도시한다. 각 입자 유형의 코로나는 질문 다음에 분석된다. 도 8F는 첫 번째, 두 번째 및 세 번째로 입자 유형으로 샘플의 연속적인 질문을 포함하는 작업 흐름을 도시한다. 각 입자 유형의 코로나는 질문 다음에 분석된다. 도 8G는 첫 번째, 두 번째, 세 번째 및 네 번째로 입자 유형으로 샘플의 연속적인 질문을 포함하는 작업 흐름을 도시한다. 각 입자 유형의 코로나는 질문 다음에 분석된다.
도 9는 입자로 연속적으로 질문된 혈장 샘플의 젤을 도시한다. 샘플은 P39 입자로 질문되었고, 입자는 추출되었고, 결과적으로 얻어진 코로나는 젤 상에서 실행되었다 (P39 코로나 1). 상층액은 P39 입자로 두 번째 및 세 번째로 질문되었고, 입자는 매번 추출되었으며, 결과적으로 얻어진 코로나는 젤 상에서 실행되었다 (P39 코로나 2 및 P39 코로나 3). 그런 후 상층액은 HX-42 입자로 질문되었고, 입자는 추출되었고, 결과적으로 얻어진 코로나는 젤 상에서 실행되었다 (P39 및 HX-42 코로나 4). 별도로, 샘플은 HX-42 입자로 질문되었고, 입자는 추출되었고, 결과적으로 얻어진 코로나는 젤 상에서 실행되었다 (HX-42 코로나 1). 상층액은 HX-42 입자로 두 번째 및 세 번째로 질문되었고, 입자는 매번 추출되었으며, 결과적으로 얻어진 코로나는 젤 상에서 실행되었다 (HX-42 코로나 2 및 HX-42 코로나 3). 그런 후 상층액은 P39 입자로 질문되었고, 입자는 추출되었고, 결과적으로 얻어진 코로나는 젤 상에서 실행되었다 (HX-42 및 P39 코로나 4). 분리된 입자는 8 M 우레아로 처리되어 단백질이 젤 상에서 실행될 입자로부터 방출되었다. 8 M 우레아로 변성된 혈장 (HP1 우레아)이 대조군으로서 실행되었다.
도 10은 미고갈 및 고갈된 혈장으로부터 유래된 단백질 코로나가 겔 이미지를 토대로 입자에 결합된 상이한 단백질을 가진 것을 보여준다. 미고갈 또는 고갈된 혈장 샘플은 P39 입자로 질문되었고, 단백질 코로나가 검정되었다. 적색 화살표는 미고갈 대비 고갈된 혈장 샘플로부터 유래된 단백질 코로나가 상이한 단백질 (밴드로 예시됨)을 나타낸다. 입자는 8 M 우레아로 처리되어 단백질이 젤 상에서 실행될 입자로부터 방출되었다.
도 11은 9개의 상이한 입자로 검정된 단일 활액 (SF) 샘플로부터의 코로나 분석 실험 결과를 보여준다. 특정 입자 처리는 x-축 상에 표시된다. 코로나 분석 ("프로테오그래프(Proteograph)") 검정이 또한 대조군으로서 입자에 접촉되지 않은 활액 ("순수(neat) SF")으로 실행되었다. 전부 9개의 입자에 의해 확인된 독특한 단백질의 수가 플롯화되었다 ("전부 NP").
도 12는 입자로 검정된 2 유형의 샘플에 대한 코로나 분석 실험 결과를 도시한다. 미세 바늘 흡인 (FNA) 샘플이 25 G 바늘이 달린 1 mL 주사기를 사용하여 제조되었다. FNA 샘플은 포유류 단백질 추출 시약 (M-PER)으로 용해되었고 코로나 분석 전에 TE 완충액으로 완충액이 교체되었다. FNA에 의해 제공된 작은 질량으로 인해, FNA-코로나를 평가하기 위해 단일 입자 (P-039)가 사용되었다. 조직 샘플이 또한 M-PER로 용해되었고 코로나 분석 전에 TE 완충액으로 완충액이 교체되었다. 100 μL의 조직 샘플이 100 μL의 입자와 인큐베이션되어 조직-입자 코로나가 형성되었다. 펩타이드는 1시간 액체 크로마토그래피 (LC) 구배를 포함한 Orbitrap Lumos 기기 상에서 실행되었다. 코로나 분석이 또한 대조군으로서 입자와 접촉되지 않은 순수 조직 샘플 상에서 ("조직 순수") 수행되었다.
도 13은 입자로 검정된 혈장 및 혈청 샘플의 매칭된 쌍으로부터의 코로나 분석 실험 결과를 도시한다. 둘 다 5배 희석의 혈장 및 혈청 (각각 "혈장 5X" 및 "혈청 5X") 및 미희석 혈장 및 혈청 (각각 "미희석 혈장" 및 "미희석 혈청")이 테스트되었다. 각 입자 처리에 대한 막대는, 좌측에서 우측으로, 혈장 5X, 혈장 순수, 혈청 5X, 혈청 순수, 및 고갈된 혈장에 상응한다. 추가적으로, 혈장 샘플의 분취액이 IgY14 및 수퍼믹스 칼럼으로 완전히 고갈되었고 순수하고 희석된 샘플로 테스트되었다. 각각의 샘플이 별도의 웰에서 7개 입자의 각각에 대해 검정되었다. 입자가 없는 샘플 세트 ("NP 없음")가 또한 대조군으로서 테스트되었다.
도 14는 EDTA 혈액 수집 튜브에 수집된 혈액 샘플 ("EDTA")을 Streck 혈액 수집 튜브에 수집된 샘플 ("STRECK")에 비교하는 실험 결과를 도시한다. Streck 샘플 처리는 주변 온도에서 샘플의 밤새 수송을 시뮬레이션하기 위해 설계되었다. 회수된 펩타이드 질량의 분석이 3명의 환자로부터 수집된 혈액 샘플 (#1, #2, 및 #3)에 대해 수행되었다. 각각의 샘플은 입자로 ("P39 코로나") 및 입자 없이 ("순수 혈장") 검정되었다. 막대 높이는 각 샘플에서 회수된 평균 단백질 질량을 나타낸다. EDTA와 STRECK 혈장 코로나 사이에서 펩타이드 수율의 차이는 관찰되지 않았다.
도 15는 도 14에서 검정된 샘플에 대해 수행된 코로나 분석 실험에 의해 확인된 단백질의 평균 수를 도시한다. 막대 높이는 각 샘플에서 확인된 단백질의 평균 수를 나타낸다. EDTA와 STRECK 혈장 코로나 사이에서 확인된 단백질의 수에서 차이는 관찰되지 않았다.
도 16은 도 14 - 도 15에서 검정된 샘플에 대해 수행된 코로나 분석 실험에 의해 검출된 펩타이드의 평균 수를 도시한다. 막대 높이는 각 샘플에서 검출된 펩타이드의 평균 수를 나타낸다. EDTA와 STRECK 혈장 코로나 사이에서 확인된 펩타이드의 수에서 차이는 관찰되지 않았다.
도 17은 도 14 - 도 16에서 검정된 샘플에 대해 수행된 코로나 분석 실험에 의해 확인된 특징의 평균 수를 도시한다. 막대 높이는 각 샘플에서 확인된 특징의 평균 수를 나타낸다. EDTA와 STRECK 혈장 코로나 사이에서 특징의 수에서 차이는 관찰되지 않았다.
도 18은 도 14 - 도 17에서 제공된 실험 결과의 요약을 도시한다. 원형은 표시된 조건 하에서 각 샘플에서 확인된 단백질을 나타낸다. 원형의 중복되는 영역은 상응하는 EDTA 샘플 및 Streck 샘플 둘 다에서 확인된 단백질을 나타낸다. 원형의 비-중복 영역은 상응하는 조건 하에서 검정된 EDTA 샘플에서만 또는 Streck 샘플에서만 확인된 단백질을 나타낸다. 각 쌍에서 좌측을 향해 배치된 원형은 EDTA 샘플을 나타내고, 각 쌍에서 우측을 향해 배치된 원형은 Streck 샘플을 나타낸다.
도 19는 도 14 - 도 18에서 검정된 각 환자 샘플에서 코로나 분석에 의해 확인된 선택된 단백질 유형의 개별 단백질의 수를 도시한다. 입자로 검정된 Streck 샘플 ("Streck") 단독에서 또는 입자로 검정된 EDTA 샘플 ("EDTA") 단독에서 3명의 환자 샘플의 각각에서 확인된 선택된 단백질 유형의 단백질의 수가 플롯화된다. 입자로 검정된 Streck 샘플 및 입자로 검정된 EDTA 샘플 둘 다 ("중복")에서 3명의 환자 샘플의 각각에서 확인된 선택된 단백질 유형의 단백질의 수가 또한 플롯화된다.
도 20은 도 14 - 도 19에서 검정된 각 샘플에 대한 단백질 그룹 강도의 분포를 도시한다.
도 21은 도 14 - 도 20에서 검정된 각 샘플에 대한 단백질 그룹 강도의 변화의 퍼센트 변동 계수 (% CV)를 도시한다.
도 22A 및 도 22B는 도 14 - 도 21에서 입자의 존재 하에 검정된 각 샘플에서 확인된 공통 및 독특한 단백질의 수를 도시한다. 각 원형의 중복되는 영역에서의 수는 중복되는 원형에 의해 나타낸 각 샘플에서 확인된 단백질을 나타낸다. 도 22A는 EDTA 혈액 수집 튜브에서 수집된 각 환자 샘플에서 확인된 공통 및 독특한 단백질의 수를 보여주고, 도 22B는 Streck 혈액 수집 튜브에서 수집된 각 환자 샘플에서 확인된 공통 및 독특한 단백질의 수를 보여준다.
도 23은 도 14 - 도 22에서 검정된 각 샘플에 대해, 도 21에서 플롯화된 것과 같이, 단백질 그룹 강도의 변동 계수 (CV)를 도시한다.
도 24는 도 14 - 도 23에서의 Streck 혈액 수집 튜브 및 EDTA 혈액 수집 튜브 둘 다에서 수집된 샘플에서 확인된 공통 단백질 그룹의 강도의 플롯을 도시한다. Streck 샘플의 단백질 그룹 강도는 x-축 상에 플롯화된다. EDTA 샘플의 단백질 그룹 강도는 y-축 상에 플롯화된다. 환자 샘플 #1 (상부 플롯), #2 (중간 플롯), 및 #3 (하부 플롯)에 대한 단백질 그룹 강도는 입자의 존재 하에 (좌측 플롯, "유형=P39 코로나") 또는 부재 하에 (우측 플롯, "유형=순수 혈장") 어느 하나에 샘플에 대해 플롯화된다. 선형 피트의 R2 값 ("Rsq")은 각 플롯의 하부 우측 코너에 제공된다.
도 25A 및 도 25B는 도 14 - 도 24에서 Streck 혈액 수집 튜브 및 EDTA 혈액 수집 튜브 둘 다에서 수집된 샘플에서 확인된 단백질 그룹의 수를 도시한다. 도 25A는 각 샘플에서 확인된 적어도 하나의 혈장 단백질을 함유하는 단백질 그룹의 수를 보여준다. 도 25B는 각 샘플에서 확인된 적어도 하나의 혈장 단백질을 함유하지 않은 각 샘플에서 확인된 단백질 그룹의 수를 보여준다. 혈장 단백질로서의 단백질의 분류는 Keshishian 등에 의해 확인된 (Mol. Cell Proteomics 14, 2375-2393 (2015), 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 5,304개의 혈장 단백질 세트를 토대로 하였다.
도 26은 EDTA 샘플 수집 튜브 ("EDTA") 또는 Streck 샘플 수집 튜브 ("Streck")에 수집된 생물학적 샘프에서 실험적으로 확인된 단백질의 중복을 도시한다.
도 27은 EDTA 샘플 수집 튜브에서 수집된 샘플 및 Streck 샘플 수집 튜브에서 수집된 샘플에서 확인된 단백질의 평균 단백질 그룹 강도를 도시한다. 단백질 그룹 강도는 Carr 혈장 단백질체 데이터베이스에 존재하는 단백질에 대해 플롯화되었고 EDTA 샘플 수집 튜브에서 수집된 샘플 (y-축) 및 Streck 샘플 수집 튜브에서 수집된 샘플 (x-축)에서 모두 확인되었다.
도 28A 및 도 28B는 도 27에서 확인된 115개의 단백질 그룹 사이의 Spearman (도 28A) 및 Pearson (도 28B) 상관 계수를 도시한다.
도 29는 본원에 제공된 방법을 실행하기 위해 프로그래밍된 또는 그렇지 않으면 구성된 컴퓨터 시스템을 도시한다.
도 30A - 도 30C는 EDTA 혈액 수집 튜브에서 수집된 혈장 샘플 (x-축) 및 Streck 샘플 수집 튜브에서 수집된 혈장 샘플 (y-축) 사이의 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 측정된 3개의 단백질 농도의 상관관계를 도시한다. 도 30A는 C-반응성 단백질 (CRP)의 상관관계를 보여준다. 도 30B는 칼그라뉼린(Calgranulin) A 및 B 헤테로다이머 ("S100")의 상관관계를 보여준다. 도 30C는 MUC16/CA125 ("CA125")의 상관관계를 보여준다.
도 31은 EDTA 혈액 수집 튜브 또는 Streck 혈액 수집 튜브 중 어느 하나에서 수집된 혈장 샘플에서 ELISA에 의해 검출된 단백질 농도의 CRP (좌측 2개의 박스와 수염), S100 (중간 2개의 박스와 수염), 및 CA125 (우측 2개의 박스와 수염)의 퍼센트 변동 계수 (% CV)를 도시한다.
도 32는 CRP (좌측 플롯), S100 (중간 플롯), 및 CA125 (우측 플롯)에 대하여 EDTA 혈액 수집 튜브 또는 Streck 혈액 수집 튜브 중 어느 하나에서 수집된 샘플에서 ELISA에 의해 검출된 단백질 농도의 매칭된 쌍의 차이를 도시한다.
도 33은 EDTA 샘플 수집 튜브 (좌측) 또는 핵산 안정화제를 포함하는 샘플 수집 튜브 (우측)에서 수집된 생물학적 샘플을 처리하는 방법의 예를 도시한다.
도 34는 동일한 단백질의 공개된 농도에 대한 입자 코로나 단백질과 혈장 단백질의 최대 강도의 상관관계를 도시한다. 청색 플롯화된 선은 데이터에 대한 선형 회귀 모델이고 음영 영역은 모델 피트의 표준 오차를 나타낸다. 입자 ("S-003", "S-007", 및 "S-011")로 검정된 샘플의 동적 범위는 입자로 검정되지 않은 혈장 샘플 ("혈장")과 비교하여, 선형 피트의 기울기의 감소에 의해 나타난 바와 같이, 압축된 동적 범위를 나타냈다. 각 플롯의 기울기는 입자가 없는 혈장, S-003 입자가 있는 혈장, S-007 입자가 있는 혈장, 및 S-011 입자가 있는 혈장에 대해 각각 0.47, 0.19, 0.22, 및 0.18이다.
도 35는 입자 코로나 형성이 없는 질량 분광분석과 비교하여 질량 분광분석이 있는 단백질 코로나 분석 검정의 동적 범위 압축을 도시한다. 도 34에서 검정된 혈장 샘플 중의 입자 코로나에서 확인된 공통 단백질의 단백질 강도 ("나노입자 MS ln 강도")는 입자가 없는 혈장의 질?U 분광분석에 의해 확인된 단백질 강도 ("혈장 MS ln 강도")에 대해 플롯화된다. 가장 밝은 점선은 1의 기울기를 보이며, 입자가 없는 질량 분광분석의 동적 범위를 나타낸다. 단백질 강도에 대한 선형 피트의 기울기는 S-003, S-007, 및 S-011 입자에 대해 각각 0.12, 0.36, 및 0.093이었다. 회색 영역은 회귀 피트의 표준 오차 영역을 나타낸다.
본원에는 다양한 생물학적 샘플과 인큐베이션될 수 있는 입자의 조성물이 제공된다. 다양한 입자 유형은 단독으로 또는 조합하여, 광범위한 생물학적 샘플과 인큐베이션되어 입자 표면에 결합하여 단백질 코로나를 형성하는 것을 토대로 상기 생물학적 샘플에 존재하는 단백질을 분석할 수 있다. 단일 입자 유형은 특히 생물학적 샘플 중의 단백질을 검정하기 위해 사용되거나 또는 다중 입자 유형이 생물학적 샘플 중의 단백질을 검정하기 위해 함께 사용될 수 있다. 단백질 코로나 분석은 생물학적 샘플을 복수의 입자와 접촉시키고, 생물학적 샘플을 복수의 입자와 함께 인큐베이션하여 단백질 코로나를 형성하고, 입자를 생물학적 샘플로부터 분리하고, 그리고 단백질 코로나를 분석하여 단백질 코로나의 조성을 측정함으로써 생물학적 샘플 (예컨대, 생체 유체)에 대해 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나를 분석하는 것은 질량 분광분석을 사용하여 수행된다. 샘플을 복수의 입자로 질문한 후 복수의 입자 상에 형성된 단백질 코로나를 분석하는 것은 본원에서 "단백질 코로나 분석"으로서 언급될 수 있다. 생물학적 샘플은 하나 이상의 입자 유형으로 질문될 수 있다. 각 입자 유형의 단백질 코로나는 별도로 분석될 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 입자 유형의 단백질 코로나는 함께 분석될 수 있다.
본 개시는 본원에 개시된 입자 및 본원에 제공된 방법을 사용하여 검정될 수 있는 여러 생물학적 샘플을 제공한다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 뇌척수액 (CSF), 활액 (SF), 소변, 혈장, 혈청, 눈물, 열구액, 정액, 전혈, 우유, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액, 폐 세척액, 전립선액, 가래, 대변, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 기관지 흡인액, 땀 또는 타액과 같은 생체 유체 샘플일 수 있다. 생체 유체는 유동화된 고체, 예를 들어 조직 균질액, 또는 생물학적 샘플로부터 추출된 유체일 수 있다. 생물학적 샘플은, 예를 들어, 조직 샘플 또는 미세 바늘 흡인 (FNA) 샘플일 수 있다. 일부 구체예에서 생물학적 샘플은 세포 배양 샘플일 수 있다. 일부 구체예에서, 생체 유체는 유동화된 생물학적 샘플이다. 예를 들어, 생체 유체는 유동화된 세포 배양 추출물일 수 있다.
또한 본원에는 고도로 풍부한 단백질의 샘플을 고갈시키는 방법 및 그렇게 하기 위한 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 고갈은 고도로 풍부한 단백질의 생물학적 샘플 (예컨대, 생체 유체)을 고갈시키기 위해 하나 이상의 입자를 사용하는 것을 포함할 수 있다. 입자를 사용한 샘플의 고갈은 하나 이상의 입자 유형 (예컨대, 독특한 물질 조성을 가진 입자)으로 샘플을 고갈시키는 라운드를 하나 이상 포함할 수 있다. 다른 경우에, 혈장 고갈 키트, 칼럼, 크로마토그래피, 원심분리, 또는 다른 시스템이 고도로 풍부한 단백질의 생물학적 샘플을 고갈시키기 위해 사용될 수 있다. 이들 고갈 방법 중 어느 것이든지 본원에 개시된 것과 같이, 본원에 개시된 다양한 입자 유형을 사용하는 샘플의 연속적인 질문 및 상기 다양한 입자 유형의 코로나 분석이 후속될 수 있다.
본 개시의 예시적인 작업 흐름은 도 8A - 도 8G에 도시된다. 도 8A는 입자로 샘플을 연속적으로 질문하기 위한 작업 흐름을 예시한다. 샘플 (예컨대, 생물학적 샘플)은 동일한 또는 상이한 입자 유형을 사용하여 반복적으로 질문될 수 있다. 선택적으로, 샘플은 연속적인 질문 전에 고갈되거나 분별될 수 있다. 동일한 입자 유형 또는 상이한 입자 유형으로 샘플의 질문은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20회, 또는 그 이상 반복될 수 있다. 일부 구체예에서, 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 이상의 입자 유형은 동일한 입자 유형일 수 있다. 일부 구체예에서, 임의의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개, 또는 그 이상의 입자 유형은 상이한 입자 유형일 수 있다. 샘플은 샘플을 입자와 함께 인큐베이션되어 입자 상에 생체분자 코로나를 형성함으로써 입자 유형으로 질문될 수 있다. 샘플의 입자 유형으로의 질문 후에, 생체분자 코로나를 포함하는 입자는 샘플로부터 분리될 수 있다 (예컨대, 자기 분리, 원심분리, 여과, 또는 중력 분리를 사용함). 분리된 입자 상의 생체분자 코로나는 분석될 수 있다 (예컨대, 질량 분광분석, 겔 전기영동, 크로마토그래피, 분광학, 또는 면역검정에 의해). 생체분자 코로나의 단백질 코로나 분석은 총 단백질 분석 방법에 비교하여 분석의 동적 범위를 압축할 수 있다.
작업 흐름의 첫 번째 예는 도 8B에 제공된다. 도 8B는 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형으로 샘플의 연속적인 질문을 포함하는 작업 흐름을 예시한다. 제1 입자 유형은 표 1로부터 선택된 입자일 수 있다. 제2 입자 유형은 표 1로부터 선택된 입자일 수 있다. 각 입자 유형의 코로나는 질문 후에 분석된다. 선택적으로, 샘플은 질문 전에 고갈되거나 분별된다.
작업 흐름의 두 번째 예는 도 8B에 제공된다. 도 8C는 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 및 제3 입자 유형으로 샘플의 연속적인 질문을 포함하는 작업 흐름을 예시한다. 제1 입자 유형은 표 1로부터 선택된 입자일 수 있다. 제2 입자 유형은 표 1로부터 선택된 입자일 수 있다. 제3 입자 유형은 표 1로부터 선택된 입자일 수 있다. 각 입자 유형의 코로나는 질문 후에 분석된다. 선택적으로, 샘플은 질문 전에 고갈되거나 분별된다.
작업 흐름의 세 번째 예는 도 8B에 제공된다. 도 8D는 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 제3 입자 유형 및 제4 입자 유형으로 샘플의 연속적인 질문을 포함하는 작업 흐름을 예시한다. 제1 입자 유형은 표 1로부터 선택된 입자일 수 있다. 제2 입자 유형은 표 1로부터 선택된 입자일 수 있다. 제3 입자 유형은 표 1로부터 선택된 입자일 수 있다. 제4 입자 유형은 표 1로부터 선택된 입자일 수 있다. 각 입자 유형의 코로나는 질문 후에 분석된다. 선택적으로, 샘플은 질문 전에 고갈되거나 분별된다.
작업 흐름의 네 번째 예는 도 8B에 제공된다. 도 8E는 첫 번째 및 두 번째로 입자 유형으로 샘플의 연속적인 질문을 포함하는 작업 흐름을 예시한다. 입자 유형은 표 1로부터 선택된 입자일 수 있다. 입자 유형의 코로나는 각 질문 후에 분석된다. 선택적으로, 샘플은 질문 전에 고갈되거나 분별된다.
작업 흐름의 다섯 번째 예는 도 8B에 제공된다. 도 8F는 첫 번째, 두 번째, 및 세 번째로 입자 유형으로 샘플의 연속적인 질문을 포함하는 작업 흐름을 예시한다. 입자 유형은 표 1로부터 선택된 입자일 수 있다. 입자 유형의 코로나는 각 질문 후에 분석된다. 선택적으로, 샘플은 질문 전에 고갈되거나 분별된다.
작업 흐름의 여섯 번째 예는 도 8B에 제공된다. 도 8G는 첫 번째, 두 번째, 세 번??, 및 네 번째로 입자 유형으로 샘플의 연속적인 질문을 포함하는 작업 흐름을 예시한다. 입자 유형은 표 1로부터 선택된 입자일 수 있다. 입자 유형의 코로나는 각 질문 후에 분석된다.
작업 흐름의 예가 도 8B - 도 8G에 제공된 한편, 샘플의 연속적인 질문은 임의의 수 또는 유형의 입자 유형으로 임의의 횟수로 수행될 수 있다. 연속적인 질문은 동일한 입자 유형과 상이한 입자 유형의 임의의 순서의 조합으로 수행될 수 있다.
본 개시는 또한 생물학적 샘플, 예컨대 생체 유체를 분별하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 생체 유체는 유체 또는 유체의 상층액을 상이한 유형의 입자에 순차적으로 접촉시킴으로써 분획으로 분리될 수 있다. 생체 유체는 제1 입자 유형과 접촉될 수 있고, 제1 입자 유형은 제1 입자 유형에 결합된 임의의 생물학적 분자 (예컨대, 단백질)와 함께 생물학적 샘플로부터 (예컨대, 원심분리 또는 자기 분리에 의해) 분리될 수 있다. 분리된 제1 입자 유형 및 결합된 생물학적 분자는 제1 분획을 구성할 수 있다. 나머지 생체 유체 (예컨대, 상층액)는 제2 입자 유형과 접촉될 수 있고, 제2 입자 유형은 제2 입자 유형에 결합된 임의의 생물학적 분자와 함께 생물학적 샘플로부터 분리될 수 있다. 이 과정은 추가적인 입자 유형으로 반복될 수 있음으로써, 생체 유체가 분별된다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 크로마토그래피, 원심분리, 침전, 전기영동, 또는 임의의 다른 생화학적 분리 방법을 사용하여 분별될 수 있다. 샘플이 분별된 후, 샘플은 본원에 개시된 것과 같이, 다양한 입자 유형으로 연속적인 질문 방법을 사용하여 단백질에 대해 검정될 수 있다.
본원에 개시된 입자, 조성물, 및 방법은 다양한 샘플 수집 및 안정화 방법 및 조성물과 부합할 수 있다. 본원에 제공된 단백질 코로나 분석 방법은 안정화된 생물학적 샘플에 대해 수행될 수 있다. 안정화된 생물학적 샘플은 안정화제 (예컨대, 보존제)로 처리된 생물학적 샘플 (예컨대, 생체 유체)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 생물학적 샘플은 세포의 항원 발현을 유지하는 액체 보존제로 처리될 수 있다. 안정화제는 샘플 수집 용기 (예컨대, 혈액 수집 튜브) 내에 함유될 수 있다. 안정화된 생물학적 샘플은 본원에 개시된 임의의 입자, 조성물, 또는 방법을 사용하는 단백질 코로나 분석에 의해 분석될 수 있다. 일부 구체예에서, 안정화된 생물학적 샘플은 단백질 코로나 분석 전에 냉장 보관되지 않을 수 있다.
입자 유형
본원에 개시된 방법과 일치하는 입자 유형은 다양한 물질로부터 만들어질 수 있다. 예를 들어, 본 개시와 일치하는 입자 물질로 금속, 중합체, 자성 물질, 및 지질을 들 수 있다. 자성 입자는 산화 철 입자일 수 있다. 금속 물질의 예로는 금, 은, 구리, 니켈, 코발트, 팔라듐, 백금, 이리듐, 오스뮴, 로듐, 루테늄, 레늄, 바나듐, 크로뮴, 망간, 니오븀, 몰리브덴, 텅스텐, 탄탈륨, 철 및 카드뮴, 또는 US7749299에서 기재된 임의의 다른 물질 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 입자는 초상자성 산화 철 나노입자 (SPION)일 수 있다.
중합체의 예로는 폴리에틸렌, 폴리카보네이트, 다가 무수물, 폴리하이드록시산, 폴리프로필푸마레이트, 폴리카프로락톤, 폴리아미드, 폴리아세탈, 폴리에테르, 폴리에스테르, 폴리(오르토에스테르), 폴리시아노아크릴레이트, 폴리비닐 알코올, 폴리우레탄, 폴리포스파젠, 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리우레아, 폴리스티렌, 또는 폴리아민, 폴리알킬렌 글리콜 (예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)), 폴리에스테르 (예컨대, 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) (PLGA), 폴리락트산, 또는 폴리카프로락톤), 또는 둘 이상의 중합체의 공중합체, 예컨대 폴리알킬렌 글리콜 (예컨대, PEG)과 폴리에스테르 (예컨대, PLGA)의 공중합체 중 어느 하나 또는 임의의 조합을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 중합체는 지질-종결된 폴리알킬렌 글리콜 및 폴리에스테르, 또는 US9549901에서 개시된 임의의 다른 물질이다.
본 개시의 입자를 형성하기 위해 사용될 수 있는 지질의 예로는 양이온, 음이온, 및 중성 전하의 지질을 들 수 있다. 예를 들어, 입자는 다이올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 다이아실포스파티딜콜린, 다이아실포스파티딜에탄올아민, 세라미드, 스핑고미엘린, 케팔린, 콜레스테롤, 세레브로사이드 및 다이아실글리세롤, 다이올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 다이미리스토일포스파티딜콜린 (DMPC), 및 다이올레오일포스파티딜세린 (DOPS), 포스파티딜글리세롤, 카디오리핀, 다이아실포스파티딜세린, 다이아실포스파티딘산, N-도데카노일 포스파티딜에탄올아민, N-석시닐 포스파티딜에탄올아민, N-글루타릴포스파티딜에탄올아민, 리실포스파티딜글리세롤, 팔미토일올레이올포스파티딜글리세롤 (POPG), 레시틴, 리소레시틴, 포스파티딜에탄올아민, 리소포스파티딜에탄올아민, 다이올레오일포스파티딜에탄올아민 (DOPE), 다이팔미토일 포스파티딜 에탄올아민 (DPPE), 다이미리스토일포스포에탄올아민 (DMPE), 다이스테아로일-포스파티딜-에탄올아민 (DSPE), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE) 팔미토일올레오일포스파티딜콜린 (POPC), 난 포스파티딜콜린 (EPC), 다이스테아로일포스파티딜콜린 (DSPC), 다이올레오일포스파티딜콜린 (DOPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린 (DPPC), 다이올레오일포스파티딜글리세롤 (DOPG), 다이팔미토일포스파티딜글리세롤 (DPPG), 팔미토일올레이올포스파티딜글리세롤 (POPG), 16-O-모노메틸 PE, 16-O-다이메틸 PE, 18-1-트란스 PE, 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민 (POPE), 1-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민 (SOPE), 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 스핑고미엘린, 케팔린, 카디오리핀, 포스파티딘산, 세레브로사이드, 다이세틸포스페이트, 및 콜레스테롤, 또는 US9445994 (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 열거된 임의의 다른 물질 중 어느 하나 또는 임의의 조합으로 만들어질 수 있다.
본 개시의 입자의 예가 표 1에 제공된다.
본 개시의 예시 입자
배치 번호 유형 입자 ID 설명
S-001-001 HX-13 SP-001 카르복실레이트 (시트레이트) 초상자성 산화 철 NP (SPION)
S-002-001 HX-19 SP-002 페놀-포름알데하이드 코팅된 SPION
S-003-001 HX-20 SP-003 실리카-코팅된 초상자성 산화 철 NP (SPION)
S-004-001 HX-31 SP-004 폴리스티렌 코팅된 SPION
S-005-001 HX-38 SP-005 카르복실화된 폴리(스티렌-co-메타크릴산), P(St-co-MAA) 코팅된 SPION
S-006-001 HX-42 SP-006 N-(3-트라이메톡시실릴프로필)다이에틸렌트라이아민 코팅된 SPION
S-007-001 HX-56 SP-007 폴리(N-(3-(다이메틸아미노)프로필) 메타크릴아미드) (PDMAPMA)-코팅된 SPION
S-008-001 HX-57 SP-008 1,2,4,5-벤젠테트라카르복실산 코팅된 SPION
S-009-001 HX-58 SP-009 폴리(비닐벤질트라이메틸암모늄 클로라이드) (PVBTMAC) 코팅된 SPION
S-010-001 HX-59 SP-010 카르복실레이트, PAA 코팅된 SPION
S-011-001 HX-86 SP-011 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트) (POEGMA)-코팅된 SPION
P-033-001 P33 SP-333 카르복실레이트 마이크로입자, 계면활성제 없음
P-039-003 P39 SP-339 폴리스티렌 카르복실 기능화됨
P-041-001 P41 SP-341 카르복실산
P-047-001 P47 SP-365 실리카
P-048-001 P48 SP-348 카르복실산, 150 nm
P-053-001 P53 SP-353 아미노 표면 마이크로입자, 0.4-0.6 μm
P-056-001 P56 SP-356 실리카 아미노 기능화된 마이크로입자, 0.1-0.39 μm
P-063-001 P63 SP-363 제파민 표면, 0.1-0.39 μm
P-064-001 P64 SP-364 폴리스티렌 마이크로입자, 2.0-2.9 μm
P-065-001 P65 SP-365 실리카
P-069-001 P69 SP-369 카르복실화된 원래의 코팅, 50 nm
P-073-001 P73 SP-373 덱스트란계 코팅. 0.13 μm
P-074-001 P74 SP-374 저산성으로 실리카 실란올 코팅됨
본 개시의 입자는 합성되거나, 또는 본 개시의 입자는 상업적 판매처로부터 구입할 수 있다. 예를 들어, 본 개시와 일치하는 입자는 Sigma-Aldrich, Life Technologies, Fisher Biosciences, nanoComposix, Nanopartz, Spherotech, 및 기타 상업적 판매처를 포함한 상업적 판매처로부터 구입할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시의 입자는 상업적 판매처로부터 구입되고 추가로 변형되거나, 코팅되거나, 또는 기능화될 수 있다.
본 개시와 일치하는 입자는 광범위한 크기로 생체 유체에서 인큐베이션된 후 단백질 코로나를 형성하는 방법으로 만들어지고 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시의 입자는 나노입자일 수 있다. 일부 구체예예에서, 본 개시의 나노입자는 직경이 약 10 nm 내지 약 1000 nm일 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 나노입자는 직경이 적어도 10 nm, 적어도 100 nm, 적어도 200 nm, 적어도 300 nm, 적어도 400 nm, 적어도 500 nm, 적어도 600 nm, 적어도 700 nm, 적어도 800 nm, 적어도 900 nm, 10 nm 내지 50 nm, 50 nm 내지 100 nm, 100 nm 내지 150 nm, 150 nm 내지 200 nm, 200 nm 내지 250 nm, 250 nm 내지 300 nm, 300 nm 내지 350 nm, 350 nm 내지 400 nm, 400 nm 내지 450 nm, 450 nm 내지 500 nm, 500 nm 내지 550 nm, 550 nm 내지 600 nm, 600 nm 내지 650 nm, 650 nm 내지 700 nm, 700 nm 내지 750 nm, 750 nm 내지 800 nm, 800 nm 내지 850 nm, 850 nm 내지 900 nm, 100 nm 내지 300 nm, 150 nm 내지 350 nm, 200 nm 내지 400 nm, 250 nm 내지 450 nm, 300 nm 내지 500 nm, 350 nm 내지 550 nm, 400 nm 내지 600 nm, 450 nm 내지 650 nm, 500 nm 내지 700 nm, 550 nm 내지 750 nm, 600 nm 내지 800 nm, 650 nm 내지 850 nm, 700 nm 내지 900 nm, 또는 10 nm 내지 900 nm일 수 있다. 일부 구체예에서, 나노입자는 직경이 1000 nm 미만일 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시의 입자는 마이크로입자일 수 있다. 마이크로입자는 직경이 약 1 μm 내지 약 1000 μm인 입자일 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 마이크로입자는 직경이 적어도 1 μm, 적어도 10 μm, 적어도 100 μm, 적어도 200 μm, 적어도 300 μm, 적어도 400 μm, 적어도 500 μm, 적어도 600 μm, 적어도 700 μm, 적어도 800 μm, 적어도 900 μm, 10 μm 내지 50 μm, 50 μm 내지 100 μm, 100 μm 내지 150 μm, 150 μm 내지 200 μm, 200 μm 내지 250 μm, 250 μm 내지 300 μm, 300 μm 내지 350 μm, 350 μm 내지 400 μm, 400 μm 내지 450 μm, 450 μm 내지 500 μm, 500 μm 내지 550 μm, 550 μm 내지 600 μm, 600 μm 내지 650 μm, 650 μm 내지 700 μm, 700 μm 내지 750 μm, 750 μm 내지 800 μm, 800 μm 내지 850 μm, 850 μm 내지 900 μm, 100 μm 내지 300 μm, 150 μm 내지 350 μm, 200 μm 내지 400 μm, 250 μm 내지 450 μm, 300 μm 내지 500 μm, 350 μm 내지 550 μm, 400 μm 내지 600 μm, 450 μm 내지 650 μm, 500 μm 내지 700 μm, 550 μm 내지 750 μm, 600 μm 내지 800 μm, 650 μm 내지 850 μm, 700 μm 내지 900 μm, 또는 10 μm 내지 900 μm일 수 있다. 일부 구체예에서, 마이크로입자는 직경이 1000 μm 미만일 수 있다.
본 개시의 입자는 생물학적 샘플 (예컨대, 생체 유체)과 접촉되어 생체분자 코로나가 형성될 수 있다. 입자 및 생체분자 코로나는 생물학적 샘플로부터, 예를 들어 원심분리, 자기 분리, 여과, 또는 중력 분리에 의해 분리될 수 있다. 입자 유형 및 생체분자 코로나는 생물학적 샘플로부터 많은 분리 기법을 사용하여 분리될 수 있다. 분리 기법의 비제한적인 예로는 자기 분리, 칼럼-기반 분리, 여과, 회전 칼럼-기반 분리, 원심분리, 초원심분리, 밀도 또는 구배-기반 원심분리, 중력 분리, 또는 그것들의 임의의 조합을 들 수 있다. 단백질 코로나 분석은 분리된 입자 및 생체분자 코로나에 대해 수행될 수 있다. 단백질 코로나 분석은 생체분자 코로나에서 하나 이상의 단백질을, 예를 들어 질량 분광분석에 의해 확인하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 단일 입자 유형 (예컨대, 표 1에 열거된 유형의 입자)이 생물학적 샘플에 접촉될 수 있다. 일부 구체예에서, 복수의 입자 유형 (예컨대, 표 1에 제공된 복수의 입자 유형)이 생물학적 샘플에 접촉될 수 있다. 복수의 입자 유형은 조합되어 단일 샘플 부피에서 생물학적 샘플에 접촉될 수 있다. 복수의 입자 유형은 순차적으로 생물학적 샘플에 접촉하고 후속 입자 유형이 생물학적 샘플에 접촉하기 전에 생물학적 샘플로부터 분리될 수 있다. 생체분자 코로나의 단백질 코로나 분석은 총 단백질 분석 방법과 비교하여 분석의 동적 범위를 압축할 수 있다.
본 개시의 입자는 제1 입자 유형을 샘플과 인큐베이션하여 제1 입자 유형 상에 생체분자 코로나를 형성하고, 제1 입자 유형을 분리하고, 제2 입자 유형을 샘플과 인큐베이션하여 제2 입자 유형 상에 생체분자 코로나를 형성하고, 제2 입자 유형을 분리하고, 질문 (샘플과의 인큐베이션에 의함)과 분리를 임의의 수의 입자 유형에 대해 반복함으로써 샘플을 연속적으로 질문하기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플의 연속적인 질문을 위해 사용된 각 입자 유형 상의 생체분자 코로나는 단백질 코로나 분석에 의해 분석될 수 있다. 일부 구체예에서, 상층액의 생체분자 함량은 하나 이상의 입자 유형으로 연속적인 질문 후에 분석될 수 있다.
일부 구체예에서, 본 개시의 입자 유형은 샘플을 연속적으로 질문한 후 샘플과 입자 유형의 인큐베이션시 형성된 단백질 코로나의 단백질의 코로나 분석에 사용될 수 있다. 연속적인 질문은 라운드 바이 라운드 방식으로 두 입자 유형으로 수행될 수 있다. 연속적인 질문은 또한 추가의 입자 횟수로 후속 질문을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시의 입자는 상기 기술된 연속적인 질문 방법 전에 샘플을 고갈시키기 위해 사용될 수 있다. 입자 유형은 샘플과 접촉되어 입자 유형 표면 상에 생체분자 코로나를 형성할 수 있고, 입자는 샘플로부터 분리됨으로써, 샘플을 고갈시킬 수 있다. 이런 전략은 하나 이상의 단백질 (예컨대, 하나 이상의 고풍부성 단백질)을 샘플로부터 고갈시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 고갈된 샘플의 상층액의 생체분자 함량은 분석될 수 있다. 일부 구체예에서, 고갈된 샘플의 상층액은 본원에 개시된 임의의 단백질 코로나 분석 방법에서 사용될 수 있다.
본 개시의 입자 유형의 예는 카르복실레이트 (시트레이트) 초상자성 산화 철 나노입자 (SPION), 페놀-포름알데하이드 코팅된 SPION, 실리카-코팅된 SPION, 폴리스티렌 코팅된 SPION, 카르복실화된 폴리(스티렌-co-메타크릴산) 코팅된 SPION, N-(3-트라이메톡시실릴프로필)다이에틸렌트라이아민 코팅된 SPION, 폴리(N-(3-(다이메틸아미노)프로필)메타크릴아미드) (PDMAPMA)-코팅된 SPION, 1,2,4,5-벤젠테트라카르복실산 코팅된 SPION, 폴리(비닐벤질트라이메틸암모늄 클로라이드) (PVBTMAC) 코팅된 SPION, 카르복실레이트, PAA 코팅된 SPION, 폴리(올리고(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 메타크릴레이트) (POEGMA)-코팅된 SPION, 카르복실레이트 마이크로입자, 폴리스티렌 카르복실 기능화된 입자, 카르복실산 코팅된 입자, 실리카 입자, 직경이 약 150 nm인 카르복실산 입자, 직경이 약 0.4-0.6 μm인 아미노 표면 마이크로입자, 직경이 약 0.1-0.39 μm인 실리카 아미노 기능화된 마이크로입자, 직경이 약 0.1-0.39 μm인 제파민 표면 입자, 직경이 약 2.0-2.9 μm인 폴리스티렌 마이크로입자, 실리카 입자, 직경이 약 50 nm인 원래의 코팅을 가진 카르복실화된 입자, 직경이 약 0.13 μm인 덱스트란계 코팅으로 코팅된 입자, 또는 저산성을 가진 실리카 실란올 코팅된 입자일 수 있다.
샘플 수집 및 추출 방법
다양한 샘플이 본 개시의 방법 및 조성물에 따라 검정될 수 있다. 본원에 개시된 샘플은 샘플이 다양한 입자 유형으로 연속적으로 질문된 후에 단백질 코로나 분석에 의해 분석될 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플은 단백질 코로나 분석 전에 분별될 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플은 단백질 코로나 분석 전에 고갈될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 개시의 방법은 샘플을 하나 이상의 입자 유형과 접촉시키고 샘플에 대해 단백질 코로나 분석을 수행하는 것을 포함할 수 있다.
샘플은 생물학적 샘플일 수 있다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 뇌척수액 (CSF), 활액 (SF), 소변, 혈장, 혈청, 눈물, 열구액, 정액, 전혈, 우유, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액, 폐 세척액, 전립선액, 가래, 대변, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 기관지 흡인액, 땀 또는 타액과 같은 생체 유체 샘플일 수 있다. 생체 유체는 유동화된 고체, 예를 들어 조직 균질액, 또는 생물학적 샘플로부터 추출된 유체일 수 있다. 생물학적 샘플은, 예를 들어, 조직 샘플 또는 미세 바늘 흡인 (FNA) 샘플일 수 있다. 일부 구체예에서 생물학적 샘플은 세포 배양 샘플일 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있는 샘플은 세포 배양에서 성장하는 세포를 포함하거나 세포 배양으로부터 취한 무세포 물질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 생체 유체는 유동화된 생물학적 샘플이다. 예를 들어, 생체 유체는 유동화된 세포 배양 추출물일 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플은 유동 샘플로부터 추출되거나, 또는 샘플은 고체 샘플로부터 추출될 수 있다. 예를 들어, 샘플은 유동화된 고체로부터 추출된 기체상 분자 (예컨대, 휘발성 유기 화합물)를 포함할 수 있다.
본원에 기술된 단백질 코로나 분석 방법은 넓은 동적 범위를 가로질러 본 개시의 샘플 중의 단백질을 검정하는 것을 포함할 수 있다. 샘플에서 검정된 단백질의 동적 범위는 샘플 내에 함유된 단백질에 대한 검정 방법 (예컨대, 질량 분광분석, 크로마토그래피, 겔 전기영동, 분광학, 또는 면역검정)에 의해 측정되는 단백질 풍부성의 측정된 신호의 범위일 수 있다. 예를 들어, 넓은 동적 범위를 가로질러 단백질을 검출할 수 있는 검정은 매우 낮은 풍부성의 단백질부터 매우 높은 풍부성의 단백질까지 검출할 수 있다. 검정의 동적 범위는 단백질 풍부성의 함수로서 검정 신호 강도의 기울기와 직접 관련될 수 있다. 예를 들어, 낮은 동적 범위를 가진 검정은 단백질 풍부성의 함수로서 검정 신호 강도의 낮은 (그러나 양성인) 기울기를 가질 수 있고, 예컨대, 고풍부성 단백질에 대해 검출된 신호 대 저풍부성 단백질에 대해 검출된 신호의 비율은 높은 동적 범위를 가진 검정보다 낮은 동적 범위를 가진 검정에 대해 더 낮을 수 있다. 본원에 기술된 단백질 코로나 분석 방법은 검정의 동적 범위를 압축할 수 있다. 검정의 동적 범위는 만약 단백질 풍부성의 함수로서 검정 신호 강도의 기울기가 다른 검정의 그것보다 낮다면 또 다른 검정에 비해 압축될 수 있다. 예를 들어, 질량 분광분석을 포함한 단백질 코로나 분석을 사용하여 검정된 혈장 샘플은, 도 34 및 도 35에서 도시된 것과 같이, 직접 샘플에 대해 질량 분광분석 단독을 사용하여 검정된 혈장 샘플과 비교하여 또는 데이터베이스 (예컨대, Keshishian et al., Mol. Cell Proteomics 14, 2375-2393 (2015)에서 제공된 데이터베이스, 본원에서 "Carr 데이터베이스"로도 언급됨)의 혈장 단백질에 대해 제공된 풍부성 값과 비교하여 압축된 동적 범위를 가질 수 있다. 압축된 동적 범위는 질량 분광분석을 단독으로 사용하는 것보다 질량 분광분석과 함께 단백질 코로나 분석을 사용하여 혈장 샘플 중의 보다 낮은 풍부성의 단백질을 검출하는 것을 가능하게 할 수 있다.
검정의 동적 범위의 압축은 본원에서 개시된 방법 (예컨대, 입자로의 연속적인 질문 후 질량 분광분석과 같은 단백질 풍부성을 정량하기 위한 검정)을 사용하여 낮은 풍부성 단백질의 검출을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 검정 (예컨대, 질량 분광분석)은 1000배의 동적 범위를 검출할 수 있다. 5개의 단백질, A, B, C, D, 및 E를 각각 1 ng/mL, 10 ng/mL, 100 ng/mL, 1,000 ng/mL, 및 10,000 ng/mL의 풍부성으로 포함하는 샘플에서, 검정 (예컨대, 질량 분광분석)은 단백질 B, C, D, 및 E를 검출할 수 있다. 그러나, 입자와 샘플을 인큐베이션하는 본원에 개시된 방법을 사용하면, 단백질 A, B, C, D, 및 E는 입자 표면에 대해 상이한 친화도를 가질 수 있고 입자 표면에 흡착되어 샘플에 존재하는 것과 상이한 풍부성에서 생체분자 코로나를 형성할 수 있다. 예를 들어, 단백질 A, B, C, D, 및 E는 각각 1 ng/mL, 231 ng/mL, 463 ng/mL, 694 ng/mL, 및 926 ng/mL의 풍부성에서 생체분자 코로나에 존재할 수 있다. 그러므로, 샘플을 질문하는 방법에서 본원에 개시된 입자를 사용하는 것은 동적 범위를 100배로 압축하는 결과를 초래하고 결과적으로 검정 (예컨대, 질량 분광분석)은 전부 5개 단백질을 검출할 수 있다.
다중 생체 유체는 본 개시의 방법 및 조성물을 사용하는 것과 병렬로 처리될 수 있다. 단백질 코로나 분석은 다중 생물학적 샘플에 대한 단백질 코로나 분석 검정의 각 단계를 동시에 수행함으로써 다중 생물학적 샘플에 대해 병렬로 수행될 수 있다. 예를 들어, 단백질 코로나 분석은 다중 생물학적 샘플에 대해 단백질 코로나 분석 검정의 제1 단계를 동시에 수행하고, 다중 생물학적 샘플에 대해 단백질 코로나 분석 검정의 제2 단계를 동시에 수행하며, 다중 생물학적 샘플에 대해 단백질 코로나 분석 검정의 제3 단계를 동시에 수행함으로써 다중 생물학적 샘플에 대해 병렬로 수행될 수 있다. 다중 생물학적 샘플에 대한 단백질 코로나 분석 검정의 각 단계의 동시 수행은 단백질 코로나 분석 검정의 모든 단계가 다중 생물학적 샘플에 대해 수행될 때까지 반복될 수 있다. 일부 경우에, 다중 생물학적 샘플은 동일한 대상체로부터 얻어질 수 있다. 이들 샘플은 대상체로부터 얻어진 샘플의 부분일 수 있다 (예컨대, 혈장 샘플의 다중 분취액). 이들 샘플은 동일한 대상체로부터 수집된 상이한 생체 유체일 수 있다.
일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 복수의 생물학적 샘플의 각 샘플에 대해 단백질 코로나 분석 검정의 제1 단계를 순차적으로 수행하고, 복수의 생물학적 샘플의 각 샘플에 대해 단백질 코로나 분석 검정의 제2 단계를 순차적으로 수행하며, 복수의 생물학적 샘플의 각 샘플에 대해 단백질 코로나 분석 검정의 제3 단계를 순차적으로 수행함으로써, 다중 생물학적 샘플에 대해 병렬로 수행될 수 있다. 단백질 코로나 분석의 각 단계의 순차적인 수행은 단백질 코로나 분석 검정의 모든 단계가 복수의 생물학적 샘플의 각각의 생물학적 샘플에 대해 수행될 때까지 복수의 생물학적 샘플의 각 샘플에 대해 수행되고 반복될 수 있다.
관심의 단백질 (예컨대, 저풍부성 단백질)은 미처리 샘플 (예컨대,입자를 사용하여 검정되지 않은 샘플)에 비해 생체분자 코로나에서 풍부해질 수 있다. 일부 구체예에서, 풍부화 수준은 미처리 샘플에 비교하여 생체분자 코로나에서의 총 단백질 농도에 비해 관심의 단백질의 농도의 퍼센트 증가 또는 배수 증가일 수 있다. 관심의 단백질은 입자에 접촉되지 않은 샘플과 비교하여 생체분자 코로나에서의 관심의 단백질의 농도를 증가시킴으로써 생체분자 코로나에서 풍부해질 수 있다. 관심의 단백질은 입자에 접촉되지 않은 샘플과 비교하여 생체분자 코로나에서의 고풍부성 단백질의 농도를 감소시킴으로써 풍부해질 수 있다. 단백질 코로나 분석 검정은 생물학적 샘플 (예컨대, 생체 유체)에서 저풍부성 단백질을 신속하게 확인하기 위하여 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 생물학적 샘플을 입자와 처음 접촉시킨 후 약 8시간 이내에 생물학적 샘플에서 적어도 약 500개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 생물학적 샘플을 입자와 처음 접촉시킨 후 약 8시간 이내에 생물학적 샘플에서 적어도 약 1000개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 생물학적 샘플을 입자와 처음 접촉시킨 후 약 4시간 이내에 생물학적 샘플에서 적어도 약 500개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 생물학적 샘플을 입자와 처음 접촉시킨 후 약 4시간 이내에 생물학적 샘플에서 적어도 약 1000개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다.
생물학적 샘플은 안정화 시약을 포함하는 샘플 수집 튜브에서 수집될 수 있다. 안정화 시약은 생체 유체 샘플의 핵화된 세포 또는 생체 유체 샘플의 다른 생체분자, 예컨대 단백질 또는 핵산 (예컨대, RNA 또는 DNA, 세포 유리 RNA 또는 DNA를 포함함)을 안정화할 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플 수집 튜브는 대사 억제제, 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, 뉴클레아제 억제제, 보존제, 폴리아미드, 또는 그것들의 조합을 포함할 수 있다. 대사 억제제는 글리세르알데하이드, 다이하이드록시아세톤 포스페이트, 글리세르알데하이드 3-포스페이트, 1,3-비스포스포글리세레이트, 3-포스포글리세레이트, 2-포스포글리세레이트, 포스포에놀피루베이트, 피루베이트 및 글리세레이트 다이하이드록시아세테이트, 불화 나트륨, 또는 K2C2O4를 포함할 수 있다. 프로테아제 억제제는 안티펜, 아프로티닌, 카이모스타틴, 엘라스타티날, 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF), APMSF, TLCK, TPCK, 류펩틴, 대두 트립신 억제제, 인돌아세트산 (IAA), E-64, EDTA, 펩스타틴, VdLPFFVdL, 1,10-페난트롤린, 포스포라모돈, 아마스타틴, 베스타틴, 다이프로틴 A, 다이프로틴 B, 알파-2-마크로글로불린, 리마콩 트립신 억제제, 췌장 프로테아제 억제제, 또는 난백 오보스타틴 난백 시스타틴을 포함할 수 있다. 포스파타제 억제제 는 칼리쿨린 A, 노둘라린, NIPP-1, 마이크로시스틴 LR, 토토마이신, 오카다산, 칸타리딘, 마이크로시스틴 LR, 오카다산, 포스트리에신, 토토마이신, 칸타리딘, 엔도탈, 노둘라린, 사이클로스포린 A, FK 506/면역필린 복합체, 사이퍼메트린, 델타메트린, 펜발레레이트, bpV(phen), 데포스타틴, mpV(pic) DMHV, 또는 나트륨 오르토바나데이트를 포함할 수 있다. 뉴클레아제 억제제는 다이에틸 피로카보네이트, 에탄올, 아우린트라이카르복실산 (ATA), 포름아미드, 바나딜-리보뉴클레오사이드 복합체, 마칼로이드, 에틸렌다이아민 테트라아세트산 (EDTA), 단백질 분해효소 K, 헤파린, 하이드록시아민-산소-제2 구리 이온, 벤토나이트, 암모늄 설페이트, 다이티오트레이톨 (DTT), 베타-머캡토에탄올, 시스테인, 다이티오에리트리톨, 트리스(2-카르복시에틸) 포스펜 염산염, 또는 Mg+2, Mn+2, Zn+2, Fe+2, Ca+2, 또는 Cu+2와 같은 이가 양이온을 포함할 수 있다. 보존제는 다이아졸리디닐 우레아, 이미다졸리디닐 우레아, 다이메토일롤-5,5-다이메틸히단토인, 다이메틸롤 우레아, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-다이올, 옥사졸리딘, 나트륨 하이드록시메틸 글리시네이트, 5-하이드록시메톡시메틸-1-1아자-3,7-다이옥사비시클로[3.3.0]옥탄, 5-하이드록시메틸-1-1아자-3,7다이옥사비시클로[3.3.0]옥탄, 5-하이드록시폴리[메틸렌옥시]메틸-1-1아자-3,7다이옥사비시클로[3.3.0]옥탄, 또는 사차 아다만틴을 포함할 수 있다. 샘플 수집 튜브는 미국 특허: 제 8,304,187호, 제 8,586,306호, 제 9,657,227호, 제 9,926,590호, 제 10,144,955호, 및 제 10,294,513호, 및 미국 출원 번호: 16/377,344 (이들 각각은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨), 및 기타 단백질 분리 기법에서 개시된 안정화제를 포함할 수 있다.
뇌척수액 (CSF) 샘플. 본 개시는 본원에 개시된 하나 이상의 입자 (예컨대, 표 1에 개시된 하나 이상의 입자)를 사용하여 뇌척수액 샘플 중의 단백질을 검정하는 방법을 제공한다. CSF의 단백질의 상대적으로 낮은 풍부성은 전통적인 수단 (예컨대, ELISA, 면역형광, 겔 전기영동, 또는 크로마토그래피)을 사용하는 단백질 검출을 혼란스럽게 할 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 낮은 단백질 농도를 가진 샘플에서 단백질을 검출하는 데 아주 적합할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 단백질 코로나 분석 검정은 약 1.0 mg/mL 이하, 약 0.9 mg/mL 이하, 약 0.8 mg/mL 이하, 약 0.7 mg/mL 이하, 약 0.6 mg/mL 이하, 약 0.5 mg/mL 이하, 약 0.4 mg/mL 이하, 약 0.3 mg/mL 이하, 약 0.2 mg/mL 이하, 또는 약 0.1 mg/mL 이하의 총 단백질 농도를 가진 샘플 중의 단백질을 검출할 수 있다.
CSF의 샘플 수집 부피는 작을 수 있어서, 약 1 mL 내지 약 10 mL의 범위이며, 각 샘플로 수행될 수 있는 검정의 수를 제한한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 작은 샘플 부피에서 단백질을 검출하는 데 아주 적합할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 개시된 단백질 코로나 분석 검정은 약 1000 μL 이하, 약 900 μL 이하, 약 800 μL 이하, 약 700 μL 이하, 약 600 μL 이하, 약 500 μL 이하, 약 400 μL 이하, 약 300 μL 이하, 약 200 μL 이하, 약 100 μL 이하, 약 50 μL 이하, 약 20 μL 이하, 약 10 μL 이하, 약 5 μL 이하, 약 2 μL 이하, 또는 약 1 μL 이하의 샘플 부피에서 단백질을 검출할 수 있다.
단백질 코로나 분석 검정은 CSF 샘플에서 저풍부성 단백질을 신속하게 확인하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 코로나 분석은 CSF 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 2시간 이내에, 약 2.5시간 이내에, 약 3시간 이내에, 약 3.5시간 이내에, 약 4시간 이내에, 약 4.5시간 이내에, 약 5시간 이내에, 약 5.5시간 이내에, 약 6시간 이내에, 약 6.5시간 이내에, 약 7시간 이내에, 약 7.5시간 이내에, 약 8시간 이내에, 약 8.5시간 이내에, 약 9시간 이내에, 약 9.5시간 이내에, 또는 약 10시간 이내에 CSF 샘플에서 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다.
일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 생물학적 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 8시간 이내에 CSF 샘플에서 적어도 약 500개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 CSF 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 8시간 이내에 CSF 샘플에서 적어도 약 1000개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 CSF 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 4시간 이내에 CSF 샘플에서 적어도 약 500개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 CSF 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 4시간 이내에 CSF 샘플에서 적어도 약 1000개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다.
본원에 개시된 방법은 CSF에서 단백질을 검정하는 다른 방법보다 월등하며 짧은 시간 내에 넓은 동적 범위를 가로질러 CSF에서 단백질의 샘플링을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 CSF 샘플에서 단백질을 신속하게 풍부화하기 위해 하나 이상의 입자를 이용한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 본원에 개시된 하나 이상의 입자 유형은 CSF 샘플에서 관심의 단백질 (고풍부성 단백질, 중간 풍부성 단백질, 또는 저풍부성 단백질)을 검정하는 방법에 사용될 수 있고, 방법은 상기 하나 이상의 입자 유형을, 입자 상에 생체분자 코로나가 형성되고 CSF 샘플에서 단백질의 풍부화가 가능해지도록 CSF 샘플에서 인큐베이션하는 단계, 입자를 CSF 샘플 중의 미결합 생체분자로부터 분리하는 단계 (예컨대, 자기 분리에 의함), 및 관심의 단백질에 대해 코로나 중의 생체분자를 트립신 처리하고 분석하는 단계를 포함한다. 추가로, 상기 방법을 사용하면 입자 유형 주변에서 형성된 생체분자 코로나에서 관심의 단백질의 효율적인 풍부화가 허용된다. 관심의 단백질은 생체분자 코로나에서 입자에 접촉되지 않은 CSF 샘플에 비해 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 풍부해질 수 있다. 관심의 단백질은 생체분자 코로나에서 입자에 접촉되지 않은 CSF 샘플에 비해 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배 풍부해질 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 하나 이상의 입자 (예컨대, 표 1에 개시된 임의의 하나 이상의 입자 유형)는 CSF 샘플로부터 적어도 약 500개, 적어도 약 600개, 적어도 약 650개, 적어도 약 700개, 적어도 약 750개, 적어도 약 800개, 적어도 약 850개, 적어도 약 900개, 적어도 약 950개, 적어도 약 1000개 단백질, 적어도 약 1050개 단백질, 적어도 약 1100개 단백질, 적어도 약 1150개 단백질, 또는 적어도 약 1200개의 구별되는 단백질을 포획하는 결과를 초래할 수 있다.
활액 샘플. 본 개시는 본원에 개시된 하나 이상의 입자 (예컨대, 및 표 1에 개시된 하나 이상의 입자)를 사용하여 활액 샘플에서 단백질을 검정하는 방법을 제공한다. SF 중의 총 단백질에 비해 상대적으로 높은 농도의 고풍부성 단백질 (예컨대, 알부민)은 전통적인 수단 (예컨대, ELISA, 면역형광, 겔 전기영동, 또는 크로마토그래피)을 사용하는 단백질 검출을 혼란스럽게 할 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 고농도의 고풍부성 단백질이 있는 샘플에서 저풍부성 단백질을 검출하는 데 아주 적합할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 단백질 코로나 분석 검정은 총 단백질 함량에 비해 고풍부성 단백질을 중량 기준으로 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70% 포함한 샘플에서 저풍부성 단백질을 검출할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 단백질 코로나 분석 검정은 추가적인 분별 또는 고갈 단계를 필요로 하지 않고 고풍부성 단백질을 상대적으로 고농도로 포함하는 샘플에 대해 수행될 수 있다.
SF의 샘플 수집 부피는 작을 수 있어서, 약 2 mL 내지 약 20 mL의 범위이며, 각 샘플로 수행될 수 있는 검정의 수를 제한한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 작은 샘플 부피에서 단백질을 검출하는 데 아주 적합할 수 있다. 예를 들어, 본원에서 개시된 단백질 코로나 분석 검정은 약 1000 μL 이하, 약 900 μL 이하, 약 800 μL 이하, 약 700 μL 이하, 약 600 μL 이하, 약 500 μL 이하, 약 400 μL 이하, 약 300 μL 이하, 약 200 μL 이하, 약 100 μL 이하, 약 50 μL 이하, 약 20 μL 이하, 약 10 μL 이하, 약 5 μL 이하, 약 2 μL 이하, 또는 약 1 μL 이하의 샘플 부피에서 단백질을 검출할 수 있다.
단백질 코로나 분석 검정은 SF 샘플에서 저풍부성 단백질을 신속하게 확인하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 코로나 분석은 SF 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 2시간 이내에, 약 2.5시간 이내에, 약 3시간 이내에, 약 3.5시간 이내에, 약 4시간 이내에, 약 4.5시간 이내에, 약 5시간 이내에, 약 5.5시간 이내에, 약 6시간 이내에, 약 6.5시간 이내에, 약 7시간 이내에, 약 7.5시간 이내에, 약 8시간 이내에, 약 8.5시간 이내에, 약 9시간 이내에, 약 9.5시간 이내에, 또는 약 10시간 이내에 SF 샘플에서 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다.
일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 생물학적 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 8시간 이내에 SF 샘플에서 적어도 약 500개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 SF 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 8시간 이내에 SF 샘플에서 적어도 약 1000개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 SF 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 4시간 이내에 SF 샘플에서 적어도 약 500개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 SF 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 4시간 이내에 SF 샘플에서 적어도 약 1000개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다.
본원에 개시된 방법은 활액에서 단백질을 검정하는 다른 방법보다 월등하며 짧은 시간 내에 넓은 동적 범위를 가로질러 활액에서 단백질의 샘플링을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 활액 샘플에서 단백질을 신속하게 풍부화하기 위해 하나 이상의 입자를 이용한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 본원에 개시된 하나 이상의 입자 유형은 활액 샘플에서 관심의 단백질 (고풍부성 단백질, 중간 풍부성 단백질, 또는 저풍부성 단백질)을 검정하는 방법에 사용될 수 있고, 방법은 상기 하나 이상의 입자 유형을, 입자 상에 생체분자 코로나가 형성되고 활액 샘플에서 단백질의 풍부화가 가능해지도록 활액 샘플에서 인큐베이션하는 단계, 입자를 활액 샘플 중의 미결합 생체분자로부터 분리하는 단계 (예컨대, 자기 분리에 의함), 및 관심의 단백질에 대해 코로나 중의 생체분자를 트립신 처리하고 분석하는 단계를 포함한다. 추가로, 상기 방법을 사용하면 입자 유형 주변에서 형성된 생체분자 코로나에서 관심의 단백질의 효율적인 풍부화가 허용된다. 관심의 단백질은 생체분자 코로나에서 입자에 접촉되지 않은 SF 샘플에 비해 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 풍부해질 수 있다. 관심의 단백질은 생체분자 코로나에서 입자에 접촉되지 않은 SF 샘플에 비해 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배 풍부해질 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 하나 이상의 입자 (예컨대, 표 1에 개시된 임의의 하나 이상의 입자 유형)는 활액 샘플로부터 적어도 약 500, 적어도 약 600, 적어도 약 700, 적어도 약 800, 적어도 약 900, 적어도 약 1000, 적어도 약 1100, 적어도 약 1200, 적어도 약 1300, 적어도 약 1400, 적어도 약 1500, 적어도 약 1600, 적어도 약 1700, 적어도 약 1800, 적어도 약 1900, 적어도 약 2000, 적어도 약 2100, 적어도 약 2200, 적어도 약 2300, 적어도 약 2400, 적어도 약 2500, 적어도 약 2750, 적어도 약 3000, 적어도 약 3250, 적어도 약 3500, 적어도 약 3750, 또는 적어도 약 4000의 풍부화를 초래할 수 있다.
소변 샘플. 본 개시는 본원에 개시된 하나 이상의 입자 (예컨대, 및 표 1에 개시된 하나 이상의 입자)를 사용하여 소변 샘플 중의 단백질을 검정하는 방법을 제공한다. 소변의 단백질의 상대적으로 낮은 풍부성은 전통적인 수단 (예컨대, ELISA, 면역형광, 겔 전기영동, 또는 크로마토그래피)을 사용하는 단백질 검출을 혼란스럽게 할 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 낮은 단백질 농도를 가진 샘플에서 단백질을 검출하는 데 아주 적합할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 단백질 코로나 분석 검정은 약 10 mg/mL 이하, 약 5.0 mg/mL 이하, 약 4.0 mg/mL 이하, 약 3.0 mg/mL 이하, 약 2.0 mg/mL 이하, 약 1.0 mg/mL 이하, 약 0.9 mg/mL 이하, 약 0.8 mg/mL 이하, 약 0.7 mg/mL 이하, 약 0.6 mg/mL 이하, 약 0.5 mg/mL 이하, 약 0.4 mg/mL 이하, 약 0.3 mg/mL 이하, 약 0.2 mg/mL 이하, 약 0.1 mg/mL 이하, 약 0.05 mg/mL 이하, 또는 약 0.02 mg/mL 이하의 총 단백질 농도를 가진 샘플 중의 단백질을 검출할 수 있다.
소변 중의 총 단백질에 비해 상대적으로 높은 농도의 고풍부성 단백질 (예컨대, 알부민)은 전통적인 수단을 사용하는 단백질 검출을 혼란스럽게 할 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 고농도의 고풍부성 단백질이 있는 샘플에서 저풍부성 단백질을 검출하는 데 아주 적합할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 단백질 코로나 분석 검정은 총 단백질 함량에 비해 고풍부성 단백질을 중량 기준으로 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 포함한 샘플에서 저풍부성 단백질을 검출할 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 단백질 코로나 분석 검정은 추가적인 분별 또는 고갈 단계를 필요로 하지 않고 고풍부성 단백질을 상대적으로 고농도로 포함하는 샘플에 대해 수행될 수 있다.
단백질 코로나 분석 검정은 소변 샘플에서 저풍부성 단백질을 신속하게 확인하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 코로나 분석은 소변 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 2시간 이내에, 약 2.5시간 이내에, 약 3시간 이내에, 약 3.5시간 이내에, 약 4시간 이내에, 약 4.5시간 이내에, 약 5시간 이내에, 약 5.5시간 이내에, 약 6시간 이내에, 약 6.5시간 이내에, 약 7시간 이내에, 약 7.5시간 이내에, 약 8시간 이내에, 약 8.5시간 이내에, 약 9시간 이내에, 약 9.5시간 이내에, 또는 약 10시간 이내에 소변 샘플에서 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다.
일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 생물학적 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 8시간 이내에 소변 샘플에서 적어도 약 500개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 소변 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 8시간 이내에 소변 샘플에서 적어도 약 1000개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 소변 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 4시간 이내에 소변 샘플에서 적어도 약 500개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 소변 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 4시간 이내에 소변 샘플에서 적어도 약 1000개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다.
본원에 개시된 방법은 소변에서 단백질을 검정하는 다른 방법보다 월등하며 짧은 시간 내에 넓은 동적 범위를 가로질러 소변에서 단백질의 샘플링을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 소변 샘플에서 단백질을 신속하게 풍부화하기 위해 하나 이상의 입자를 이용한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 본원에 개시된 하나 이상의 입자 유형은 소변 샘플에서 관심의 단백질 (고풍부성 단백질, 중간 풍부성 단백질, 또는 저풍부성 단백질)을 검정하는 방법에 사용될 수 있고, 방법은 상기 하나 이상의 입자 유형을, 입자 상에 생체분자 코로나가 형성되고 활액 샘플에서 단백질의 풍부화가 가능해지도록 소변 샘플에서 인큐베이션하는 단계, 입자를 소변 샘플 중의 미결합 생체분자로부터 분리하는 단계 (예컨대, 자기 분리에 의함), 및 관심의 단백질에 대해 코로나 중의 생체분자를 트립신 처리하고 분석하는 단계를 포함한다. 추가로, 상기 방법을 사용하면 입자 유형 주변에서 형성된 생체분자 코로나에서 관심의 단백질의 효율적인 풍부화가 허용된다. 관심의 단백질은 생체분자 코로나에서 입자에 접촉되지 않은 소변 샘플에 비해 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 풍부해질 수 있다. 관심의 단백질은 생체분자 코로나에서 입자에 접촉되지 않은 소변 샘플에 비해 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배 풍부해질 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 하나 이상의 입자 (예컨대, 표 1에 개시된 임의의 하나 이상의 입자 유형)는 소변 샘플로부터 적어도 약 291, 적어도 약 294, 적어도 약 300, 적어도 약 350, 적어도 약 400, 적어도 약 450, 적어도 약 470, 적어도 약 500, 적어도 약 550, 적어도 약 600, 적어도 약 618, 적어도 약 650, 적어도 약 700, 적어도 약 709, 적어도 약 718, 적어도 약 750, 적어도 약 800, 적어도 약 838, 적어도 약 840, 적어도 약 847, 적어도 약 850, 적어도 약 900, 적어도 약 950, 적어도 약 984, 적어도 약 1000, 적어도 약 1050, 적어도 약 1100, 적어도 약 1150, 또는 적어도 약 1200의 풍부화를 초래할 수 있다.
유동화된 고체 샘플. 본 개시는 본원에 개시된 하나 이상의 입자 (예컨대, 및 표 1에 개시된 하나 이상의 입자)를 사용하여 유동화된 고체 샘플 중의 단백질을 검정하는 방법을 제공한다. 유동화된 고체 (예컨대, 조직 균질액)는 불균질성을 포함할 수 있고, 그것은 전통적인 수단 (예컨대, ELISA, 면역형광, 겔 전기영동, 또는 크로마토그래피)을 사용하는 단백질 검출을 혼란스럽게 할 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 불균질한 샘플에서 단백질을 검출하는 데 아주 적합할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 단백질 코로나 분석 검정은 추가적인 정제, 분별, 또는 고갈 단계에 대한 필요성 없이 유동화된 고체에 대해 수행될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 유동화된 고체에서 단백질을 검정하는 다른 방법보다 월등하며 짧은 시간 내에 넓은 동적 범위를 가로질러 유동화된 고체에서 단백질의 샘플링을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 유동화된 고체 샘플에서 단백질을 신속하게 풍부화하기 위해 하나 이상의 입자를 이용한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 본원에 개시된 하나 이상의 입자 유형은 유동화된 고체 샘플에서 관심의 단백질 (고풍부성 단백질, 중간 풍부성 단백질, 또는 저풍부성 단백질)을 검정하는 방법에 사용될 수 있고, 방법은 상기 하나 이상의 입자 유형을, 입자 상에 생체분자 코로나가 형성되고 유동화된 고체 샘플에서 단백질의 풍부화가 가능해지도록 유동화된 고체 샘플에서 인큐베이션하는 단계, 입자를 유동화된 고체 샘플 중의 미결합 생체분자로부터 분리하는 단계 (예컨대, 자기 분리에 의함), 및 관심의 단백질에 대해 코로나 중의 생체분자를 트립신 처리하고 분석하는 단계를 포함한다. 추가로, 상기 방법을 사용하면 입자 유형 주변에서 형성된 생체분자 코로나에서 관심의 단백질의 효율적인 풍부화가 허용된다. 관심의 단백질은 생체분자 코로나에서 입자에 접촉되지 않은 유동화된 고체 샘플에 비해 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 풍부해질 수 있다. 관심의 단백질은 생체분자 코로나에서 입자에 접촉되지 않은 유동화된 고체 샘플에 비해 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배 풍부해질 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 하나 이상의 입자 (예컨대, 표 1에서 개시된 임의의 하나 이상의 입자 유형)는 유동화된 고체 샘플로부터 적어도 약 291, 적어도 약 294, 적어도 약 300, 적어도 약 350, 적어도 약 400, 적어도 약 450, 적어도 약 470, 적어도 약 500, 적어도 약 550, 적어도 약 600, 적어도 약 618, 적어도 약 650, 적어도 약 700, 적어도 약 709, 적어도 약 718, 적어도 약 750, 적어도 약 800, 적어도 약 838, 적어도 약 840, 적어도 약 847, 적어도 약 850, 적어도 약 900, 적어도 약 950, 적어도 약 984, 적어도 약 1000, 적어도 약 1100, 적어도 약 1200, 적어도 약 1300, 적어도 약 1400, 적어도 약 1500, 적어도 약 1600, 적어도 약 1700, 적어도 약 1800, 적어도 약 1900, 적어도 약 2000, 적어도 약 2100, 적어도 약 2200, 적어도 약 2300, 적어도 약 2400, 적어도 약 2500, 적어도 약 2750, 적어도 약 3000, 적어도 약 3250, 적어도 약 3500, 적어도 약 3750, 또는 적어도 약 4000의 풍부화를 초래할 수 있다.
단백질 코로나 분석 검정은 유동화된 고체 샘플에서 저풍부성 단백질을 신속하게 확인하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 코로나 분석은 유동화된 고체 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 2시간 이내에, 약 2.5시간 이내에, 약 3시간 이내에, 약 3.5시간 이내에, 약 4시간 이내에, 약 4.5시간 이내에, 약 5시간 이내에, 약 5.5시간 이내에, 약 6시간 이내에, 약 6.5시간 이내에, 약 7시간 이내에, 약 7.5시간 이내에, 약 8시간 이내에, 약 8.5시간 이내에, 약 9시간 이내에, 약 9.5시간 이내에, 또는 약 10시간 이내에 유동화된 고체 샘플에서 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다.
일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 생물학적 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 8시간 이내에 유동화된 고체 샘플에서 적어도 약 500개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 유동화된 고체 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 8시간 이내에 유동화된 고체 샘플에서 적어도 약 1000개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 유동화된 고체 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 4시간 이내에 유동화된 고체 샘플에서 적어도 약 500개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 유동화된 고체 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 4시간 이내에 유동화된 고체 샘플에서 적어도 약 1000개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다.
세포 배양 샘플. 본 개시는 본원에 개시된 하나 이상의 입자 (예컨대, 및 표 1에 개시된 하나 이상의 입자)를 사용하여 세포 배양 샘플 (세포 샘플, 세포 투과 샘플, 또는 세포외 샘플)에서 단백질을 검정하는 방법을 제공한다. 세포 배양 샘플은 불균질성을 포함할 수 있고, 그것은 전통적인 수단 (예컨대, ELISA, 면역형광, 겔 전기영동, 또는 크로마토그래피)을 사용하는 단백질 검출을 혼란스럽게 할 수 있다. 본원에 개시된 방법 및 조성물은 불균질한 샘플에서 단백질을 검출하는 데 아주 적합할 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 단백질 코로나 분석 검정은 추가적인 정제, 분별, 또는 고갈 단계에 대한 필요성 없이 세포 배양 샘플에 대해 수행될 수 있다.
본원에 개시된 방법은 세포 배양 샘플 (세포 샘플, 세포 투과 샘플, 또는 세포외 샘플)에서 단백질을 검정하는 다른 방법보다 월등하며 짧은 시간 내에 넓은 동적 범위를 가로질러 세포 배양 샘플 (세포 샘플, 세포 투과 샘플, 또는 세포외 샘플)에서 단백질의 샘플링을 제공한다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 세포 배양 샘플 (세포 샘플, 세포 투과 샘플, 또는 세포외 샘플)에서 단백질을 신속하게 풍부화하기 위해 하나 이상의 입자를 이용한다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 본원에 개시된 하나 이상의 입자 유형은 세포 배양 샘플 (세포 샘플, 세포 투과 샘플, 또는 세포외 샘플)에서 관심의 단백질 (고풍부성 단백질, 중간 풍부성 단백질, 또는 저풍부성 단백질)을 검정하는 방법에 사용될 수 있고, 방법은 상기 하나 이상의 입자 유형을, 입자 상에 생체분자 코로나가 형성되고 세포 배양 샘플 (세포 샘플, 세포 투과 샘플, 또는 세포외 샘플)에서 단백질의 풍부화가 가능해지도록 세포 배양 샘플 (세포 샘플, 세포 투과 샘플, 또는 세포외 샘플)에서 인큐베이션하는 단계, 입자를 세포 배양 샘플 (세포 샘플, 세포 투과 샘플, 또는 세포외 샘플) 중의 미결합 생체분자로부터 분리하는 단계 (예컨대, 자기 분리에 의함), 및 관심의 단백질에 대해 코로나 중의 생체분자를 트립신 처리하고 분석하는 단계를 포함한다. 추가로, 상기 방법을 사용하면 입자 유형 주변에서 형성된 생체분자 코로나에서 관심의 단백질의 효율적인 풍부화가 허용된다. 관심의 단백질은 생체분자 코로나에서 입자에 접촉되지 않은 세포 배양 샘플에 비해 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 100% 풍부해질 수 있다. 관심의 단백질은 생체분자 코로나에서 입자에 접촉되지 않은 세포 배양 샘플에 비해 적어도 약 1.1배, 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 2배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배, 적어도 약 3.5배, 적어도 약 4배, 적어도 약 4.5배, 적어도 약 5배, 적어도 약 5.5배, 적어도 약 6배, 적어도 약 6.5배, 적어도 약 7배, 적어도 약 7.5배, 적어도 약 8배, 적어도 약 8.5배, 적어도 약 9배, 적어도 약 9.5배, 적어도 약 10배, 적어도 약 20배, 적어도 약 30배, 적어도 약 40배, 적어도 약 50배, 적어도 약 60배, 적어도 약 70배, 적어도 약 80배, 적어도 약 90배, 또는 적어도 약 100배 풍부해질 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 임의의 하나 이상의 입자 (예컨대, 표 1에 개시된 임의의 하나 이상의 입자 유형)는 세포 배양 샘플과 인큐베이션될 때 입자 유형의 표면 상에 형성되는 코로나에서 세포 배양 샘플 (세포 샘플, 세포 투과 샘플, 또는 세포외 샘플)로부터 적어도 약 100개, 적어도 약 200개, 적어도 약 300개, 적어도 약 350개, 적어도 약 400개, 적어도 약 450개, 적어도 약 470개, 적어도 약 500개, 적어도 약 550개, 적어도 약 600개, 적어도 약 618개, 적어도 약 650개, 적어도 약 700개, 적어도 약 709개, 적어도 약 718개, 적어도 약 750개, 적어도 약 800개, 적어도 약 838개, 적어도 약 840개, 적어도 약 847개, 적어도 약 850개, 적어도 약 900개, 적어도 약 950개, 적어도 약 984개, 적어도 약 1000개, 적어도 약 1100개, 적어도 약 1200개, 적어도 약 1300개, 적어도 약 1400개, 적어도 약 1500개, 적어도 약 1600개, 적어도 약 1700개, 적어도 약 1800개, 적어도 약 1900개, 적어도 약 2000개, 적어도 약 2100개, 적어도 약 2200개, 적어도 약 2300개, 적어도 약 2400개, 적어도 약 2500개, 적어도 약 2750개, 적어도 약 3000개, 적어도 약 3250개, 적어도 약 3500개, 적어도 약 3750개, 또는 적어도 약 4000개의 단백질을 포획하는 결과를 초래할 수 있다.
단백질 코로나 분석 검정은 세포 배양 샘플에서 저풍부성 단백질을 신속하게 확인하기 위해 사용될 수 있다. 단백질 코로나 분석은 세포 배양 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 2시간 이내에, 약 2.5시간 이내에, 약 3시간 이내에, 약 3.5시간 이내에, 약 4시간 이내에, 약 4.5시간 이내에, 약 5시간 이내에, 약 5.5시간 이내에, 약 6시간 이내에, 약 6.5시간 이내에, 약 7시간 이내에, 약 7.5시간 이내에, 약 8시간 이내에, 약 8.5시간 이내에, 약 9시간 이내에, 약 9.5시간 이내에, 또는 약 10시간 이내에 세포 배양 샘플에서 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다.
일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 생물학적 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 8시간 이내에 세포 배양 샘플에서 적어도 약 500개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 세포 배양 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 8시간 이내에 세포 배양 샘플에서 적어도 약 1000개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 세포 배양 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 4시간 이내에 세포 배양 샘플에서 적어도 약 500개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질 코로나 분석은 세포 배양 샘플이 처음 입자와 접촉한 후 약 4시간 이내에 세포 배양 샘플에서 적어도 약 1000개의 저풍부성 단백질을 확인할 수 있다.
본 개시의 생물학적 샘플은 많은 상이한 기법으로 수집될 수 있다. 조직 샘플은 생검, 해부, 미세 바늘 흡인, 또는 수술적 절제를 통해 수집될 수 있다. 조직 샘플은 예를 들어 균질화 또는 원심분리에 의해 유동화될 수 있다. 유체 샘플 (예컨대, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 또는 정액)은 샘플 수집 튜브에 수집될 수 있다. 상업적으로 이용 가능한 수집 튜브가 유체 샘플의 수집에 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 샘플을 수집하기 위해 사용될 수 있는 상업적으로 이용 가능한 수집 튜브로는 EDTA 수집 튜브, 핵산 안정화제를 포함하는 수집 튜브 (예컨대, Streck 튜브), 혈청-분리 튜브 (SST), 시트르산 나트륨 수집 튜브, 시트레이트, 테오필린, 아데노신 및 디피리다몰 (CTAD) 수집 튜브, 리튬/나트륨 헤파린 수집 튜브, 불화 나트륨 수집 튜브, 산 시트레이트 덱스트로스 (ACD) 수집 튜브, 또는 나트륨 폴리아네톨 설포네이트 (SPS) 수집 튜브를 들 수 있다.
일부 구체예에서, 생체 유체는 안정화 시약 (예컨대, 보존제, 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, 또는 가교제)을 포함하는 샘플 수집 튜브에 수집될 수 있다. 안정화 시약은 냉동되지 않은 채로 보관될 생체 유체를 안정화시킬 수 있다. 생체 유체는 주변 온도에서, 실온에서, 또는 0℃ 내지 37℃의 임의의 온도에서 보관될 수 있다. 예를 들어, 안정화 시약을 포함하는 샘플 수집 튜브에 수집된 생체 유체는 최대 1, 최대 2, 최대 3, 최대 4, 최대 5, 최대 6, 최대 7, 최대 8, 최대 9, 최대 10, 최대 11, 최대 12, 최대 13, 또는 최대 14일 동안 냉동되지 않고 보관될 수 있다 (예컨대, 0℃ 내지 37℃의 온도에서). 실온에서 보관 후, 생체 유체는 분석되거나 (예컨대, 코로나 분석을 통해) 또는 나중에 사용하기 위해 냉동될 수 있다. 예를 들어, 생체 유체 샘플은 핵산 안정화제를 포함하는 수집 튜브 (예컨대, Streck 튜브)에 수집되고 실온에서 밤새도록 보관될 수 있거나, 또는 생체 유체 샘플은 핵산 안정화제를 포함하는 혈액 수집 튜브에 보관되고 얼음 또는 드라이 아이스 없이 운송될 수 있다. 냉동되지 않은 생체 유체는 샘플이 수집된 별도의 시설에서 처리될 수 있다.
수집 튜브에 수집되고 냉동되지 않고 보관된 생체 유체는 단백질 코로나 분석에 의한 분석에 적합할 수 있다. 0℃ 내지 37℃의 온도에서 보관한 후, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 600개, 적어도 700개, 적어도 800개, 적어도 900개, 적어도 1000개, 적어도 1100개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 적어도 1400개, 또는 적어도 1500개의 단백질이 코로나 분석을 사용하여 생체 유체에서 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, 0℃ 내지 37℃의 온도에서 보관한 후, 적어도 1000개, 적어도 1100개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 적어도 1400개, 적어도 1500개, 적어도 1600개, 적어도 1700개, 적어도 1800개, 적어도 1900개, 적어도 2000개, 적어도 2500개, 적어도 3000개, 적어도 3500개, 적어도 4000개, 적어도 4500개, 또는 적어도 5000개의 펩타이드가 코로나 분석을 사용하여 생체 유체에서 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, 0℃ 내지 37℃의 온도에서 보관한 후, 적어도 5000개, 적어도 6000개, 적어도 7000개, 적어도 7100개, 적어도 7200개, 적어도 7300개, 적어도 7400개, 적어도 7500개, 적어도 7600개, 적어도 7700개, 적어도 7800개, 적어도 7900개, 적어도 8000개, 적어도 8500개, 또는 적어도 9000개의 단백질 특징이 코로나 분석을 사용하여 생체 유체에서 검출될 수 있다. 냉동된 생체 유체는 얼음 상에서, 드라이 아이스 상에서, 또는 액체 질소와 함께 운송될 수 있다. 냉동된 생체 유체는 샘플이 수집되는 별도의 시설에서 해동되고 처리될 수 있다. 예를 들어, 생체 유체는 의료 시설에서 핵산 안정화제를 포함하는 튜브 (예컨대, Streck 튜브)에서 수집되고 코로나 분석을 위해 주변 조건 하에서 연구 시설로 운송될 수 있다.
일부 구체예에서, 생체 유체는 샘플 수집 튜브에 수집되고 냉동될 수 있다. 생체 유체는 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 40분, 약 50분, 약 60분, 약 1시간, 약 2시간, 약 3시간, 약 4시간, 약 5시간, 또는 약 6시간 내에 냉동될 수 있다. 샘플 수집 튜브에 수집되고 냉동될 수 있는 생체 유체는 단백질 코로나 분석에 의한 분석에 적합할 수 있다. 냉동 보관 (예컨대, 0℃보다 아래의 온도에서 보관) 후, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개, 적어도 500개, 적어도 600개, 적어도 700개, 적어도 800개, 적어도 900개, 적어도 1000개, 적어도 1100개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 적어도 1400개, 또는 적어도 1500개의 단백질이 코로나 분석을 사용하여 생체 유체에서 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, 0℃보다 아래의 온도에서 보관한 후, 적어도 1000개, 적어도 1100개, 적어도 1200개, 적어도 1300개, 적어도 1400개, 적어도 1500개, 적어도 1600개, 적어도 1700개, 적어도 1800개, 적어도 1900개, 적어도 2000개, 적어도 2500개, 적어도 3000개, 적어도 3500개, 적어도 4000개, 적어도 4500개, 또는 적어도 5000개의 펩타이드가 코로나 분석을 사용하여 생체 유체에서 검출될 수 있다. 일부 구체예에서, 0℃보다 아래의 온도에서 보관한 후, 적어도 5000개, 적어도 6000개, 적어도 7000개, 적어도 7100개, 적어도 7200개, 적어도 7300개, 적어도 7400개, 적어도 7500개, 적어도 7600개, 적어도 7700개, 적어도 7800개, 적어도 7900개, 적어도 8000개, 적어도 8500개, 또는 적어도 9000개의 단백질 특징이 코로나 분석을 사용하여 생체 유체에서 검출될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법은 Streck 혈액 수집 튜브에서 생체 유체의 수집, 입자와의 인큐베이션으로 코로나 형성, 및 후기 시점 (예컨대, 실온에서 Streck 혈액 수집 튜브에서 상기 샘플의 인큐베이션 후 최대 14일 후)에 코로나의 단백질의 후속 분석을 제공한다.
생물학적 샘플 중의 단백질 코로나 분석
본원에 개시된 입자 및 그것의 사용 방법은 생물학적 샘플 (예컨대, 생체 유체)의 대다수의 독특한 단백질에 결합할 수 있다. 본원에 기술된 단백질 코로나 분석 방법을 사용하여 분석될 수 있는 생물학적 샘플의 비제한적인 예로는 생체 유체 샘플 (예컨대, 뇌척수액 (CSF), 활액 (SF), 소변, 혈장, 혈청, 눈물, 정액, 전혈, 우유, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액, 폐 세척액, 전립선액, 가래, 대변, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 기관지 흡인액, 땀 또는 타액), 유동화된 고체 (예컨대, 조직 균질액), 또는 세포 배양으로부터 유래된 샘플을 들 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 입자는 본원에 개시된 임의의 생물학적 샘플과 함께 인큐베이션되어 적어도 100개의 독특한 단백질, 적어도 120개의 독특한 단백질, 적어도 140개의 독특한 단백질, 적어도 160개의 독특한 단백질, 적어도 180개의 독특한 단백질, 적어도 200개의 독특한 단백질, 적어도 220개의 독특한 단백질, 적어도 240개의 독특한 단백질, 적어도 260개의 독특한 단백질, 적어도 280개의 독특한 단백질, 적어도 300개의 독특한 단백질, 적어도 320개의 독특한 단백질, 적어도 340개의 독특한 단백질, 적어도 360개의 독특한 단백질, 적어도 380개의 독특한 단백질, 적어도 400개의 독특한 단백질, 적어도 420개의 독특한 단백질, 적어도 440개의 독특한 단백질, 적어도 460개의 독특한 단백질, 적어도 480개의 독특한 단백질, 적어도 500개의 독특한 단백질, 적어도 520개의 독특한 단백질, 적어도 540개의 독특한 단백질, 적어도 560개의 독특한 단백질, 적어도 580개의 독특한 단백질, 적어도 600개의 독특한 단백질, 적어도 620개의 독특한 단백질, 적어도 640개의 독특한 단백질, 적어도 660개의 독특한 단백질, 적어도 680개의 독특한 단백질, 적어도 700개의 독특한 단백질, 적어도 720개의 독특한 단백질, 적어도 740개의 독특한 단백질, 적어도 760개의 독특한 단백질, 적어도 780개의 독특한 단백질, 적어도 800개의 독특한 단백질, 적어도 820개의 독특한 단백질, 적어도 840개의 독특한 단백질, 적어도 860개의 독특한 단백질, 적어도 880개의 독특한 단백질, 적어도 900개의 독특한 단백질, 적어도 920개의 독특한 단백질, 적어도 940개의 독특한 단백질, 적어도 960개의 독특한 단백질, 적어도 980개의 독특한 단백질, 적어도 1000개의 독특한 단백질, 100 내지 1000개의 독특한 단백질, 150 내지 950개의 독특한 단백질, 200 내지 900개의 독특한 단백질, 250 내지 850개의 독특한 단백질, 300 내지 800개의 독특한 단백질, 350 내지 750개의 독특한 단백질, 400 내지 700개의 독특한 단백질, 450 내지 650개의 독특한 단백질, 500 내지 600개의 독특한 단백질, 200 내지 250개의 독특한 단백질, 250 내지 300개의 독특한 단백질, 300 내지 350개의 독특한 단백질, 350 내지 400개의 독특한 단백질, 400 내지 450개의 독특한 단백질, 450 내지 500개의 독특한 단백질, 500 내지 550개의 독특한 단백질, 550 내지 600개의 독특한 단백질, 600 내지 650개의 독특한 단백질, 650 내지 700개의 독특한 단백질, 700 내지 750개의 독특한 단백질, 750 내지 800개의 독특한 단백질, 800 내지 850개의 독특한 단백질, 850 내지 900개의 독특한 단백질, 900 내지 950개의 독특한 단백질, 950 내지 1000개의 독특한 단백질을 포함하는 단백질 코로나를 형성할 수 있다. 일부 구체예에서, 특정 생물학적 샘플에서 다수의 단백질을 확인하기 위하여 여러 상이한 유형의 입자가 별도로 또는 조합되어 사용될 수 있다. 다르게 말하면, 입자는 생물학적 샘플에서 다수의 단백질에 결합 및 확인하기 위하여 복합적이 될 수 있다. 생체분자 코로나의 단백질 코로나 분석은 총 단백질 분석 방법과 비교하여 분석의 동적 범위를 압축할 수 있다.
본원에 개시된 조성물 및 방법은 특정 생물학적 샘플에서 다양한 생물학적 상태를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 생물학적 상태는 특정 단백질 또는 단백질 세트의 상승된 또는 낮은 수준을 나타낼 수 있다. 다른 예에서, 생물학적 상태는 질환, 예컨대 암의 확인을 나타낼 수 있다. 하나 이상의 입자 유형은 CSF와 인큐베이션되어, 단백질 코로나의 형성을 허용할 수 있다. 그런 후 상기 단백질 코로나는 단백질 패턴을 확인하기 위하여 겔 전기영동 또는 질량 분광분석에 의해 분석될 수 있다. 단백질 코로나의 (예컨대, 질량 분광분석 또는 겔 전기영동에 의한) 분석은 코로나 분석으로서 언급될 수 있다. 단백질 패턴은 대조군 샘플에 대해 수행된 동일한 방법에 비교될 수 있다. 단백질 패턴을 비교할 때, 제1 CSF 샘플이 특정 유형의 뇌암에 상응하는 상승된 수준의 마커를 포함하는 것이 확인될 수 있다. 그러므로 입자 및 그것의 사용 방법은 특정 질환 상태를 진단하기 위해 사용될 수 있다.
연속적인 질문에 의한 코로나 분석
본원에는 고풍부성 단백질에 비해 저풍부성 단백질의 검출을 용이하게 하기 위한 단백질체 분석 검정의 동적 범위를 압축하기 위한 여러 방법이 제공된다. 본원에서 사용되는 바, 구절 "동적 범위"는 샘플 중의 분자의 최고 농도 대 샘플 중의 분자의 최저 농도의 비율이다. 동적 범위는 샘플 중의 분자의 최고 농도 대 샘플 중의 분자의 최저 농도의 비율을 평가하는 것과 일치하는 많은 방법에 의해 정량화될 수 있다. 예를 들어, 동적 범위는 샘플 중의 단백질의 상위 십분위 대 샘플 중의 단백질의 하위 십분위의 비율로서 정량화될 수 있다. 동적 범위는 샘플에서 검출 가능한 최고 농도 대 샘플에서 검출 가능한 최저 농도의 농도 비율에 의해 정량화될 수 있다. 동적 범위는 샘플 중의 단백질의 사분위수 범위의 범위 (75번째 백분위수와 25번째 백분위수의 비율)로서 정량화될 수 있다. 동적 범위는 샘플에서 검출된 (예컨대, 입자로의 연속적인 질문과 같은 본원에 개시된 방법을 사용함) 단백질의 모든 농도의 상기 단백질의 공개된 농도 (예컨대, 혈장 단백질의 Carr 데이터베이스를 사용함)에 대한 플롯에서 피팅된 데이터의 기울기를 측정함으로써 정량화될 수 있다. 동적 범위는 샘플에서 검출된 (예컨대, 입자로의 연속적인 질문과 같은 본원에 개시된 방법을 사용함) 단백질 농도의 상기 단백질의 공개된 농도 (예컨대, 혈장 단백질의 Carr 데이터베이스를 사용함)에 대한 플롯에서 임의의 두 지점 사이의 기울기를 측정함으로써 정량화될 수 있다. 그러므로, 동적 범위는 분자가 샘플에서 검출될 수 있는 농도 범위, 또는 크기의 차수를 포작한다. 예를 들어, "동적 범위"는 샘플 중의 단백질의 최고 검출 가능한 농도 대 샘플 중의 또 다른 단백질의 최저 검출 가능한 농도의 비율을 나타낼 수 있다. 그러므로, 이 예에서, 동적 범위는 단백질이 샘플에서 검출 가능한 농도 범위, 또는 크기의 차수를 포작한다. 본원에서 사용되는 바, 구절 "동적 범위를 압축하는" 또는 "동적 범위의 압축"은 샘플 중의 분자의 최고 농도 대 샘플 중의 분자의 최저 농도의 비율의 감소를 나타낸다. 그러므로, 동적 범위는 분자가 샘플에서 검출 가능한 농도 범위, 또는 크기 차수가 감소될 때 압축된다. 예를 들어, 본 개시의 입자 유형은 샘플을 연속적으로 질문하기 위해 사용될 수 있다. 샘플에서 입자 유형이 인큐베이션될 때, 입자 유형의 표면 상에 생체분자 코로나가 형성된다. 만약 단백질이 상기 입자 유형을 사용하지 않고, 예를 들어 샘플의 직접 질량 분광분석에 의해 직접 샘플에서 검출된다면, 동적 범위는 단백질이 입자 유형의 표면 상에 지시되는 경우보다 더 넓은 범위의 농도, 또는 더 큰 차수의 크기에 걸쳐 있을 수 있다. 그러므로, 본원에 개시된 입자 유형을 사용하면 샘플 중의 단백질의 동적 범위를 압축한다. 이론에 의해 제한되지는 않지만, 이 효과는 입자 유형의 생체분자 코로나에서 더 높은 친화도, 더 낮은 풍부성 단백질의 더 많은 포획 및 입자 유형의 생체분자 코로나에서 더 낮은 친화도, 더 높은 풍부성 단백질의 더 적은 포획으로 인해 관찰될 수 있다. 단백질체 분석 검정의 동적 범위는 샘플 중의 단백질의 총 풍부성의 함수로서 단백질체 분석 검정에 의해 측정된 단백질 신호의 플롯의 기울기일 수 있다. 동적 범위를 압축하는 것은 샘플 중의 단백질의 총 풍부성의 함수로서 단백질체 분석 검정에 의해 측정된 단백질 신호의 플롯의 기울기를 샘플 중의 단백질의 총 풍부성의 함수로서 제2 단백질체 분석 검정에 의해 측정된 단백질 신호의 플롯의 기울기에 비해 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 단백질 코로나 분석 검정은 총 단백질 분석 방법 (예컨대, 질량 분광분석, 겔 전기영동, 또는 액체 크로마토그래피)의 동적 범위에 비해 동적 범위를 압축시킬 수 있다.
일부 구체예에서, 단백질체 분석 검정의 동적 범위는 최고 풍부성 단백질 (예컨대, 풍부한 단백질의 최고 10%)에 의해 생성된 신호 대 최저 풍부성 단백질 (예컨대, 풍부한 단백질의 최저 10%)에 의해 생성된 신호의 비율일 수 있다. 단백질체 분석의 동적 범위를 압축하는 것은 제1 단백질체 분석 검정에 대해 최고 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호 대 최저 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호의 비율을 제2 단백질체 분석 검정의 그것에 비해 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 단백질 코로나 분석 검정은 총 단백질 분석 방법 (예컨대, 질량 분광분석, 겔 전기영동, 또는 액체 크로마토그래피)의 동적 범위에 비해 동적 범위를 압축시킬 수 있다.
단백질체 분석의 동적 범위를 압축시키는 것은 연속적인 질문에 의해 달성될 수 있다. 단백질체 분석의 동적 범위를 압축시키는 방법은 샘플 (예컨대, 생물학적 샘플)을 입자로 연속적으로 질문하는 단계 및 입자에 의해 포획된 단백질체학 데이터의 단백질 코로나 분석을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질체 분석의 동적 범위를 압축시키는 방법은 고풍부성 단백질을 샘플로부터 고갈시키거나 저풍부성 단백질을 샘플에서 풍부화하는 단계, 샘플을 단일 입자 유형으로 여러 번 또는 다양한 입자 유형으로 연속적으로 질문하는 단계, 및 입자의 단백질 코로나 분석을 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 단백질체 분석의 동적 범위를 압축시키는 방법은 샘플을 분별하는 단계 및 본원에서 개시된 것과 같이, 샘플을 다양한 입자 유형으로 연속적으로 질문하는 방법을 사용하여 저풍부성 단백질에 대해 풍부화되거나 고풍부성 단백질이 고갈된 분획을 질문하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플의 연속적인 질문은 샘플 분별 또는 샘플 고갈 전에, 후에, 또는 대신 수행될 수 있다.
본원에 개시된 연속적인 질문 방법은 단백질 코로나 분석에 의한 저풍부성 단백질의 검출을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 연속적인 질문 방법은 저풍부성 단백질에 대한 검정 능력에 영향을 주는 고풍부성 단백질의 샘플을 고갈시키는 것을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 연속적인 질문 방법은 단백질 코로나 분석에 의한 저풍부성 단백질의 검출을 증가시킬 수 있는데, 이것은 혼란스럽게 하는 고풍부성 단백질이 존재하는 샘플에서 상기 저풍부성 단백질을 직접 샘플링하는 대신 단백질 코로나에 포획된 단백질의 압축된 동적 범위가 입자 표면 상에서 저풍부성 단백질의 국지적인 농축을 허용하기 때문이다. 또 다른 예에서, 연속적인 질문 방법은 입자 상에 형성된 생체분자 코로나에서 저풍부성 단백질을 풍부화하는 것을 포함할 수 있다. 샘플을 다양한 샘플 유형으로 연속적으로 질문하기 위한 본원에 개시된 방법은 고갈 또는 분별이 선행될 수 있다. 이들 고갈 방법은 고갈 키트를 사용한 고갈을 포함할 수 있다. 이들 고갈 방법은 또한 본원에 개시된 신규한 입자 (예컨대, 표 1의 임의의 하나의 입자)로의 고갈을 포함할 수 있다.
샘플을 다양한 입자 유형으로 연속적으로 질문한 후 코로나 분석은 코로나 분석 전에 고갈된 생물학적 샘플에 대해 수행될 수 있다. 샘플을 다양한 입자 유형으로 연속적으로 질문한 후 코로나 분석은 분별된 생물학적 샘플의 개별적인 분획에 대해 수행될 수 있다. 샘플을 다양한 입자 유형으로 연속적으로 질문한 후 코로나 분석은 연속적으로 질문된 샘플로부터 분리된 하나 이상의 입자 유형에 대해 수행될 수 있다. 분별은 샘플을 고갈시키기 위해 사용될 수 있고, 다양한 입자 유형으로의 샘플의 연속적인 질문 및 코로나 분석은 분별된 샘플에 대해 수행될 수 있다. 코로나 분석 전의 생물학적 샘플의 분별 또는 고갈은 코로나 분석의 민감성, 정확성, 또는 특이성을 증가시킬 수 있다. 일부 구체예에서, 코로나 분석 전의 생물학적 샘플의 연속적인 질문, 분별, 또는 고갈은 총 단백질 함량에 대해 직접 검정되는 (예컨대, 겔 분석 또는 질량 분광분석에 의해) 샘플에서 검출될 수 없는 하나 이상의 생물학적 분자의 검출을 가능하게 할 수 있다. 다양한 입자 유형으로의 샘플의 연속적인 질문 및 분별된 샘플의 개별 분획의 코로나 분석은 생물학적 분자의 원하는 하위세트의 검출을 가능하게 할 수 있다. 고갈될 수 있는 샘플은 그런 후 다양한 입자 유형으로 연속적으로 질문되고, 그런 후에 단백질 코로나 분석에 의해 분석된다. 또 다른 예에서, 샘플은 분별될 수 있고, 하나 이상의 분획이 다양한 입자 유형으로 연속적으로 질문될 수 있으며, 그런 후에 단백질 코로나 분석에 의해 분석된다.
연속적인 질문. 샘플 (예컨대, 생물학적 샘플)은 하나 이상의 본 개시의 입자 유형으로 연속적으로 질문될 수 있다. 입자 유형은 샘플로부터 분리될 수 있고, 단백질 코로나 분석이 수행될 수 있다. 연속적인 질문은 샘플을 입자 유형과 접촉시켜서 입자 상에 단백질 코로나를 형성하는 단계, 입자 유형을 분리하는 단계, 및 접촉 및 분리를 동일한 샘플에 대해 동일한 입자 유형, 상이한 입자 유형, 또는 그것들의 조합으로 1회 이상 반복하는 단계를 포함할 수 있다. 단백질 코로나 분석은 하나 이상의 분리된 입자 유형에 대해 수행될 수 있다. 샘플의 연속적인 질문은 작은 샘플 크기에 아주 적합할 수 있다. 예를 들어, 입자 유형 패널 (예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개, 또는 그 이상의 입자 유형의 패널)을 사용하는 단백질 코로나 분석은 약 1000 μL 이하, 약 900 μL 이하, 약 800 μL 이하, 약 700 μL 이하, 약 600 μL 이하, 약 500 μL 이하, 약 400 μL 이하, 약 300 μL 이하, 약 200 μL 이하, 약 100 μL 이하, 약 50 μL 이하, 또는 약 20 μL 이하, 약 10 μL 이하, 약 5 μL 이하, 약 2 μL 이하, 또는 약 1 μL 정도로 낮은 샘플 부피를 사용하여 수행될 수 있다. 이것은 샘플을 하나 이상의 입자 유형과 접촉시키기 전에 분할하는 것을 포함하는 다른 단백질 코로나 분석 방법보다 나은 장점을 제공할 수 있다. 샘플의 연속적인 질문은 단일 입자 유형으로 샘플을 질문하는 것과 비교하여 단백질 코로나 분석에 의해 확인될 수 있는 단백질의 수를 증가시킬 수 있다.
샘플의 생체분자 조성은 연속적인 질문 중에 실질적으로 변화하지 않을 수 있다. 예를 들어, 샘플을 제1 입자 유형과 접촉시키기 전의 샘플의 생체분자 조성은 샘플로부터 제1 입자 유형의 분리 후의 샘플의 생체분자 조성과 실질적으로 동일할 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플을 제1 입자 유형과 접촉시키기 전의 샘플의 생체분자 조성은 제2 입자 유형, 제3 입자 유형, 제4 입자 유형, 제5 입자 유형, 또는 그 이상의 입자 유형의 샘플로부터의 분리 후의 샘플의 생체분자 조성과 실질적으로 동일할 수 있다. 샘플의 생체분자 조성은 만약 총 생체분자 질량이 약 1 질량% 이하, 약 2 질량% 이하, 약 3 질량% 이하, 약 4 질량% 이하, 약 5 질량% 이하, 약 6 질량% 이하, 약 7 질량% 이하, 약 8 질량% 이하, 약 9 질량% 이하, 약 10 질량% 이하, 약 11 질량% 이하, 약 12 질량% 이하, 약 13 질량% 이하, 약 14 질량% 이하, 또는 약 15 질량% 이하로 변화한다면 실질적으로 동일할 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플의 총 생체분자 질량은 약 1 질량% 미만으로 변화할 수 있다. 샘플의 생체분자 조성은 만약 생체분자의 하위세트의 질량이 약 1 질량% 이하, 약 2 질량% 이하, 약 3 질량% 이하, 약 4 질량% 이하, 약 5 질량% 이하, 약 6 질량% 이하, 약 7 질량% 이하, 약 8 질량% 이하, 약 9 질량% 이하, 약 10 질량% 이하, 약 11 질량% 이하, 약 12 질량% 이하, 약 13 질량% 이하, 약 14 질량% 이하, 또는 약 15 질량% 이하로 변화한다면 실질적으로 동일할 수 있다. 일부 구체예에서, 생체분자의 하위세트는 중간 풍부성 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 생체분자의 하위세트는 저풍부성 단백질을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 연속적인 질문은 샘플을 제1 입자 유형과 접촉시키는 단계, 생물학적 분자가 제1 입자 유형에 결합하도록 허용하는 단계, 및 생체 유체로부터 제1 입자 유형을 결합된 생물학적 분자와 함께 분리하는 단계에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 입자는 생체 유체로부터 원심분리 또는 자기 분리를 사용하여 분리될 수 있다. 생체 유체는 유체를 제2 입자 유형과 접촉시키고, 생물학적 분자가 제2 입자 유형에 결합하도록 허용하며, 그리고 생체 유체로부터 결합된 생물학적 분자와 함께 제2 입자 유형을 분리함으로써 추가로 질문될 수 있다. 일부 구체예에서, 연속적인 질문은 생물학적 샘플을 동일한 또는 상이한 입자 유형과 순차적으로 접촉시키는 단계, 생물학적 분자가 입자 유형에 결합하도록 허용하는 단계, 및 각각의 입자 유형 및 결합된 생물작적 분자를 다음 입자 유형을 첨가하기 전에 분리하는 단계에 의해 수행될 수 있다. 각각의 분리된 입자 유형 및 결합된 생물학적 분자는 분획을 구성할 수 있다. 일부 구체예에서, 연속적인 질문은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 입자 유형으로 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 입자 유형으로의 연속적인 질문은 샘플 입자 유형을 사용하여 반복될 수 있다. 일부 구체예에서, 코로나 분석은 연속적으로 질문된 생물학적 샘플의 분획에 대해 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 코로나 분석은 연속적인 질문 후에 생물학적 샘플의 남아 있는 상층액에 대해 수행될 수 있다.
고갈. 본원에는 고도로 풍부한 단백질의 샘플을 고갈시키는 방법 및 그렇게 하기 위한 조성물이 제공된다. 고풍부성 단백질의 샘플을 고갈시키는 이들 방법은 샘플을 다양한 입자 유형으로 연속적으로 질문하는 본원에 기술된 방법 전에 수행될 수 있고, 그런 후 본원에 개시된 단백질 코로나 분석 방법을 사용하여 분석된다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 나노입자가 고도로 풍부한 단백질의 생물학적 샘플을 고갈시키기 위해 사용될 수 있다. 입자를 사용한 샘플의 고갈은 샘플의 라운드 바이 라운드 고갈을 포함할 수 있고, 각각의 라운드 내에서, 상이한 유형의 입자 (예컨대, 독특한 물질 조성을 가진 입자)가 고갈에 사용될 수 있다. 다른 경우에, 혈장 고갈 키트, 칼럼, 크로마토그래피, 또는 다른 시스템이 고도로 풍부한 단백질의 생물학적 샘플을 고갈시키기 위해 사용될 수 있다. 고갈과 이어지는 다양한 입자 유형으로의 샘플의 연속적인 질문 및 단백질 코로나 분석은 미고갈 샘플에서 동일한 방법을 수행하는 것과 비교하여 확인될 수 있는 단백질의 수를 증가시킬 수 있다. 그러나, 고갈은 필요하지 않을 수 있고 다양한 입자 유형으로의 샘플의 연속적인 질문 및 단백질 코로나 분석이 샘플이 먼저 고갈된 경우보다 더 짧은 검정 시간에 다양한 단백질을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
샘플 고갈은 생체 유체 샘플 중의 적어도 하나의 생물학적 분자 (예컨대, 단백질)의 수준을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 샘플 고갈은 샘플 중의 고도로 풍부한 단백질의 수준을 감소시키는 것을 포함할 수 있다. 고도로 풍부한 단백질은 알부민, IgG, 또는 리보솜 단백질일 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플 고갈은 생체 유체를 제1 입자 유형과 접촉시키는 단계, 생물학적 분자가 제1 입자 유형에 결합하도록 허용하는 단계, 및 생체 유체로부터 제1 입자 유형을 결합된 생물학적 분자와 함께 분리하는 단계에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 입자는 생체 유체로부터 원심분리 또는 자기 분리를 사용하여 분리될 수 있다. 생체 유체는 유체를 제2 입자 유형과 접촉시키고, 생물학적 분자가 제2 입자 유형에 결합하도록 허용하며, 그리고 생체 유체로부터 결합된 생물학적 분자와 함께 제2 입자 유형을 분리함으로써 추가로 고갈될 수 있다. 고갈은 라운드 바이 라운드 방식으로, 생체 유체를 상이한 입자 유형과 접촉시키고 생체 유체가 다음 입자 유형과 접촉하기 전에 각각의 입자 유형을 분리함으로써 생체 유체에 대해 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 고갈은 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 또는 적어도 20개의 입자 유형으로 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플 고갈은 크로마토그래피 또는 전기영동을 사용하여 수행될 수 있다.
일부 구체예에서, 샘플 고갈은 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 샘플을 고갈시키는 것을 포함할 수 있다. 샘플을 고갈시키기 위해 사용될 수 있는 키트는 스핀 칼럼-기반 고갈 키트, 알부민 고갈 키트, 면역고갈 키트, 또는 풍부한 단백질 고갈 키트일 수 있다. 샘플 고갈에 사용될 수 있는 키트의 비제한적인 예로는 PureProteomeTM 인간 알부민/면역글로불린 고갈 키트 (EMD Millipore Sigma), ProteoPrep® 면역친화성 알부민 & IgG 고갈 키트 (Millipore Sigma), Seppro® 단백질 고갈 키트 (Millipore Sigma), Top 12 풍부한 단백질 고갈 스핀 칼럼 (Pierce), 또는 Proteome PurifyTM 면역고갈 키트 (R&D Systems)를 들 수 있다. 이들 키트는 예로 열거된 것이고, 기술분야의 숙련된 사람은 샘플 고갈에 사용될 수 있는 수많은 다른 키트를 구상할 수 있을 것이다.
본 개시의 키트는 샘플을 연속적으로 질문하기 위해 입자 유형을 포함할 수 있다. 키트는 구별되는 분취액으로 사전 포장될 수 있다. 다른 예에서, 키트는 샘플을 연속적으로 질문하기 위해 사용될 수 있는 복수의 상이한 입자 유형을 포함할 수 있다. 복수의 입자 유형은 사전 포장될 수 있고 복수의 각각의 입자 유형이 별도로 포장된다. 대안으로, 복수의 입자 유형은 단일 포장에 입자 유형의 조합을 함유하도록 함께 포장될 수 있다.
샘플을 고갈시키는 것은 샘플로부터 구성요소를 침전시키는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플을 고갈시키는 것은 원치 않는 구성요소 (예컨대 고풍부성 단백질)를 침전시키는 것을 포함할 수 있다. 원치 않는 구성요소는 침전될 수 있고, 상층액이 추가로 (예컨대, 단백질 코로나 분석, 연속적인 질문, 분별, 또는 고갈에 의해) 처리될 수 있다. 일부 구체예에서, 침전된 원치 않는 구성요소는 여과, 원심분리, 초원심분리, 또는 중력 분리에 의해 상층액으로부터 제거될 수 있다. 원치 않는 구성요소를 침전시키는 방법은 극저온 침전 또는 화학적 침전 (예컨대, 콘 방법 또는 에탄올 침전)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플을 고갈시키는 것은 원하는 구성요소 (예컨대, 저풍부성 단백질)를 침전시키는 것을 포함할 수 있다. 원하는 구성요소는 침전될 수 있고, 상층액은 버려질 수 있으며, 침전은 추가 처리 (예컨대, 다양한 입자 유형으로의 연속적인 질문, 그런 후 단백질 코로나 분석, 분별, 또는 고갈에 의해 검정됨)를 위해 재현탁될 수 있다. 일부 구체예에서, 침전된 원하는 구성요소는 상층액으로부터 여과, 원심분리, 초원심분리, 또는 중력 분리에 의해 분리될 수 있다. 원하는 구성요소를 침전시키는 방법은 극저온 침전 또는 화학적 침전 (예컨대, 콘 방법 또는 에탄올 침전)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 미처리 샘플은 원치 않는 침전을 포함할 수 있다. 원치 않는 침전은 상층액으로부터 여과, 원심분리, 초원심분리, 또는 중력 분리에 의해 제거될 수 있다.
샘플을 고갈시키는 것은 원하는 구성요소로부터 원치 않는 구성요소를 분리하는 것 (예컨대, 저풍부성 단백질로부터 고풍부성 단백질을 분리하는 것)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 구성요소는 생화학적 특성 (예컨대, 결합 친화도, 전하, 또는 크기)을 토대로 분리될 수 있다. 일부 구체예에서, 고갈은 크로마토그래피 또는 겔 전기영동을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플은 생화학적 특성을 토대로 둘 이상의 분획으로 분리될 수 있다. 제1 분획은 원하는 구성요소를 포함할 수 있고, 제2 분획은 원치 않는 구성요소를 포함할 수 있다. 원하는 구성요소를 포함하는 분획은 추가로 (예컨대, 다양한 입자 유형으로의 연속적인 질문 및 코로나 분석, 추가의 분별, 또는 고갈에 의해) 처리될 수 있다. 원치 않는 구성요소를 포함하는 분획은 버려질 수 있다. 고갈 방법의 비제한적인 예로는 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 또는 역상 크로마토그래피를 들 수 있다. 이들 방법이 예로 열거되지만, 기술분야의 숙련된 사람은 샘플 고갈에 사용될 수 있는 수많은 다른 방법을 구상할 수 있을 것이다.
본원에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여, 고갈은 적어도 50%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 100%, 5% 내지 20%, 5% 내지 100%, 10% 내지 95%, 15% 내지 90%, 20% 내지 85%, 25% 내지 80%, 30% 내지 75%, 35% 내지 70%, 40% 내지 65%, 45% 내지 60%, 50% 내지 55%, 60% 내지 70%, 60% 내지 80%, 또는 50% 내지 90%의 고풍부성 단백질을 생물학적 샘플로부터 제거하는 결과를 초래할 수 있다. 일부 구체예에서, 샘플을 고갈시키기 위해 본원에 개시된 고갈 방법 및 조성물은 전부, 또는 100%의 고도로 풍부한 단백질을 제거할 수 있다. 코로나 분석은 고갈된 생물학적 샘플에 대해 수행될 수 있다.
분별. 본원에는 샘플 (예컨대, 생물학적 샘플)의 구성요소를 분획으로 분리하는 방법이 제공된다. 제1 분획은 제2 분획과 생체분자 조성이 다를 수 있다. 예를 들어, 분별되지 않은 샘플에 비해, 제1 분획은 고풍부성 단백질이 풍부하고, 제2 분획은 저풍부성 단백질이 풍부할 수 있다. 분획은 본원에 개시된 방법 및 조성물을 사용하여 추가로 질문될 수 있다 (예컨대, 샘플이 연속적으로 질문된 후에 연속적인 질문에 사용된 각각의 입자 유형의 단백질 코로나 분석이 이어짐). 일부 구체예에서, 분별은 고풍부성 단백질을 저풍부성 단백질로부터 분리하고, 그로써 저풍부성 단백질의 검출을 증가시킴으로써 단백질 코로나 분석을 용이하게 할 수 있다. 일부 구체예에서, 분별은 샘플을 특정 입자 유형에 아주 적합한 분획으로 분리함으로써 단백질 코로나 분석을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 제1 분획은 제1 입자 유형으로 질문될 수 있고, 제2 분획은 제2 입자 유형으로 질문될 수 있다. 분별과 이어지는 단백질 코로나 분석은 분별되지 않은 샘플의 단백질 코로나 분석과 비교하여 확인될 수 있는 단백질의 수를 증가시킬 수 있다.
샘플 분별은 생물학적 샘플의 구성요소를 분리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 구성요소는 생화학적 특성 (예컨대, 결합 친화도, 전하, 또는 크기)을 토대로 분리될 수 있다. 일부 구체예에서, 분별은 크로마토그래피 또는 겔 전기영동을 사용하여 수행될 수 있다. 하나 이상의 분획은 추가로 처리될 수 있다 (예컨대, 샘플을 연속적으로 질문한 후에 연속적인 질문에 사용된 각각의 입자 유형의 단백질 코로나 분석, 추가의 분별, 또는 고갈에 의함). 분별 방법의 비제한적인 예로는 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 또는 역상 크로마토그래피를 들 수 있다. 이들 방법이 예로 열거되지만, 기술분야의 숙련된 사람은 샘플 분별에 사용될 수 있는 수많은 다른 방법을 구상할 수 있을 것이다.
단백질 코로나 분석 방법
본원에 개시된 방법은 하나 또는 하나 이상의 샘플 (예컨대, 생물학적 샘플 또는 연속적으로 질문된 샘플)로부터 하나 이상의 입자 유형을 분리하는 단계를 포함한다. 입자 유형은 자석을 사용하여 샘플로부터 신속하게 고립시키거나 분리할 수 있다. 더욱이, 공간적으로 분리되는 다중 샘플은 병렬로 처리될 수 있다. 그러므로, 본원에 개시된 방법은 샘플 중의 미결합 단백질로부터 입자 유형을 고립 또는 분리하는 것을 제공한다. 입자 유형은 한정하는 것은 아니지만 자기 분리, 원심분리, 여과, 또는 중력 분리를 포함한 다양한 수단에 의해 분리될 수 있다. 일부 구체예에서, 입자 패널은 복수의 공간적으로 분리된 샘플과 함께 인큐베이션될 수 있고, 각각의 공간적으로 분리된 샘플은 웰 플레이트 (예컨대, 96-웰 플레이트)의 웰에 있다. 일부 구체예에서, 인큐베이션 후에, 웰 플레이트의 각각의 웰의 입자 유형은 전체 플레이트를 자석 위에 배치함으로써 공간적으로 분리된 샘플에 존재하는 미결합 단백질로부터 분리될 수 있다. 이것은 동시에 입자 패널의 초상자성 입자를 끌어 내린다. 각 샘플의 상층액은 미결합 단백질을 제거하기 위해 제거될 수 있다. 이들 단계 (인큐베이션, 끌어 내림)는 입자를 효과적으로 세척하기 위해 반복될 수 있고, 그로써 샘플에 존재할 수 있는 잔류 배경 미결합 단백질이 제거된다. 이것은 한 예지만, 기술분야의 숙련된 사람은 초상자성 입자가 하나 또는 하나 이상의 공간적으로 분리된 샘플로부터 동시에 신속하게 분리되는 수많은 다른 시나리오를 구상할 수 있을 것이다.
일부 구체예에서, 본 개시의 방법 및 조성물은 단백질체학 데이터를 입자 표면 상에 형성된 코로나의 소화를 통해 처리함으로써 생물학적 샘플의 특정 단백질의 확인 및 측정을 제공한다. 확인되고 측정될 수 있는 단백질의 예로는 고도로 풍부한 단백질, 중간 풍부성의 단백질, 및 저풍부성 단백질을 들 수 있다. 저풍부성 단백질은 샘플에 약 10 ng/mL 이하의 농도로 존재할 수 있다. 고풍부성 단백질은 샘플에 약 10 μg/mL 이상의 농도로 존재할 수 있다. 중강 풍부성의 단백질은 샘플에 약 10 ng/mL 내지 약 10 μg/mL의 농도로 존재할 수 있다. 고도로 풍부한 단백질인 단백질의 예로는 알부민, IgG, 및 혈장에서 질량의 95%에 기여하는 풍부한 상위 14개 단백질을 들 수 있다. 추가적으로, 종래의 고갈 칼럼을 사용하여 정제될 수 있는 임의의 단백질은 본원에 개시된 입자 패널을 사용하여 샘플에서 직접 검출될 수 있다. 단백질의 예는 Keshishian et al. (Mol Cell Proteomics. 2015 Sep;14(9):2375-93. doi: 10.1074/mcp.M114.046813. Epub 2015 Feb 27.), Farr et al. (J Proteome Res. 2014 Jan 3;13(1):60-75. doi: 10.1021/pr4010037. Epub 2013 Dec 6.), 또는 Pernemalm et al. (Expert Rev Proteomics. 2014 Aug;11(4):431-48. doi: 10.1586/14789450.2014.901157. Epub 2014 Mar 24.)과 같은 공개된 데이터베이스에서 열거된 임의의 단백질일 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 개시된 방법 및 조성물을 사용하여 측정 및 확인될 수 있는 단백질의 예로는 알부민, IgG, 리소자임, CEA, HER-2/neu, 방광 종양 항원, 티로글로불린, 알파-피토단백질, PSA, CA125, CA19.9, CA 15.3, 렙틴, 프로락틴, 오스테오폰틴, IGF-II, CD98, 파신(fascin), sPigR, 14-3-3 에타, 트로포닌 I, B-형 나트륨 이뇨 펩타이드, BRCA1, c-Myc, IL-6, 피브리노겐. EGFR, 가스트린, PH, G-CSF, 데스민. NSE, FSH, VEGF, P21, PCNA, 칼시토닌, PR, CA125, LH, 소마토스타틴. S100, 인슐린. 알파-프로락틴, ACTH, Bcl-2, ER 알파, Ki-67, p53, 카텝신 D, 베타 카테닌. VWF, CD15, k-ras, 카스파제 3, EPN, CD10, FAS, BRCA2. CD30L, CD30, CGA, CRP, 프로트롬빈, CD44, APEX, 트란스페린, GM-CSF, E-카드헤린, IL-2, Bax, IFN-감마, 베타-2-MG, TNF 알파, c-erbB-2, 트립신, 사이클린 D1, MG B, XBP-1, HG-1, YKL-40, S-감마, NESP-55, 네트린-1, 제미닌, GADD45A, CDK-6, CCL21, BrMS1, 17베타HDI, PDGFRA, Pcaf, CCL5, MMP3, 클라우딘-4, 및 클라우딘-3을 들 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 개시된 입자 패널을 사용하여 측정 및 확인될 수 있는 단백질의 다른 예는 관심의 특정 질환 표시 (예컨대, 전립선암, 폐암, 또는 알츠하이머병)에 대한 공개 표적 데이터베이스에 열건된 임의의 단백질 또는 단백질 그룹이다.
생물학적 샘플의 단백질체학 데이터는 상이한 많은 분석 기법을 사용하여 확인되고, 측정되고, 정량화될 수 있다. 예를 들어, 단백질체학 데이터는 SDS-PAGE 또는 임의의 젤-기반 분리 기법을 사용하여 분석될 수 있다. 펩타이 및 단백질 또한 면역검정, 예컨대 ELISA를 사용하여 확인되고, 측정되고, 정량화될 수 있다. 대안으로, 단백질체학 데이터는 질량 분광분석, 고성능 액체 크로마토그래피, LC-MS/MS, 에드만 분해(Edman Degradation), 면역친화성 기법, EP3548652, WO2019083856, WO2019133892 (이들은 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 방법, 및 다른 단백질 분리 기법을 사용하여 확인되고, 측정되고, 정량화될 수 있다.
컴퓨터 제어 시스템
본 개시는 개시의 방법을 실행하기 위해 프로그래밍된 컴퓨터 제어 시스템을 제공한다. 도 29는 본원에 제공된 방법을 실행하기 위해 프로그래밍된 또는 그렇지 않으면 구성된 컴퓨터 시스템을 도시한다. 컴퓨터 시스템 (901)은 자동화될 수 있는, 본원에 개시된 검정의 다양한 측면 (예컨대, 기질 상에서 본원에 개시된 임의의 시약의 이동)을 조절할 수 있다. 컴퓨터 시스템 (901)은 사용자의 전자 장치이거나 전자 장치와 관련하여 원격으로 위치한 컴퓨터 시스템이다. 전자 장치는 이동식 전자 장치일 수 있다.
컴퓨터 시스템 (901)은 단일 커어 또는 다중 코어 프로세서이거나, 또는 병렬 처리를 위한 복수의 프로세서일 수 있는 중앙 처리 장치 (CPU, 또한 본원에서 "프로세서" 및 "컴퓨터 프로세서") (905)를 포함한다. 컴퓨터 시스템 (901)은 또한 메모리 또는 메모리 로케이션 (910) (예컨대, 랜덤-액세스 메모리, 판독 전용 메모리, 플래시 메모리), 전자 저장 장치 (915) (예컨대, 하드 디스크), 하나 이상의 다른 시스템과 통신하기 위한 통신 인터페이스 (920) (예컨대, 네트워크 어댑터), 및 주변 장치 (925), 예컨대 캐시(cache), 다른 메모리, 데이터 저장 및/또는 전자 디스플레이 어댑터를 포함한다. 메모리 (910), 저장 장치 (915), 인터페이스 (920) 및 주변 장치 (925)는 통신 버스 (실선), 예컨대 마더보드를 통해 CPU (905)와 통신된다. 저장 장치 (915)는 데이터를 저장하기 위한 데이터 저장 장치 (또는 데이터 저장소)일 수 있다. 컴퓨터 시스템 (901)은 통신 인터페이스 (920)의 도움으로 컴퓨터 네트워크 ("네트워크") (930)에 작동할 수 있게 결합된다. 네트워크 (930)는 인터넷, 인터넷 및/또는 엑스트라넷, 또는 인트라넷 및/또는 인터넷과 통신되는 엑스트라넷일 수 있다. 일부 경우에 네트워크 (930)는 전기통신 및/또는 데이터 네트워크이다. 네트워크 (930)는 분산 컴퓨팅, 예컨대 클라우드 컴퓨팅을 가능하게 할 수 있는 하나 이상의 컴퓨터 서버를 포함할 수 있다. 네트워크 (930)는, 일부 경우에 컴퓨터 시스템 (901)의 도움으로, 컴퓨터 시스템 (901)에 결합된 장치가 클라이언트 또는 서버로서 작동하는 것을 가능하게 할 수 있는, 피어 투 피어(peer-to-peer) 네트워크를 실행할 수 있다.
CPU (905)는 프로그램 또는 소프트웨어에서 구현될 수 있는 일련의 기계-판독 명령을 실행할 수 있다. 명령은 메모리 로케이션, 예컨대 메모리 (910)에 저장될 수 있다. 명령은 CPU (905)로 향할수 있고, 그것은 계속해서 본 개시의 방법을 실행하기 위해 프로그래밍되거나 또는 그렇지 않으면 CPU (905)를 구성할 수 있다. CPU (905)에 의해 수행된 작동의 예로는 페치(fetch), 디코딩(decode), 실행, 및 쓰기 저장(writeback)을 들 수 있다.
CPU (905)는 회로, 예컨대 집적 회로의 일부분일 수 있다. 시스템 (901)의 하나 이상의 다른 구성요소가 회로에 포함될 수 있다. 일부 경우에, 회로는 용도별 집적 회로 (ASIC)이다.
저장 장치 (915)는 파일, 예컨대 드라이버, 라이브러리 및 저장된 프로그램을 저장할 수 있다. 저장 장치 (915)는 사용자 데이터, 예컨대, 사용자 기본 설정 및 사용자 프로그램을 저장할 수 있다. 컴퓨터 시스템 (901)은 일부 경우에 컴퓨터 시스템 (901)의 외부에 있는, 예컨대 인트라넷 또는 인터넷을 통해 컴퓨터 시스템 (901)과 통신되는 원격 서버 상에 위치한 하나 이상의 추가 데이터 저장 장치를 포함할 수 있다.
컴퓨터 시스템 (901)은 네트워크 (930)를 통해 하나 이상의 원격 컴퓨터 시스템과 통신된다. 예를 들어, 컴퓨터 시스템 (901)은 사용자의 원격 컴퓨터 시스템과 통신될 수 있다. 원격 컴퓨터 시스템의 예로는 개인용 컴퓨터 (예컨대, 휴대용 PC), 슬레이트 또는 태블릿 PC (예컨대, Apple® iPad, Samsung® 갤럭시 탭), 전화기, 스마트폰 (예컨대, Apple® iPhone, 안드로이드-등록 디바이스, Blackberry®), 또는 개인용 디지털 보조기를 들 수 있다. 사용자는 컴퓨터 시스템 (901)에 네트워크 (930)를 통해 접속할 수 있다.
본원에 기술된 방법은 컴퓨터 시스템 (901)의 전자 저장 장소에, 예컨대, 예를 들어, 메모리 ((910)) 또는 전자 저장 장치 (915) 상에 저장된 기계 (예컨대, 컴퓨터 프로세서) 실행 가능 코드에 의해 실행될 수 있다. 기계 실행 가능 또는 기계 판독 가능 코드는 소프트웨어 형태로 제공될 수 있다. 사용 중에, 코드는 프로세서 (905)에 의해 실행될 수 있다. 일부 경우에, 코드는 저장 장치 (915)로부터 검색될 수 있고 프로세서 (905)에 의해 즉시 액세스되도록 메모리 (910) 상에 저장될 수 있다. 일부 상황에서, 전자 저장 장치 (915)는 배제될 수 있고, 기계-실행 가능 명령은 메모리 (910) 상에 저장된다.
코드는 사전 컴파일링되고 코드를 실행하도록 적응된 프로세서를 가진 기계와 함께 사용하기 위해 구성되거나, 또는 작동 시간 중에 컴파일링될 수 있다. 코드는 코드가 사전 컴파일링된 또는 컴파일링된 방식으로 실행되는 것을 가능하게 하도록 선택될 수 있는 프로그래밍 언어로 공급될 수 있다.
본원에 제공된 시스템 및 방법의 측면, 예컨대 컴퓨터 시스템 (901)은 프로그래밍에 구현될 수 있다. 기술의 다양한 측면은 전형적으로 기계 (또는 프로세서) 실행 가능 코드 및/또는 일종의 기계 판독 가능 매체 상에 반송되거나 구현되는 관련 데이터 형태의 "제품" 또는 "제조품"으로 간주될 수 있다. 기계-실행 가능 코드는 전자 저장 장치, 예컨대 메모리 (예컨대, 판독 전용 메모리, 랜덤-액세스 메모리, 플래시 메모리) 또는 하드 디스크 상에 저장될 수 있다. "저장"형 매체는 컴퓨터, 프로세서 등의 유형 메모리, 또는 그것의 관련된 모듈의 어느 것 또는 전부, 예컨대 언제든지 소포트웨어 프로그래밍을 위해 비-일시적 저장을 제공할 수 있는 다양한 반도체 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 등을 포함할 수 있다. 소프트웨어의 전부 또는 일부는 때때로 인터넷 또는 다양한 다른 전기통신 네트워크를 통해 통신될 수 있다. 그러한 통신은, 예를 들어, 한 컴퓨터 또는 프로세서로부터 다른 것으로, 예를 들어, 관리 서버 또는 숙주 컴퓨터로부터 응용 서버의 컴퓨터 플랫폼으로 소프트웨어의 로딩을 가능하게 할 수 있다. 그러므로, 소프트웨어 요소를 포함할 수 있는 또 다른 유형의 매체는, 예컨대 유선 및 광학 유선전화 네트워크를 통해 및 다양한 공중 링크를 지나 로컬 장치 사이의 물리적인 인터페이스를 가로질러 사용된 광학, 전기 및 전자기파를 포함한다. 그러한 파를 반송하는 물리적 요소, 예컨대 유선 또는 무선 링크, 광학 링크 등이 또한 소프트웨어를 포함하는 매체로서 고려될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 비-일시적인, 유형 "저장" 매체로 제한되지 않는 한, 컴퓨터 또는 기계 "판독 가능 매체"와 같은 용어는 실행을 위해 프로세서에 명령을 제공하는 데 참여하는 임의의 매체를 나타낸다.
그러므로, 기계 판독 가능 매체, 예컨대 컴퓨터-실행 가능 코드는 한정하는 것은 아니지만, 유형 저장 매체, 반송파 매체 또는 물리적 전송 매체를 포함한, 많은 형태를 취할 수 있다. 비-휘발성 저장 매체로는, 예를 들어, 광학 또는 자기 디스크, 예컨대 도면에서 도시된, 예컨대 데이터베이스를 실행하기 위해 사용될 수 있는 임의의 컴퓨터(들)의 임의의 저장 장치 등을 들 수 있다. 휘발성 저장 매체로는 동적 메모리, 예컨대 그러한 컴퓨터 플랫폼의 주요 메모리를 들 수 있다. 유형 전송 매체로는 동축 케이블; 컴퓨터 시스템 내의 버스를 포함하는 와이어를 포함한, 구리 와이어 및 광섬유를 들 수 있다. 반송파 전송 매체는 전기 또는 전자기 신호, 또는 무선 주파수 (RF) 및 적외선 (IR) 데이터 통신 중에 생성된 것과 같은 음향 또는 광파의 형태를 취할 수 있다. 그러므로 컴퓨터-판독 가능 매체의 공통 형태로는 예를 들어: 플로피 디스크, 가요성 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 임의의 다른 자성 매체, CD-ROM, DVD 또는 DVD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드 페이퍼 테이프, 구멍의 패턴을 가진 임의의 다른 물리적 저장 매체, RAM, ROM, PROM 및 EPROM, 플래시-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 반송파 전송 데이터 또는 명령, 그러한 반송파를 전송하는 케이블 또는 링크, 또는 컴퓨터가 프로그래밍 코드 및/또는 데이터를 판독할 수 있게 되는 임의의 다른 매체를 들 수 있다. 컴퓨터 판독 가능 매체의 이들 형태 중 많은 것이 하나 이상의 명령의 하나 이상의 시퀀스를 실행을 위해 프로세서에 전송하는 데 관여할 수 있다.
컴퓨터 시스템 (901)은 예를 들어 본원에 개시된 방법을 사용하여 확인된 단백질의 판독값을 제공하기 위해, 사용자 인터페이스 (UI) (940)를 포함하는 전자 디스플레이 (935)와 통신을 포함하거나 통신될 수 있다. UI의 예로는, 제한 없이, 그래픽 사용자 인터페이스 (GUI) 및 웹-기반 사용자 인터페이스를 들 수 있다.
본 개시의 방법 및 시스템은 하나 이상의 알고리즘에 의해 실행될 수 있다. 알고리즘은 중앙 처리 장치 (905)에 의한 실행시에 소프트웨어에 의해 실행될 수 있다.
측정, 분석 또는 통계적 분류는 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어, 광범위한 지도된 및 비지도 데이터 분석 및 클러스터링 접근법, 예컨대, 다른 것들 중에서도, 계층적 클러스터 분석 (HCA), 주요 구성요소 분석 (PCA), 부분 최소 제곱 판별 분석 (PLSDA), 기계 학습(machine learning) (또한 랜덤 포레스트로도 알려짐), 로지스틱 회귀, 결정 나무, 지원 벡터 기계 (SVM), k-최근접 이웃, 나이브 베이, 선형 회귀, 다항식 회귀, 회귀용 SVM, K-평균 클러스터링, 및 은닉 마르코프 모델을 포함한, 기술분야에 알려져 있는 방법에 의해 실시된다. 컴퓨터 시스템은 본 개시의 단백질 세트 또는 단백질 코로나를 분석하는 다양한 측면, 예컨대, 예를 들어, 개별 생체분자 코로나 사이에서 어떤 패턴이 공통적인지를 통계적 유의성으로 측정하기 위하여 여러 샘플의 생체분자 코로나를 비교/분석하는 것을 수행하여 생물학적 상태와 관련된 단백질 세트를 측정할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 상이한 단백질 세트 또는 단백질 코로나 (예컨대, 단백질 코로나의 조성의 특징임)를 검출 및 구별하기 위한 분류기를 개발하기 위해 사용될 수 있다. 현재 개시된 센서 어레이로부터 수집된 데이터는 기계 학습 알고리즘, 특히 환자로부터 어레이 측정을 수용하여 각 환자로부터 특정 생체분자 코로나 조성을 출력하는 알고리즘을 훈련하기 위해 사용될 수 있다. 알고리즘을 훈련하기 전에, 어레이로부터의 미가공 데이터는 개별 변수의 가변성을 줄이기 위하여 먼저 노이즈가 제거될 수 있다.
기계 학습은 학습 데이터 세트를 경험한 후 새로운, 보이지 않는 예/작업에 대해 정확하게 수행하는 학습 기계의 능력으로서 일반화될 수 있다. 기계 학습은 다음의 개념 및 방법을 포함할 수 있다. 지도된 학습 개념은 AODE; 인공 신경 네트워크, 예컨대 역전파(Backpropagation), 자동 인코더(Autoencoders), 홉필드(Hopfield) 네트워크, 볼츠만 기계, 제한된 볼츠만 기계, 및 스파이킹 신경 네트워크; 베이지안 통계, 예컨대 베이지안 네트워크 및 베이지안 지식 기초; 사례-기반 추론; 가우시안 프로세스 회귀; 유전자 발현 프로그래밍; 그룹 데이터 처리 방법 (GMDH); 유도 논리 프로그래밍; 사례-기반 학습; 게으른 학습; 학습 오타마타(Learning Automata); 벡터 양자화 학습; 로지스틱 모델 나무; 최소 메시지 길이 (결정 나무, 결정 그래프, 등), 예컨대 최근접 이웃 알고리즘 및 유사한 모델링; 아마도 대략적으로 정확한 학습 (PAC) 학습; 리플 다운 규칙(Ripple down rules), 지식 획득 방법론; 기호 기계 학습 알고리즘; 지원 벡터 기계; 랜덤 포레스트; 분류기 앙상블, 예컨대 부트스트랩 집계 (배깅) 및 부스팅 (메타-알고리즘); 서수적 분류; 정보 퍼지 네트워크 (IFN); 조건부 랜덤 필드; ANOVA; 선형 분류기, 예컨대 Fisher 선형 판별식, 선형 회귀, 로지스틱 회귀, 다항식 로지스틱 회귀, 나이브 베이즈 분류기, 퍼셉트론(Perceptron), 지원 벡터 기계; 이차 분류기; k-최근접 이웃; 부스팅; 결정 나무, 예컨대 C4.5, 랜덤 포레스트, ID3, CART, SLIQ SPRINT; 베이지안 네트워크, 예컨대 나이브 베이즈; 및 은닉 마르코프 모델을 포함할 수 있다. 지도되지 않은 학습 개념은 기댓값-최대화 알고리즘; 벡터 양자화; 생성 지형도; 정보 병목 방법; 인공 신경 네트워크, 예컨대 자기 조직화 지도; 연관 규칙 학습, 예컨대, Apriori 알고리즘, Eclat 알고리즘, 및 FPgrowth 알고리즘; 계층적 클러스터링, 예컨대 단일연결 클러스터링 및 개념적 클러스터링; 클러스터 분석, 예컨대, K-평균 알고리즘, 퍼지 클러스터링, DBSCAN, 및 OPTICS 알고리즘; 및 이상치 검출, 예컨대 국소 이상값 요인을 포함할 수 있다. 반-지도 학습 개념은 생성 모델; 저밀도 분리; 그래프-기반 방법; 및 공-훈련을 포함할 수 있다. 강화 학습 개념은 시차 학습; Q-학습; 학습 오토마타; 및 SARSA를 포함할 수 있다. 심층 학습 개념은 심층 믿음 네트워크; 심층 볼츠만 기계; 심층 컨볼루션 신경 네트워크; 심층 재발 신경 네트워크; 및 계층적 시간 기억을 포함할 수 있다. 컴퓨터 시스템은 본원에 기술된 방법을 실행하기 위해 조정될 수 있다. 시스템은 본원에 기술된 방법을 실행하도록 프로그래밍된 중앙 컴퓨터 서버를 포함한다. 서버는 단일 코어 프로세서, 다중 코어 프로세서, 또는 병렬 처리를 위한 복수의 프로세서일 수 있는 중앙 처리 장치 (CPU, 또한 "프로세서")를 포함한다. 서버는 또한 메모리 (예컨대, 랜덤 액세스 메모리, 판독 전용 메모리, 플래시 메모리); 전자 저장 장치 (예컨대 하드 디스크); 하나 이상의 다른 시스템과 통신하기 위한 통신 인터페이스 (예컨대, 네트워크 어댑터); 및 캐시, 다른 메모리, 데이터 저장, 및/또는 전자 디스플레이 어댑터를 포함할 수 있는 주변 장치를 포함한다. 메모리, 저장 장치, 인터페이스, 및 주변 장치는 통신 버스 (실선), 예컨대 마더보드를 통해 프로세서와 통신된다. 저장 장치는 데이터를 저장하기 위한 데이터 저장 장치일 수 있다. 서버는 통신 인터페이스의 도움으로 컴퓨터 네트워크 ("네트워크")에 작동할 수 있게 결합된다. 네트워크는 인터넷, 인트라넷 및/또는 엑스트라넷, 인트라넷 및/또는 인터넷과 통신되는 엑스트라넷, 전기통신 또는 데이터 네트워크이다. 네트워크는 일부 경우에, 서버의 도움으로, 서버에 결합된 장치가 클라이언트 또는 서버로서 작동하는 것을 가능하게 할 수 있는, 피어 투 피어 네트워크를 실행할 수 있다.
저장 장치는 파일, 예컨대 주제 보고서, 및/또는 개인에 대한 데이터와의 통신, 또는 본 개시와 관련된 데이터의 임의의 측면을 저장할 수 있다.
컴퓨터 서버는 네트워크를 통해 하나 이상의 원격 컴퓨터 시스템과 통신될 수 있다. 하나 이상의 원격 컴퓨터 시스템은, 예를 들어, 개인용 컴퓨터, 랩톱(laptops), 태블릿, 전화기, 스마트폰, 또는 개인용 디지털 보조기일 수 있다.
일부 적용에서 컴퓨터 시스템은 단일 서버를 포함한다. 다른 상황에서, 시스템은 인트라넷, 엑스트라넷 및/또는 인터넷을 통해 서로 통신하는 다중 서버를 포함한다.
서버는 본원에서 제공된 측정 데이터 또는 데이터베이스, 대상체로부터의 환자 정보, 예컨대, 예를 들어, 병력, 가족력, 인구통계학적 데이터 및/또는 특정 으용과 잠재적으로 관련된 기타 임상 또는 개인 정보를 저장하기 위해 조정될 수 있다. 그러한 정보는 저장 장치 또는 서버 상에 저장될 수 있고 그러한 데이터는 네트워크를 통해 전송될 수 있다.
본원에 기술된 방법은 서버의 전자 저장 장소, 예컨대, 예를 들어, 메모리, 또는 전자 저장 장치 상에 저장된 기계 (또는 컴퓨터 프로세서) 실행 가능 코드 (또는 소프트웨어)에 의해 실행될 수 있다. 사용 중에, 코드는 프로세서에 의해 실행될 수 있다. 일부 경우에, 코드는 저장 장치로부터 검색될 수 있고 프로세서에 의해 즉시 액세스하도록 메모리 상에 저장될 수 있다. 일부 상황에서, 전자 저장 장치는 배제될 수 있고, 기계-실행 가능 명령은 메모리 상에 저장된다. 대안으로, 코드는 제2 컴퓨터 시스템 상에서 실행될 수 있다.
본원에 제공된 시스템 및 방법의 측면, 예컨대 서버는 프로그래밍에 구현될 수 있다. 기술의 다양한 측면은 전형적으로 기계 (또는 프로세서) 실행 가능 코드 및/또는 일종의 기계 판독 가능 매체 상에 반송되거나 구현되는 관련 데이터 형태의 "제품" 또는 "제조품"으로 간주될 수 있다. 기계-실행 가능 코드는 전자 저장 장치, 예컨대 메모리 (예컨대, 판독 전용 메모리, 랜덤-액세스 메모리, 플래시 메모리) 또는 하드 디스크 상에 저장될 수 있다. "저장"형 매체는 컴퓨터, 프로세서 등의 유형 메모리, 또는 그것의 관련된 모듈의 어느 것 또는 전부, 예컨대 언제든지 소포트웨어 프로그래밍을 위해 비-일시적 저장을 제공할 수 있는 다양한 반도체 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 등을 포함할 수 있다. 소프트웨어의 전부 또는 일부는 때때로 인터넷 또는 다양한 다른 전기통신 네트워크를 통해 통신될 수 있다. 그러한 통신은, 예를 들어, 한 컴퓨터 또는 프로세서로부터 다른 것으로, 예를 들어, 관리 서버 또는 숙주 컴퓨터로부터 응용 서버의 컴퓨터 플랫폼으로 소프트웨어의 로딩을 가능하게 할 수 있다. 그러므로, 소프트웨어 요소를 포함할 수 있는 또 다른 유형의 매체는, 예컨대 유선 및 광학 유선전화 네트워크를 통해 및 다양한 공중 링크를 지나 로컬 장치 사이의 물리적인 인터페이스를 가로질러 사용된 광학, 전기 및 전자기파를 포함한다. 그러한 파를 반송하는 물리적 요소, 예컨대 유선 또는 무선 링크, 광학 링크 등이 또한 소프트웨어를 포함하는 매체로서 고려될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 비-일시적인, 유형 "저장" 매체로 제한되지 않는 한, 컴퓨터 또는 기계 "판독 가능 매체"와 같은 용어는 실행을 위해 프로세서에 명령을 제공하는 데 참여하는 임의의 매체를 나타낼 수 있다.
본원에 기술된 컴퓨터 시스템은 본원에 기술된 임의의 알고리즘 또는 알고리즘-기반 방법을 수행하기 위한 컴퓨터-실행 가능 코드를 포함할 수 있다. 일부 적용에서 본원에 기술된 알고리즘은 적어도 하나의 데이터베이스로 구성된 메모리 장치를 사용할 것이다.
본 개시와 관련된 데이터는 수신자에 의한 수신 및/또는 검토를 위해 네트워크 또는 연결을 지나 전송될 수 있다. 수신자는 한정하는 것은 아니지만 보고서가 속한 대상체 또는 그의 간병인, 예컨대, 건강 관리 제공자, 관리자, 기타 건강 관리 전문가, 또는 다른 돌보는 사람; 분석을 수행한 및/또는 주문한 사람 또는 단체일 수 있다. 수신자는 또한 그러한 보고서를 저장하기 위한 로컬 또는 원격 시스템 (예컨대 "클라우드 컴퓨팅" 아키텍처의 다른 시스템)일 수 있다. 한 구체예에서, 컴퓨터-판독 가능 매체는 본원에 기술된 방법을 사용하여 생물학적 샘플을 분석한 결과의 전송에 적합한 매체를 포함한다.
본원에 제공된 시스템 및 방법의 측면은 프로그래밍에 구현될 수 있다. 기술의 다양한 측면은 전형적으로 기계 (또는 프로세서) 실행 가능 코드 및/또는 일종의 기계 판독 가능 매체 상에 반송되거나 구현되는 관련 데이터 형태의 "제품" 또는 "제조품"으로 간주될 수 있다. 기계 실행 가능 코드는 전자 저장 장치, 예컨대 메모리 (예컨대, 판독 전용 메모리, 랜덤-액세스 메모리, 플래시 메모리) 또는 하드 디스크 상에 저장될 수 있다. "저장"형 매체는 컴퓨터, 프로세서 등의 유형 메모리, 또는 그것의 관련된 모듈의 어느 것 또는 전부, 예컨대 언제든지 소포트웨어 프로그래밍을 위해 비일시적 저장을 제공할 수 있는 다양한 반도체 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 드라이브 등을 포함할 수 있다. 소프트웨어의 전부 또는 일부는 때때로 인터넷 또는 다양한 다른 전기통신 네트워크를 통해 통신될 수 있다. 그러한 통신은, 예를 들어, 한 컴퓨터 또는 프로세서로부터 다른 것으로, 예를 들어, 관리 서버 또는 숙주 컴퓨터로부터 응용 서버의 컴퓨터 플랫폼으로 소프트웨어의 로딩을 가능하게 할 수 있다. 그러므로, 소프트웨어 요소를 포함할 수 있는 또 다른 유형의 매체는, 예컨대 유선 및 광학 유선전화 네트워크를 통해 및 다양한 공중 링크를 지나 로컬 장치 사이의 물리적인 인터페이스를 가로질러 사용된 광학, 전기 및 전자기파를 포함한다. 그러한 파를 반송하는 물리적 요소, 예컨대 유선 또는 무선 링크, 광학 링크 등이 또한 소프트웨어를 포함하는 매체로서 고려될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, 비-일시적인, 유형 "저장" 매체로 제한되지 않는 한, 컴퓨터 또는 기계 "판독 가능 매체"와 같은 용어는 실행을 위해 프로세서에 명령을 제공하는 데 참여하는 임의의 매체를 나타낼 수 있다.
그러므로, 기계 판독 가능 매체, 예컨대 컴퓨터-실행 가능 코드는 한정하는 것은 아니지만, 유형 저장 매체, 반송파 매체 또는 물리적 전송 매체를 포함한, 많은 형태를 취할 수 있다. 비-휘발성 저장 매체로는, 예를 들어, 광학 또는 자기 디스크, 예컨대 도면에서 도시된, 예컨대 데이터베이스를 실행하기 위해 사용될 수 있는 임의의 컴퓨터(들)의 임의의 저장 장치 등을 들 수 있다. 휘발성 저장 매체로는 동적 메모리, 예컨대 그러한 컴퓨터 플랫폼의 주요 메모리를 들 수 있다. 유형 전송 매체로는 동축 케이블; 컴퓨터 시스템 내의 버스를 포함하는 와이어를 포함한, 구리 와이어 및 광섬유를 들 수 있다. 반송파 전송 매체는 전기 또는 전자기 신호, 또는 무선 주파수 (RF) 및 적외선 (IR) 데이터 통신 중에 생성된 것과 같은 음향 또는 광파의 형태를 취할 수 있다. 그러므로 컴퓨터-판독 가능 매체의 공통 형태로는 예를 들어: 플로피 디스크, 가요성 디스크, 하드 디스크, 자기 테이프, 임의의 다른 자성 매체, CD-ROM, DVD 또는 DVD-ROM, 임의의 다른 광학 매체, 펀치 카드 페이퍼 테이프, 구멍의 패턴을 가진 임의의 다른 물리적 저장 매체, RAM, ROM, PROM 및 EPROM, 플래시-EPROM, 임의의 다른 메모리 칩 또는 카트리지, 반송파 전송 데이터 또는 명령, 그러한 반송파를 전송하는 케이블 또는 링크, 또는 컴퓨터가 프로그래밍 코드 및/또는 데이터를 판독할 수 있게 되는 임의의 다른 매체를 들 수 있다. 컴퓨터 판독 가능 매체의 이들 형태 중 많은 것이 하나 이상의 명령의 하나 이상의 시퀀스를 실행을 위해 프로세서에 전송하는 데 관여할 수 있다.
기계 학습을 사용하는 단백질 코로나의 분류
질환 또는 장애 및/또는 질환 상태와 관련된 단백질 세트를 측정하는 방법은 적어도 두 샘플의 코로나의 분석을 포함한다. 이런 측정, 분석 또는 통계적 분류는, 한정하는 것은 아니지만, 예를 들어 광범위한 지도 및 비지도 데이터 분석, 기계 학습, 심층 학습, 및 다른 것들 중에서도 계층적 클러스터 분석 (HCA), 주요 구성요소 분석 (PCA), 부분 최소 제곱 판별 분석 (PLS-DA), 랜덤 포레스트, 로지스틱 회귀, 결정 나무, 지원 벡터 기계 (SVM), k-최근접 이웃, 나이브 베이, 선형 회귀, 다항식 회귀, 회귀용 SVM, K-평균 클러스터링, 및 은닉 마르코프 모델을 포함한 클러스터링 접근법을 포함한, 기술분야에 알려져 있는 방법에 의해 실시된다. 달리 말하면, 각 샘플의 코로나의 단백질은 질환 또는 장애 또는 질환 상태와 관련된 단백질 세트를 측정하기 위하여 개별 코로나 사이에서 어떤 패턴이 공통적인지를 통계적 유의성으로 측정하기 위하여 서로 비교/분석된다.
일반적으로, 예시를 기술하는 입력 특징을 토대로 부류 표지를 예시에 정확하게 배정하는 모델을 구성하기 위해 기계 학습 알고리즘이 사용된다. 일부 경우에 본원에 기술된 방법에 대한 기계 학습 및/또는 심층 학습 접근법을 사용하는 것이 유익할 수 있다. 예를 들어, 기계 학습은 단백질 코로나를 다양한 질환 상태와 연관시키기 위해 사용될 수 있다 (예컨대 질환이 없거나, 질환 전 상태이거나, 질환의 초기 또는 후기 단계를 갖고 있는 등). 예를 들어, 일부 경우에, 단백질 코로나 및 그것으로부터 유래된 단백질 세트에 의해 검출되고 얻어진 데이터를 분석하기 위하여 발명의 방법과 관련하여 하나 이상의 기계 학습 알고리즘이 사용된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 기계 학습은 대상체가 암의 전 단계, 암을 가졌는지 또는 암을 갖지 않았는지 또는 암을 발생시키고 있는지를 측정할뿐만 아니라, 암의 유형을 구별하기 위하여 본원에 기술된 센서 어레이와 결합될 수 있다.
다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 기술을 가진 사람에 의해 일반적으로 이해되는 것과 같은 의미를 가진다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바, 단수를 나타내는 용어들은 맥락이 분명하게 다른 것을 나타내지 않는 한 복수의 대상을 포함한다. 본원에서 "또는"에 대한 모든 언급은 다르게 표시되지 않는 한 "및/또는"을 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "적어도", "보다 큰", 또는 "이상"이 일련의 둘 이상의 수치에서 첫 번째 수치 앞에 있을 때는 언제나, 용어 "적어도", "보다 큰" 또는 "이상"은 그 일련의 수치에서 각각의 수치에 적용된다. 예를 들어, 1, 2, 또는 3 이상은 1 이상, 2 이상, 또는 3 이상과 동등하다.
용어 "이하", "미만", "이하", 또는 "최대"가 일련의 둘 이상의 수치에서 첫 번째 수치 앞에 있을 때는 언제나, 용어 "이하", "미만" 또는 "이하", 또는 "최대"는 그 일련의 수치에서 각각의 수치에 적용된다. 예를 들어, 3, 2, 또는 1 이하는 3 이하, 2 이하, 또는 1 이하와 동등하다.
값이 범위로서 기술되는 경우, 그러한 개시는 그러한 범위 내의 모든 가능한 하위 범위의 개시 뿐만 아니라, 특정 수치 또는 특정 하위 범위가 분명하게 진술되는 지의 여부와 관계없이 그러한 범위 내에 속하는 특정 수치를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
번호로 표시된 구체예
다음의 구체예는 본원에 개시된 특징의 조합의 비제한적인 순열을 나열한다. 특징의 조합의 다른 순열 또한 고려된다. 특히, 이들 번호를 매긴 구체예의 각각은, 나열된 순서와 관계없이, 모든 이전 또는 후속 번호 구체예에 의존하거나 관련된 것으로 고려되다. 1. 샘플을 연속적으로 질문하는 방법으로서, 방법은: a) 샘플을 제1 입자 유형과 접촉시키고 제1 입자 유형을 샘플과 인큐베이션하여 제1 생체분자 코로나를 형성하는 단계로, 제1 생체분자 코로나는 제1 입자 유형을 샘플과 인큐베이션할 때 형성되며 제1 생체분자 코로나는 단백질을 포함하는 것인 단계; b) 샘플로부터 제1 생체분자 코로나를 포함하는 제1 입자 유형을 분리하는 단계; c) 샘플을 제2 입자 유형과 접촉시키고 제2 입자 유형을 샘플과 인큐베이션하여 제2 생체분자 코로나를 형성하는 단계로, 제2 생체분자 코로나는 제2 입자 유형을 샘플과 인큐베이션할 때 형성되며, 제2 생체분자 코로나는 단백질을 포함하고, 추가로 (i) 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 동일한 입자 유형이거나 또는 (ii) 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 상이한 것인 단계; d) 제2 생체분자 코로나를 포함하는 제2 입자 유형을 샘플로부터 분리하는 단계; e) 제1 생체분자 코로나 및 제2 생체분자 코로나를 검정하여 검정된 제1 생체분자 코로나 및 제2 생체분자 코로나를 토대로 샘플 중의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계를 포함한다. 2. 구체예 1의 방법으로서, 제1 생체분자 코로나를 형성하기 위하여 제1 입자 유형을 샘플과 인큐베이션시킬 때, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위에 비해 압축되는 것인 방법. 3. 구체예 2의 방법으로서, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는 a) 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 더 높은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호; 및 b) 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 더 낮은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호의 제1 비율인 것인 방법. 4. 구체예 2의 방법으로서, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 최고 풍부성 단백질의 농도 대 최저 풍부성 단백질의 농도의 제1 비율인 것인 방법. 5. 구체예 2의 방법으로서, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 상위 십분위 대 단백질의 하위 십분위의 제1 비율인 것인 방법. 6. 구체예 2의 방법으로서, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 사분위수 범위의 범위를 포함하는 제1 비율인 것인 방법. 7. 구체예 2의 방법으로서, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 모든 농도 대비 샘플 중의 동일한 단백질의 공지된 농도의 플롯에서 피팅된 데이터의 기울기를 포함하는 제1 비율인 것인 방법. 8. 구체예 7의 방법으로서, 샘플 중의 동일한 단백질의 공지된 농도는 데이터베이스로부터 얻어지는 것인 방법. 9. 구체예 2-8 중 어느 하나의 방법으로서, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위는 a) 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질의 더 높은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호; 및 b) 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질의 더 낮은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호의 제2 비율인 것인 방법. 10. 구체예 2-8 중 어느 하나의 방법으로서, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질 중의 최고 풍부성 단백질의 농도 대 최저 풍부성 단백질의 농도의 제2 비율인 것인 방법. 11. 구체예 2-8 중 어느 하나의 방법으로서, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질 중의 단백질의 상위 십분위 대 단백질의 하위 십분위의 제2 비율인 것인 방법. 12. 구체예 2-8 중 어느 하나의 방법으로서, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질의 단백질의 사분위수 범위의 범위를 포함하는 제2 비율인 것인 방법. 13. 구체예 2-8 중 어느 하나의 방법으로서, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질 중의 단백질의 모든 농도 대비 샘플 중의 동일한 단백질의 공지된 농도의 플롯에서 피팅된 데이터의 기울기를 포함하는 제2 비율인 것인 방법. 14. 구체예 13의 방법으로서, 샘플 중의 동일한 단백질의 공지된 농도는 데이터베이스로부터 얻어지는 것인 방법. 15. 구체예 9-14 중 어느 하나의 방법으로서, 동적 범위를 압축하는 것은 제2 비율에 비해 감소된 제1 비율을 포함하는 것인 방법. 16. 구체예 15의 방법으로서, 감소된 제1 비율은 제2 비율보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 더 적은 것인 방법. 17. 구체예 1-16 중 어느 하나의 방법으로서, 방법은 제2 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 18. 구체예 1-17 중 어느 하나의 방법으로서, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계 또는 제2 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계는 질량 분광분석을 수행하는 것을 포함하는 것인 방법. 19. 구체예 1-18 중 어느 하나의 방법으로서, 방법은 단계 a), b), 및 e)를 하나 이상의 추가 입자 유형으로 반복하여 하나 이상의 추가 생체분자 코로나를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 20. 구체예 19의 방법으로서, 하나 이상의 추가 입자 유형은 제1 입자 유형 또는 제2 입자 유형과 동일한 것인 방법. 21. 구체예 19의 방법으로서, 하나 이상의 추가 입자 유형은 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 또는 그것들의 조합과 상이한 것인 방법. 22. 구체예 19-21 중 어느 하나의 방법으로서, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나는 샘플로부터의 단백질을 포함하는 것인 방법. 23. 구체예 19-22 중 어느 하나의 방법으로서, 제1 생체분자 코로나, 제2 생체분자 코로나, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나, 또는 그것들의 임의의 조합은 적어도 100개의 구별되는 단백질을 포함하는 것인 방법. 24. 구체예 19-23 중 어느 하나의 방법으로서, 제1 생체분자 코로나, 제2 생체분자 코로나, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나, 또는 그것들의 임의의 조합은 적어도 200개의 구별되는 단백질, 적어도 300개의 구별되는 단백질, 적어도 400개의 구별되는 단백질, 적어도 500개의 구별되는 단백질, 적어도 1000개의 구별되는 단백질, 적어도 2000개의 구별되는 단백질, 또는 적어도 5000개의 구별되는 단백질을 포함하는 것인 방법. 25. 구체예 19-24 중 어느 하나의 방법으로서, 제1 생체분자 코로나, 제2 생체분자 코로나, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나, 또는 그것들의 임의의 조합은 단백질의 상이한 조성, 단백질의 하위세트의 상이한 농도, 또는 그것들의 조합을 포함하는 것인 방법. 26. 구체예 19-25 중 어느 하나의 방법으로서, 하나 이상의 추가 입자 유형을 샘플과 인큐베이션하여 하나 이상의 추가 생체분자 코로나가 형성될 때, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위에 비해 압축되는 것인 방법. 27. 구체예 26의 방법으로서, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는 a) 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 더 높은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호; 및 b) 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 더 낮은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호의 추가 비율인 것인 방법. 28. 구체예 26의 방법으로서, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는 하나 이상의 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 최고 풍부성 단백질의 농도 대 최저 풍부성 단백질의 농도의 추가 비율인 것인 방법. 29. 구체예 26의 방법으로서, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는 하나 이상의 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 상위 십분위 대 단백질의 하위 십분위의 추가 비율인 것인 방법. 30. 구체예 26의 방법으로서, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는 하나 이상의 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 사분위수 범위의 범위를 포함하는 추가 비율인 것인 방법. 31. 구체예 26의 방법으로서, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는 하나 이상의 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 모든 농도 대비 샘플 중의 동일한 단백질의 공지의 농도의 플롯에서 피팅된 데이터의 기울기를 포함하는 추가 비율인 것인 방법. 32. 구체예 31의 방법으로서, 샘플 중의 동일한 단백질의 공지된 농도는 데이터베이스로부터 얻어지는 것인 방법. 33. 구체예 27-32 중 어느 하나의 방법으로서, 동적 범위를 압축하는 것은 제2 비율에 비해 감소된 추가 비율을 포함하는 것인 방법. 34. 구체예 33의 방법으로서, 감소된 제1 비율은 제2 비율보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 더 적은 것인 방법. 35. 구체예 2-34 중 어느 하나의 방법으로서, 총 단백질 분석 방법은 샘플 중의 복수의 단백질의 질량 분광분석, 겔 전기영동, 또는 액체 크로마토그래피에 의한 직접 정량화를 포함하는 것인 방법. 36. 구체예 1-35 중 어느 하나의 방법으로서, 샘플은 약 1000 μL 이하, 약 900 μL 이하, 약 800 μL 이하, 약 700 μL 이하, 약 600 μL 이하, 약 500 μL 이하, 약 400 μL 이하, 약 300 μL 이하, 약 200 μL 이하, 약 100 μL 이하, 약 50 μL 이하, 약 20 μL 이하, 약 10 μL 이하, 약 5 μL 이하, 약 2 μL 이하, 또는 약 1 μL 이하의 샘플 부피를 포함하는 것인 방법. 37. 구체예 1-36 중 어느 하나의 방법으로서, 샘플은 생물학적 샘플을 포함하는 것인 방법. 38. 구체예 37의 방법으로서, 생물학적 샘플은 생체 유체를 포함하는 것인 방법. 39. 구체예 38의 방법으로서, 생체 유체는 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 활액, 눈물, 타액, 전혈, 우유, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액, 폐 세척액, 땀, 열구액, 정액, 전립선액, 가래, 대변, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 기관지 흡인액, 유동화된 고체, 미세 바늘 흡인 샘플, 조직 균질액, 및 세포 배양 샘플로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법. 40. 구체예 38-39 중 어느 하나의 방법으로서, 생체 유체는 혈장 또는 혈청인 것인 방법. 41. 구체예 38-39 중 어느 하나의 방법으로서, 생체 유체는 뇌척수액인 것인 방법. 42. 구체예 19-41 중 어느 하나의 방법으로서, 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 하나 이상의 추가 입자 유형, 또는 그것들의 임의의 조합은 표 1로부터 선택되는 것인 방법. 43. 구체예 1-42 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 a) 전에 샘플을 고갈시키거나 분별함으로써 고풍부성 단백질을 샘플로부터 제거하는 단계를 포함하는 것인 방법. 44. 구체예 19-43 중 어느 하나의 방법으로서, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나는 단백질을 포함하는 것인 방법. 45. 구체예 19-44 중 어느 하나의 방법으로서, 제1 생체분자 코로나, 제2 생체분자 코로나, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나, 또는 그것들의 임의의 조합은 지질, 핵산, 다당, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법. 46. 구체예 19-45 중 어느 하나의 방법으로서, 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 또는 하나 이상의 추가 입자 유형은 적어도 하나의 물리화학적 특성이 상이한 것인 방법. 47. 구체예 1-46 중 어느 하나의 방법으로서, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 적어도 하나의 물리화학적 특성이 상이하고 제1 생체분자 코로나는 제2 생체분자 코로나에 비해 구별되지만 중복되는 단백질 세트를 포함하는 것인 방법. 48. 구체예 1-47 중 어느 하나의 방법으로서, 복수의 단백질의 조성 및 복수의 단백질의 단백질 농도는 제1 생체분자 코로나 및 제2 생체분자 코로나 중의 구별되지만 중복되는 단백질 세트를 토대로 측정되는 것인 방법. 49. 구체예 19-48 중 어느 하나의 방법으로서, 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 하나 이상의 추가 입자 유형, 또는 그것들의 임의의 조합은 나노입자, 마이크로입자, 미셸, 리포솜, 산화 철 입자, 그래핀 입자, 실리카 입자, 단백질-기반 입자, 폴리스티렌 입자, 은 입자, 금 입자, 금속 입자, 양자점, 초상자성 입자, 또는 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법. 50. 구체예 1-49 중 어느 하나의 방법으로서, 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 하나 이상의 추가 입자 유형, 또는 그것들의 임의의 조합은 초상자성 입자인 것인 방법. 51. 구체예 1-50 중 어느 하나의 방법으로서, 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 하나 이상의 추가 입자 유형, 또는 그것들의 임의의 조합은 표 1로부터 선택되는 것인 방법. 52. 구체예 1-51 중 어느 하나의 방법으로서, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 동일한 입자 유형이고 제1 생체분자 코로나 및 제2 생체분자 코로나에서 검정된 단백질의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 동일한 것인 방법. 53. 구체예 1-52 중 어느 하나의 방법으로서, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 상이하고 제1 생체분자 코로나 및 제2 생체분자 코로나에서 검정된 단백질의 70% 이하, 80% 이하, 90% 이하, 또는 95% 이하는 동일한 것인 방법. 54. 복수의 생체 유체를 분석하는 고처리량 방법으로서, 방법은: a) 복수의 생체 유체의 제1 생체 유체 및 제2 생체 유체를 입자 유형과 접촉시키는 단계; b) 제1 부피에서, 입자 유형을 복수의 생체 유체의 제1 생체 유체로부터 분리하고 입자 유형에 상응하는 제1 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계; 및 c) 제2 부피에서, 입자 유형을 복수의 생체 유체의 제2 생체 유체로부터 분리하고 입자 유형에 상응하는 제2 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계를 포함하며, 여기서 제1 생체 유체 및 제2 생체 유체는 상이한 생체 유체이다. 55. 구체예 54의 방법으로서, 복수의 생체 유체의 생체 유체는 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 활액, 눈물, 타액, 전혈, 우유, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액, 폐 세척액, 땀, 열구액, 정액, 전립선액, 가래, 대변, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 기관지 흡인액, 유동화된 고체, 미세 바늘 흡인 샘플, 조직 균질액, 및 세포 배양 샘플로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법. 56. 구체예 55의 방법으로서, 생체 유체는 혈장 또는 혈청인 것인 방법. 57. 구체예 55의 방법으로서, 생체 유체는 뇌척수액인 것인 방법. 58. 구체예 54-57 중 어느 하나의 방법으로서, 생체분자 코로나는 입자 유형을 샘플과 인큐베이션시킬 때 형성되며 제1 생체분자 코로나는 단백질을 포함하는 것인 방법. 59. 구체예 58의 방법으로서, 생체분자 코로나는 지질, 핵산, 다당, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법. 60. 구체예 54-59 중 어느 하나의 방법으로서, 단계 a) 전에 샘플을 고갈시키거나 분별함으로써 샘플로부터 고풍부성 단백질을 제거하는 단계를 포함하는 것인 방법. 61. 구체예 54-60 중 어느 하나의 방법으로서, 입자 유형은 나노입자, 마이크로입자, 미셸, 리포솜, 산화 철 입자, 그래핀 입자, 실리카 입자, 단백질-기반 입자, 폴리스티렌 입자, 은 입자, 금 입자, 금속 입자, 양자점, 초상자성 입자, 또는 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법. 62. 구체예 54-61 중 어느 하나의 방법으로서, 입자 유형은 초상자성 입자인 것인 방법. 63. 구체예 54-62 중 어느 하나의 방법으로서, 입자 유형은 표 1로부터 선택되는 것인 방법. 64. 구체예 1-63 중 어느 하나의 방법으로서, 분리는 자기 분리, 여과, 중력 분리, 또는 원심분리를 포함하는 것인 방법. 65. 구체예 1-64 중 어느 하나의 방법으로서, 접촉은 시험관내에서 일어나는 것인 방법. 66. 구체예 38-53 또는 55-65 중 어느 하나의 방법으로서, 방법은 생물학적 상태를 확인하기 위한 훈련된 알고리즘을 사용하여 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 처리하는 생체 유체의 생물학적 상태를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 67. 구체예 38-53 또는 55-66 중 어느 하나의 방법으로서, 생체 유체는 대상체로부터 분리되는 것인 방법. 68. 구체예 67의 방법으로서, 대상체는 인간인 것인 방법. 69. 구체예 67의 방법으로서, 대상체는 비인간 동물인 것인 방법. 70. 구체예 67-69 중 어느 하나의 방법으로서, 대상체는 상태를 가진 것인 방법. 71. 구체예 70의 방법으로서, 상태는 질환 상태인 것인 방법. 72. 구체예 71의 방법으로서, 질환 상태는 암인 것인 방법. 73. 구체예 72의 방법으로서, 암은 전립선암, 대장암, 폐암, 또는 유방암인 것인 방법. 74. 구체예 71의 방법으로서, 질환 상태는 알츠하이머병인 것인 방법. 75. 구체예 1-74 중 어느 하나의 방법으로서, 분리는 자기 분리, 칼럼-기반 분리, 여과, 회전 칼럼-기반 분리, 원심분리, 초원심분리, 밀도 또는 구배-기반 원심분리, 중력 분리, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함하는 것인 방법. 76. 생체 유체를 분석하는 방법으로서, 방법은: a) 생체 유체 수집 튜브에서 생체 유체를 입자 유형과 접촉시키는 단계로, 혈액 수집 튜브는 안정화 시약을 포함하고, 안정화 시약은 생체 유체의 세포 유리 핵산 분자를 안정화시키는 것인 단계; 및 b) 생체 유체 및 입자 유형을 생체 유체 수집 튜브에서 인큐베이션하여 생체 유체의 단백질의 입자 유형에의 결합을 허용함으로써, 입자 유형에 결합된 단백질을 포함하는 생체분자 코로나를 형성하는 단계로, 생체분자 코로나는 EDTA에서 보관되고 대조군 생체분자 코로나를 형성하는 것이 허용된 경우에 입자 유형이 생체 유체에서 인큐베이션될 때 또한 검출되는 단백질 집단을 포함하는 것인 단계를 포함하고; 생체 유체 및 입자 유형은 약 20℃ 내지 약 35℃의 생체 유체 수집 튜브에서 인큐베이션되며 생체분자 코로나의 단백질 집단의 50% 이상은 또한 대조군 생체분자 코로나에서 검출될 수 있다. 77. 구체예 76의 방법으로서, 생체분자 코로나의 단백질 집단의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상이 또한 대조군 생체분자 코로나에서 검출될 수 있는 것인 방법. 78. 구체예 76-77 중 어느 하나의 방법으로서, 단백질 집단의 적어도 하위세트는 입자 유형이 EDTA에서 보관된 경우 생체 유체에서 인큐베이션될 때보다 더 높은 풍부성에서 검출되는 것인 방법. 79. 구체예 76-78 중 어느 하나의 방법으로서, 단백질 집단의 적어도 5%는 입자 유형이 EDTA에서 보관된 경우 생체 유체에서 인큐베이션될 때보다 더 높은 풍부성에서 검출되는 것인 방법. 80. 구체예 76-79 중 어느 하나의 방법으로서, 단백질 집단의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%가 입자 유형이 EDTA에서 보관된 경우 생체 유체에서 인큐베이션될 때보다 더 높은 풍부성에서 검출되는 것인 방법. 81. 구체예 76-80 중 어느 하나의 방법으로서, 입자 유형이 EDTA에서 보관된 경우 생체 유체에서 인큐베이션될 때보다 더 낮은 검출 한계에서 생체분자 코로나의 단백질을 검정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 82. 구체예 76-81 중 어느 하나의 방법으로서, 인큐베이션은 실온에서 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 방법. 83. 구체예 76-82 중 어느 하나의 방법으로서, 인큐베이션은 최대 14일, 최대 13일, 최대 12일, 최대 11일, 최대 10일, 최대 9일, 최대 8일, 최대 7일, 최대 6일, 최대 5일, 최대 4일, 또는 최대 3일 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 방법. 84. 구체예 76-83 중 어느 하나의 방법으로서, 인큐베이션은 최대 14일 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는 것인 방법. 85. 구체예 76-84 중 어느 하나의 방법으로서, 생체분자 코로나는 대조군 생체분자 코로나에는 없는 독특한 단백질을 포함하는 것인 방법. 86. 구체예 76-85 중 어느 하나의 방법으로서, 생체분자 코로나는 적어도 100개의 구별되는 단백질, 적어도 200개의 구별되는 단백질, 적어도 300개의 구별되는 단백질, 적어도 400개의 구별되는 단백질, 적어도 500개의 구별되는 단백질, 적어도 1000개의 구별되는 단백질, 적어도 2000개의 구별되는 단백질, 또는 적어도 5000개의 구별되는 단백질을 포함하는 것인 방법. 87. 구체예 76-86 중 어느 하나의 방법으로서, 입자 유형은 100개 이상의 구별되는 단백질에 결합하는 것인 방법. 88. 구체예 86-87 중 어느 하나의 방법으로서, 생체 유체는 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 활액, 눈물, 타액, 전혈, 우유, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액, 폐 세척액, 땀, 열구액, 정액, 전립선액, 가래, 대변, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 기관지 흡인액, 유동화된 고체, 미세 바늘 흡인 샘플, 조직 균질액, 또는 세포 배양 샘플을 포함하는 것인 방법. 89. 구체예 86-88 중 어느 하나의 방법으로서, 생체 유체는 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 활액, 눈물, 타액, 전혈, 우유, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액, 폐 세척액, 땀, 열구액, 정액, 전립선액, 가래, 대변, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 기관지 흡인액, 유동화된 고체, 미세 바늘 흡인 샘플, 조직 균질액, 또는 세포 배양 샘플인 것인 방법. 90. 구체예 76-89 중 어느 하나의 방법으로서, 입자 유형을 생체 유체로부터 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 91. 구체예 90의 방법으로서, 분리는 자기 분리, 여과, 중력 분리, 또는 원심분리를 포함하는 것인 방법. 92. 구체예 76-91 중 어느 하나의 방법으로서, 생체분자 코로나 중의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 93. 구체예 76-92 중 어느 하나의 방법으로서, 대조군 생체분자 코로나 중의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 94. 구체예 76-93 중 어느 하나의 방법으로서, 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 것은 질량 분광분석, 겔 전기영동, 또는 액체 크로마토그래피를 포함하는 것인 방법. 95. 구체예 76-94 중 어느 하나의 방법으로서, 안정화 시약은 대사 억제제, 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, 뉴클레아제 억제제, 보존제, 또는 그것들의 조합을 포함하는 것인 방법. 96. 구체예 95의 방법으로서, 대사 억제제는 글리세르알데하이드, 다이하이드록시아세톤 포스페이트, 글리세르알데하이드 3-포스페이트, 1,3-비스포스포글리세레이트, 3-포스포글리세레이트, 2-포스포글리세레이트, 포스포에놀피루베이트, 피루베이트 및 글리세레이트 다이하이드록시아세테이트, 불화 나트륨, 또는 K2C2O4를 포함하는 것인 방법. 97. 구체예 95 또는 구체예 96의 방법으로서, 프로테아제 억제제는 안티펜, 아프로티닌, 카이모스타틴, 엘라스타티날, 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF), APMSF, TLCK, TPCK, 류펩틴, 대두 트립신 억제제, 인돌아세트산 (IAA), E-64, EDTA, 펩스타틴, VdLPFFVdL, 1,10-페난트롤린, 포스포라모돈, 아마스타틴, 베스타틴, 다이프로틴 A, 다이프로틴 B, 알파-2-마크로글로불린, 리마콩 트립신 억제제, 췌장 프로테아제 억제제, 또는 난백 오보스타틴 난백 시스타틴을 포함하는 것인 방법. 98. 구체예 95-97 중 어느 하나의 방법으로서, 포스파타제 억제제는 칼리쿨린 A, 노둘라린, NIPP-1, 마이크로시스틴 LR, 토토마이신, 오카다산, 칸타리딘, 마이크로시스틴 LR, 오카다산, 포스트리에신, 토토마이신, 칸타리딘, 엔도탈, 노둘라린, 사이클로스포린 A, FK 506/면역필린 복합체, 사이퍼메트린, 델타메트린, 펜발레레이트, bpV(phen), 데포스타틴, mpV(pic) DMHV, 또는 나트륨 오르토바나데이트를 포함하는 것인 방법. 99. 구체예 95-98 중 어느 하나의 방법으로서, 뉴클레아제 억제제는 다이에틸 피로카보네이트, 에탄올, 아우린트라이카르복실산 (ATA), 포름아미드, 바나딜-리보뉴클레오사이드 복합체, 마칼로이드, 에틸렌다이아민 테트라아세트산 (EDTA), 단백질 분해효소 K, 헤파린, 하이드록시아민-산소-제2 구리 이온, 벤토나이트, 암모늄 설페이트, 다이티오트레이톨 (DTT), 베타-머캡토에탄올, 시스테인, 다이티오에리트리톨, 트리스(2-카르복시에틸) 포스펜 염산염, 또는 Mg+2, Mn+2, Zn+2, Fe+2, Ca+2, 또는 Cu+2와 같은 이가 양이온을 포함하는 것인 방법. 100. 구체예 95-99 중 어느 하나의 방법으로서, 보존제는 다이아졸리디닐 우레아, 이미다졸리디닐 우레아, 다이메토일롤-5,5-다이메틸히단토인, 다이메틸롤 우레아, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-다이올, 옥사졸리딘, 나트륨 하이드록시메틸 글리시네이트, 5-하이드록시메톡시메틸-1-1아자-3,7-다이옥사비시클로[3.3.0]옥탄, 5-하이드록시메틸-1-1아자-3,7다이옥사비시클로[3.3.0]옥탄, 5-하이드록시폴리[메틸렌옥시]메틸-1-1아자-3,7다이옥사비시클로[3.3.0]옥탄, 또는 사차 아다만틴을 포함하는 것인 방법. 101. 구체예 76-100 중 어느 하나의 방법으로서, 생체 유체 수집 튜브는 혈액 수집 튜브인 것인 방법. 102. 구체예 76-101 중 어느 하나의 방법으로서, 입자 유형은 나노입자 또는 마이크로입자인 것인 방법. 103. 구체예 76-102 중 어느 하나의 방법으로서, 입자 유형은 나노입자, 마이크로입자, 미셸, 리포솜, 산화 철 입자, 그래핀 입자, 실리카 입자, 단백질-기반 입자, 폴리스티렌 입자, 은 입자, 금 입자, 금속 입자, 양자점, 초상자성 입자, 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인 방법. 104. 구체예 76-103 중 어느 하나의 방법으로서, 입자 유형은 표 1로부터 선택되는 것인 방법. 105. 구체예 76-104 중 어느 하나의 방법으로서, 생체 유체를 하나 이상의 추가 입자 유형과 접촉시키는 단계, 생체 유체를 하나 이상의 추가 입자 유형과 함께 인큐베이션하여 생체 유체의 단백질의 하나 이상의 추가 입자 유형에의 결합을 허용하고, 그로써 하나 이상의 추가 입자 유형에 결합된 단백질을 포함하는 하나 이상의 추가 생체분자 코로나를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 106. 구체예 105의 방법으로서, 하나 이상의 추가 입자 유형은 입자 유형의 생체분자 단백질 중의 단백질 집단과 구별되지만 중복되는 단백질 집단에 결합하는 것인 방법. 107. 구체예 105-106 중 어느 하나의 방법으로서, 생체 유체를 하나 이상의 추가 입자 유형과 접촉시키는 것은 생체 유체를 입자 유형과 접촉시키는 단계 후에 일어나는 것인 방법. 1. 복수의 생체 유체를 분석하는 방법으로서, 방법은: (a) 복수의 생체 유체의 각각의 생체 유체를 나노입자와 별도로 접촉시키는 단계; (b) 제1 나노입자를 분리하고 복수의 생체 유체의 제1 생체 유체에 상응하는 제1 단백질 코로나를 분석하는 단계; 및 (c) 제2 나노입자를 분리하고 복수의 생체 유체의 제2 생체 유체에 상응하는 제2 단백질 코로나를 분석하는 단계를 포함하고, 단계 (b) 및 단계 (c)는 동시에 일어난다. 2. 구체예 1의 방법으로서, 방법은 복수의 생체 유체를 제3 나노입자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 3. 구체예 1-2 중 어느 하나의 방법으로서, 방법은 복수의 생체 유체를 제4 나노입자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 4. 구체예 1-3 중 어느 하나의 방법으로서, 방법은 복수의 생체 유체를 제5 나노입자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 5. 구체예 1의 방법으로서, 제1 나노입자 및 제2 나노입자는 동일한 것인 방법. 6. 구체예 1의 방법으로서, 방법은 복수의 생체 유체를 최대 10개의 상이한 나노입자와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 7. 구체예 1의 방법으로서, 나노입자는 지질, 중합체, 금속, 또는 그것들의 임의의 조합으로부터 선택된 물질로 만들어지는 것인 방법. 8. 구체예 7의 방법으로서, 중합체는 PS, PLA, PGA, PLGA, 또는 PVP를 포함하는 것인 방법. 9. 구체예 7의 방법으로서, 지질은 EPC, DOPC, DOPG, 또는 DPPG를 포함하는 것인 방법. 10. 구체예 7의 방법으로서, 금속은 산화 철, 금, 또는 은을 포함하는 것인 방법. 11. 구체예 1의 방법으로서, 나노입자는 양의 표면 전하를 포함하는 것인 방법. 12. 구체예 1의 방법으로서, 나노입자는 음의 표면 전하를 포함하는 것인 방법. 13. 구체예 1의 방법으로서, 나노입자는 중성 표면 전하를 포함하는 것인 방법. 14. 구체예 1의 방법으로서, 나노입자는 1-400 nm의 크기를 포함하는 것인 방법. 15. 구체예 1의 방법으로서, 생체 유체는 혈장, 혈청, CSF, 소변, 눈물, 또는 타액을 포함하는 것인 방법. 16. 구체예 1의 방법으로서, 방법은 제1 생체 유체를 제1 나노입자와 접촉시킴으로써 확인된 제1 대조군 단백질 코로나에 제1 단백질 코로나를 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 17. 구체예 1의 방법으로서, 방법은 제2 생체 유체를 제2 나노입자와 접촉시킴으로써 확인된 제2 대조군 단백질 코로나에 제2 단백질 코로나를 비교하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 18. 구체예 1의 방법으로서, 방법은 제1 단백질 코로나를 제1 생물학적 상태에 연관시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 19. 구체예 1의 방법으로서, 방법은 제2 단백질 코로나를 제2 생물학적 상태에 연관시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 1. 대상체의 샘플의 생물학적 상태를 확인하는 방법으로서, 방법은: 샘플을 고갈 나노입자와 인큐베이션함으로써, 고갈된 샘플을 생성하는 단계; 고갈된 샘플을 제1 나노입자와 인큐베이션하여 단백질 코로나를 생성하는 단계; 제1 나노입자와 관련된 단백질 코로나 중의 단백질에 상응하는 단백질 데이터를 생성하는 단계; 및 훈련된 알고리즘을 사용하여 단백질 데이터를 처리하여 대상체의 생물학적 상태를 확인하는 단계를 포함한다. 2. 대상체로부터의 단백질 샘플의 생물학적 상태를 확인하는 방법으로서, 방법은: 단백질 샘플을 분별함으로써, 단백질 샘플에 단백질의 하위세트를 포함하는 분별된 샘플을 생성하는 단계; 고갈된 샘플을 제1 나노입자와 인큐베이션하여 단백질 코로나를 생성하는 단계; 제1 나노입자와 관련된 단백질 코로나의 단백질에 상응하는 단백질 데이터를 생성하는 단계; 및 훈련된 알고리즘을 사용하여 단백질 데이터를 처리하여 대상체의 생물학적 상태를 확인하는 단계를 포함하며, 샘플을 분별하는 단계는 콘의 방법, 칼럼 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 원심분리, 여과, 한외여과 및 및 극저온 침전으로 이루어지는 군으로부터 선택된 방법으로 고풍부성 단백질을 분리하는 것을 포함한다. 3. 구체예 1의 방법으로서, 샘플을 고갈 나노입자와 인큐베이션하는 것은 샘플을 고갈 나노입자와 적어도 약 30분 동안 인큐베이션하고 샘플로부터 고갈 나노입자를 추출하는 것을 포함하는 것인 방법. 4. 구체예 3의 방법으로서, 샘플을 고갈 나노입자와 적어도 약 30분 동안 인큐베이션하고 고갈 나노입자를 샘플로부터 추출하는 것은 샘플로부터 적어도 약 80%의 고풍부성 단백질을 제거하는 것인 방법. 5. 구체예 1의 방법으로서, 고갈 나노입자와 관련된 단백질 코로나를 분석하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 6. 구체예 1의 방법으로서, 샘플을 고갈 나노입자와 인큐베이션하는 것은 샘플을 고갈 나노입자와 적어도 약 60분 동안 인큐베이션하고 고갈 나노입자를 샘플로부터 적어도 2회 추출하는 것을 포함하는 것인 방법. 7. 구체예 6의 방법으로서, 샘플을 고갈 나노입자와 적어도 약 60분 동안 인큐베이션하고 고갈 나노입자를 샘플로부터 적어도 2회 추출하는 것은 99%의 고풍부성 단백질을 제거하는 것인 방법. 8. 구체예 1 또는 2의 방법으로서, 고갈된 샘플 중의 제1 나노입자의 농도는 1-50 mg/mL인 것인 방법. 9. 구체예 1 또는 2의 방법으로서, 고갈된 샘플 중의 제1 나노입자의 농도는 2.5-10 mg/mL인 것인 방법. 10. 구체예 1의 방법으로서, 고갈 나노입자는 제1 나노입자로부터의 적어도 하나의 상이한 물리화학적 특성을 포함하는 것인 방법. 11. 구체예 10의 방법으로서, 상이한 물리화학적 특성은 크기, 표면 전하, 또는 화학적 모이어티를 포함하는 것인 방법. 12. 구체예 1 또는 2의 방법으로서, 제1 나노입자와 관련된 단백질 코로나 중의 단백질에 상응하는 단백질 데이터를 생성하는 것은 단백질 코로나 중의 각각의 독특한 단백질의 농도를 측정하고 단백질 코로나 중의 각각의 독특한 단백질의 농도를 생물학적 상태에 연관시키는 것을 포함하는 것인 방법. 13. 구체예 1 또는 2의 방법으로서, 대상체의 생물학적 상태를 확인하기 위하여 훈련된 알고리즘을 사용하여 단백질 데이터를 처리하는 것은 생물학적 상태를 생체분자 핑거프린트에 연관시키는 것을 포함하는 것인 방법. 14. 구체예 1 또는 2의 방법으로서, 샘플은 혈장 또는 혈청인 것인 방법. 15. 구체예 1의 방법으로서, 단백질 데이터를 처리하는 것은 단백질 코로나를 분석하거나, 고갈 전에 샘플을 분석하거나, 또는 고갈된 샘플을 분석하는 것을 포함하는 것인 방법. 16. 구체예 2의 방법으로서, 단백질 데이터를 처리하는 것은 단백질 코로나를 분석하거나, 분별 전에 샘플을 분석하거나, 또는 분별된 샘플을 분석하는 것을 포함하는 것인 방법. 17. 생물학적 샘플을 검정하는 방법으로서, (a) 복수의 생체분자를 포함하는 생물학적 샘플을 얻는 단계로, 복수의 생체분자는 단백질을 포함하는 것인 단계; (b) 크기, 전하, 소수성, 구조 및 친화성으로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 토대로 상기 생물학적 샘플을 풍부화하여 처리된 생물학적 샘플을 얻는 단계; (c) (b)의 상기 처리된 생물학적 생믈로부터 하나 이상의 나노입자의 도움으로 생체분자의 적어도 제1 하위세트 및 생체분자의 제2 하위세트를 생성하는 단계로, 생체분자의 상기 제1 하위세트는 상기 하나 이상의 나노입자와 관련되고 생체분자의 상기 제2 하위세트는 상기 하나 이상의 나노입자와 관련되지 않는 것인 단계; 및 (d) 생체분자의 적어도 상기 제1 하위세트 또는 생체분자의 제2 하위세트에 대해 별도로 하나 이상의 검정을 수행하는 단계를 포함하는 방법. 18. 구체예 17의 방법으로서, (e) 생체분자의 상기 제1 하위세트를 생체분자의 상기 제2 하위세트로부터 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법. 19. 구체예 17의 방법으로서, 상기 하나 이상의 검정은 질량 분광분석 및 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 검정을 포함하는 것인 방법. 20. 구체예 17의 방법으로서, 상기 하나 이상의 검정은 질량 분광분석을 포함하는 것인 방법. 21. 구체예 17의 방법으로서, 상기 생물학적 샘플을 풍부화하는 것은 상기 처리된 생물학적 샘플을 얻기 위한 분별을 포함하는 것인 방법. 22. 구체예 21의 방법으로서, 분별은 콘의 방법, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 원심분리, 여과, 한외여과 및 극저온 침전로 이루어지는 군으로부터 선택된 방법으로 고풍부성 단백질을 분리하는 것을 포함하는 것인 방법. 23. 구체예 17의 방법으로서, 상기 처리된 생물학적 샘플을 얻기 위하여 상기 생물학적 샘플을 풍부화하는 것은 하나 이상의 단백질을 고갈시키는 것을 포함하는 방법. 24. 구체예 17의 방법으로서, (b)에서, 하나 이상의 고갈 나노입자는 상기 처리된 생물학적 샘플을 얻기 위하여 사용되는 것인 방법. 25. 구체예 24의 방법으로서, (b)의 상기 하나 이상의 고갈 나노입자는 (c)의 상기 하나 이상의 나노입자와 상이한 것인 방법. 26. 구체예 17의 방법으로서, 상기 하나 이상의 검정은 상기 제1 하위세트에 대해 수행되고, 검정은 ELISA인 것인 방법. 27. 구체예 17의 방법으로서, 상기 생물학적 샘플은 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 눈물, 타액, 전혈, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액, 폐 세척액, 땀, 열구액, 정액, 전립선액, 가래, 활액, 대변, 섬유주액, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 및 기관지 흡인액으로 이루어지는 군으로부터 선택된 생체 유체인 것인 방법. 28. 구체예 17의 방법으로서, 상기 하나 이상의 검정은 단백질체학 데이터를 유발하고, 상기 단백질체학 데이터를 처리하여 생물학적 상태를 예측하는 것을 추가로 포함하는 것인 방법. 29. 구체예 28의 방법으로서, 상기 단백질체학 데이터를 상기 처리하는 것은 훈련된 알고리즘의 사용을 포함하고, 훈련된 알고리즘은 독립적인 세트의 생물학적 샘플을 사용하여 훈련되는 것인 방법. 30. 구체예 17의 방법으로서, 생체분자의 상기 제1 하위세트는 상기 하나 이상의 나노입자와 인큐베이션될 때 상기 하나 이상의 나노입자와 회합되어 단백질 코로나를 형성하는 것인 방법. 31. 구체예 17의 방법으로서, 상기 생물학적 샘플은 (a) 전에 고갈되는 것인 방법. 32. 구체예 17의 방법으로서, 생체분자의 상기 제1 하위세트 및 생체분자의 상기 제2 하위세트는 단백질을 포함하는 것인 방법.
실시예
다음의 실시예는 본원에 기술된 장치, 방법, 시스템, 및 키트의 범주에 대해 예시적이며 비제한적이다.
실시예 1
뇌척수액 (CSF) 단백질 코로나에서 단백질의 확인
이 실시예는 뇌척수액 (CSF) 단백질 코로나에서 단백질의 확인을 설명한다.
뇌척수액 (CSF) 샘플로부터 단백질 코로나를 생성하기 위하여, 미세역가 플레이트에서 약 100 μL의 P39 입자를 약 100 μL의 순수 CSF와 혼합하였다. 플레이트를 밀봉하고 약 37℃에서 약 1시간 동안 300 rpm에서 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 플레이트를 자기 수집의 상부에 약 5분 동안 놓아 입자를 펠릿화하였다. 생물학적 샘플 중의 미결합 단백질을 피펫으로 제거하였다. 단백질 코로나를 자기 분리로 약 200 μL의 PBS로 3회 더 세척하였다.
입자 상에 결합된 단백질을 소화하기 위하여, 트립신 소화 키트 (iST 96X, PreOmics, Germany)를 제공된 프로토콜을 따라 사용하였다. 간단히 설명하면, 마지막 라운드의 세척 후에 완충액을 플레이트로부터 피펫으로 제거하고, 약 50 μL의 용해 완충액을 각 웰에 첨가하고 샘플을 약 95℃에서 약 10분 동안 교반하면서 가열하였다. 플레이트를 실온으로 냉각한 후, 트립신 소화 완충액을 첨가하고 플레이트를 약 37℃에서 약 3시간 동안 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 소화 과정을 중단 완충액으로 중단시켰다. 상층액을 입자로부터 자기 수집기에 의해 분리하고 키트에 포함된 펩타이드 클린업 카트리지에 의해 추가로 정화하였다. 펩타이드를 약 75 μL의 용출 완충액으로 2회 용출하여 조합하였다. 펩타이드 농도를 Pierce사로부터의 정량 열량측정 펩타이드 검정 키트에 의해 측정하였다.
펩타이드 용출액을 동결건조하고 약 0.1% TFA에 재구성하였다. 약 2 μg 분취액 (제출된 단백질 정량 값을 토대로 함)을 나노 LC/MS/MS에 의해 ThermoFisher Fusion Lumos에 인터페이스되어 있는 Waters NanoAcquity HPLC 시스템으로 분석하였다. 펩타이드를 트랩핑 칼럼 상에 로딩하고 75 μm 분석 칼럼에서 350 nL/분에서 용출하였다; 두 칼럼 모두 Luna C18 수지 (Phenomenex)로 패킹되었다. 또한 1시간 구배를 사용하여 획득한 샘플 33295를 제외한 모든 경우에 2시간 구배를 사용하였다. 질량 분광분석기를 데이터-의존 방식으로 작동시켰고, MS 및 MS/MS를 각각 60,000 FWHM 해상도 및 15,000 FWHM 해상도에서 Orbitrap에서 수행하였다. APD를 켰다. 기기를 MS 및 MS/MS에 대해 3초 사이클로 실행시켰다. 질량 분광분석 데이터를 MaxQuant 소프트웨어 v1.6.0.16을 통해 처리하였다. Swissprot를 사용하여 1% 단백질 및 펩타이드 허위 발견률 (FDR)로 단백질 확인을 검색하였다. 검출된 펩타이드에 대해 피크 영역을 계산하였다. MaxQuant 결과를 시각화를 위해 Scaffold 소프트웨어로 구문 분석하였다.
도 1은 상이한 CSF 샘플에서 확인된 단백질의 총 수를 도시한다. 10개의 개별 CSF 샘플 세트가 P39와 상호작용하여 질량 분광분석 분석의 경우 10개의 단백질 코로나가 생성되었다. 확인된 단백질의 총 수를 각 샘플에 대해 계수하였다: CSF1의 경우 - 약 710개 단백질; CSF2의 경우 - 약 850개 단백질; CSF3의 경우 - 약 620개 단백질; CSF4의 경우 - 약 760개 단백질; CSF5의 경우 - 약 700개 단백질; CSF6의 경우 - 약 620개 단백질; CSF7의 경우 - 약 690개 단백질; CSF8의 경우 - 약 760개 단백질; CSF9의 경우 - 약 710개 단백질; 및 CSF10의 경우 - 약 640개 단백질. 데이터는 혈장에서 동일한 입자로 얻어진 것보다 상당히 더 높은 수의 단백질을 보여준다. CSF 단백질은 그것의 대부분을 혈장에서 측정할 수 없기 때문에 함께 클러스터링된다.
도 2A 및 도 2B에서 알 수 있는 것과 같이, CSF 및 혈장/혈청 단백질 코로나는 샘플의 두 유형의 양호한 분리를 입증하였다. 혈청 또는 혈장 단백질 코로나의 4개 샘플이 열지도의 좌측 4개의 노드 상에서 클러스터링되었다. 모든 CSF 단백질 코로나는 열지도의 우측에서 클러스터링되었다. 또한, 도 3은 CSF 단백질 코로나 및 혈장 단백질 코로나와 관련된 스펙트럼 카운트를 보여준다.
도 4는 상이한 입자로부터 유래된 CSF 단백질 코로나에서 확인된 단백질의 총 수를 도시한다. 모아진 CSF 샘플을 모든 입자에 대해 사용하였다. 1000개 이상의 독특한 단백질이 모든 입자로 확인되었다.
실시예 2
소변 단백질 코로나에서 단백질의 확인
이 실시예는 소변 단백질 코로나에서 단백질의 확인을 설명한다.
소변 샘플로부터 단백질 코로나를 생성하기 위하여, 약 100 μL의 P39 입자를 미세역가 플레이트에서 100 μL의 순수 소변 샘플과 혼합하였다. 플레이트를 밀봉하고 37℃에서 1시간 동안 300 rpm에서 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 검정의 나머지는 실시예 1에서 기술된 것과 같이, CSF 단백질 코로나와 동일한 방식으로 수행하였다.
도 5에서 알 수 있는 것과 같이, 실질적인 수의 단백질을 각각의 소변 샘플에서 확인하였다. 도 5에서, 10개의 소변 샘플 (U1 내지 U10) 세트 및 1개의 대조군 혈장 샘플 (PC)이 P39와 상호작용하여 질량 분광분석 분석의 경우 11개의 단백질 코로나가 생성되었다. 각각의 소변 샘플에서 확인된 확인된 단백질의 총 수는 테스트한 모든 소변 샘플에 대해 혈장에서 확인된 단백질의 수보다 컸다.
실시예 3
펩타이드 코로나 확인을 위한 샘플 제조
이 실시예는 펩타이드 코로나의 확인을 위한 샘플 제조를 설명한다.
펩타이드 코로나로부터 단백질체학 데이터를 생성하기 위하여, 혈장 샘플을 트립신으로 소화시키기 전에 먼저 변성하고 환원시켰다. 결과적으로 얻어진 펩타이드를 미세역가 플레이트에서 약 100 μL의 상자성 입자와 인큐베이션하였다. 플레이트를 밀봉하고 37℃에서 1시간 동안 300 rpm에서 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 펩타이드 코로나를 자기 분리로 TE 완충액으로 3회 세척하였다. 결합된 펩타이드를 50%의 아세토니트릴 중의 1% TFA로 용출시켰다. 펩타이드 용출액을 동결건조하고 질량 분광분석 분석을 위해 제출하기 전에 0.1% TFA에 재구성하였다.
실시예 4
단백질 코로나의 다중 측정
이 실시예는 단백질 코로나의 다중 측정을 설명한다.
단백질 코로나를 두 가지 상이한 방법: 입자 혼합 및 소화 후 혼합으로 다중화할 수 있다.
입자 혼합으로, 입자를 거의 동등한 농도로 제조하고 사전 혼합한 후 미세역가 플레이트에 약 100 μL로 플레이팅하였다. 생물학적 샘플을 평소와 같이 제조하고 혼합물을 위아래로 적어도 약 10회 피펫팅하여 입자와 완전히 혼합하였다. 플레이트를 밀봉하고 37℃에서 1시간 동안 300 rpm에서 흔들어주면서 인큐베이션하였다. 검정의 나머지는 실시예 1에서 기술된 것과 같이, CSF 단백질 코로나와 동일한 방식으로 수행하였다.
소화 후 혼합으로, 단백질 코로나 검정을 상기에서 기술된 것과 같이, CSF 단백질 코로나와 동일한 방식으로 수행하였다. 소화된 펩타이드를 용출시킨 후에, 상이한 입자로부터 유래된 펩타이드를 조합하고 혼합한 후 동결건조하였다. 펩타이드 용출액을 동결건조하고 질량 분광분석 분석을 위해 제출하기 전에 0.1% TFA에 재구성하였다.
도 6A 및 도 6B는 입자 P39, HX42 및 HX56으로부터 유래된 단백질 코로나의 다중 측정으로부터 확인된 단백질을 도시한다. TE 완충액으로 5배 희석된 모아진 혈장 샘플을 입자 및 입자 조합에 대한 이 실험에서 사용하였다. 도 6A는 상이한 조건으로 확인된 단백질의 총 수를 도시한다. 단일 입자 단백질 코로나 (P39, HX42 및 HX56)로, 3개 입자에 대해 각각 234, 303 및 353개의 독특한 단백질을 확인할 수 있다. "P39+HX42+HX56"으로 표지된 칼럼에서 알 수 있는 것과 같이, 모든 입자를 별도로 실행시켰을 때 총 411개의 독특한 단백질을 확인하였다. 더 높은 농도 ("3NP_8", 8 mg/mL의 최종 총 NP 농도) 및 더 낮은 농도 ("3NP_3", 3 mg/mL의 최종 총 NP 농도)에서의 입자 혼합으로, 305 및 284개의 독특한 단백질을 확인하였다. 전부 3개의 단백질 코로나의 소화후 혼합 ("3NP_PM")으로, 303개의 독특한 단백질을 확인하였다. 도 6B는 별도로 실행된 입자 ("P39+HX42+HX56"), 입자 혼합 ("P39+HX42+HX56 NP 혼합"), 및 소화후 혼합 ("P39+HX42+HX56 소화 후 혼합") 사이의 단백질의 중복을 도시한다.
실시예 5
입자 단백질 코로나에서 다양한 단백질의 확인
이 실시예는 입자 단백질 코로나에서 다양한 단백질의 확인을 설명한다.
23개의 상이한 입자 유형의 코로나에서 확인한 단백질을 확인된 단백질의 세포 농도와 비교하였다.
도 7A는 생체 유체에서의 단백질체의 광범위한 범위를 도시한다. 이것은 광범위한 질문이 어렵고 느린 것을 보여준다. 단백질은 Geyer, et al. Mol Syst Biol 13, 942-15 (2017) (그 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 기술된 것과 같이 혈장 단백질체 프로젝트로부터 추출된 혈장 또는 혈청으로부터 확인된 단백질의 농도를 토대로 순위가 매겨진다. 도 7B는 본 개시의 입자 바이오센서 (X-축 표지 상에 및 도 7B의 우측의 설명에서 열거됨)가 깊이, 폭, 및 효율로 단백질체를 질문할 수 있음을 보여준다. 각각의 점은 상응하는 입자의 코로나에서 확인된 단백질 및 문헌에서 본 것과 같은 그 단백질의 혈장 농도를 나타낸다. 단백질을 많은 상이한 입자 유형의 단백질 코로나에서 광범위한 농도에서 확인할 수 있다. 입자 바이오센서는 그것의 넓은 동적 범위를 가로질러 단백질체를 신속하게 질문한다 (예컨대, 약 0.001 ug/ml 내지 거의 105 μg/ml의 농도에서 존재하는 단백질을 검정함으로써).
실시예 6
입자-기반 연속적인 질문 과정
이 실시예는 입자-기반 연속적인 질문 과정을 설명한다.
혈장을 제1 단계에서 다양한 입자로 질문하고, 새로운 또는 동일한 입자로 연속적으로 질문하여 미세한 변화를 추가로 찾아낸다. 그러한 연속적인 질문에 대한 작업 흐름의 예를 표 2에 제공한다. 입자 유형은 실험 설계에 따라 변할 수 있다.
입자를 사용하는 샘플 고갈에 대한 순서의 예
단계 단백질 공급원 입자 (NP)
1 희석된 혈장 NP1
2 NP1에 의해 질문된 혈장 NP1
3 NP1-NP1에 의해 질문된 혈장 NP1
4 NP1-NP1-NP-1에 의해 질문된 혈장 NP2
도 9는 입자로 연속적으로 질문된 혈장 샘플의 젤을 도시한다. 샘플을 P39 입자로 질문하였고, 입자를 추출하였고, 결과적으로 얻어진 코로나를 젤 상에서 실행하였다 (P39 코로나 1). 상층액을 P39 입자로 두 번째 및 세 번째로 질문하였고, 입자를 매번 추출하였으며, 결과적으로 얻어진 코로나를 젤 상에서 실행하였다 (P39 코로나 2 및 P39 코로나 3). 그런 후 상층액을 HX-42 입자로 질문하였고, 입자를 추출하였고, 결과적으로 얻어진 코로나를 젤 상에서 실행하였다 (P39 및 HX-42 코로나 4). 별도로, 샘플을 HX-42 입자로 질문하였고, 입자를 추출하였고, 결과적으로 얻어진 코로나를 젤 상에서 실행하였다 (HX-42 코로나 1). 상층액을 HX-42 입자로 두 번째 및 세 번째로 질문하였고, 입자를 매번 추출하였으며, 결과적으로 얻어진 코로나를 젤 상에서 실행하였다 (HX-42 코로나 2 및 HX-42 코로나 3). 그런 후 상층액을 P39 입자로 질문하였고, 입자를 추출하였고, 결과적으로 얻어진 코로나를 젤 상에서 실행하였다 (HX-42 및 P39 코로나 4). 분리된 입자를 8 M 우레아로 처리하여 단백질을 젤 상에서 실행될 입자로부터 방출시켰다. 8 M 우레아로 변성된 혈장 (HP1 우레아)을 대조군으로서 실행하였다.
도 9에서 알 수 있는 것과 같이, 다중 단계는 풍부한 단백질이 먼저 제거된 후 보다 다양한 단백질의 분석을 허용한다. 연속적인 질문 중에 상이한 코로나가 생성되었다. 단백질 코로나 상의 단백질 풍부성의 변화를 혈장 샘플 중의 고풍부성 단백질로도 관찰하였다.
실시예 7
고갈 및 연속적인 질문 검정
이 실시예는 고갈 검정과 이어지는 입자와의 연속적인 인큐베이션 및 검정을 설명한다.
고갈에 대해, EMD Millipore Sigma사로부터의 PureProteomeTM 인간 알부민/면역글루불린 고갈 키트를 사용하였다. 비드의 원래의 완충액을 제거하고, 비드를 TE로 2회 세척하고, 4배 희석된 혈장을 첨가하고 격력하게 혼합하였다. 그런 후, 비드와 혈장을 대략 실온에서 약 1시간 동안 회전시키면서 인큐베이션하였다. 상층액을 제거하였다.
제2 검정으로, 혈장 샘플을 자기 비드를 사용하여 알부민 및 면역글로불린 (Ig)에 대해 고갈시켰다. 고갈된 혈장을 (1) 가장 풍부한 단백질을 고갈시키고 (2) 중간 풍부성 단백질을 고갈시키기 위하여 두 HPLC 칼럼 시리즈를 사용하여 고갈시켰다. 고갈된 및 미고갈 샘플을 입자로 질문하여 단백질 코로나를 형성하였다.
도 10은 미고갈 및 고갈된 혈장으로부터 유래된 단백질 코로나가 겔 이미지를 토대로 입자에 결합된 상이한 단백질을 가진 것을 보여준다. 미고갈 또는 고갈된 혈장 샘플을 P39 입자로 질문하였고, 단백질 코로나를 검정하였다. 적색 화살표는 미고갈 대비 고갈된 혈장 샘플로부터 유래된 단백질 코로나가 상이한 단백질 (밴드로 예시됨)을 나타낸다. 입자를 8 M 우레아로 처리하여 단백질을 젤 상에서 실행될 입자로부터 방출시켰다.
실시예 8
스핀 칼럼을 사용한 고갈 과정
이 실시예는 스핀 칼럼을 사용한 고갈 과정을 설명한다.
스핀 칼럼을 사용한 고갈의 경우, 고갈 스핀 칼럼을 대략 실온으로 평형화하고, 100 μL의 샘플을 칼럼의 수지 슬러리에 직접 첨가하고, 혼합물을 칼럼에서 약 10분 동안 대략 실온에서 완만한 엔드 오버 에드 혼합으로 인큐베이션한 후, 혼합물을 1,000 x g에서 약 2분 동안 원심분리한다. 그런 후, 관통액을 수집한다.
실시예 9
활액 샘플의 단백질 고갈 및 코로나 분석
이 실시예는 활액 샘플의 단백질 고갈 및 코로나 분석을 설명한다.
활액 (SF) 샘플을 입자와 인큐베이션하여 입자 단백질 코로나를 형성하였다. 100 μL의 샘플을 100 μL의 입자와 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 입자를 자석을 사용하여 펠릿화하였다. 상층액을 피펫을 사용하여 제거하였다. 펠릿을 PBS로 세척하고 3회 재펠릿화하였다. 입자에 결합된 단백질을 트립신 소화 키트 (iST 96X, PreOmics, Germany)로 키트에 제공되고 실시예 1에서 요약한 프로토콜에 따라 소화시켰다. 펩타이드 농도를 Thermo Fisher Scientific사로부터의 정량 열량측정 펩타이드 검정 키트에 의해 측정하였다. 용출된 펩타이드에 대해 질량 분광분석을 실시예 1에서 기술된 방법을 따라 수행하였다.
도 11은 9개의 상이한 입자로 검정된 단일 활액 (SF) 샘플로부터의 코로나 분석 실험 결과를 보여준다. 특정 입자 처리는 x-축 상에 표시한다. 코로나 분석 ("프로테오그래프") 검정을 또한 대조군으로서 입자에 접촉되지 않은 활액 ("순수 SF")으로 실행하였다. 전부 9개의 입자에 의해 확인된 독특한 단백질의 수가 플롯화되었다 ("전부 NP").
막대 높이에 의해 나타낸 것과 같이, 각각의 입자-함유 코로나 샘플에 대해 1000개를 넘는 확인된 단백질을 검출하였다. 대조적으로, 순수 SF 음성 대조군에서는 334개의 확인된 단백질만이 검출되었다. 9개 입자 각각으로부터의 코로나 분석 결과를 조합했을 때, 3500개를 넘는 단백질을 검출하였다 ("전부 NP").
실시예 10
조직 및 미세 바늘 흡인 샘플의 단백질 고갈 및 코로나 분석
이 실시예는 조직 및 미세 바늘 흡인 샘플의 단백질 고갈 및 코로나 분석을 설명한다. 단백질 코로나를 제조하여 활액 샘플과 관련하여 실시예 9에서 기술한 것과 같이 조직 샘플 및 미세 바늘 흡인 (FNA) 샘플에 대해 분석하였다.
도 12는 입자로 검정된 두 유형의 샘플에 대한 코로나 분석 실험 결과를 도시한다. 미세 바늘 흡인 (FNA) 샘플을 25 G 바늘이 달린 1 mL 주사기를 사용하여 제조하였다. FNA 샘플을 포유류 단백질 추출 시약 (M-PER)으로 용해하였고 코로나 분석 전에 TE 완충액으로 완충액을 교체하였다. FNA에 의해 제공된 작은 질량으로 인해, FNA-코로나를 평가하기 위해 단일 입자 (P-039)를 사용하였다. 조직 샘플을 또한 M-PER로 용해하였고 코로나 분석 전에 TE 완충액으로 완충액을 교체하였다. 100 μL의 조직 샘플을 100 μL의 입자와 인큐베이션하여 조직-입자 코로나를 형성하였다. 펩타이드를 1시간 액체 크로마토그래피 (LC) 구배를 포함한 Orbitrap Lumos 기기 상에서 실행시켰다. 코로나 분석을 또한 대조군으로서 입자와 접촉되지 않은 순수 조직 샘플 상에서 ("조직 순수") 수행하였다.
실시예 11
단백질 코로나 분석 및 단백질 고갈
이 실시예는 단백질 코로나 분석 및 단백질 고갈을 설명한다. 단백질 코로나를 제조하여, 활액 샘플과 관련하여 실시예 9에서 기술한 것과 같이 매칭된 혈장 샘플 및 혈청 샘플에 대해 분석하였다. 고갈된 혈장을 (1) 가장 풍부한 단백질을 고갈시키고 (2) 중간 풍부성 단백질을 고갈시키기 위하여 두 HPLC 칼럼 시리즈를 사용하여 고갈시켰다.
도 13은 입자로 검정된 혈장 및 혈청 샘플의 매칭된 쌍으로부터의 코로나 분석 실험 결과를 도시한다. 둘 다 5배 희석의 혈장 및 혈청 (각각 "혈장 5X" 및 "혈청 5X") 및 미희석 혈장 및 혈청 (각각 "미희석 혈장" 및 "미희석 혈청")을 테스트하였다. 각 입자 처리에 대한 막대는, 좌측에서 우측으로, 혈장 5X, 혈장 순수, 혈청 5X, 혈청 순수, 및 고갈된 혈장에 상응한다. 추가적으로, 혈장 샘플의 분취액을 IgY14 및 수퍼믹스 칼럼으로 완전히 고갈시켰고 순수하고 희석된 샘플로 테스트하였다. 각각의 샘플을 별도의 웰에서 7개 입자의 각각에 대해 검정하였다. 입자가 없는 샘플 세트 ("NP 없음")를 또한 대조군으로서 테스트하였다.
실험은 더 큰 수의 단배길이 대부분의 입자 처리를 위해 고갈된 혈장 샘플에서 확인된 것을 입증하였다.
실시예 12
핵산 안정화제를 포함하는 혈액 수집 튜브에 수집된 샘플의 단백질 코로나 분석
이 실시예는 핵산 안정화제를 포함하는 혈액 수집 튜브에 수집된 샘플의 단백질 코로나 분석을 설명한다.
3명의 환자 (#1, #2, 및 #3)로부터의 혈액 샘플을 EDTA 혈액 수집 튜브 (BCT, BD Biosciences Product # 366643)에 수집하고 샘플 수집 후 1시간 내에 원심분리하고 냉동시켰다. 동일한 3명의 환자로부터의 혈액 샘플을 또한 Streck BCT에 수집하여 실온에서 밤새도록 부드럽게 흔들어주면서 저장한 후, 혈장을 처리하고 냉동시켰다. Streck 샘플 처리를 주변 온도에서 샘플의 밤새 운송을 시뮬레이션하기 위해 설계하였다. 도 33은 EDTA 샘플 수집 튜브 (좌측) 또는 Streck 샘플 수집 튜브 (우측)에 수집된 생물학적 샘플을 처리하는 방법을 요약한다.
도 14는 EDTA 혈액 수집 튜브에 수집된 혈액 샘플 ("EDTA")을 Streck 혈액 수집 튜브에 수집된 샘플 ("STRECK")에 비교하는 실험 결과를 도시한다. 회수된 펩타이드 질량의 분석을 3명의 환자로부터 수집된 혈액 샘플 (#1, #2, 및 #3)에 대해 수행하였다. 각각의 샘플을 입자로 ("P39 코로나") 및 입자 없이 ("순수 혈장") 검정되었다. 막대 높이는 각 샘플에서 회수된 평균 단백질 질량을 나타낸다. EDTA와 STRECK 혈장 코로나 사이에서 펩타이드 수율의 차이는 관찰되지 않았다. 입자에 접촉되지 않은 EDTA 및 Streck 혈장 샘플은 둘 다 유사한 펩타이드 질량을 유발하였다. 입자로 검정된 Streck 혈장 샘플은 또한 입자로 검정된 EDTA 혈장 샘플과 유사한 펩타이드 질량을 유발하여 관찰된 펩타이드 정량화의 전형적인 변동 계수를 나타냈다 (약 10% 내지 15%).
그런 후 EDTA BCT 또는 Streck BCT의 어느 하나에 수집된 샘플의 각각에 조재하는 단백질, 펩타이드, 및 특징의 수를 단백질 코로나 분석 검정을 사용하여 측정하였다. 도 15는 샘플에 대해 수행된 코로나 분석 실험에 의해 확인된 단백질의 평균 수를 도시한다. 막대 높이는 각 샘플에서 확인된 단백질의 평균 수를 나타낸다. EDTA와 STRECK 혈장 코로나 사이에서 확인된 단백질의 수에서 차이는 관찰되지 않았다. 입자에 접촉되지 않은 EDTA 및 Streck 혈장 샘플 둘 다에서 유사한 수의 단백질을 확인하였다. 입자로 검정된 EDTA 혈장 샘플과 비교하여 입자로 검정된 Streck 혈장 샘플에서 더 많은 단백질이 확인되었다.
도 16은 샘플에 대해 수행된 코로나 분석 실험에 의해 검출된 펩타이드의 평균 수를 도시한다. 막대 높이는 각 샘플에서 검출된 펩타이드의 평균 수를 나타낸다. EDTA와 STRECK 혈장 코로나 사이에서 확인된 펩타이드의 수에서 차이는 관찰되지 않았다. 입자로 검정된 EDTA 혈장 샘플과 비교하여 입자로 검정된 Streck 혈장 샘플에서 더 많은 단백질이 검출되었다.
도 17은 샘플에 대해 수행된 코로나 분석 실험에 의해 확인된 특징의 평균 수를 도시한다. 막대 높이는 각 샘플에서 확인된 특징의 평균 수를 나타낸다. EDTA와 STRECK 혈장 코로나 사이에서 특징의 수에 차이는 관찰되지 않았다. 입자로 검정된 EDTA 혈장 샘플과 비교하여 입자로 검정된 Streck 혈장 샘플에서 유사한 수의 특징이 검출되었다.
도 18은 도 14 - 도 17에서 제공된 실험 결과의 요약을 도시한다. 원형은 표시된 조건 하에서 각 샘플에서 확인된 단백질을 나타낸다. 원형의 중복되는 영역은 상응하는 EDTA 샘플 및 Streck 샘플 둘 다에서 확인된 단백질을 나타낸다. 원형의 비-중복 영역은 상응하는 조건 하에서 검정된 EDTA 샘플에서만 또는 Streck 샘플에서만 확인된 단백질을 나타낸다. 각 쌍에서 좌측을 향해 배치된 원형은 EDTA 샘플을 나타내고, 각 쌍에서 우측을 향해 배치된 원형은 Streck 샘플을 나타낸다. 각각의 환자 샘플 (#1, #2, 및 #3)은 입자의 부재 하에 검정된 Streck 샘플과 입자의 부재 하에 검정된 EDTA 샘플 사이에 유사한 수의 공통 단백질을 초래하였다. 입자로 검정된 Streck 샘플과 입자로 검정된 EDTA 샘플 사이의 공통 단백질의 유사한 수가 각각의 환자 샘플에서 확인된 한편, 입자로 검정된 EDTA 샘플보다 입자로 검정된 Streck 샘플에서 더 많은 독특한 단백질이 확인되었다.
도 19는 각각의 환자 샘플에서 코로나 분석에 의해 확인된 선택된 단백질 유형의 개별 단백질의 수를 도시한다. 입자로 검정된 Streck 샘플 ("Streck") 단독에서 또는 입자로 검정된 EDTA 샘플 ("EDTA") 단독에서 3명의 환자 샘플의 각각에서 확인된 선택된 단백질 유형의 단백질의 수를 플롯화한다. 입자로 검정된 Streck 샘플 및 입자로 검정된 EDTA 샘플 둘 다 ("중복")에서 3명의 환자 샘플의 각각에서 확인된 선택된 단백질 유형의 단백질의 수를 또한 플롯화한다. 확인된 당단백질, 핵-관련 단백질, DNA-관련 단백질, 및 RNA-관련 단백질의 수는 "중복" 데이터 중에 최고였고 Streck 샘플 및 EDTA 샘플에 의해 공유된 공통 단백질을 입증하였다.
도 20은 도 14 - 도 19에서 플롯화한 샘플에 대한 단백질 그룹 강도의 분포를 도시한다. EDTA 및 STRECK 혈장 샘플은 입자로 또는 입자 없이 검정되었을 때 유사한 펩타이드 수율, 단백질 수, 펩타이드 수, 특징 수 및 단백질 범주를 보였고, 이것은 단백질 코로나 분석 검정에서 핵산 안정화제를 포함하는 샘플 수집 튜브에 수집된 샘플의 적합성을 나타낸다.
도 21은 도 14 - 도 20에서 플롯화한 샘플에 대한 단백질 그룹 강도의 퍼센트 변동 계수 (% CV)를 도시한다. EDTA 및 STRECK 혈장 샘플은 입자로 또는 입자 없이 검정되었을 때 유사한 생산성을 보였고, 이것은 단백질 코로나 분석 검정에서 핵산 안정화제를 포함하는 샘플 수집 튜브에 수집된 샘플의 적합성을 나타낸다.
도 22A 및 도 22B는 입자의 존재 하에 검정된 도 14 - 도 21에서 플롯화한 샘플에서 확인된 공통 및 독특한 단백질의 수를 도시한다. 각 원형의 중복되는 영역에서의 수는 중복되는 원형에 의해 나타낸 각 샘플에서 확인된 단백질을 나타낸다. 도 22A는 EDTA 혈액 수집 튜브에 수집된 각 환자 샘플에서 확인된 공통 및 독특한 단백질의 수를 보여주고, 도 22B는 Streck 혈액 수집 튜브에 수집된 각 환자 샘플에서 확인된 공통 및 독특한 단백질의 수를 보여준다. Streck 혈액 수집 튜브 및 EDTA 혈액 수집 튜브에 수집된 샘플은 복제물 샘플 중에서 유사한 일관성을 입증하였다.
도 23은 도 14 - 도 22에서 플롯화한 샘플에 대한 단백질 그룹 강도의 변동 계수 (CV)를 도시한다.
도 24는 Streck 혈액 수집 튜브 및 EDTA 혈액 수집 튜브 둘 다에서 수집된 샘플에서 확인되고 도 14 - 도 23에서 플롯화한 공통 단백질 그룹의 강도의 플롯을 도시한다. Streck 샘플의 단백질 그룹 강도는 x-축 상에 플롯화한다. EDTA 샘플의 단백질 그룹 강도는 y-축 상에 플롯화한다. 환자 샘플 #1 (상부 플롯), #2 (중간 플롯), 및 #3 (하부 플롯)에 대한 단백질 그룹 강도를 입자의 존재 하에 (좌측 플롯, "유형=P39 코로나") 또는 부재 하에 (우측 플롯, "유형=순수 혈장") 어느 하나에 샘플에 대해 플롯화한다. 선형 피트의 R2 값 ("Rsq")을 각 플롯의 하부 우측 코너에 제공한다. 이들 결과는 단백질 그룹 강도가 모든 테스트된 조건 하에서 EDTA 혈액 수집 튜브 및 Streck 혈액 수집 튜브에서 수집된 샘플 간에 꽤 상관관계가 있음을 나타냈다.
도 25A 및 도 25B는 도 14 - 도 24에서 Streck 혈액 수집 튜브 및 EDTA 혈액 수집 튜브 둘 다에서 수집된 샘플에서 확인된 단백질 그룹의 수를 도시한다. 도 25A는 각 샘플에서 확인된 적어도 하나의 혈장 단백질을 함유하는 단백질 그룹의 수를 보여준다. 도 25B는 각 샘플에서 확인된 적어도 하나의 혈장 단백질을 함유하지 않은 각 샘플에서 확인된 단백질 그룹의 수를 보여준다. 혈장 단백질로서의 단백질의 분류는 Keshishian 등에 의해 확인된 (Mol. Cell Proteomics 14, 2375-2393 (2015), 그 전문이 본원에 참조로 포함됨) 5,304개의 혈장 단백질 세트를 토대로 하였다.
이들 검정은 단백질 커버리지가 핵산 안정화제를 포함하는 혈액 수집 튜브에 수집된 혈장으로부터 유래된 코로나 및 EDTA 혈액 수집 튜브에 수집된 혈장에서 실질적으로 유사한 것을 나타냈다. 단백질의 특정 그룹으로부터의 단백질, 예컨대 당단백질, 핵-관련 단백질, DNA-관련 단백질, 및 RNA-관련 단백질은 EDTA 혈액 수집 튜브에 수집된 혈장에서보다 핵산 안정화제를 포함하는 혈액 수집 튜브에 수집된 혈장에서 더 빈번하게 확인되었다. 이들 결과는 함께 핵산 안정화제를 포함하는 튜브 (예컨대, Streck 튜브)에 수집된 샘플이 단백질 코로나 분석에 적합한 것을 나타냈다.
실시예 13
핵산 안정화제를 포함하는 튜브에 수집된 폐암 샘플의 단백질 코로나 분석
이 실시예는 핵산 안정화제를 포함하는 튜브에 수집된 폐암 샘플의 단백질 코로나 분석을 설명한다.
샘플을 폐암 연구에 참여하는 대상체로부터 수집하였다. 각 대상체로부터의 샘플을 EDTA 혈장 수집 튜브 및 Streck 혈장 수집 튜브에 수집하였다. 수집한 샘플을 단백질 코로나 분석을 위해 처리하였다. EDTA 샘플 수집 튜브에 수집한 샘플을 현장에서 분석하였다. Streck 샘플 수집 튜브에 수집한 샘플을 밤새 운송하여 원격 시설에서 분석하였다. 20명의 대상체로부터의 샘플을 단일 입자 유형으로 분석하였다. 각 샘플을 삼중으로 검정하였다. MS 분석을 각 샘플 및 복제물에 대해 TF Lumos를 사용하여 1시간 데이터-의존성 획득 (DDA) 실행으로 수행하였다.
도 26은 EDTA 샘플 수집 튜브 ("EDTA") 또는 Streck 샘플 수집 튜브 ("Streck")에 수집된 생물학적 샘프에서 실험적으로 확인된 단백질의 중복을 도시한다. 더 많은 단백질이 EDTA 튜브에 수집된 샘플에서 확인된 한편, Streck 튜브에 수집된 샘플에서 확인된 단백질은 DTA 튜브에 수집된 샘플에서 확인된 단백질과 거의 완전하게 중복하였다.
도 27은 EDTA 샘플 수집 튜브에서 수집된 샘플 및 Streck 샘플 수집 튜브에서 수집된 샘플에서 확인된 단백질의 평균 단백질 그룹 강도를 도시한다. 단백질 그룹 강도를 Carr 혈장 단백질체 데이터베이스에 존재하는 단백질에 대해 플롯화하였고 EDTA 샘플 수집 튜브에서 수집된 샘플 (y-축) 및 Streck 샘플 수집 튜브에서 수집된 샘플 (x-축)에서 모두 확인하였다.
도 28A 및 도 28B는 도 27에서 확인된 115개의 단백질 그룹 사이의 Spearman (도 28A) 및 Pearson (도 28B) 상관 계수를 도시한다. Spearman 및 Pearson 상관 계수는 둘 다 EDTA 튜브에서 수집된 샘플과 Streck 튜브에서 수집된 샘플 사이의 단백질 그룹 강도의 강력한 양성 상관관계를 나타낸다. 이들 결과는 함께 Streck 튜브에서의 생물학적 샘플의 수집이 입자 샘플 제조 방법을 사용하는 대규모 단백질체 프로파일링에 적합한 것을 나타냈다.
실시예 14
뇌척수액 샘플의 연속적인 질문을 통한 코로나 분석
이 실시예는 뇌척수액 샘플의 연속적인 질문을 통한 코로나 분석을 설명한다. 뇌척수액 샘플을 대상체로부터 수집한다. 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 제1 입자 유형을 100 μL의 뇌척수액 샘플에 첨가하고 인큐베이션하여 단백질 코로나를 형성한다. 제1 입자 유형을 뇌척수액 샘플로부터 원심분리 또는 자기 풀다운에 의해 분리한다. 상층액을 수집한다. 입자를 함유한 펠릿을 세척 및 재현탁하고, 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 제2 입자 유형을 상층액에 첨가하고 인큐베이션하여 단백질 코로나를 형성한다. 선택적으로, 제2 입자 유형은 제1 입자 유형과 동일하다. 제2 입자 유형을 상층액으로부터 원심분리 또는 자기 풀다운에 의해 분리한다. 상층액을 수집한다. 입자를 함유한 펠릿을 세척 및 재현탁하고, 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 제3 입자 유형을 상층액에 첨가하고 인큐베이션하여 단백질 코로나를 형성한다. 선택적으로, 제3 입자 유형은 제1 입자 유형과 동일하다. 제3 입자 유형을 상층액으로부터 원심분리 또는 자기 풀다운에 의해 분리한다. 상층액을 수집한다. 입자를 함유한 펠릿을 세척 및 재현탁하고, 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 상층액을 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 최대 10개의 입자 유형으로 재질문하고, 각 입자 유형 상에 형성된 단백질 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 최대 10개의 입자 유형의 각각에서 형성된 단백질 코로나의 질량 분광분석 분석으로부터 단백질을 확인한다.
실시예 15
활액 샘플의 연속적인 질문을 통한 코로나 분석
이 실시예는 활액 샘플의 연속적인 질문을 통한 코로나 분석을 설명한다. 활액 샘플을 대상체로부터 수집한다. 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 제1 입자 유형을 100 μL의 활액 샘플에 첨가하고 인큐베이션하여 단백질 코로나를 형성한다. 제1 입자 유형을 활액 샘플로부터 원심분리 또는 자기 풀다운에 의해 분리한다. 상층액을 수집한다. 입자를 함유한 펠릿을 세척 및 재현탁하고, 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 제2 입자 유형을 상층액에 첨가하고 인큐베이션하여 단백질 코로나를 형성한다. 선택적으로, 제2 입자 유형은 제1 입자 유형과 동일하다. 제2 입자 유형을 상층액으로부터 원심분리 또는 자기 풀다운에 의해 분리한다. 상층액을 수집한다. 입자를 함유한 펠릿을 세척 및 재현탁하고, 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 제3 입자 유형을 상층액에 첨가하고 인큐베이션하여 단백질 코로나를 형성한다. 선택적으로, 제3 입자 유형은 제1 입자 유형과 동일하다. 제3 입자 유형을 상층액으로부터 원심분리 또는 자기 풀다운에 의해 분리한다. 상층액을 수집한다. 입자를 함유한 펠릿을 세척 및 재현탁하고, 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 상층액을 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 최대 10개의 입자 유형으로 재질문하고, 각 입자 유형 상에 형성된 단백질 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 최대 10개의 입자 유형의 각각에서 형성된 단백질 코로나의 질량 분광분석 분석으로부터 단백질을 확인한다.
실시예 16
균질화된 조직 샘플의 연속적인 질문을 통한 코로나 분석
이 실시예는 균질화된 조직 샘플의 연속적인 질문을 통한 코로나 분석을 설명한다. 균질화된 조직 샘플을 대상체로부터 수집한다. 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 제1 입자 유형을 100 μL의 균질화된 조직 샘플에 첨가하고 인큐베이션하여 단백질 코로나를 형성한다. 제1 입자 유형을 균질화된 조직 샘플로부터 원심분리 또는 자기 풀다운에 의해 분리한다. 상층액을 수집한다. 입자를 함유한 펠릿을 세척 및 재현탁하고, 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 제2 입자 유형을 상층액에 첨가하고 인큐베이션하여 단백질 코로나를 형성한다. 선택적으로, 제2 입자 유형은 제1 입자 유형과 동일하다. 제2 입자 유형을 상층액으로부터 원심분리 또는 자기 풀다운에 의해 분리한다. 상층액을 수집한다. 입자를 함유한 펠릿을 세척 및 재현탁하고, 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 제3 입자 유형을 상층액에 첨가하고 인큐베이션하여 단백질 코로나를 형성한다. 선택적으로, 제3 입자 유형은 제1 입자 유형과 동일하다. 제3 입자 유형을 상층액으로부터 원심분리 또는 자기 풀다운에 의해 분리한다. 상층액을 수집한다. 입자를 함유한 펠릿을 세척 및 재현탁하고, 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 상층액을 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 최대 10개의 입자 유형으로 재질문하고, 각 입자 유형 상에 형성된 단백질 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 최대 10개의 입자 유형의 각각에서 형성된 단백질 코로나의 질량 분광분석 분석으로부터 단백질을 확인한다.
실시예 17
혈장 샘플의 연속적인 질문을 통한 코로나 분석
이 실시예는 혈장 샘플의 연속적인 질문을 통한 코로나 분석을 설명한다. 혈장 샘플을 대상체로부터 수집한다. 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 제1 입자 유형을 100 μL의 혈장 샘플에 첨가하고 인큐베이션하여 단백질 코로나를 형성한다. 제1 입자 유형을 혈장 샘플로부터 원심분리 또는 자기 풀다운에 의해 분리한다. 상층액을 수집한다. 입자를 함유한 펠릿을 세척 및 재현탁하고, 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 제2 입자 유형을 상층액에 첨가하고 인큐베이션하여 단백질 코로나를 형성한다. 선택적으로, 제2 입자 유형은 제1 입자 유형과 동일하다. 제2 입자 유형을 상층액으로부터 원심분리 또는 자기 풀다운에 의해 분리한다. 상층액을 수집한다. 입자를 함유한 펠릿을 세척 및 재현탁하고, 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 제3 입자 유형을 상층액에 첨가하고 인큐베이션하여 단백질 코로나를 형성한다. 선택적으로, 제3 입자 유형은 제1 입자 유형과 동일하다. 제3 입자 유형을 상층액으로부터 원심분리 또는 자기 풀다운에 의해 분리한다. 상층액을 수집한다. 입자를 함유한 펠릿을 세척 및 재현탁하고, 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 상층액을 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 최대 10개의 입자 유형으로 재질문하고, 각 입자 유형 상에 형성된 단백질 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 최대 10개의 입자 유형의 각각에서 형성된 단백질 코로나의 질량 분광분석 분석으로부터 단백질을 확인한다.
실시예 18
소변 샘플의 연속적인 질문을 통한 코로나 분석
이 실시예는 소변 샘플의 연속적인 질문을 통한 코로나 분석을 설명한다. 소변 샘플을 대상체로부터 수집한다. 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 제1 입자 유형을 100 μL의 소변 샘플에 첨가하고 인큐베이션하여 단백질 코로나를 형성한다. 제1 입자 유형을 소변 샘플로부터 원심분리 또는 자기 풀다운에 의해 분리한다. 상층액을 수집한다. 입자를 함유한 펠릿을 세척 및 재현탁하고, 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 제2 입자 유형을 상층액에 첨가하고 인큐베이션하여 단백질 코로나를 형성한다. 선택적으로, 제2 입자 유형은 제1 입자 유형과 동일하다. 제2 입자 유형을 상층액으로부터 원심분리 또는 자기 풀다운에 의해 분리한다. 상층액을 수집한다. 입자를 함유한 펠릿을 세척 및 재현탁하고, 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 제3 입자 유형을 상층액에 첨가하고 인큐베이션하여 단백질 코로나를 형성한다. 선택적으로, 제3 입자 유형은 제1 입자 유형과 동일하다. 제3 입자 유형을 상층액으로부터 원심분리 또는 자기 풀다운에 의해 분리한다. 상층액을 수집한다. 입자를 함유한 펠릿을 세척 및 재현탁하고, 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 상층액을 표 1에 제공된 입자로부터 선택한 최대 10개의 입자 유형으로 재질문하고, 각 입자 유형 상에 형성된 단백질 코로나를 질량 분광분석에 의해 분석한다. 최대 10개의 입자 유형의 각각에서 형성된 단백질 코로나의 질량 분광분석 분석으로부터 단백질을 확인한다.
실시예 19
핵산 안정화제를 포함하는 EDTA 또는 혈액 수집 튜브에서 수집된 혈장 샘플에서 ELISA에 의한 단백질 검출
이 실시예는 핵산 안정화제를 포함하는 EDTA 또는 혈액 수집 튜브에서 수집된 혈장 샘플에서 ELISA에 의한 단백질 검출을 설명한다. 혈장 샘플을 인간 대상체로부터 EDTA 혈액 수집 튜브 또는 Streck 혈액 수집 튜브로 수집한다. 쌍을 이룬 EDTA 및 Streck 샘플을 비교를 위해 20명의 환자 각각으로부터 수집하였다. 3개의 매우 중요한 단백질인 C-반응성 단백질 (CRP), 칼그라뉼린 A 및 B ("S100"), 및 MUC16/CA125 ("CA125")의 농도를 각 샘플에서 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 측정하였다. CRP는 혈액 혈장에서 발견되는 펜타머 단백질로, 그것의 순환 농도는 염증에 반응하여 상승한다. 상승된 수준의 CRP는 임의의 유형의 암, 폐암, 및 아마도 대장암의 미래의 증가된 위험과 관련된다. 칼그라뉼린 A 및 B는 활성화된 면역 세포, 예컨대 단핵세포, 과립구, 및 호중구에 의해 헤테로다이머 형태로 분비되며 류머티스성 관절염과 같은 염증성 질환, 및 일부 유형의 암에서 다량으로 발현되는 칼슘-결합 단백질이다. CA125는 안구 표면, 호흡기관 및 여성 생식기 관의 구성요소이며 여러 상이한 메커니즘에 의해 종양생성 및 종양 증식을 진행시키는 데 역할을 하는 것으로 밝혀졌다.
단백질 농도를 각 단백질에 대해 특이적인 상업적으로 이용 가능한 키트를 사용하여 측정하였다. CRP를 인간 C-반응성 단백질/CRP 키트 (R&D Systems, Inc.)를 사용하여 검출하였고, S100을 인간 S100A8/S100A9 헤테로다이머 키트 (R&D Systems, Inc.)를 사용하여 검출하였으며, CA125를 인간 CA125/MUC16 키트 (R&D Systems, Inc.)를 사용하여 검출하였다. 도 30A - 도 30C는 EDTA 혈액 수집 튜브에서 수집된 혈장 샘플 (x-축) 및 Streck 샘플 수집 튜브에서 수집된 혈장 샘플 (y-축) 사이의 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 측정된 3개의 단백질 농도의 상관관계를 도시한다. 도 30A는 C-반응성 단백질 (CRP)의 상관관계를 보여준다. 도 30B는 칼그라뉼린 A 및 B 헤테로다이머 ("S100")의 상관관계를 보여준다. 도 30C는 MUC16/CA125 ("CA125")의 상관관계를 보여준다. 각 샘플의 단백질 농도를 이중으로 측정하고 2회 반복 사이에서 평균을 구하였다. CRP, S100, 및 CA125의 농도는 EDTA 혈액 수집 튜브에서 수집된 샘플과 Streck 혈액 수집 튜브에서 수집한 샘플 사이에서 꽤 상관이 있었다. 도 31은 EDTA 혈액 수집 튜브 또는 Streck 혈액 수집 튜브 중 어느 하나에서 수집된 혈장 샘플에서 ELISA에 의해 검출된 단백질 농도의 CRP (좌측 2개의 박스와 수염), S100 (중간 2개의 박스와 수염), 및 CA125 (우측 2개의 박스와 수염)의 퍼센트 변동 계수 (% CV)를 도시한다. 단백질 농도의 퍼센트 변동 계수는 EDTA 혈액 수집 튜브에서 수집된 샘플 및 Streck 혈액 수집 튜브에서 수집한 샘플 사이에서 일관되었다. 도 32는 CRP (좌측 플롯), S100 (중간 플롯), 및 CA125 (우측 플롯)에 대하여 EDTA 혈액 수집 튜브 또는 Streck 혈액 수집 튜브 중 어느 하나에서 수집된 샘플에서 ELISA에 의해 검출된 단백질 농도의 매칭된 쌍의 차이를 도시한다. EDTA 혈액 수집 튜브에서 수집된 샘플 및 Streck 혈액 수집 튜브에서 수집한 샘플의 단백질 농도의 차이는 낮았다.
실시예 20
단백질 코로나 분석을 사용하는 혈장의 동적 범위 압축
이 실시예는 단백질 코로나 분석을 사용하는 혈장의 동적 범위 압축을 설명한다.
측정된 동적 범위를 압축하는 입자의 능력을 평가하기 위하여, 측정되고 확인된 단백질 특징 강도를 동일한 단백질의 농도에 대해 공개된 값과 비교하였다. 먼저, 각 단백질에 대한 결과적으로 얻어진 펩타이드 특징을 단백질에 대한 모든 가능한 특징의 최대 MS-측정된 강도로 선택한 후 (단일 동위원소 피크 값을 추출하기 위해 OpenMS MS 데이터 처리 도구를 사용함), 동일한 단백질에 대해 공개된 풍부성에 대해 모델화하였다. 도 34는 동일한 단백질의 공개된 농도에 대한 입자 코로나 단백질과 혈장 단백질의 최대 강도의 상관관계를 도시한다. 청색 플롯화된 선은 데이터에 대한 선형 회귀 모델이고 음영 영역은 모델 피트의 표준 오차를 나타낸다. 입자 ("S-003", "S-007", 및 "S-011")로 검정된 샘플의 동적 범위는 입자로 검정되지 않은 혈장 샘플 ("혈장")과 비교하여, 선형 피트의 기울기의 감소에 의해 나타난 바와 같이, 압축된 동적 범위를 나타냈다. 각 플롯의 기울기는 입자가 없는 혈장, S-003 입자가 있는 혈장, S-007 입자가 있는 혈장, 및 S-011 입자가 있는 혈장에 대해 각각 0.47, 0.19, 0.22, 및 0.18이다. 도 35는 입자 코로나 형성이 없는 질량 분광분석과 비교하여 질량 분광분석이 있는 단백질 코로나 분석 검정의 동적 범위 압축을 도시한다. 도 34에서 검정된 혈장 샘플 중의 입자 코로나에서 확인된 공통 단백질의 단백질 강도 ("나노입자 MS ln 강도")를 입자가 없는 혈장의 질?U 분광분석에 의해 확인된 단백질 강도 ("혈장 MS ln 강도")에 대해 플롯화한다. 가장 밝은 점선은 1의 기울기를 보이며, 입자가 없는 질량 분광분석의 동적 범위를 나타낸다. 단백질 강도에 대한 선형 피트의 기울기는 S-003, S-007, 및 S-011 입자에 대해 각각 0.12, 0.36, 및 0.093이었다. 회색 영역은 회귀 피트의 표준 오차 영역을 나타낸다.
회귀 모델 기울기와 측정된 데이터의 강도 범위를 비교함으로써, 입자 코로나는 혈장보다 (측정된 또는 보고된) 더 낮은 풍부성에서 더 많은 단백질을 함유한다. 그런 측정값의 동적 범위를 혈장 측정과 비교하여 입자 측정에 대해 압축하였다 (회귀 모델의 기울기가 감소됨). 이것은 혈장에서의 원래의 동적 범위와 비교하여 입자가 결과적으로 얻어진 코로나에서 풍부성에 대해 측정된 동적 범위를 효과적으로 압축할 수 있다는 이전 관찰과 일치하였고, 단백질의 절대 농도, 그것의 입자에 대한 결합 친화도, 및 인접한 단백질과의 상호작용의 조합에 기인한 것일 수 있다. 결과는 단백질 코로나 전략이 혈장 단백질, 특히 종래의 단백질체 기법에 의해 신속한 검출에 대한 도전이 되고 있는 저풍부성의 단백질의 광범위한 스펙트럼의 확인을 용이하게 했음을 나타냈다.
실시예 21
샘플의 병렬 질문과 비교한 연속적인 질문
이 실시예는 입자로의 샘플의 병렬 질문과 비교한 입자로의 샘플의 연속적인 질문을 설명한다.
10 μL의 낮은 샘플 부피를 가지는 제1 샘플을 둘 이상의 입자 유형으로 연속적으로 질문한다. 제1 입자 유형을 제1 샘플에 접촉시키고, 제1 샘플 및 제1 입자 유형을 인큐베이션하여 제1 입자 유형 상에서 제1 생체분자 코로나의 형성을 허용하며, 제1 입자 유형을 제1 샘플로부터 분리한다. 제1 샘플의 나머지를 제2 입자 유형에 접촉시키고, 제1 샘플의 나머지 및 제2 입자 유형을 인큐베이션하여 제1 입자 유형 상에서 제2 생체분자 코로나의 형성을 허용하며, 제2 입자 유형을 제1 샘플의 나머지로부터 분리한다. 접촉, 인큐베이션, 및 분리를 추가의 입자 유형으로 선택적으로 반복한다. 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 및 임의의 추가 입자 유형 상의 생체분자 코로나를, 예를 들어, 질량 분광분석에 의해, 코로나 중의 단백질에 대한 검정에 의해 분석한다.
제1 샘플과 동일한 공급원으로부터의 제2 샘플을 둘 이상의 입자 유형으로 병렬 질문하기 위해 10 μL의 다중 분취액으로 나눈다. 샘플을 단백질에 대한 검정 방법에서 사용될 입자 유형의 수 이상의 수의 분취액으로 나눈다. 제1 입자 유형을 제1 분취액에 접촉시키고, 제1 분취액 및 제1 입자 유형을 인큐베이션하여 제1 입자 유형 상에서 제1 생체분자 코로나의 형성을 허용하며, 제1 입자 유형을 제1 분취액으로부터 분리한다. 나란히, 제2 입자 유형을 제2 분취액에 접촉시키고, 제2 분취액 및 제2 입자 유형을 인큐베이션하여 제2 입자 유형 상에서 제2 생체분자 코로나의 형성을 허용하며, 제2 입자 유형을 제2 분취액으로부터 분리한다. 접촉, 인큐베이션, 및 분리를 추가의 분취액에서 추가의 입자 유형으로 수행한다. 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 및 임의의 추가 입자 유형 상의 생체분자 코로나를, 예를 들어, 질량 분광분석에 의해, 코로나 중의 단백질에 대한 검정에 의해 분석한다.
제1 샘플의 둘 이상의 입자 유형으로의 연속적인 질문은 단백질 코로나 분석에 대해, 검정될 입자 유형당 10 μL의 샘플 을 사용하는 제2 샘플의 병렬 질문보다 더 적은 샘플 부피 (총 10 μL)를 사용한다. 더 적은 총 샘플을 사용하지만, 제1 샘플의 연속적인 질문은 병렬 질문에 의해 검출된 범위와 비슷하거나 더 넓은 단백질 범위의 검출을 가능하게 한다. 도 9에서 알 수 있는 것과 같이, 입자 (예컨대, HX-42) 상에 형성된 생체분자 코로나는 또 다른 입자 유형으로 3 라운드의 연속적인 질문을 한 후의 샘플과 접촉되었을 때 ("P39 & HX-42 코로나 4")보다 먼저 샘플과 접촉될 때 ("HX-42 코로나 1") 상이한 단백질 집단을 함유할 수 있다. 제1 샘플의 연속적인 질문은 병렬 질문에 의해 검출된 범위와 비슷하거나 더 넓은 저풍부성 단백질의 범위의 검출을 가능하게 한다. 예를 들어, 제1 샘플의 연속적인 질문은 초기 라운드의 질문에서 저풍부성, 고친화성 단백질의 고갈을 초래할 수 있어서, 나중 라운드의 질문에서 사용된 입자 유형의 생체분자 코로나로의 저풍부성, 저친화성 단백질의 흡착을 허용한다.
본 개시의 바람직한 구체예가 본원에서 제시되고 기술되었지만, 그러한 구체예는 실시예에 의해서만 제공되는 것이 기술분야에 숙련된 사람들에게는 분명할 것이다. 수많은 변화, 변경, 및 치환이 개시로부터 벗어나지 않으면서 기술분야에 숙련된 사람들에게 이제 일어날 것이다. 본원에 기술된 개시의 구체예에 대한 다양한 대안이 개시의 실시에 사용될 수 있는 것이 이해되어야 한다. 다음의 청구범위는 개시의 범주를 정의하고 이들 청구범위 및 그것의 동등물의 범주 내에 있는 방법 및 구조는 그로 인해 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (107)

  1. 샘플을 연속적으로 질문하는 방법으로서, 방법은:
    a) 샘플을 제1 입자 유형과 접촉시키고 제1 입자 유형을 샘플과 인큐베이션하여 제1 생체분자 코로나를 형성하는 단계로, 제1 생체분자 코로나는 제1 입자 유형을 샘플과 인큐베이션할 때 형성되며 제1 생체분자 코로나는 단백질을 포함하는 것인 단계;
    b) 샘플로부터 제1 생체분자 코로나를 포함하는 제1 입자 유형을 분리하는 단계;
    c) 샘플을 제2 입자 유형과 접촉시키고 제2 입자 유형을 샘플과 인큐베이션하여 제2 생체분자 코로나를 형성하는 단계로, 제2 생체분자 코로나는 제2 입자 유형을 샘플과 인큐베이션할 때 형성되며, 제2 생체분자 코로나는 단백질을 포함하고, 추가로 (i) 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 동일한 입자 유형이거나 또는 (ii) 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 상이한 것인 단계;
    d) 제2 생체분자 코로나를 포함하는 제2 입자 유형을 샘플로부터 분리하는 단계;
    e) 제1 생체분자 코로나 및 제2 생체분자 코로나를 검정하여 검정된 제1 생체분자 코로나 및 제2 생체분자 코로나를 토대로 샘플 중의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제1 생체분자 코로나를 형성하기 위하여 제1 입자 유형을 샘플과 인큐베이션시킬 때, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위에 비해 압축되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는:
    a) 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 더 높은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호; 및
    b) 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 더 낮은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호
    의 제1 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항에 있어서, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 최고 풍부성 단백질의 농도 대 최저 풍부성 단백질의 농도의 제1 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제2항에 있어서, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 상위 십분위 대 단백질의 하위 십분위의 제1 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제2항에 있어서, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 사분위수 범위의 범위를 포함하는 제1 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제2항에 있어서, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 동적 범위는 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 모든 농도 대비 샘플 중의 동일한 단백질의 공지된 농도의 플롯에서 피팅된 데이터의 기울기를 포함하는 제1 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제7항에 있어서, 샘플 중의 동일한 단백질의 공지된 농도는 데이터베이스로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위는:
    a) 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질의 더 높은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호; 및
    b) 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질의 더 낮은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호
    의 제2 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질 중의 최고 풍부성 단백질의 농도 대 최저 풍부성 단백질의 농도의 제2 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질 중의 단백질의 상위 십분위 대 단백질의 하위 십분위의 제2 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질의 단백질의 사분위수 범위의 범위를 포함하는 제2 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제2항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질 중의 단백질의 모든 농도 대비 샘플 중의 동일한 단백질의 공지된 농도의 플롯에서 피팅된 데이터의 기울기를 포함하는 제2 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 샘플 중의 동일한 단백질의 공지된 농도는 데이터베이스로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 범위를 압축하는 것은 제2 비율에 비해 감소된 제1 비율을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 감소된 제1 비율은 제2 비율보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 더 적은 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 제2 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계 또는 제2 생체분자 코로나의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계는 질량 분광분석을 수행하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 단계 a), b), 및 e)를 하나 이상의 추가 입자 유형으로 반복하여 하나 이상의 추가 생체분자 코로나를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 하나 이상의 추가 입자 유형은 제1 입자 유형 또는 제2 입자 유형과 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제19항에 있어서, 하나 이상의 추가 입자 유형은 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 또는 그것들의 조합과 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나는 샘플로부터의 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생체분자 코로나, 제2 생체분자 코로나, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나, 또는 그것들의 임의의 조합은 적어도 100개의 구별되는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생체분자 코로나, 제2 생체분자 코로나, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나, 또는 그것들의 임의의 조합은 적어도 200개의 구별되는 단백질, 적어도 300개의 구별되는 단백질, 적어도 400개의 구별되는 단백질, 적어도 500개의 구별되는 단백질, 적어도 1000개의 구별되는 단백질, 적어도 2000개의 구별되는 단백질, 또는 적어도 5000개의 구별되는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생체분자 코로나, 제2 생체분자 코로나, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나, 또는 그것들의 임의의 조합은 단백질의 상이한 조성, 단백질의 하위세트의 상이한 농도, 또는 그것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가 입자 유형을 샘플과 인큐베이션하여 하나 이상의 추가 생체분자 코로나가 형성될 때, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는, 총 단백질 분석 방법에 의해 측정되는 바, 샘플 중의 복수의 단백질의 동적 범위에 비해 압축되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는:
    a) 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 더 높은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호; 및
    b) 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 더 낮은 풍부성 단백질에 의해 생성된 신호
    의 추가 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제26항에 있어서, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는 하나 이상의 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 최고 풍부성 단백질의 농도 대 최저 풍부성 단백질의 농도의 추가 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제26항에 있어서, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는 하나 이상의 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 상위 십분위 대 단백질의 하위 십분위의 추가 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제26항에 있어서, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는 하나 이상의 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 사분위수 범위의 범위를 포함하는 추가 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제26항에 있어서, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 동적 범위는 하나 이상의 생체분자 코로나의 복수의 단백질 중의 단백질의 모든 농도 대비 샘플 중의 동일한 단백질의 공지의 농도의 플롯에서 피팅된 데이터의 기울기를 포함하는 추가 비율인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 샘플 중의 동일한 단백질의 공지된 농도는 데이터베이스로부터 얻어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 동적 범위를 압축하는 것은 제2 비율에 비해 감소된 추가 비율을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제33항에 있어서, 감소된 제1 비율은 제2 비율보다 적어도 1.1배, 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 3.5배, 적어도 4배, 적어도 5배, 또는 적어도 10배 더 적은 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제2항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 총 단백질 분석 방법은 샘플 중의 복수의 단백질의 질량 분광분석, 겔 전기영동, 또는 액체 크로마토그래피에 의한 직접 정량화를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 약 1000 μL 이하, 약 900 μL 이하, 약 800 μL 이하, 약 700 μL 이하, 약 600 μL 이하, 약 500 μL 이하, 약 400 μL 이하, 약 300 μL 이하, 약 200 μL 이하, 약 100 μL 이하, 약 50 μL 이하, 약 20 μL 이하, 약 10 μL 이하, 약 5 μL 이하, 약 2 μL 이하, 또는 약 1 μL 이하의 샘플 부피를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플은 생물학적 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 생물학적 샘플은 생체 유체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 생체 유체는 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 활액, 눈물, 타액, 전혈, 우유, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액, 폐 세척액, 땀, 열구액, 정액, 전립선액, 가래, 대변, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 기관지 흡인액, 유동화된 고체, 미세 바늘 흡인 샘플, 조직 균질액, 및 세포 배양 샘플로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 생체 유체는 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제38항 또는 제39항에 있어서, 생체 유체는 뇌척수액인 것을 특징으로 하는 방법.
  42. 제19항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 하나 이상의 추가 입자 유형, 또는 그것들의 임의의 조합은 표 1로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 전에 샘플을 고갈시키거나 분별함으로써 고풍부성 단백질을 샘플로부터 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  44. 제19항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  45. 제19항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 생체분자 코로나, 제2 생체분자 코로나, 하나 이상의 추가 생체분자 코로나, 또는 그것들의 임의의 조합은 지질, 핵산, 다당, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  46. 제19항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 또는 하나 이상의 추가 입자 유형은 적어도 하나의 물리화학적 특성이 상이한 것을 특징으로 하는 방법.
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 적어도 하나의 물리화학적 특성이 상이하고 제1 생체분자 코로나는 제2 생체분자 코로나에 비해 구별되지만 중복되는 단백질 세트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 복수의 단백질의 조성 및 복수의 단백질의 단백질 농도는 제1 생체분자 코로나 및 제2 생체분자 코로나 중의 구별되지만 중복되는 단백질 세트를 토대로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  49. 제19항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 하나 이상의 추가 입자 유형, 또는 그것들의 임의의 조합은 나노입자, 마이크로입자, 미셸, 리포솜, 산화 철 입자, 그래핀 입자, 실리카 입자, 단백질-기반 입자, 폴리스티렌 입자, 은 입자, 금 입자, 금속 입자, 양자점, 초상자성 입자, 또는 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  50. 제1항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 하나 이상의 추가 입자 유형, 또는 그것들의 임의의 조합은 초상자성 입자인 것을 특징으로 하는 방법.
  51. 제1항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 입자 유형, 제2 입자 유형, 하나 이상의 추가 입자 유형, 또는 그것들의 임의의 조합은 표 1로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제1항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 동일한 입자 유형이고 제1 생체분자 코로나 및 제2 생체분자 코로나에서 검정된 단백질의 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%는 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제1항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 입자 유형 및 제2 입자 유형은 상이하고 제1 생체분자 코로나 및 제2 생체분자 코로나에서 검정된 단백질의 70% 이하, 80% 이하, 90% 이하, 또는 95% 이하는 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 복수의 생체 유체를 분석하는 고처리량 방법으로서, 방법은:
    a) 복수의 생체 유체의 제1 생체 유체 및 제2 생체 유체를 입자 유형과 접촉시키는 단계;
    b) 제1 부피에서, 입자 유형을 복수의 생체 유체의 제1 생체 유체로부터 분리하고 입자 유형에 상응하는 제1 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계; 및
    c) 제2 부피에서, 입자 유형을 복수의 생체 유체의 제2 생체 유체로부터 분리하고 입자 유형에 상응하는 제2 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계를 포함하며,
    여기서 제1 생체 유체 및 제2 생체 유체는 상이한 생체 유체이다.
  55. 제54항에 있어서, 복수의 생체 유체의 생체 유체는 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 활액, 눈물, 타액, 전혈, 우유, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액, 폐 세척액, 땀, 열구액, 정액, 전립선액, 가래, 대변, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 기관지 흡인액, 유동화된 고체, 미세 바늘 흡인 샘플, 조직 균질액, 및 세포 배양 샘플로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 제55항에 있어서, 생체 유체는 혈장 또는 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제55항에 있어서, 생체 유체는 뇌척수액인 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제54항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 생체분자 코로나는 입자 유형을 샘플과 인큐베이션시킬 때 형성되며 제1 생체분자 코로나는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 생체분자 코로나는 지질, 핵산, 다당, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 a) 전에 샘플을 고갈시키거나 분별함으로써 샘플로부터 고풍부성 단백질을 제거하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제54항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 유형은 나노입자, 마이크로입자, 미셸, 리포솜, 산화 철 입자, 그래핀 입자, 실리카 입자, 단백질-기반 입자, 폴리스티렌 입자, 은 입자, 금 입자, 금속 입자, 양자점, 초상자성 입자, 또는 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제54항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 유형은 초상자성 입자인 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제54항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 유형은 표 1로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제1항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 분리는 자기 분리, 여과, 중력 분리, 또는 원심분리를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제1항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 접촉은 시험관내에서 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제38항 내지 제53항 또는 제55항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은 생물학적 상태를 확인하기 위한 훈련된 알고리즘을 사용하여 생체분자 코로나 중의 복수의 단백질의 조성 및 농도를 처리하는 생체 유체의 생물학적 상태를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제38항 내지 제53항 또는 제55항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 유체는 대상체로부터 분리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제67항에 있어서, 대상체는 비인간 동물인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제67항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체는 상태를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 상태는 질환 상태인 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제71항에 있어서, 질환 상태는 암인 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제72항에 있어서, 암은 전립선암, 대장암, 폐암, 또는 유방암인 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제71항에 있어서, 질환 상태는 알츠하이머병인 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 분리는 자기 분리, 칼럼-기반 분리, 여과, 회전 칼럼-기반 분리, 원심분리, 초원심분리, 밀도 또는 구배-기반 원심분리, 중력 분리, 또는 그것들의 임의의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 생체 유체를 분석하는 방법으로서, 방법은:
    a) 생체 유체 수집 튜브에서 생체 유체를 입자 유형과 접촉시키는 단계로, 혈액 수집 튜브는 안정화 시약을 포함하고, 안정화 시약은 생체 유체의 세포 유리 핵산 분자를 안정화시키는 것인 단계; 및
    b) 생체 유체 및 입자 유형을 생체 유체 수집 튜브에서 인큐베이션하여 생체 유체의 단백질의 입자 유형에의 결합을 허용함으로써, 입자 유형에 결합된 단백질을 포함하는 생체분자 코로나를 형성하는 단계
    를 포함하며, 생체분자 코로나는 EDTA에서 보관되고 대조군 생체분자 코로나를 형성하는 것이 허용된 경우에 입자 유형이 생체 유체에서 인큐베이션될 때 또한 검출되는 단백질 집단을 포함하는 것인 단계를 포함하고; 그리고
    생체 유체 및 입자 유형은 약 20℃ 내지 약 35℃의 생체 유체 수집 튜브에서 인큐베이션되며 생체분자 코로나의 단백질 집단의 50% 이상은 또한 대조군 생체분자 코로나에서 검출될 수 있다.
  77. 제76항에 있어서, 생체분자 코로나의 단백질 집단의 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 또는 90% 이상이 또한 대조군 생체분자 코로나에서 검출될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  78. 제76항 또는 제77항에 있어서, 단백질 집단의 적어도 하위세트는 입자 유형이 EDTA에서 보관된 경우 생체 유체에서 인큐베이션될 때보다 더 높은 풍부성에서 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  79. 제76항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 집단의 적어도 5%는 입자 유형이 EDTA에서 보관된 경우 생체 유체에서 인큐베이션될 때보다 더 높은 풍부성에서 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  80. 제76항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 집단의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 100%가 입자 유형이 EDTA에서 보관된 경우 생체 유체에서 인큐베이션될 때보다 더 높은 풍부성에서 검출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  81. 제76항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 유형이 EDTA에서 보관된 경우 생체 유체에서 인큐베이션될 때보다 더 낮은 검출 한계에서 생체분자 코로나의 단백질을 검정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  82. 제76항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션하는 것은 실온에서 인큐베이션하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  83. 제76항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션하는 것은 최대 14일, 최대 13일, 최대 12일, 최대 11일, 최대 10일, 최대 9일, 최대 8일, 최대 7일, 최대 6일, 최대 5일, 최대 4일, 또는 최대 3일 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  84. 제76항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 인큐베이션하는 것은 최대 14일 동안 인큐베이션하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  85. 제76항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 생체분자 코로나는 대조군 생체분자 코로나에는 없는 독특한 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  86. 제76항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 생체분자 코로나는 적어도 100개의 구별되는 단백질, 적어도 200개의 구별되는 단백질, 적어도 300개의 구별되는 단백질, 적어도 400개의 구별되는 단백질, 적어도 500개의 구별되는 단백질, 적어도 1000개의 구별되는 단백질, 적어도 2000개의 구별되는 단백질, 또는 적어도 5000개의 구별되는 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  87. 제76항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 유형은 100개 이상의 구별되는 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, 생체 유체는 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 활액, 눈물, 타액, 전혈, 우유, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액, 폐 세척액, 땀, 열구액, 정액, 전립선액, 가래, 대변, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 기관지 흡인액, 유동화된 고체, 미세 바늘 흡인 샘플, 조직 균질액, 또는 세포 배양 샘플을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  89. 제86항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 유체는 혈장, 혈청, 소변, 뇌척수액, 활액, 눈물, 타액, 전혈, 우유, 유두 흡인액, 관 세척액, 질액, 비강액, 귀액, 위액, 췌장액, 섬유주액, 폐 세척액, 땀, 열구액, 정액, 전립선액, 가래, 대변, 기관지 세척액, 면봉으로 닦은 액체, 기관지 흡인액, 유동화된 고체, 미세 바늘 흡인 샘플, 조직 균질액, 또는 세포 배양 샘플인 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 제76항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 유형을 생체 유체로부터 분리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  91. 제90항에 있어서, 분리는 자기 분리, 여과, 중력 분리, 또는 원심분리를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 제76항 내지 91항 중 어느 한 항에 있어서, 생체분자 코로나 중의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 제76항 내지 92항 중 어느 한 항에 있어서, 대조군 생체분자 코로나 중의 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 제76항 내지 93항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질의 조성 및 농도를 측정하는 것은 질량 분광분석, 겔 전기영동, 또는 액체 크로마토그래피를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 제76항 내지 94항 중 어느 한 항에 있어서, 안정화 시약은 대사 억제제, 프로테아제 억제제, 포스파타제 억제제, 뉴클레아제 억제제, 보존제, 또는 그것들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 제95항에 있어서, 대사 억제제는 글리세르알데하이드, 다이하이드록시아세톤 포스페이트, 글리세르알데하이드 3-포스페이트, 1,3-비스포스포글리세레이트, 3-포스포글리세레이트, 2-포스포글리세레이트, 포스포에놀피루베이트, 피루베이트 및 글리세레이트 다이하이드록시아세테이트, 불화 나트륨, 또는 K2C2O4를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 제95항 또는 제96항에 있어서, 프로테아제 억제제는 안티펜, 아프로티닌, 카이모스타틴, 엘라스타티날, 페닐메틸설포닐 플루오라이드 (PMSF), APMSF, TLCK, TPCK, 류펩틴, 대두 트립신 억제제, 인돌아세트산 (IAA), E-64, EDTA, 펩스타틴, VdLPFFVdL, 1,10-페난트롤린, 포스포라모돈, 아마스타틴, 베스타틴, 다이프로틴 A, 다이프로틴 B, 알파-2-마크로글로불린, 리마콩 트립신 억제제, 췌장 프로테아제 억제제, 또는 난백 오보스타틴 난백 시스타틴을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  98. 제95항 내지 97항 중 어느 한 항에 있어서, 포스파타제 억제제는 칼리쿨린 A, 노둘라린, NIPP-1, 마이크로시스틴 LR, 토토마이신, 오카다산, 칸타리딘, 마이크로시스틴 LR, 오카다산, 포스트리에신, 토토마이신, 칸타리딘, 엔도탈, 노둘라린, 사이클로스포린 A, FK 506/면역필린 복합체, 사이퍼메트린, 델타메트린, 펜발레레이트, bpV(phen), 데포스타틴, mpV(pic) DMHV, 또는 나트륨 오르토바나데이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  99. 제95항 내지 98항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레아제 억제제는 다이에틸 피로카보네이트, 에탄올, 아우린트라이카르복실산 (ATA), 포름아미드, 바나딜-리보뉴클레오사이드 복합체, 마칼로이드, 에틸렌다이아민 테트라아세트산 (EDTA), 단백질 분해효소 K, 헤파린, 하이드록시아민-산소-제2 구리 이온, 벤토나이트, 암모늄 설페이트, 다이티오트레이톨 (DTT), 베타-머캡토에탄올, 시스테인, 다이티오에리트리톨, 트리스(2-카르복시에틸) 포스펜 염산염, 또는 Mg+2, Mn+2, Zn+2, Fe+2, Ca+2, 또는 Cu+2와 같은 이가 양이온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  100. 제95항 내지 99항 중 어느 한 항에 있어서, 보존제는 다이아졸리디닐 우레아, 이미다졸리디닐 우레아, 다이메토일롤-5,5-다이메틸히단토인, 다이메틸롤 우레아, 2-브로모-2-니트로프로판-1,3-다이올, 옥사졸리딘, 나트륨 하이드록시메틸 글리시네이트, 5-하이드록시메톡시메틸-1-1아자-3,7-다이옥사비시클로[3.3.0]옥탄, 5-하이드록시메틸-1-1아자-3,7다이옥사비시클로[3.3.0]옥탄, 5-하이드록시폴리[메틸렌옥시]메틸-1-1아자-3,7다이옥사비시클로[3.3.0]옥탄, 또는 사차 아다만틴을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  101. 제76항 내지 100항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 유체 수집 튜브는 혈액 수집 튜브인 것을 특징으로 하는 방법.
  102. 제76항 내지 101항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 유형은 나노입자 또는 마이크로입자인 것을 특징으로 하는 방법.
  103. 제76항 내지 102항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 유형은 나노입자, 마이크로입자, 미셸, 리포솜, 산화 철 입자, 그래핀 입자, 실리카 입자, 단백질-기반 입자, 폴리스티렌 입자, 은 입자, 금 입자, 금속 입자, 양자점, 초상자성 입자, 그것들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  104. 제76항 내지 103항 중 어느 한 항에 있어서, 입자 유형은 표 1로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  105. 제76항 내지 104항 중 어느 한 항에 있어서, 생체 유체를 하나 이상의 추가 입자 유형과 접촉시키는 단계, 생체 유체를 하나 이상의 추가 입자 유형과 함께 인큐베이션하여 생체 유체의 단백질의 하나 이상의 추가 입자 유형에의 결합을 허용하고, 그로써 하나 이상의 추가 입자 유형에 결합된 단백질을 포함하는 하나 이상의 추가 생체분자 코로나를 형성하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  106. 제105항에 있어서, 하나 이상의 추가 입자 유형은 입자 유형의 생체분자 단백질 중의 단백질 집단과 구별되지만 중복되는 단백질 집단에 결합하는 것을 특징으로 하는 방법.
  107. 제105항 또는 제106항에 있어서, 생체 유체를 하나 이상의 추가 입자 유형과 접촉시키는 것은 생체 유체를 입자 유형과 접촉시키는 단계 후에 일어나는 것을 특징으로 하는 방법.
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