JP2009532340A - 神経変性疾患の治療 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、PP2Aの活性を高める方法および組成物におけるセレン酸またはその薬学的に許容される塩の使用に関する。本発明はまた、タウタンパク質のリン酸化を阻害または低減する方法、GSK3βの活性を阻害する方法および、特に、神経変性疾患を治療または予防する方法におけるセレン酸またはその薬学的に許容される塩の使用に関する。いくつかの態様で、本発明は、セレン酸またはその薬学的に許容される塩と、神経変性疾患を治療または予防する方法で使用するための他の治療法との併用に関する。
神経変性疾患とは、正常な脳機能を促進するニューロンを損傷することによって脳が自らまたは身体を制御する能力を損なわせることによって作用する数多くの障害を指す総称である。神経変性疾患は主に高齢者の疾病である。平均寿命が延びるとともに、全世界の人口がより長く生き、神経変性疾患を患う人の数が増大している。
本発明は、一部には、タンパク質ホスファターゼPP2Aの活性をセレン酸またはその薬学的に許容される塩への曝露によって高めることができるという発見に基づく。PP2Aの活性の増強は、タウタンパク質のリン酸化、特にリン酸化過剰を、二叉の手法、すなわち i) Aktを脱リン酸化および不活性化し、それによってGSK3βのリン酸化を低減し、その結果、タウタンパク質のリン酸化を低減すること、および ii) タウタンパク質の直接的脱リン酸化により、低減または阻害することができる。タウタンパク質のリン酸化、特にリン酸化過剰の低減は、ニューロンおよびグリア細胞中の異常なタウタンパク質の蓄積または沈着を低減または阻止し、したがって、神経変性障害の治療または予防で有用である。
1. 定義
断りない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似している、または同等である任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を記載する。本発明に関して、以下の用語を以下のように定義する。
本発明は、一部には、セレン酸またはその薬学的に許容される塩がPP2Aの活性を高めるのに有効であり、それが他方で、GSK3βによるタウタンパク質のリン酸化の低減および/またはタウタンパク質の脱リン酸化速度の増大を生じさせるという断定に基づく。本発明の方法は、一般に、ニューロンまたはグリア細胞中に存在するPP2Aを、PP2A活性増強量のセレン酸またはその薬学的に許容される塩に曝露することを含む。好適には、セレン酸のPP2A活性増強量は、セレン酸またはその薬学的に許容される塩の栄養量または栄養過剰量である。いくつかの態様で、セレン酸またはその薬学的に許容される塩の、特にセレン酸またはその塩の量は、1日約0.015mg/kg〜約20mg/kg、通常は約0.1mg/kg〜14mg/kg、0.07mg/kg〜6.5mg/kgまたは0.15mg/kg〜5mg/kg、たとえば1日0.07mg/kg〜2mg/kgである。
実施例1
間接的機構によってAktを脱リン酸化するセレン酸ナトリウム
セレン酸ナトリウムは無傷の前立腺癌細胞において一貫してAktの脱リン酸化を誘発する。このような脱リン酸化は、Aktタンパク質そのものに対する直接的な阻害効果の結果であるかもしれず、または、Aktリン酸化の負の調節因子をブーストする、または正の調節因子を阻害することにより、間接的に同様に達成することもできる。直接的機構と間接的機構とを区別するため、無細胞環境でAktリン酸化および活性に対するセレン酸ナトリウムの効果を測定した。PC3前立腺癌細胞を100mm皿で平板培養し、70〜80%密集したところで血清を夜通し欠乏させた。無傷の細胞中でのAktリン酸化に対する効果を測定するため、PC3細胞を、新鮮な無血清培地中、セレン酸ナトリウム500μMで1時間処理した。細胞を溶解させ、Akt Ser473リン酸化のレベルを、活性化特異的抗体を用いるイムノブロット分析によって測定し、発現したAktタンパク質のレベルに対して比較を実施した。精製Aktに対する効果を測定するため、同様に平板培養した、ただし非処理のPC3細胞を、タンパク質-タンパク質複合体の維持を最小限にする強力な細胞溶解緩衝液であるRIPA(ホスファターゼ阻害薬なし)中で溶解した。等しい量(40〜500μg)の全細胞溶解産物(WCL)からpan-Aktモノクロナール抗体を用いる免疫沈降によってAktを精製したのち、37℃のヒートブロック中、500μMセレン酸ナトリウムとともに1時間インキュベートした。そして、免疫沈降したタンパク質を分解し、活性化Aktのレベルを上記のイムノブロット分析によって測定した。図1Aは、PC3細胞に関して無傷の細胞および無細胞環境の両方における処理後のリン酸化Aktのレベルを比較する。無傷のPC3細胞を500μMセレン酸ナトリウムで1時間処理した結果、Aktリン酸の大幅な低減が生じた。
PP2Aのホスファターゼ活性を刺激することによってAktを脱リン酸化するセレン酸ナトリウム
正味Akt活性の低下は、初期Aktリン酸を防ぐことにより、または、Akt脱リン酸化を高めることにより、間接的に達成することができる[Kohn et. al. 1996]。しかし、セレン酸ナトリウムによって誘発されるAktリン酸化の二相性応答(初期の一過性ブーストののち深く持続性の低下がある)を考慮すると、セレン酸ナトリウムが、単に上流側キナーゼがAktをリン酸化する能力を下げることによって作用したとは考えにくい。したがって、セレン酸ナトリウムがAkt脱リン酸化を誘発する能力に対するタンパク質ホスファターゼ阻害の効果を測定した。まず、Akt脱リン酸化の調節に関与する二つのホスファターゼであるリンタンパク質ホスファターゼPP1およびPP2Aを阻害する、赤潮藻類からのポリエーテル毒素(かつ、下痢性貝毒の原因)である、オカダ酸を使用した[Fernandez et al., 2002]。PC3前立腺癌細胞5×105個を6穴プレートの各穴で平板培養し、8時間付着させたのち、血清を夜通し欠乏させた。新鮮な無血清培地中、オカダ酸5nMまたは1000nMを用いて、または用いずに細胞を30分間前処理したのち、1時間かけてセレン酸ナトリウムを500μMの最終濃度まで加えた。溶解した細胞をSDS-PAGEによって分解したのち、Ser473残基でのAktリン酸化に関し、この部位でリン酸化されたときAktを特異的に認識する抗体を用いるイムノブロット分析によってプロービングし、発現したAktタンパク質の全レベルに関して比較を実施した(図2A)。PTEN欠失PC3細胞をセレン酸ナトリウムで処理すると、予想どおり、この細胞株で認められる慢性的に高いレベルのAktリン酸化が顕著に低下し、この低下は、5nMオカダ酸との事前のインキュベーションによる影響を受けない。対照的に、オカダ酸1000nMでの前処理は、非セレン酸対照でAktリン酸化をブーストするだけでなく、セレン酸ナトリウムの阻害効果を完全に消滅させる。
PP2Aコア二量体のホスファターゼ活性を直接ブーストするセレン酸ナトリウム
PP2Aのコア構造は、36kDa触媒サブユニット(PP2Ac)および65kDa調節サブユニット(PR65またはAサブユニット)からなる。第三の調節Bサブユニットとの結合が基質特異性を調節する[Wera and Hemmings, 1995]。PP2Aホスファターゼ活性は、図3に概略的に示す翻訳後修飾によって調節することができる。PP2Acは、受容体および非受容体チロシンキナーゼのいずれも、たとえばEGFR、インスリン受容体、p60v-srcおよびp56lckによってインビトロでリン酸化されることが示されている[Chen et al., 1992]。このリン酸化は、Tyr307で特異的に起こり、ホスファターゼ活性の90%超の損失と関連している[Chen et al., 1992]。このリン酸化はまた、インビボでも特定されており、血清またはEGFで刺激された、またはp60v-srcで形質転換された線維芽細胞中で増大するが、血清欠乏によって減少する[Chen et al., 1994]。隣接するThr304のリン酸化もまた、ホスファターゼ活性の有意な損失に関連している[Guo and Damuni, 1993]。Tyr307とは対照的に、Thr304は、自己リン酸化活性化タンパク質キナーゼによってリン酸化され、それにより、初期阻害シグナルを増幅させると思われる。いずれの場合でも、PP2Aは、オカダ酸またはミクロシスチンLRによる薬理学的阻害がリン酸化を増大させるように、それ自体のホスファターゼとして作用する[Chen et al., 1994、Guo and Damuni, 1993]。したがって、阻害性刺激の除去ののち、PP2Aは両リン酸基を加水分解して活性ホスファターゼを急速に再生させる。PP2Acはまた、カルボキシ末端リジン残基L309の可逆性メチル化によって調節に付される。メチル化反応は、ロイシンカルボキシルメチルトランスフェラーゼによって触媒され[Xie and Clarke, 1994]、活性三量体を形成するためのサブユニットの正しい会合のために必要であると思われる[Wu et al., 2000、Tulstylch et al., 2000、Bryant et al., 1999]。PP2Acはホスファターゼメチルエステラーゼ1 (PME-. 1)によって脱メチル化される[Lee et al., 1996]。興味深いことに、PME-1はまた、PP2Aチロシルホスファターゼ活性を刺激するものとしてはじめに同定されたタンパク質であるホスホチロシルホスファターゼ活性化因子(PTPA)によって逆転される状況である不活性コンフォメーションにあるPP2a二量体および三量体に結合し、それらを潜在的に安定化すると報告されている[Cayla et al., 1994, Langin et al., 2004、Van Hoof et al., 2005]。
活性=(試料の量、リットル単位)×A405/1.78×104M-1cm-1 (吸光係数)×0.25cm×15分×0.05U酵素
PP2Aの酸化還元調節に影響しないセレン酸ナトリウム
ますます多くの研究が、可逆性酸化が、タンパク質ホスファターゼをマイナスに調節する一般的な機構であることを示唆している[Wang et al., 1996、Barrett et al., 1999、Sohn and Rudolph 2003]。触媒領域中の保存されたシステイン残基がそれらの酵素活性にとって重要であるが、酸化性ミクロ環境では、これは、細胞内ジスルフィドまたはスルフェニル-アミド結合のいずれかの形成によって修飾されて(図5A)、ホスファターゼ活性の損失を伴うかもしれない[Salmeen et al., 2003, Kwon et al., 2004]。セレン化合物が細胞酸化還元状態に影響することができるものとして、セレン酸ナトリウムが酸化の阻害効果を軽減することによってPP2Aを刺激するという可能性を調査した。
基質特異性を示すセレン酸ナトリウム刺激PP2Aホスファターゼ活性
PP2Aは、全細胞タンパク質の0.1〜1%を構成すると推定される、遍在性で多量に発現するタンパク質であり[Gallego M and Virshup 2005; Cohen, 1997]、増大する数のタンパク質基質の調節に関与する[Zhu et al., 2004、Woetmann et al., 2003, Silverstein et al., 2002]。PP2A基質特異性を制御する機構は不完全にしか理解されていないが、特異性調節Bサブユニットの示差的結合が重要であると思われる[Van Kanegan et al., 2005]。セレン酸ナトリウムによって刺激される増大したPP2Aホスファターゼ活性が無差別的であるのか、または特にヘテロ三量体に対して特異的であるのかを判定した。
グリコーゲン合成に対するインスリンの代謝効果は、Aktの直接下流基質であるグリコーゲンシンターゼキナーゼ-3 (GSK-3)によって媒介される。GSK-3は、グリコーゲンシンターゼをリン酸化しかつ不活性化する、遍在的に発現するセリン/トレオニンキナーゼである。インスリン受容体の活性化に応答して、Aktは抑制因子GSK-3をリン酸化しかつ不活性化し、それによってグリコーゲン合成を刺激する[Cross et al., 1995]。加えて、GSK-3は、タンパク質翻訳の調節、細胞周期進行およびWntシグナル伝達に関与している[Diehl et al., 1998, Welsh et al., 1996、He et al., 1995]。GSK-3β活性化に対するセレン酸ナトリウム処理の効果を測定するため、PC3前立腺癌細胞を平板培養し、血清を夜通し欠乏させたのち、新鮮な培地中、表記する様々な時間、セレン酸ナトリウム500μMで処理した(図7)。分解された全細胞溶解産物を、キナーゼ活性にとって重要な部位であるSer9でリン酸化された場合のみGSK-3βを特異的に認識する抗体を用いるイムノブロット分析に付し、負荷対照としての細胞骨格タンパク質β-チューブリンとで比較を実施した。PC3細胞は、対照レーン(0時間)で観察される高程度のリン酸化によって示されるGSK-3β活性化の高い基底レベルを有する。セレン酸ナトリウムによる処理は、1時間および3時間で最大であり、6時間の時点で基底レベルに戻るリン酸化の顕著な低下を招いた。セレン酸ナトリウムが誘発した阻害の程度を定量化するため、セレン酸ナトリウム500μMの3時間の効果をLY294002 50μMの1時間の効果と比較する数値化イムノブロットを作成し、濃度測定により、GSK-3βリン酸化の程度を発現タンパク質の割合として測定した。平均で、セレン酸ナトリウムはGSK-3βを20%超低下させたが、一方、LY294002はリン酸化レベルのほぼ60%の低下を生じさせた。
Akt/タンパク質キナーゼB活性化を強力に阻害するが、セレノメチオニンはそうではないセレン酸ナトリウム
セレン酸ナトリウムがPI3K経路の活性を妨害することができるかどうかを判定するため、無血清PC3細胞を500μMセレン酸ナトリウムで様々な時間処理した。活性化特異的抗体を使用して全細胞溶解産物中のAktのリン酸化状態を測定した。PTENの損失のせいで、さらなる血清の非存在でさえ、Ser473およびThre308の両部位でAktの強力な活性化がある。セレン酸ナトリウムの添加は、曝露から10分以内に両部位でAktのリン酸化における一過性のブーストを誘発した。そして、このブーストに続き、顕著で長い不活性化が生じ、その間、全細胞Aktレベル(pan Akt)は本質的に変化のないままであった。
セレン酸ナトリウムに特有であるAkt脱リン酸化を誘発する能力
セレン酸ナトリウムが一貫してカギキナーゼAktの強いリン酸化を誘発するが、セレノメチオニンは効果を有しないということを考慮して、この能力がセレン酸ナトリウムに特有であるのか、またはセレンの他の化学形態によって共有されるのかを判定した。他の無機セレン種(亜セレン酸ナトリウム、二酸化セレン、硫化セレンおよび亜セレン酸)および有機セレン種(メチルセレノシステイン、セレノシステイン)を、Akt活性化に影響するそれらの能力に関して試験した。DMSOに可溶化させた硫化セレンを除き、すべての形態を水に溶解し、500μMの濃度で1時間、血清欠乏PC3細胞に加えた。そして、全細胞溶解産物を分解し、Akt発現の全レベル(pan Akt)だけでなく、Aktの活性化状態を、Ser473部位でリン酸化されたときAktを特異的に認識する抗体を用いるイムノブロッティングによって測定した。Akt活性化の程度を定量化するため、イムノブロットを数値化し、全Aktに対するリン酸化Aktの比を濃度測定によって測定した。三つの独立した実験からの全Aktタンパク質レベルに対するリン酸化Aktの平均比±SEMを図9にまとめた。PC3細胞を500μMのセレン酸ナトリウムで1時間処理すると、非処理細胞に比較して、Ser473でAktリン酸化の80%を超える低下が生じた(p<0.05、スチューデントt検定)。対照的に、同一条件下で投与されたセレンの他の無機形態および有機形態によるPC3細胞の処理は、Akt活性化の程度に対して有意な効果を及ぼさなかった。要するに、これらのデータは、Akt脱リン酸化を誘発する能力がセレン酸ナトリウムに特有であることを示す。
セレン酸ナトリウムに特有であるPP2A活性を高める能力
実施例7では、試験したセレンのすべての化学形態のうち、セレン酸ナトリウムだけがAktの脱リン酸化を有意に誘発するということを実証するデータが提示された。PP2A活性に対する差別的な効果がこの特異性を説明することができるかどうかを判定するため、PP2Aホスファターゼ活性に対するセレン酸ナトリウム(5mMまたは50μM)、亜セレン酸ナトリウム(5mMまたは50μM)およびセレノメチオニン(5mMまたは50μM)の効果を、pNPPおよびセリンリンペプチドをそれぞれ基質として使用するpNPP加水分解アッセイで比較した(図10Aおよび10B)。セレン酸ナトリウムで認められたホスファターゼ活性の明らかなブーストとは対照的に、亜セレン酸ナトリウムまたはセレノメチオニンのいずれもPP2Aホスファターゼ活性に有意に影響しなかった。
試薬
細胞株
実験手順で使用した哺乳動物細胞株の詳細を表1に記載する。
上記の実験作業では、市販の一次抗体およびセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合または蛍光標識またはビオチン化二次抗体を数多く使用した。これらの詳細を以下にまとめる:
抗Aktウサギポリクロナール抗体、カタログ番号9272、Cell Signalling Technology (CST);
抗Akt (5G3)マウスモノクロナール、カタログ番号2966、CST;
抗ホスホAkt (ser473)ウサギポリクロナール、カタログ番号9271、CST;
抗ホスホGSK3β(ser9)ウサギポリクロナール、カタログ番号9336、CST;
各種抗PP2A抗体、カタログ番号05-421、06-2221、07-334および05-592、Upstate。
セレン酸ナトリウムをSigmaから購入した。すべての溶液をdH2O中で新たに作り、記載の濃度で使用した。
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)
指定の処理ののち、培養中の細胞をPBS中で一度洗浄したのち、プロテアーゼ阻害薬カクテル(Calbiochemプロテアーゼ阻害薬カクテルセット1 #539131)およびホスファターゼ阻害薬(10mMオルトバナジン酸ナトリウムおよび10mMフッ化ナトリウム)を含有する、卵溶解緩衝液(ELB)またはRIPA溶解衝液のいずれかの中で、細胞スクレーパを用いながら4℃で15分間溶解させた。試料を4℃で15分間、14,000rpmで遠心分離することによって明澄化し、上澄みを分析に使用した。ビシンコニン酸溶液アッセイ(BCA)によって試料タンパク質濃度を測定した。96穴プレート中で溶解産物1μlをdH2Oで1:25に希釈した。ビシンコニン酸溶液および4% (w/v)硫酸銅の80:1溶液200μlを各試料に加え、37℃で30分間インキュベートした。一連のタンパク質標準に照らして590nmで吸光度を計測した(Perkin Elmer MBA2000)。
分解ののち、タンパク質をPVDF膜(Immobilon P, Millipore)に移した。膜を100%メタノールに10秒間浸漬することによって調製し、蒸留水ですすぎ、ウェスタン転写緩衝液中で平衡させた。転写は、100Vで、室温で1.5時間または4℃で夜通し実施した。TBS-T中で膜を5分間洗浄し、1時間乾燥するにまかせた。そして、膜を、0.1% Tweenを含むTBS中3%スキムミルクによって室温で1時間ブロックした。膜を、TBS-Tで5分間ずつ3回洗浄したのち、3%スキムミルク/0.1% TBS-Tまたは3% BSA/0.1% TBS-Tで希釈した一次抗体とで室温で1〜2時間、あるいは4℃で夜通し優しく撹拌しながらインキュベートした。0.1% TBS-T中で5分間の洗浄を3回実施したのち、膜をブロッキング緩衝液中セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体とで1時間インキュベートした。膜を再び5分ずつ3回洗浄したのち、Super Signal(登録商標) West Dura Extended Duration Substrate (Pierce #34075)またはECL Western Blotting Detection Agents (Amersham Biosciences #RPN2106)を用いる増強化学発光によって抗体結合を検出した。CL露光フィルム(Kodak)を使用するオートラジオグラフィーによって発光を記録した。初期の分析ののち、イムノブロットを膜ストリッピング緩衝液(62.5mM TRIS pH7、2% SDS、7%β-メルカプトエタノール)によって60℃で15分間ストリッピングし、TBS-T中で3回洗浄し、再びブロックしたのち、再プロービングを実施した。
Vistaデジタルスキャナ(Umax)を使用して、関連するイムノブロットをCorel Photo-Paintバージョン8 (Corel Corporation)で.tifファイルに変換した。Windows用Image-Pro-Plus V4.5.1.22 (Media Cybernetics)で濃度測定分析を実施した。白に0の値を割り当て、黒に255の値を割り当てる線形較正を使用して、関連するバンドに対応する対象領域を選択し、シグナル強度を測定した。
全細胞溶解産物100〜600μgを、種々の抗体とともに、1:100の希釈度で、回転ホイール上の微量遠心管中、前記のように室温で1〜2時間または4℃で16時間インキュベートした。短時間の遠心分離ののち、予備洗浄した50%タンパク質-Aセファロース高速フロービーズ(Sigma #9424)30〜40μlを各管に加え、4℃で1時間、室温または4℃で回転させた。短時間の遠心分離ののち、上澄みを除去し、ペレットを細胞溶解緩衝液500μlで洗浄した。そのような洗浄3回ののち、ビーズを酵素アッセイに使用した、またはビーズを3×SDSタンパク質負荷緩衝液中で5分間煮沸することによってタンパク質を溶離させ、SDS-PAGEゲル上で分解した。
アリコート中に-20℃で提供され、貯蔵された希釈緩衝液により、精製ヒトPP2AcおよびウサギPP1を0.01U/μlに希釈した。
合成リンペプチドK-R-pT-I-R-R(Upstate #12-219)およびR-R-A-pS-V-A (Upstate #12-220) 1mgを、dH2O 1.10〜1.285mlに溶解して1mM溶液を調製し、分取し、使用するまで-20℃で貯蔵した。ヒト赤血球から精製した精製PP2A A-C二量体0.01〜0.05Uまたは骨格筋から精製したウサギPP1 0.05Uをリンペプチド500μMと混合し、前記のような種々の処理の存在で、加熱ブロック上、37℃で15分間インキュベートした。各反応物をpNPP緩衝液(50mM Tris-HCl、pH7.0、100μM CaCl2)で合計量25μlに調合した。マラカイトグリーン溶液(10mMモリブデン酸アンモニウム中0.034%マラカイトグリーン、1N HCl、3.4%エタノール、0.01% Tween-20) 100μlを加えることによって酵素反応を終了させた。マラカイトグリーンは、モリブデートおよびオルトホスフェートの存在で安定な緑色複合体を形成して、存在する無機ホスフェートの量を計測することを可能にする。試料ごとに590nmで吸光度を二重反復で読み取った。
PC3細胞1×106個を60mmプレートで平板培養し、8時間付着させたのち、血清を夜通し欠乏させた。前記のような種々の処理ののち、培地を吸引し、細胞をTBSで洗浄した。細胞を溶解緩衝液(20mM Tris-HCl、pH7.0、1% Igepal-CA、2mM EDTA、2mM EGTA、1×完全プロテアーゼ阻害薬カクテル) 0.3ml中で溶解させ、溶解産物を2ml Zeba脱塩スピンカラム(Pierce #89890)に通すことによってホスフェートを除去した。前記のようにBCAアッセイによって脱塩溶解産物のタンパク質濃度を測定した。抗PP2Aモノクロナール抗体4μgおよびタンパク質A-セファローススラリー30μlを用いて全タンパク質100〜150μgを4℃で2時間免疫沈降させた。そして、試料を14,000rpmで1分間ペレット化し、過剰のTBS中で3回洗浄し、pNPPアッセイ緩衝液で一度洗浄した。最後のスピンののち、上澄みの全部を入念に除去し、最終容量80μlのリン光体−トレオニンペプチド500μMをビーズに加えた。試料を撹拌しながら30℃で10分間インキュベートし、マラカイトグリーン溶液の添加によって反応を停止させた。吸光度を試料ごとに590nmで二重反復で読み取った。
パラニトロフェニルホスフェート(pNPP)は、ホスフェート部分の加水分解ののち、アルカリ条件下で可溶性である強い黄色のクロモゲンであるパラニトロフェノールを生成するホスファターゼ酵素の化学基質である。相対ホスファターゼ活性を計測するアッセイでは、精製PP2A 0.05Uを、マイクロ遠心分離管中、40mM NiCl2 5μlおよびBSA溶液(5mg/ml) 5μlと混合した。前記のような種々の処理を加え、pNPPアッセイ緩衝液で容量を80μlに調整した。試料を37℃で15分間プレインキュベートした。各アッセイの前に、1.5mg/ml pNPPを50mM Tris-HCl、pH 7.0に溶解することにより、pNPP基質を新たに調製した。ホスファターゼ反応を開始させるため、pNPP基質120μlを加え、試料を37℃でさらに15分間インキュベートした。各試料の吸光度を405nmおよび基準としての590nmで二重反復で計測した。以下の式を使用してPP2A活性を計算した:
活性=(試料量、リットル単位)×A405/1.78×104M-1cm-1 (吸光係数)×0.25cm×15分×0.05U酵素
種々の処理ののち、精製PP2A中の遊離スルフヒドリル基の変化をEllman試薬によって測定した。PP2A 0.01Uに対し、希釈緩衝液(30mM Tris-HCl、3mM EDTA、pH8.2) 37.5μl、DTNB試薬(Ellman試薬) 12.5μlおよびメタノール200μlを加えた。試料を室温で5分間インキュベートしたのち、それぞれ412nmで吸光を計測した。結果を、N-アセチルシステインを用いて精製した標準曲線と比較した。
K-LISA(商標)AKT活性キット(Calbiochem #CBA019)を使用して、組換えヒトAkt1キナーゼ活性に対するセレン酸ナトリウムの効果を測定した。これは、二番目のセリンでAkt1、Akt2、Akt3、SGK (血清糖コルチコイドキナーゼ)およびMSK1によってリン酸化されているビオチン化ペプチド基質(GRPRTSSFAEG)を使用するELISAベースのアッセイである。ビオチン化Akt基質およびAkt試料を、リン酸化および基質捕獲を単一ステップで可能にする、ストレプトアビジンでコートされた96穴プレーの穴の中、ATPの存在でインキュベートした。リン酸化基質をホスホセリン検出抗体によって検出したのち、HRP-抗体結合体によって検出し、TMB基質で発色させた。
2',7'-ジクロロジヒドロフルオレセインジアセテート(DCFDA)を使用して細胞内酸化還元状態を測定した。DCFDAは非蛍光性かつ自由に細胞透過性であるが、反応性酸素種(ROS)の存在では、細胞非透過性かつ高度に蛍光性の2',7'-ジクロロフルオレセイン(DCF)へと急速に転換される。種々の処理の前に、細胞をDCFDA 5μMで15分間平衡させた。そして、付着性細胞を収穫し、PBSで2回洗浄し、蛍光細胞の割合をただちにフローサイトメトリーによって測定した。
マウス脳組織およびヒト神経芽細胞種細胞株の両方におけるタウリン酸化活性に対するセレン酸の効果
材料および方法
細胞培養物
ヒト神経芽細胞種SY5YおよびBE2M17細胞株をJanetta Culvenor (Department of Pathology, University of Melbourne, VIC)から得た。SY5Y細胞を、10%ウシ胎児血清(FBS、Invitrogen, GIBCO)、1%非必須アミノ酸(Sigma, St Louis, MO, USA)、1OmM HEPES (Invitrogen, GIBCO)、1mMピルビン酸ナトリウム(Invitrogen, GIBCO)および1%抗生/抗真菌物質混合物(Invitrogen, GIBCO)で補足されたRPMI 1640培地(Invitrogen, Auckland, New Zealand)で通常どおりに培養した。BE2M17細胞を、10% FBS(Invitrogen, GIBCO)、1%非必須アミノ酸(Sigma, St Louis, MO, USA)、1mMピルビン酸ナトリウム(Invitrogen, GIBCO)および1%抗生/抗真菌物質混合物(Invitrogen, GIBCO)で補足されたOPTI-MEM I還元血清培地(Invitrogen, GIBCO)で培養した。5% CO2中37℃で細胞を培養した。セレン酸ナトリウムをSigma (St Louis, MO, USA)から得た。
断りない限り、以下の抗体をPierce Endogen (Rockford, USA)から得た: 抗ヒトPHF-タウモノクロナール(クローンAT100: AT180; AT270)および抗ヒトタウモノクロナール(クローンHT-7)。ポリクロナールヤギ抗マウス免疫グロブリン/HRP (Dako, Denmark)および抗チューブリン(G712A, Promega)。
SY5YまたはBE2M17細胞2×105個を、Falcon 6穴プレートの各穴の中、コートされた面またはコートされていない面のいずれかで平板培養し、完全増殖培地中、5% CO2/37℃で夜通し付着させた(上記の通り)。培地を、100μM濃度のセレン酸ナトリウムを含有する新鮮な完全増殖培地に交換し、3時間培養した。細胞を、0.1% ゼラチン(Sigma, St Louis, MO, USA)、マトリゲル(カタログ番号354234, BD, NSW, Australia)または0.5μg/mlフィブロネクチン(Sigma, St Louis, MO, USA)のいずれかでコートされた表面を有するFalcon 6穴プレートで培養した。
14週齢Balb/C Nu Nu雄マウスをARCから得た。マウスに対し、PBS 200μlあたりセレン酸ナトリウム300μgの皮下注射を一回施した。注射後の様々な時点でマウスを殺処分し、血液および脳組織標本を採取した。
細胞を冷温PBS中で2回洗浄し、冷温RIPA緩衝液(10%グリセロール、20mM Tris、137mM NaCl、0.1% SDS、0.05% IGEPAL、1% Triton X-100、2mM EDTA、10% NaV、2% NaFおよび4Xプロテアーゼ阻害薬を含有) 150μl中で溶解させ、同様に、乳鉢および乳棒を使用して脳組織をドライアイス中で均質化し、RIPA緩衝液150μl中で溶解させた。試料を氷上で30分間インキュベートしたのち、13000rpm/10分/4℃で遠心分離に付した。上澄みを捕集し、BCA試薬(Sigma)を使用することによって試料ごとにタンパク質推定値を計算した。等しい量のタンパク質を10% SDS-ポリアクリルアミドゲルの各レーンに添加した。タンパク質をPVDF (Millipore)膜に移し、5%スキムミルクブロットで2時間ブロックした。膜をブロックしたのち、一次抗体:抗ヒトPHF-タウ(1:200のAT100、1:1000のAT180および1:2500のAT270)または抗ヒトタウ(1:1000のHT-7)のいずれかを5%スキムミルクブロット中4℃で夜通しインキュベートした。二次抗体インキュベーションの前に、膜を3×すすぎ、次いで3×5分間、0.01% Tweenを含むTris緩衝食塩水中で室温で洗浄した。続いて、5%スキムミルクブロット中/室温で、1:10000希釈度のセイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)に結合した二次抗体ポリクロナールヤギ抗マウス(Dako, Denmark)の1時間のインキュベーションを実施した。上記のように膜を洗浄し、Amersham ECLウェスタンブロッティング検出試薬(Amersham Bioscience, Buckinghamshire, UK)を使用することによって検出した。2% SDS/β-メルカプトエタノール抗体除去緩衝液を使用して膜を抗体除去し、チューブリン(Promega)に関して再プロービングしてタンパク質負荷を確認した。
抗ヒトPHF-タウクローンAT100が68kDaで検出された。セレン酸ナトリウムの存在では、PHF-タウシグナルは、セレン酸非処理細胞と比較して、フィブロネクチンおよびマトリゲル上で培養された細胞から減少したように思われた。
抗ヒトPHF-タウクローンAT270が70kDaで特異的に検出された。ゼラチンおよびフィブロネクチン上で培養されたセレン酸処理細胞は、セレン酸非処理細胞に比較して弱いPHF-タウシグナルを有するように思われた。
PBSは、研究したすべてのクローン(AT100、AT180およびAT270)に関し、抗ヒトPHFタウシグナルに対して効果を有するように思われた。等しいタンパク質負荷を確認するため、方法部分で説明したように、すべての膜を抗体除去し、チューブリンに関して再プロービングした。
ヒトタウ441を過剰発現する遺伝子導入マウス(TMHT)の行動およびタウ脳病変に対するセレン酸ナトリウムの効果
方法
序文
この実験は、脳特異的ネズミThy-1プロモータの制御下、二つの突然変異V337MおよびR406Wを有するヒトTAU441遺伝子を過剰発現するTAU441遺伝子導入(Tg) TMHTマウス(C57BL6バックグラウンド)の行動および脳形態に対するセレン酸ナトリウム処理の効果を評価するために設計された。処理の1.5および3ヶ月後にすべてのTgマウスの行動をオープンフィールド(OF)試験、ロータロッド(RR)試験および好奇行動を評価するためのノーズポーク好奇・活動試験で評価した。さらに、処理の最後に、モリス水迷路(MWM)タスクで記憶および学習を評価した。また、ベースライングループの非処理マウスをOF試験、RR試験、ノーズポーク試験およびMWMタスクで試験した。まず、処理グループあたり3匹で脳TAU病変を測定した。
脳特異性ネズミThy-1プロモータの調節制御下、ミスセンス変異V337MおよびR406Wを有するヒトTAU441を発現する雄および雌Tg TMHTマウスを使用した。マウスは、JSW-Research (Graz, Austria)で繁殖し、飼育したものであった。これらのマウスのためのC57BL/6バックグラウンドは、優良学習個体として知られるマウスを生み出す。このマウスモデルはヒトアルツハイマー病タウ病変に似ている。処理の開始時、マウスは5ヶ月±2週の年齢であり、これがベースライングループの年齢でもあった。
マウスをイヤーマーキングで識別した。これらのマウスを、ABEDD(登録商標)によって供給される標準化齧歯類用ベッディング上で個別の通気されたケージ(IVC)に収容した。各ケージに最大5匹のマウスを収容した。国際規格に基づく標準的作業手順にしたがってマウスを維持した。
マウスをグループA(セレン酸ナトリウム)、B(溶媒)およびC(ベースライン)にランダムに割り当てた。処理グループAには、飲み水を介してセレン酸ナトリウムを12週間与え、一方、対象マウス(B)には、通常の水道水を与えた。投与に際して、セレン酸ナトリウム1.2mgを無菌水10OmLに溶解し、重さを記録し、ボトルをケージに入れた。これを毎週月曜、水曜および金曜に実施し、交換時に水を計量して消費量を計測した。
オープンフィールド試験
運動機能のもっとも標準化された一般的測度は、オープンフィールド(OF)における自発的活動である。本治験には、Plexiglasオープンフィールド(48×48cm、TSE-System(登録商標))を使用した。赤外線フォトビームを箱の回りに1.4cm離して配置した。立ち上がり(後足で立つ)を感知するため、もう一つのフォトビーム列を最初の列の4cm上に取り付けた。試験セッションを5分継続させて、新環境におけるマウスの行動および慣れをチェックした。その後、情動性の測度として脱糞回数を数えた。臭いの痕跡を消すために、マウスごとにOFを70%エタノールで清浄した。試験は、概日サイクルの光段階中、標準の室内照明条件下で実施した。
この試験を使用してTAU Tgマウスにありうる運動欠損を検出した。加速式5レーンロータロッド(TSE-Systems(登録商標))で治験を実施した。マウスには、最大300秒のプログラムを完了させた。5rpmの速度で出発し、120秒後、ロッドは60rpmの速度に達した。この実験ののち、落下までの潜時およびその時点でのロッド速度を計算した。
穴あきボード装置は、新規な環境に対するマウスの応答を計測する簡単な方法を提供し、マウスの好奇性および穴の中に鼻を突っ込む性質を利用する。好奇性行動の治験は、穴あきボード(1枚あたり穴16個)を備えたOFボックスで実施した。頭が穴に突っ込まれると、各穴の縁のすぐ下を通る赤外線ビームが遮られるものであった。1匹ごとに5分間、頭を突っ込む回数および期間を計算した。
モリス水迷路タスクは、直径100cmの黒い円形プールの中で実施した。プールには22±1℃の水道水を満たし、プールを仮想的に4つのセクタに分割した。透明なプラットフォーム(直径8cm)を水面下約0.5cmに配置した。予試験を除く全試験セッション中、プラットフォームをプールの南西側四分円に配置した。
4日目の最後のトライアルの1時間後、マウスは、いわゆるプローブトライアルに合格しなければならなかった。このとき、プラットフォームをプールから取り除き、1分のプローブトライアル中、実験者は、以前の標的位置を横切る回数を数えた。さらに、この四分円中の滞在を計測した。
処理期間の最後に、すべての行動試験に続き、各マウスを殺処分して、血液(血漿および血清)、CSFおよび脳を採取し、すぐに処理するか、さらなる実験に備えて貯蔵した。
モノクロナールTAU抗体AT180およびHT7 (Pierce Endogen(登録商標))を使用してTAU沈着を測定した。AT180はPHF-TAUおよび濃縮体様形成[この抗体のエピトープはリン酸化Thr231残基である]を認識し、HT7は正常なヒトTAUおよびPHF-TAU [この抗体のエピトープは、残基159および163の間でヒトTAUにマッピングされている]を認識する。
1.) Tissue Clear (Sakura(登録商標))および等級付けアルコール(Merck(登録商標))シリーズに通して組織切片を脱パラフィン化し、水和させる。
2.) 二回蒸留水(Fresenius-Kabi(登録商標))中で2分間洗浄する。
3.) 抗原アンマスキングのために組織切片をスチーマ中95℃で10%クエン酸緩衝液(Labvision(登録商標))に15分間入れ、15分かけて室温まで冷ます。
4.) 切片をPBS中で2×5分間洗浄する。
5.) 内在性ペルオキシダーゼを、メタノール(Merck(登録商標))中1%過酸化水素(Linaris(登録商標))により、室温で10分間ブロックする。
6.) 切片をPBS中で2×5分間洗浄する。
7.) ダンプチャンバ中、室温で60分間、MOMブロッキング試薬(Vector(登録商標))との非特異的結合をブロックする。
8.) 切片をPBS中で2×5分間洗浄する。
9.) 室温で5分間、MOM希釈剤(Vector(登録商標))との非特異的結合をブロックする。
10.) ダンプチャンバ中、室温で60分間、AT180 (Pierce Endogen(登録商標); MOM希釈剤中1:100)とでインキュベートする。
11.) 切片をPBS中で3×5分間洗浄する。
12.) ダンプチャンバ中、室温で10分間、10%非免疫ヤギ正常血清(Dako(登録商標))との非特異的結合をブロックする。
13.) 切片をPBS中で2×5分間洗浄する。
14.) ダンプチャンバ中、室温で60分間、Cy3ヤギ抗マウス(Jackson(登録商標); MOM希釈剤中1:500)とでインキュベートする。
15.) 切片をPBS中で5分間洗浄する。
16.) 切片を二回蒸留水中で5分間洗浄する。
17.) 切片をMoviolおよびカバーガラスでカバーする。
メタノール中1%過酸化水素:
メタノール60mL+30%過酸化水素2mL+Triton X-100 (Amresco(登録商標)) 0.6mL。
MOMブロッキング試薬:
MOMマウスIgGブロッキング試薬(MOM-Kit (Vector(登録商標))から) 2滴+PBS 2.5mL。
MOM希釈剤:
PBS 10mL+タンパク質濃縮物(MOM-Kit (Vector(登録商標))から) 800μL。
抗体AT180:
MOM希釈剤中1:100。
抗体Cy3ヤギ抗Mouse:
MOM希釈剤中1:500。
1.) Tissue Clear(Sakura(登録商標))および等級付けアルコール(Merck(登録商標))シリーズに通して組織切片を脱パラフィン化し、水和させる。
2.) 二回蒸留水(Fresenius-Kabi(登録商標))中で2分間洗浄する。
3.) 抗原アンマスキングのために組織切片をスチーマ中95℃で1%クエン酸緩衝液(Labvision(登録商標))に15分間入れ、15分かけて室温まで冷ます。
4.) 切片をPBS中で2×5分間洗浄する。
5.) 内在性ペルオキシダーゼを、メタノール(Merck(登録商標))中1%過酸化水素(Linaris(登録商標))により、室温で10分間ブロックする。
6.) 切片をPBS中で2×5分間洗浄する。
7.) ダンプチャンバ中、室温で60分間、MOMブロッキング試薬(Vector(登録商標))との非特異的結合をブロックする。
8.) 切片をPBS中で2×5分間洗浄する。
9.) 室温で5分間、MOM希釈剤(Vector(登録商標))との非特異的結合をブロックする。
10.) ダンプチャンバ中、室温で60分間、HT7 (Pierce Endogen(登録商標); MOM希釈剤中1:100)とでインキュベートする。
11.) 切片をPBS中で3×5分間洗浄する。
12.) ダンプチャンバ中、室温で10分間、10%非免疫ヤギ正常血清(Dako(登録商標))との非特異的結合をブロックする。
13.) 切片をPBS中で2×5分間洗浄する。
14.) ダンプチャンバ中、室温で60分間、Cy3ヤギ抗マウス(Jackson(登録商標); MOM希釈剤中1:500)とでインキュベートする。
15.) 切片をPBS中で5分間洗浄する。
16.) 切片を二回蒸留水中で5分間洗浄する。
17.) 切片をMoviolおよびカバーガラスでカバーする。
メタノール中1%過酸化水素:
メタノール60mL+30%過酸化水素2mL+Triton X-100 (Amresco(登録商標)) 0.6mL。
MOMブロッキング試薬:
MOMマウスIgGブロッキング試薬(MOM-Kit (Vector(登録商標))から) 2滴+PBS 2.5mL。
MOM希釈剤:
PBS 10mL+タンパク質濃縮物(MOM-Kit (Vector(登録商標))から) 800μl。
抗体HT7:
MOM希釈剤中1:1000。
抗体Cy3ヤギ抗マウス:
MOM希釈剤中1:500。
行動
オープンフィールド(OF)では、水平および垂直活動、脱糞回数、立ち上がりの回数および期間、活動過剰ならびにオープンフィールドの中央で費やした時間vsオープンフィールドの周縁部で費やした時間を計測した。
海馬および扁桃におけるTAU免疫反応性の程度を測定するため、専用の画像解析ソフトウェア(Image Pro Plus、バージョン4.5.1.29)を使用した。以下のパラメータを評価し、計算した。
・各スライス中の海馬および扁桃の領域面積
・特定の脳領域である海馬および扁桃中の免疫反応陽性細胞の絶対面積
・海馬および扁桃の特定脳領域面積に対する免疫反応陽性面積の数
a) スライス形態をより良く可視化するため、画像にコントラストを適用することなく画像の対比を強調する。
b) 海馬輪郭の対話式描画および海馬面積(=領域面積)の計測。
c) 強度ベースのしきいレベルを超える染色された物体が検出される対象区域(AOI)の対話式描画。しきい値を測定するために、可視性の免疫反応がない区域でAOIの近くにラインヒストグラムを対話式に描画した。ラインヒストグラムの全画素からの平均強度レベル+定数が強度しきいレベルを規定した。7μm2未満のサイズの物体は排除した。
d) 各物体の面積およびAOI中の染色面積の合計の計測。
e) 扁桃に関してa〜d)を繰り返す。
f) 相対TAU免疫陽性区域(=「TAU免疫反応性の合計面積/領域面積×100」)の計算。
g) パラメータ「画像タイトル、領域面積、合計TAU面積およびTAU面積の%をはじめとする、Excelスプレッドシートへの自動化データエクスポート。注釈のためのフィールドを使用してそれぞれ画質および排除基準を記録した。排除基準は、スライスの欠損部分、多くのしわまたは大きな欠陥であった。
h) 保存せずに画像を閉じる(生データを保持するため)。
すべての計測パラメータに関して平均値、標準偏差またはSEMを計算した。
総括
概して、セレン酸ナトリウムによる処理はマイナスの副作用をもたらさなかったし、また早期死を生じさせなかったと述べることができる。
オープンフィールド
活動パラメータ(活動、活動過剰、立ち上がり行動)はセレン酸ナトリウム処理による影響を受けなかったが、セレン酸ナトリウム処理マウスは、最初のOFセッションの間に接触走性行動の乱れを示した。これは、最初のターンで溶媒処理マウスとセレン酸ナトリウム処理マウスとの間で、オープンフィールドボックスの中央における有意に高い滞在、すなわち、より低い接触走性を生じさせた(図14-「接触走性」を参照。処理動物のT検定、p=0.019)。ターン2の処理の最後に、接触走性行動は溶媒対照のレベルに正規化した。
運動能力はセレン酸ナトリウム処理で変化ないままであった。
好奇行動はセレン酸ナトリウム処理で変化ないままであった。
二つの異なる処理グループ+ベースライン(5月齢マウス処理)のモリス水迷路(MWM)成績の結果が、統計学的分析の結果を示す図15および表4に示されている。MWMタスクは、溶媒グループとの比較および三ヶ月若いベースライングループとの比較で、セレン酸ナトリウム処理マウスの間で、場合によっては顕著な差(表4を参照)、さらには有意な差を明らかにした。
結果概要
AT180およびHT7の定量では、海馬および扁桃のIHC領域面積は、治験したすべての脳を通じて非常に一定であり、それは、免疫組織化学的染色ステップにおける組織に対するマイナスの効果(たとえば収縮、異なる切除環境)を排除し、さらには、処理によって誘発される萎縮がなかったということのサインである。最小限の差をも扱うことができるよう、計測されたTAU負荷データをスライス中の個々の領域サイズに関連させた。
海馬中の相対HT7-TAU面積の割合は、溶媒で処理されたグループ(ANOVA:p<0.05、処理グループのT検定: p=0.04)および非処理ベースライングループ(ANOVA:p<0.05; 図16Aを参照)に対し、セレン酸ナトリウム(1.2mg)で処理されたマウスで有意に減少していた。この効果は、セレン酸ナトリウムで処理されたマウスが、非処理ベースライングループ(ANOVA: p<0.01)および溶媒で処理されたマウス(ANOVA: p<0.05; 処理のみのT検定: p=0.0018)に対し、有意に低下した相対HT7-TAU面積の割合を示した扁桃でより顕著であった(図16Bを参照)。
〇 処理開始から1.5ヶ月後での接触走性の低下は、セレン酸ナトリウムで処理された遺伝子導入マウスの扁桃構造に関連する恐怖の変化を暗示する。長期的なセレン酸ナトリウム処理ののち、マウスは、殺処分前の二回目のオープンフィールド試験実施で、溶媒で処理された対象の匹敵しうる正常な接触走性行動に戻った。
Claims (20)
- 有効量のセレン酸またはその薬学的に許容される塩を対象に投与する段階を含む、対象の神経変性疾患を治療または予防する方法。
- 神経変性疾患がタウオパチーまたはα-シヌクレオパチーである、請求項1記載の方法。
- タウオパチーが、初老期認知症、老人性認知症、アルツハイマー病、第17染色体にリンクしたパーキンソン症(FTDP-17)、進行性核上性麻痺、ピック病、一次進行性失語症、前頭側頭型認知症、および皮質基底認知症から選択される、請求項2記載の方法。
- タウオパチーが、初老期認知症、老人性認知症、およびアルツハイマー病から選択される、請求項3記載の方法。
- α-シヌクレオパチーが、パーキンソン病、認知症を伴うパーキンソン病、レビー小体を伴う認知症、ピック病、ダウン症、多系統萎縮症、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、およびハレルフォルデン・スパッツ症候群から選択される、請求項2記載の方法。
- α-シヌクレオパチーがパーキンソン病である、請求項5記載の方法。
- 神経変性疾患を治療または予防するためのもう一つの治療薬または神経変性疾患の症状を軽減するための治療薬の投与をさらに含む、請求項1記載の方法。
- ニューロンまたはグリア細胞を有効量のセレン酸またはその薬学的に許容される塩に曝露する段階を含む、ニューロン、グリア細胞、またはレビー小体におけるタウタンパク質のリン酸化を阻害または低減する方法。
- タウタンパク質が微小管関連タウタンパク質である、請求項8記載の方法。
- タウタンパク質が神経原線維濃縮体中にある、請求項8記載の方法。
- タウタンパク質のリン酸化過剰が阻害または阻止される、請求項8記載の方法。
- PP2Aを有効量のセレン酸またはその薬学的に許容される塩に曝露する段階を含む、PP2Aの活性を高める方法。
- PP2Aが、Aktを脱リン酸化するアイソフォームである、請求項12記載の方法。
- PP2Aが、タウタンパク質を脱リン酸化するアイソフォームである、請求項12記載の方法。
- タウタンパク質が、ニューロン、グリア細胞、またはレビー小体中に見られる微小管関連タウタンパク質である、請求項14記載の方法。
- ニューロンまたはグリア細胞を有効量のセレン酸またはその薬学的に許容される塩に曝露する段階を含む、ニューロンまたはグリア細胞におけるGSK3βの活性を阻害する方法。
- 神経変性疾患を治療または予防するための医薬の製造における、セレン酸またはその薬学的に許容される塩の使用。
- セレン酸またはその薬学的に許容される塩と、神経変性疾患を治療または予防するためのもう一つの薬剤とを含む、薬学的組成物。
- 他の薬剤が、コリンエステラーゼ阻害薬、N-メチル-D-アスパルテート受容体拮抗薬、エストロゲン様薬剤、非ステロイド抗炎症薬、レボドパ、ドーパデカルボキシラーゼ阻害薬、ドーパミン作動薬、モノアミンオキシダーゼB阻害薬、抗コリン作動薬、およびCOMT阻害薬の一つまたは複数から選択される、請求項18記載の薬学的組成物。
- 他の薬剤が、タクリン、ドネペジル、ガランタミン、リバスチグミン、メマンチン、プレマリン、アスピリン、イブプロフェン、レボドパ、カルビドパ、ベンセラジド、ブロモクリプチン、ペルゴリド、プラミペキソール、ロピニロール、カベルゴリン、アポモルフィン、リスリド、セレギリン、ラサジリン、メシル酸ベンズトロピン、塩酸トリヘキシフェニジル、エンタカポン、トルカポン、およびアマンタジンから選択される、請求項18記載の薬学的組成物。
Applications Claiming Priority (3)
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