KR20090015038A

KR20090015038A - 신경변성 질환의 치료

Info

Publication number: KR20090015038A
Application number: KR1020087026561A
Authority: KR
Inventors: 크리스토퍼 호벤스; 니알 코르코란
Original assignee: 벨라코르 테라퓨틱스 피티와이 엘티디
Priority date: 2006-03-29
Filing date: 2007-03-29
Publication date: 2009-02-11
Also published as: EP2004204A4; NZ571835A; JP5542430B2; RU2008142514A; CN101478977A; ES2394348T3; BRPI0709033A2; US20090169649A1; RU2489155C2; CN101478977B; CA2644441A1; MX2008012479A; CA2644441C; EP2004204B1; KR101451439B1; AU2007231547A1; US8920851B2; WO2007109851A1; AU2007231547B2; JP2009532340A

Abstract

본 발명은 단백질 포스파타제 PP2A의 활성을 증대시키기 위한 조성물 및 방법에서의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다. 본 발명에는 또한 타우 단백질의 인산화를 감소시키는 방법, GSK3의 활성을 억제시키는 방법, 및 신경변성 질환을 치료하거나 예방하는 방법이 또한 개시되어 있다.

Description

신경변성 질환의 치료{TREATMENT OF NEURODEGENERATIVE DISEASES}

본 발명은 PP2A의 활성을 증대시키기 위한 조성물 및 방법에서의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 타우 단백질의 인산화를 억제하거나 감소시키는 방법, GSK3β의 활성을 억제하는 방법 및 특히 신경변성 질환을 치료하거나 예방하는 방법에서의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명은 신경변성 질환을 치료하거나 예방하는 방법에 사용하기 위한 다른 치료제와 배합된 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도에 관한 것이다.

신경변성 질환은 정상적인 뇌 기능을 조장하는 신경세포를 손상시켜 뇌 자체 또는 신체를 조절하는 뇌의 능력을 저하시킴으로써 작용하는 다수의 장애에 대한 일반적인 용어이다. 신경변성 질환은 주로 고령자들의 질환이다. 평균 수명이 증가함에 따라, 세계 인구는 더 오래 살고 있으며 신경변성 질환으로 고생하는 사람의 수도 증가하고 있다.

다수의 신경변성 장애의 경우, 뇌의 신경세포 및 신경교 세포에는 이상(abnormal) 타우 단백질이 증착되어 있다. 예를 들어, 비정상 타우 단백질은 알츠하이머병(AD, Alzheimer's disease)의 특징인 신경원섬유 농축체에서 발견되었 다. 신경원섬유 농축체(NT, neurofibrillary tangle)는 AD의 두 가지 신경병리학적 특질 중 하나이다[Lee et al., 2001]. 이중나선 사상체(PHF, paired helical filament)는 NT의 주된 구조 성분으로서 주로 미세소관-관련 단백질 타우로 이루어진다[Lee et al., 1991, Grundke-Iqbal et al., 1986a, Grundke-Iqbal et al., 1986b]. 비정상적으로 인산화되기 때문에(정상 타우 단백질에서보다 많은 부위에서 인산화됨), PHF-타우(PHF로부터 단리된 타우 단백질)는 매우 불용성으로서 SDS 겔 상에서 지연된 이동성을 나타내고 미세소관과 결합할 수 없다[Lee et al., 1991, Grundke-Iqbal et al., 1986a, Grundke-Iqbal et al., 1986b]. 탈인산화시, PHF-타우는 가용화되어 정상 타우 단백질 만큼이나 미세소관 집합(microtubule assembly)을 속박 및 촉진할 수 있게 된다[Wang et al., 1995, Wang et al., 1996, Bramblett et al., 1993]. 비정상적인 타우 인산화는 AD와 관련된 치매, 신경변성, 축사 이동 상실(axonal transport loss), 미세소관 불안정성 및 타우 기능부전을 야기하는 것으로 여겨진다[Alonso et al., 1996].

비정상 타우 단백질 형태 중 하나는 과인산화 타우 단백질이다. 타우 단백질은 생체내에서 글리코겐 신타제 키나제 3β(GSK3β)에 의해 다수의 인산화 부위(알츠하이머병 특이 Ser³⁹⁶ 잔기를 포함함)에서 인산화되는 것으로 알려져 있다[Li and Paudel, 2006]. 한편, GSK3β는 단백질 키나제 Akt에 의해 인산화되는 것으로 알려져 있으며, Akt의 활성은 단백질 포스파타제 PP2A에 의해 약화되는 것으로 알려져 있다.

PP2A는 상이한 조절 아단위에 결합된 공통의 핵심(core) 구조로 이루어진 다형(multiple form)으로 존재하는 헤테로삼량체 완전효소이다[Mumby and Walter, 1993]. 핵심 효소는 촉매 (C) 및 구조 (A) 아단위 사이의 복합체이다. B로 명명되는 제 3 부류의 아단위는 PP2A 활성 및 특이성을 조절하는 몇몇 폴리펩타이드를 포함한다[Mumby and Walter, 1993, Kamibayashi et al., 1994]. PP2A의 ABC 아형(isoform) 중 중요한 부분은 신경세포의 미세소관과 관련이 있으며[Sontag et al., 1995], PP2A를 타우와 같이 미세소관-관련 단백질(MAP, microtubule-associated protein)의 인산화 상태의 조절에 관여하게 한다. PP2A의 다른 형태는 아니지만 B 조절 아단위를 함유하는 PP2A(즉, B' 및 B")는 시험관내에서 타우를 속박하거나 강력하게 탈인산화시키는 것으로 나타났다. 또한, PP2A의 ABC 아형을 억제하면 타우의 과인산화, 미세소관으로부터 타우의 해리 및 타우-유도 미세소관 안정화의 상실이 유도된다[Sontag et al., 1996]. 최근 PP2A가 인간 뇌의 총 타우 포스파타제 활성 중 대략 71%를 차지하는 것으로 나타났다[Liu et al., 2005]. 타우에의 PP2A의 활성 및 총 포스파타제 활성은 AD 환자의 뇌에서 크게 감소한 반면, PP2B와 같은 다른 포스파타제의 활성은 사실상 AD 환자의 뇌에서 증가하였다[Liu et al., 2005]. PP2A 활성은 인간 뇌의 대부분의 인산화 부위에서 타우 인산화의 수준과 부정적으로 서로 관련이 있다. 이는 PP2A가 인간 뇌의 여러 부위에서 그것의 인산화를 조절하는 주된 타우 포스파타제임을 나타내는 것이다. 이것은 타우의 비정상적인 과인산화는 부분적으로 AD 뇌에서의 PP2A 활성의 하향조절에 기인한 것이며, PP2A의 활성을 증가시키도록 작용할 수 있는 제제 및 특히 PP2A의 ABC 아형 은 신경변성 질환의 발달을 치료하거나 예방하는데 있어서 임상적으로 유용성을 가진다는 것을 의미한다.

또한, 비정상 α-시뉴클레인(synuclein) 단백질이 존재하는 신경변성 장애와 관련이 있을 수 있다는 증거가 증가하고 있다. 타우 및 α-시뉴클레인 병증은 모두 알츠하이머병, 파킨슨병, 괌(Guam)-파킨슨-ALS-치매 복합증 및 α-시뉴클레인의 돌연변이에 의해 야기된 파킨슨병에서 일어난다(Duda et al., 2002, Forman et al., 2002, Ishizawa et al., 2003).

단백질 α-시뉴클레인은 파킨슨병(PD, Parkinson's disease)의 병태생리학에서 중요한 역할을 하는 것처럼 보인다. 주로 α-시뉴클레인으로 이루어진 루이 소체는 PD의 병리학적 특질이다(Spillantini et al., 1997; Spillantini et al., 1998b).

α-시뉴클레인은 PD의 병태생리학에서 결정적인 역할을 하는 것을 판단되는데, 그러한 이유는 그것이 루이 소체에 축적되기 때문이기도 하고 유전학 연구를 통해 가족성 PD와 관련이 있는 α-시뉴클레인의 돌연변이가 확인되었기 때문이기도 하다(Kruger et al., 1998; Polymeropoulos et al., 1997; Singleton et al., 2003; Spillantini et al., 1998b; Zarranz et al., 2004).

α-시뉴클레인의 A53T 및 A30P 돌연변이는 α-시뉴클레인의 응집 경향의 증가에 의한 PD의 원인이 되는 것으로 보인다. 상기 돌연변이는 모두 자발적으로 또는 외인성 인자, 이를 테면 금속 및 산화적 스트레스에 대한 반응으로 응집하려고 하는 α-시뉴클레인의 경향을 증가시킨다(Conway et al., 2000; Hashimoto et al., 1999; Kruger et al., 1998; Ostrerova-Golts et al., 2000; Paik et al., 1999, 2000; Polymeropoulos et al., 1997).

α-시뉴클레인의 A53T 및 A30P 돌연변이는 또한 유전자이식 마우스 및 초파리에서 연령-의존성 α-시뉴클레인 응집 및 신경세포 손상을 야기한다(Feany and Bender, 2000; Giasson et al., 2002; Kahle et al., 2001; Masliah et al., 2000). 이러한 결과들은 신경변성 연구에 대한 α-시뉴클레인의 타당성을 강조한다.

비정상적으로 인산화된 타우는 산발성 PD 환자들에서 발견된 루이 소체에 존재하며, α-시뉴클레인 병증을 가진 영역 근처의 신경세포에 있는 신경세포에서 발생한다(Ishizawa et al., 2003). 시험관내 증거는 또한 α-시뉴클레인이 시험관내에서 타우를 속박하는 것과 같이 α-시뉴클레인 및 타우를 연결하고 시험관내에서 단백질 키나제 A에 의한 타우 인산화를 자극한다(Giasson et al., 2003; Jensen et al., 1999). α-시뉴클레인이 시험관내에서 타우 원섬유화(fibrillization)를 증가시키는 점 및 비정상 타우 원섬유가 돌연변이 A53T α-시뉴클레인을 과발현하는 증후성 유전자이식 마우스의 뇌에 존재한다는 점이 최근 결과로 나타났다(Giasson et al., 2003).

문헌[Frasier M et al., 2005]에는 A30P α-시뉴클레인 응집이 타우 병증과 함께 일어난다는 것과 α-시뉴클레인 응집이 A30P α-시뉴클레인을 과발하는 유전자이식 마우스에서 타우 병증과 나란히 일어난다는 것이 개시되어 있고, 증후성 A30P α-시뉴클레인 유전자이식 마우스가 비정상 타우 인산화를 나타내는 것과 인 산화가 c-준(jun) 키나제의 활성과 서로 관련이 있다는 것이 개시되어 있다.

α-시뉴클레인 (α-Syn)의 응집과는 별도로, 산화적 스트레스 및 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP)과 같은 특정의 신경독에의 노출은 PD의 발병기전으로 이어진다. MPTP는, PD에서 알 수 있는 바와 같이 α-Syn 발현 수준 및 응집의 증가와 관련이 있는 마우스 및 영장류의 흑질선조체 도파민성 경로의 선택적 변성을 유도하지만 실제 루이 소체를 유도하지 않는데(Dauer and Przedborski, 2003), MPTP의 연속 투여시에는 유비퀴틴(ubiquitin) 및 α-시뉴클레인에 대한 면역반응성 흑질 봉입체(inclusion)의 형성을 일으킨다(Fornai et al., 2005). 특정 루이 소체의 또 다른 성분은 비정상적으로 인산화된 타우이다(Ishizawa et al., 2003). 응집체 또는 봉입체로서 α-Syn 및 타우의 신경세포성 공국재화(neuronal colocalization), 또는 내부 특정 루이 소체 또는 루이 소체 유사 봉입체는 가족성 알츠하이머병(AD), 다운 증후군 및 루이소체 질환을 가진 환자들의 뇌에서 보고되었다(Kotzbauer et al., 2001; Lippa et al., 1999; Arima et al., 1999; Iseki et al., 1999).

타우와 α-Syn 사이의 유사성으로는 신경접합전(presynaptic) 신경세포에서의 발현, 생체내 긴 반감기, 열 안정성을 가지게 하는 "선천적으로 접히지 않는" 성질, 및 집합 원섬유의 핵심을 형성하는 소수성 잔기의 신장(stretch)을 통해 원섬유화하려는 경향이 포함된다(Friedhoff et al., 2000; Serpell et al., 2000).

[396/404]S 3E 이중 돌연변이체[타우의 가장 긴 인간 아형인 ht40의 396번 및 404번 위치에 있는 2 개의 세린 잔기가 글루탐산 잔기로 대체되는 PHF-1 인산화 부위를 모방하는 의사인산화(pseudophosphorylation) 작제물] 타우에 의한 다른 시험관내 데이터에 의해, Ser396/404에서의 과인산화가 타우의 C 말단으로 하여금 더욱 확장된 형상을 취하게 하여 타우 올리고머화에 대한 그의 억제 효과를 변화시키고 미세섬유(filament) 형성률을 증가시킨다는 것이 알려졌다(Abraha et al., 2000).

문헌[Duka T et al., 2006]에는 현재, MPTP에 의해 유도된 중뇌 도파민성 신경세포내 α-Syn 발현 수준의 증가가 PHF-1 결합 부위(Ser396/404)에서의 타우의 인산화 패턴의 변화를 촉진하여 두 단백질의 위치착오(mislocation)를 야기하고, 사르코실(sarkosyl)-불용성 과인산 타우 수준의 증가와 함께 상호면역침전(coimmunoprecipitation)이 증가하는데, 이는 MPTP에 의해 유도된 파킨슨증 및 신경독성의 초기단계가 Ser396/404에서의 타우의 α-Syn-개재 과인산화임을 제시한다는 것이 개시되어 있다.

MPTP가 세포골격 결합 분획과 관련된 인산화된-타우의 수준 감소와 함께 미세소관으로부터 α-Syn의 해리 증가를 야기한다는 조사 결과는 또한 신경변성 과정의 토대가 되는 메카니즘(들)과 관련성이 있을 수 있다. 타우의 과인산화는 미세소관에 대한 타우의 친화도를 크게 감소시켜 그들의 불안정화를 유발한다(Drechsel et al., 1992; Biernat et al., 1993; Michaelis et al., 2002). 그에 더하여, 인산화된 타우는 미세소관으로부터 MAP1 및 MAP2과 같은 다른 미세소관 결합 단백질과 결합하거나 그것들을 고갈시키는 것으로 알려져있다(Iqbal and Grundke-Iqbal., 2005). 게다가, α-Syn은 축삭 이동에 관여할 가능성이 있는(Sidhu et al., 2004) 미세소관에 결합하는 것으로 알려져 있으므로(Wersinger and Sidhu, 2005), 미세소관으로부터 이러한 단백질의 해리는 미세소관의 불안정성을 더욱 악화시켜 세포골격망(cytoskeletal network) 및 세포 항상성을 붕괴시킬 것으로 판단된다. 따라서, 미세소관으로부터α-Syn의 해리 및 미세소관에 결합된 타우의 특성 이상은 봉입체 형성과 관련된 신경변성 과정을 유도하는 사례의 일환을 이루는 것을 추가로 포함할 수 있다.

MPTP에 의해 유도된 비정상적인 α-Syn 수준은 인산화된-타우 형성을 조절하며, 특히 타우의 PHF-1 형태는 신경세포 생체기능의 관련 손상 및 PHF 형성 둘 다의 초기 발달에 대한 식견을 제공하고, MPTP에 의해 유도된 파킨슨 증후군 또는 신경독성이 시뉴클레오병증(synucleopathies)을 연상케하는 방식으로 α-Syn의 변경을 수반하는 타우병증(tauopathy)일 수 있다는 것을 제시한다.

이는 AD의 발병기전 동안 동원되는 것으로 알려진 단백질(타우)의 이상이 또한 AD와 관련이 없는 뇌의 영역이지만 파킨슨증에 동원될 수 있고, 이로 인해 특정 신경변성 질환의 기원에 있어서 상당히 중복된다는 것을 제시한다는 것을 제안하는 것이다. 이것은 관련이 없어 보이는 신경변성 질환이 실제 신경세포 변성을 개시하는 공통적인 유발 사례 및 후속적인 병변을 가진다는 것을 제안하는 것이다.

타우 단백질의 인산화에 영향을 주고 신경변성 장애의 치료 또는 예방에 있어서 임상적으로 유용한 제제가 필요한다.

발명의 개요

본 발명은 단백질 포스파타제 PP2A의 활성이 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염에의 노출에 의해 증대될 수 있다는 발견에서 어느 정도 기초를 두고 있다. PP2A 활성의 증대는 i) GSK3β의 인산화를 감소시키고 그 결과로서 타우 단백질의 인산화를 감소시키는, Akt의 비활성화 및 탈인산화 및 ii) 타우 단백질의 직접적인 탈인산화라는 두 가지 접근법에 의해 타우 단백질의 인산화, 특히 과인산화를 감소시키거나 억제할 수 있다. 타우 단백질의 인산화, 특히 과인산화의 감소는 신경세포 및 신경교 세포에 비정상 타우 단백질의 축적 또는 침착을 감소시키거나 방지하며, 따라서 신경변성 장애의 치료 또는 예방에 유용하다.

따라서, 하나의 일면으로, 본 발명은 대상에게 유효량의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함하여 대상에서 신경변성 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일부 구체예로, 신경변성 질환은 타우병증이다. 일부 구체예로, 신경변성 질환은 α-시뉴클레오병증(synucleopathy)이다. 특정 구체예로, 신경변성 질환은 초로 치매, 노년 치매, 알츠하이머병 및 파킨슨병 중에서 선택된다.

본 발명의 또 다른 일면으로, 신경세포 또는 신경교 세포를 유효량의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염에 노출시키는 단계를 포함하여, 신경세포, 신경교 세포 또는 루이 소체에서 타우 단백질의 인산화를 억제하거나 감소시키는 방법이 제공된다. 일부 구체예로, 타우 단백질은 미세소관-관련 타우 단백질이다. 일부 구체예로, 타우 단백질은 신경원섬유 농축체(neurofibrillary tangle)에 존재한다. 일부 구체예로, 타우 단백질의 과인산화가 억제되거나 예방된다.

또 다른 일면으로, 본 발명은 PP2A를 유효량의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염에 노출시키는 단계를 포함하여, PP2A의 활성을 증대시키는 방법을 제공한다. 일부 구체예로, PP2A는 Akt를 탈인산화시키는 아형(isoform)이다. 일부 구체예로, PP2A는 타우 단백질, 특히 신경세포 및 신경교 세포 및 루이 소체에서 발견되는 미세소관-연관 타우 단백질을 탈인산화시키는 아형이다.

추가의 일면으로, 본 발명은 신경세포 또는 신경교 세포를 유효량의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염에 노출시키는 단계를 포함하여, 신경세포 또는 신경교 세포에서 GSK3β의 활성을 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 추가의 일면으로, 신경변성 질환의 치료용 또는 예방용 의약을 제조하기 위한 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도가 제공된다.

상기 폭넓게 개시된 방법 및 용도의 일부 구체예로, 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 신경변성 질환의 치료 또는 예방에 적합한 다른 치료제 또는 신경변성 질환의 증상을 경감시키는데 적합한 치료제와 병용하여 투여된다.

발명에 관한 설명

1. 정의

달리 정의되지 않는한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자들에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 발명의 실시 또는 시험에서 개시된 것들과 동일 또는 동등한 임의의 방법 및 재료가 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 재료를 개시한다. 본 발명의 목적을 위해, 다음의 용어를 아래 정의한다.

관사 "a" 및 "an"은 그 관사의 하나 또는 하나를 초과하는(즉, 적어도 하나)의 문법상의 대상을 나타내기 위해 본원에 사용된다. 예로서, "하나의 원소(an element)"는 하나의 원소 또는 하나를 초과하는 원소를 의미한다.

본원에 사용된 용어 "약"은 기준이 되는 수량, 수준, 값, 치수, 크기 또는 양에 대하여 30%, 20% 또는 10% 정도로 차이가 나는 수량, 수준, 값, 치수, 크기 또는 양을 의미한다.

본 명세서 및 다음에 오는 청구범위 전체에 걸쳐, 달리 필요로 되지 않는한, 단어 "포함한다(comprise)"와 "포함한다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 어미변화어는 언급된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 포함을 의미하는 것이며, 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹의 배제를 의미하지 않은 것으로 이해될 것이다.

본원에 사용된 용어 "탈인산화"는 단백질과 같은 생화학적 실체로부터 인산기(PO₄ ^2-)의 화학적 제거를 의미한다. 세포 조건하에서, 탈인산화는 포스파타제와 같은 효소에 의해 효소적으로 달성된다.

본원에 사용된 용어 "신경교 세포" 및 "신경교 세포들"은 중추 신경계에서 신경세포에 대한 구조적 및 대사적 지지체를 제공하는 비신경세포를 의미한다. 신경교 세포는 또한 신경아교 또는 아교로 언급될 수도 있다.

용어 "과인산화"는 단백질과 같은 생화학적 실체 위에 있는 이용가능한 인산화 부위 모두가 인산화되는 환경을 의미한다. 생화학적 실체에 대한 추가적인 인산화가 일어날 수 없다. 어구 "과인산화를 억제하거나 감소시키는"은 생화학적 실체 위에 있는 부위 모두가 인산화되는 것을 방지하는 것과 그의 인산화 부위 모두가 인산화된 생화학적 실체의 수를 감소시키는 것을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "와 병용하여"는 신경변성 질환에 대한 그의 효과가 동일한 시간 기간에 걸쳐 적어도 부분적으로 발생하도록 대상을 적어도 2 가지 제제로 치료하는 것을 의미한다. 적어도 2 가지 제제는 단일 조성물로 동시에 투여될 수 있거나, 각각의 제제가 분리된 조성물로 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

용어 "루이 소체" 및 "루이 소체들"은 신경 세포(nerve cell)에서 발달하는 단백질의 비정상적 응집을 의미한다. 루이 소체에서 주된 단백질 응집체는 α-시뉴클레인으로 이루어진다.

본원에 사용된 용어 "신경변성 질환"은 신경세포의 손상 또는 변성에 의해 특징지워지는 신경계 질환을 의미한다. 신경변성 질환으로는 기억 상실 및/또는 치매와 관련이 있는 신경변성 질병 및 신경변성 운동 장애가 포함된다. 신경변성 질환으로는 타우병증(tauopathy) 및 α-시뉴클레오병증(synucleopathy)이 포함된다. 신경변성 질환의 예로는 초로 치매, 노년 치매, 알츠하이머병, 염색체 17과 연관된 파킨슨증(FTDP-17), 진행성 핵상 마비(progressive supranuclear palsy, PSP), 피크병(Pick's disease), 원발성 진행성 실어증, 전두측두 치매, 피질기저핵(corticobasal) 치매, 파킨슨병, 치매를 지닌 파킨슨병, 루이 소체를 지닌 치매, 다운 증후군, 다계통 위축증(multiple system atrophy), 근위축성 축삭 경화증(ALS, amyotrophic lateral sclerosis) 및 할러보르덴-스파츠 증후군(Hallervorden-Spatz syndrome)이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

본원에 사용된 용어 "신경원섬유 농축체(neurofibrillary tangle)"는 뇌에 위치하며 이중나선 사상체(신경미세섬유 및 미세소관)의 밀집 배열로 이루어진 비이상적 구조를 말한다. 신경원섬유 농축체로는 타우 단백질, 특히 미세소관-관련 타우 단백질이 포함된다. 뇌에 존재하는 신경원섬유 농축체의 수가 대상에서 치매의 정도와 상관관계가 있는 것으로 여겨진다. 신경원섬유 농축체는 알츠하이머병의 두드러진 특징이다.

본원에 사용된 용어 "신경세포(neuron)"는 정보를 수용하고 처리하며 전달하도록 특수화된(specialised) 중추신경계에서 발견되는 세포를 말한다. 신경세포는 또한 신경 세포(nerve cell)로 언급될 수도 있다.

본원에 사용된 용어 "영양적 양(nutritional amount)"으로는 평균 일일 섭취량을 제공하는 셀레늄의 양을 포함한다. 미합중국에서, 평균 일일 섭취량은 80-120 ㎍/일이다.

셀렌산염에 관하여 본원에 사용된 "약제학적 염"이란 인간 및 동물 투여에 대하여 독성적으로 안전한 금속 이온염을 말한다. 예를 들어, 적합한 약제학적으로 허용가능한 염으로는 염산, 황산, 인산, 질산, 탄산, 붕산, 설팜산 및 브롬화수소산과 같은 약제학적으로 허용되는 무기산의 염 또는 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 타르타르산, 말레산, 하이드록시말레산, 푸마르산, 말레산, 시트르산, 락트산, 점액산, 글루콘산, 벤조산, 숙신산, 옥살산, 페닐아세트산, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산, 벤젠설폰산, 살리실산, 설파닐산, 아스파르트산, 글루탐산, 에데트산, 스테아르산, 팔미틴산, 올레산, 라우린산, 판토텐산, 탄닌산, 아스코르브산 및 발레산과 같은 약제학적으로 허용되는 유기산의 염이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

염기성 염으로는 약제학적으로 허용되는 양이온, 이를 테면 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 철, 니켈, 아연, 암모늄 및 알킬암모늄으로 형성된 것들이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

염기성 질소-함유 기로는 저급 알킬 할로겐화물, 이를 테면 메틸, 에틸, 프로필 및 부틸의 염화물, 브롬화물 및 요오드화물; 디메틸 및 디에틸 황산염과 같은 디알킬 황산염; 등과 같은 제제로 4급화될 수 있다.

셀렌산염의 적합한 금속 이온 염으로는 나트륨, 칼륨, 리튬, 마그네슘, 칼슘, 철, 니켈, 아연, 암모늄 및 알킬암모늄 염이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 일부 구체예로, 상기 염은 리튬 셀렌산염이 아니다. 셀렌산염의 바람직한 염은 나트륨 염, Na₂SeO₄이다.

본원에 사용된 용어 "인산화"는 단백질과 같은 생화학적 실체에 대한 인산기(PO₄ ^2-)의 화학적 첨가를 말한다. 세포 조건하에서, 인산화는 키나제와 같은 효소에 의해 효소적으로 달성된다. 어구 "인산화를 억제하거나 감소시키는"은 과인산화에서와 같이 모든 인산화 부위의 인산화를 방지하는 것을 비롯하여, 생화학적 실체 위에 있는 하나 이상의 인산화 부위의 인산화를 방지하는 것을 포함한다. 이러한 어구는 또한 하나 이상의 인산화 부위에서 일어나는 인산화를 방지함으로써 또는 생화학적 실체 위에 있는 하나 이상의 인산화 부위에서 일어나는 탈인산의 결과로서 생화학적 실체의 인산화 정도를 감소시키는 것을 포함한다.

본원에 상호교환적으로 사용된 용어 "대상" 또는 "개체" 또는 "환자"는 예방 또는 치료하기에 적합한 임의의 대상, 특히 척추동물 대상, 더욱 특히는 포유동물 대상을 말한다. 본 발명의 범위내에 있는 적합한 척추 동물로는 영장류, 조류, 가축 동물(예, 돼지, 양, 소, 말, 당나귀), 실험실 시험 동물(예, 토끼, 마우스, 래트, 기니아 피그, 햄스터), 반려 동물(예, 고양이 및 개) 및 포획 야생 동물(예, 여우, 사슴, 들개)이 포함되나 이들에 한정되지 않는다. 바람직한 대상은 신경변성 질환, 특히 알츠하이머병 또는 치매의 치료 또는 예방을 필요로 하는 인간이다. 그러나, 전술한 용어가 증상이 존재한다는 것을 의미하지는 않는다.

본원에 사용된 용어 "초영양적(supranutritional)"은 영양상 필요하다고 고려되는 양보다 많은 양을 의미한다. 미합중국에서, 셀레늄의 평균 일일 섭취량은 80-120 ㎍/일이다. 셀레늄의 초영양적 양은 일일 권장량 이상으로 대상에게 셀레늄을 제공한다. 예를 들어, 셀레늄의 초영양적 양은 1일 3 ㎍/kg 내지 20 ㎎/㎏, 0.015 ㎎/㎏ 내지 20 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏ 내지 20.0 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏ 내지 14 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏ 내지 13 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏ 내지 12 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏ 내지 9 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏ 내지 8 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏ 내지 7 ㎎/㎏, 0.1 ㎎/㎏ 내지 6 ㎎/㎏, 0.15 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏, 0.15 ㎎/㎏ 내지 4 ㎎/㎏, 0.15 ㎎/㎏ 내지 3 ㎎/㎏, 0.15 ㎎/㎏ 내지 2 ㎎/㎏, 0.15 ㎎/㎏ 내지 1 ㎎/㎏, 특히 1일 0.1 ㎎/㎏ 내지 14 ㎎/㎏, 0.07 ㎎/㎏ 내지 6.5 ㎎/㎏ 또는 0.15 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏, 더욱 특히는 1일 0.07 ㎎/㎏ 내지 2 ㎎/㎏일 수 있다.

본원에 사용된 용어 "α-시뉴클레오병증"은 뇌의 신경 세포에서 α-시뉴클레인의 응집 또는 비정상적인 α-시뉴클레인에 관여하는 신경변성 장애 또는 질환을 의미한다. α-시뉴클레오병증으로는 파킨슨병, 치매를 지닌 파킨슨병, 루이 소체를 지닌 치매, 피크병, 다운 증후군, 다계통 위축증, 근위축성 축삭 경화증(ALS) 및 할러보르덴-스파츠 증후군이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

신경변성 질환을 치료 또는 예방하거나 타우 단백질의 인산화를 억제 또는 감소시키거나, GSK3β의 활성을 억제하는 내용에서 용어 "유효량"은 PP2A의 활성을 증대시키는데 유효하고, 특히 신경변성 질환과 관련이 있는 증상 초래의 예방, 이러한 증상의 억제 및/또는 현존하는 증상의 치료에 유효한 단일 투여 또는 일련의 투여 중 일부로서 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 양을 투여하거나 첨가하는 것을 의미한다. 유효량은 치료하고자 하는 개체의 건강 및 신체 조건, 치료하고자 하는 개체의 분류 집단, 조성물의 처방, 의학적 상태의 평가 및 다른 관련 요인에 따라 변할 것이다. 이 양은 일상적인 시험에 의해 결정될 수 있는 비교적 넓은 범위내에 속할 것으로 예측된다. 특정 구체예에서, 유효량은 영양적 또는 초영양적 양이다.

본원에 사용된 용어 "타우병증"은 뇌의 신경세포 및 신경교 세포에서 비정상 타우 단백질 아형의 침착과 관련이 있는 신경변성 장애 또는 질병을 말한다. 타우병증으로는 과인산화된 타우 단백질을 비롯하여 타우 단백질이 비정상적으로 인산화되는 질환 및 장애가 포함된다. 타우병증으로는 초로 치매, 노년 치매, 알츠하이머병, 염색체 17과 연관된 파킨슨증(FTDP-17), 진행성 핵상 마비(PSP), 피크병, 원발성 진행성 실어증, 전두측도 치매 및 피질기저핵 치매가 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

2. 신경변성 질환을 치료하거나 예방하는 방법

본 발명은 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이 PP2A의 활성을 증대시키며, 이어 GSK3β에 의한 타우 단백질 인산화의 감소 및/또는 타우 단백질의 탈인산화 속도의 증가를 일으키는데 유효하다는 결정에 부분적으로 기초한 것이다. 본 발명의 방법은 일반적으로 신경세포 또는 신경교 세포에 존재하는 PP2A를 PP2A 활성을 증대시키는 양의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염에 노출시키는 단계를 포함한다. 적합하게도, PP2A 활성을 증대시키는 양의 셀렌산염은 영양적 또는 초영양적 양의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 일부 구체예로, 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 특히 셀렌산염 또는 그의 염의 양은 1 일 약 0.015 ㎎/㎏ 내지 약 20 ㎎/㎏이고, 통상적으로는 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 14 ㎎/㎏, 0.07 ㎎/㎏ 내지 6.5 ㎎/㎏ 또는 0.15 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏, 예를 들어 1일 0.07 ㎎/㎏ 내지 2 ㎎/㎏이다.

본 발명은 신경변성 질환을 치료하거나 예방하는데 효과적으로 사용될 수 있다. 신경변성 질환으로는 기억 상실과 관련된 신경변성 질환 및 신경변성 운동 장애가 포함되고, 타우병증 및 α-시튜클레오병증이 포함된다. 신경변성 질환의 예시적인 예로는 초로 치매, 노년 치매, 알츠하이머병, 염색체 17과 연관된 파킨슨증(FTDP-17), 진행성 핵상 마비(PSP), 피크병, 원발성 진행성 실어증, 전두측두 치매, 피질기저핵 치매, 파킨슨병, 치매를 지닌 파킨슨병, 루이 소체를 지닌 치매, 다운 증후군, 다계통 위축증, 근위축성 축삭 경화증(ALS) 및 할러보르덴-스파츠 증후군이 포함된다. 바람직한 구체예로, 본 발명은 타우병증, 특히 알츠하이머병 및 치매를 치료하거나 예방하는데 적합하다. 다른 구체예로, 본 발명은 α-시뉴클레오병증, 특히 파킨슨병을 치료하거나 예방하는데 적합하다. 적합하게도, 유효량의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 영양적 또는 초영약적 양의 셀렌산염이다. 일부 구체예로, 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 양은 1일 약 0.015 ㎎/㎏ 내지 약 20 ㎎/㎏이고, 통상적으로는 약 0.1 ㎎/㎏ 내지 14 ㎎/㎏ 또는 0.07 ㎎/㎏ 내지 6.5 ㎎/㎏ 또는 0.15 ㎎/㎏ 내지 5 ㎎/㎏이며, 예를 들어 1일 0.07 ㎎/㎏ 내지 2 ㎎/㎏이다. 바람직한 구체예로, 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 셀렌산 나트륨(Na₂SeO₄)이다.

일부 구체예로, 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 신경변성 질환을 치료하거나 예방하기 위한 또 다른 치료제와 병용하여 대상에게 투여된다. 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염과 병용하여 사용될 수 있는, 신경변성 질환을 치료하거나 예방하기 위한 치료제의 예시적인 예로는 콜린에스테라제 억제제, 이를 테면 타크린(Tacrine, Cognex^®), 도네페질(Donepezil), 갈란타민(Galantamine) 및 리바스티그민(Rivastigmine); N-메틸-D-아스파라긴산염(NMDA) 수용체 길항제, 이를 테면 메만틴(Memantine); 에스트로겐 치료제, 이를 테면 프레마린(Premarin), 비스테로이드성 항염증성 약물(NSAID), 이를 테면 아스피린(Aspirin) 및 이부프로펜(Ibuprofen), 레보도파(Levodopa, L-Dopa), 도파 데카르복실라제 억제제, 이를 테면 카비도파(Carbidopa) 및 벤세라지드(Benserazide), 또는 도파 데카르복실라제 억제제와 L-Dopa의 배합제, 이를 테면 시네메트(Sinemet^®) 및 스타레보(Stalevo^®), 도파민 작용제, 이를 테면 브로모크립틴(Bromocriptine)(Parlodel^®), 페르골리드(Pergolide)(Permax^®), 프라미펙솔(Pramipexole)(Mirapex®), 로피니롤(Ropinirole)(Requip^®), 카베르골린(Cabergoline), 아포모르핀(Apomorphine)(APOKYN^TM) 및 리수리드(Lisuride), 모노-아민 옥시다제 B 억제제, 이를 테면 셀레길린(Selegiline)(Eldepryl^® 및 Carbex^®) 및 라사길린(Rasagiline)(Azilect^®), 항콜린작용성 제제, 이를 테면 벤조트롭핀 메실레이트(Cogentin^®) 및 트리헥시페니딜 염산염(Artane^®) 및 COMT 억제제, 이를 테면 엔타캅폰(Entacapone)(Commtan^®) 및 톨캅폰(Tolcapone)(Tasmar^®), 또는 기타 의약, 이를 테면 리바스티그민(rivastigmine) 타르트산염(Exelon^®) 및 아만타딘(Amantadine)(Symmetrel^®); 또는 레보도파, 도파 데카르복실라제 억제제, 도파민 작용제, 모노-아민 옥시다제 B 억제제, 항콜린작용성 제제 또는 COMT 억제제 중 둘 또는 그 이상의 혼합물이 포함되나 이들에 한정되지 않는다.

병용 치료제는 유효량의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 보통 셀렌산염의 부재하에 사용되는 양으로 신경변성 질환을 치료하거나 예방하기 위해 사용되는 제제와 함께 포함할 수 있다. 예를 들어, 타크린 염산염은 40 ㎎/일 내지 160 ㎎/일의 양으로 AD와 같은 신경변성 질환을 가진 환자들에게 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염과의 배합물의 일부로서 투여될 수 있고, 도네페질은 5-10 ㎎/일의 양으로 투여될 수 있다. 프레마린은 치매 환자에서 1.25 ㎎/일의 접합 마 에스트로겐(CEE, conjugated equine estrogen)을 달성한 투여량으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 신경변성 장애의 치료에 사용되는 제제의 양은 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염과 동시-투여시 감소될 수 있다. 일부 구체예로, 병용은 상승 효과를 나타낼 수 있다.

본 발명의 특정 구체예는 대상에서 신경변성 질환을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 일반적으로 대상에게 유효량의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함한다. 이들 방법을 실시하기 위해, 대상을 관리하는 사람은 대상의 특정 조건 및 환경에 대하여 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 효과적인 투여형을 결정할 수 있다. 셀렌산염의 유효량은 증상 초래의 예방, 증상의 억제 및 증상의 치료를 비롯한 신경변성 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 양이다. 일부 구체예로, 유효량은 영양적 양이다. 다른 구체예로, 유효량은 초영양적 양이다. 특정 구체예로, 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 셀렌산 나트륨이다.

본 발명의 방법에 사용하기 위한 투여 방식, 투여되는 셀렌산염의 양 및 셀렌산염 제제를 이하에 기술하였다. 치료하고자 하는 신경변성 질환은 질환의 경과를 나타내는 하나 이상의 진단 파라미터를 적절한 대조군과 비교하여 측정함으로써 결정될 수 있다. 인간 대상의 경우에, "적절한 대조군"은 치료전의 개체일 수 있거나 플라시보로 치료한 인간(예, 연령-적합 또는 유사한 대조군)일 수 있다. 본 발명에 따르면, 신경변성 질환의 치료는 (i) 상기 질환에 대한 소인은 있으나 아직 상기 질환으로 진단되지 않은 대상에서 신경변성 질환을 예방하는 것(따라서, 신경변성 질환에 대한 예방적 치료가 되는 치료); (ii) 신경변성 질환을 억제하는 것(즉 신경변성 질환의 발달을 저지하는 것); 또는 (iii) 신경변성 질환으로 기인된 증상을 경감하는 것을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 방법은 신경변성 질환으로 진단받은 개체, 신경변성 질환에 걸린 것으로 의심을 받는 개체 또는 신경변성 질환에 걸리기 쉬운 것으로 알려진 개체 및 신경변성으로 발달할 가능성이 있는 개체를 치료하는데 적합하다.

상기 방법의 일부 구체예로, 신경변성 질환은 타우병증, 특히 알츠하이머병 또는 치매이고, 치료는 임의로 상기 개시된 타우병증을 치료하는데 적합한 또 다른 제제의 투여를 추가로 포함한다.

상기 방법의 다른 구체예로, 신경변성 질환은 α-시뉴클레오병증, 특히 파킨슨병이며, 치료는 임의로 상기 개시된 α-시뉴클레오병증을 치료하는데 적합한 또 다른 제제의 투여를 추가로 포함한다.

바람직한 구체예로, 셀렌산염은 셀렌산 나트륨이다.

본 발명의 방법으로 치료하기 위한 예시적인 대상은 척추동물, 특히 포유동물이다. 특정 구체예에서, 대상은 인간, 양, 소(cattle), 말, 소(bovine), 돼지, 개 및 고양이로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 바람직한 대상은 인간이다.

셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 약물 전달 분야에 공지된 임의의 다수의 기술에 따라 제제화될 수 있다. 물론, 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 다수의 수단에 의해 투여될 수 있는데, 제제 모두가 투여 경로 모두에 적합하다는 것은 아님을 유의해야 한다. 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 고체 또는 액체의 형태로 투여될 수 있다. 적용은, 경구, 직장, 비강, 국소(구강 및 설하 포함), 또는 흡입에 의한 것일 수 있다. 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 통상의 약제학적으로 허용되는 보조제, 담체 및/또는 희석제와 함께 투여될 수 있다.

고체의 적용 형태는 정제, 캡슐제, 산제, 환제, 향정제, 좌제 및 과립의 투여 형태를 포함한다. 이들은 또한 담체 또는 첨가제, 이를 테면 향미제, 염료, 희석제, 연화제, 결합제, 방부제, 지속화 제제 및/또는 봉입용 재료를 포함할 수 있다. 액체의 적용 형태는 용액, 현탁액 및 유액을 포함한다. 이들은 또한 상기 언급된 첨가제와 함께 제공될 수 있다.

셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용액 및 현탁액은 용이 사용하기에 적합한 점도를 가진 경우 주사될 수 있다. 주사하기에는 너무 점도가 큰 현탁액은 필요에 따라 이러한 목적을 위해 설계된 장치를 사용하여 주입될 수 있다. 서방 형태는 일반적으로 비경구 또는 장내 수단을 통해 투여된다. 비경구 투여는 본 발명을 실시하기 위해 사용된 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 또 다른 투여 경로이다. "비경구"는 주사 및 비강, 질내, 직장 및 구강 투여에 적합한 제제를 포함한다.

셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 투여는 경구 장기 투여 제제를 포함할 수 있다. 경구 투여 제제는 바람직하게는 1일 1회 내지 1일 3회 서방성 캡슐제 또는 정제의 형태로 또는 다르게는 수성 용액으로 투여된다. 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 매일, 연속적으로, 주 1회 또는 주 3회 정맥내 투여될 수 있다.

셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 투여는 매일 투여를 포함하며, 서방성 캡슐제 또는 정제의 형태의 경우 1일 1회, 수용액의 경우 1일 1회가 바람직하다.

셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 및 신경변성 질환을 치료하는데 적합한 적어도 하나의 제제의 배합물이 고체 또는 액체의 형태로 단일 제제 또는 조성물 또는 분리된 제제 또는 조성물로 투여될 수 있다. 일부 구체예로, 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 및 신경변성 질환 치료용 제제는 단일 정제 또는 캡슐제로서 또는 분리된 정제 또는 캡슐제로서 경구적으로 투여된다. 다른 구체예로, 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 및 신경변성 질환 치료용 제제는 단일 조성물 또는 분리된 조성물로 정맥내 투여된다.

본 발명 또한 영양적 또는 초영양적 양의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 신경변성 질환 치료용 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다. 일부 구체예로, 상기 조성물은 약 0.5 ㎎ 내지 약 1.0 g, 예를 들어 5 ㎎ 내지 450 mg의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 약제학적으로 허용되는 담체를 함유한다. 일부 구체예로, 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 약 5.0 ㎎ 내지 약 700 ㎎ 또는 5 ㎎ 내지 450 ㎎의 양으로 존재한다. 예시적은 예로, 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 단일 또는 분할된 일일 용량에 대하여 약 1.6 ㎎ 내지 450 ㎎, 5 ㎎ 내지 450 ㎎, 7.5 ㎎ 내지 250 ㎎, 특히 50 ㎎ 내지 200 ㎎, 예를 들어 50 ㎎ 내지 100 ㎎ 또는 100 ㎎ 내지 150 ㎎이다. 일부 구체예로, 약학 조성물은 타우병증, 특히 알츠하이머병 또는 치매를 치료하거나 예방하는데 유용하다. 다른 구체예로, 상기 약학 조성물은 α-시뉴클레오병증, 특히 파킨슨병을 치료하거나 예방하는데 유용하다.

셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 약학 조성물은 신경변성 질환을 치료하거나 예방하기 위한 또 다른 제제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 콜린에스테라제 억제제, 이를 테면 타크린, 도네페질, 갈란타민 또는 리바스티그민, N-메틸-D-아스파라긴산염(NMDA) 수용체 길항제, 이를 테면 메만틴, 에스트로겐 제제, 이를 테면 프레마린 또는 비스테로이드성 항염증성 약물(NSAID), 이를 테면 아스피린 또는 이부프로펜, 레보도파, 도파 데카르복실라제 억제제, 레보도파와 도파 데카르복실라제 억제제 및/또는 COMT 억제제의 배합물, 도파민 작용제, 모노아민 옥시다제 B 억제제, 항콜린작용성 제제, COMT 억제제 또는 다른 의약, 이를 테면 리바스티그민 타르트산염 또는 아만타딘을 함유할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 비면역원성이며 셀렌산염과 생체적합성일 뿐만 아니라 무손상 분자(intact molecule)로서 생체흡수(bioabsorption), 생분해(biodegradation), 제거(elimination)가 가능한 추가의 임의의 성분을 포함할 수 있다. 제제는 즉시 사용형(ready-to-use form)으로 공급될 수 있거나 투여전 비히클의 첨가를 필요로하는 무균 분말 또는 액체로서 공급될 수 있다. 무균이 바람직한 경우, 제제는 무균 조건하에서 제조될 수 있고, 혼합물의 개개 성분은 무균일 수 있거나, 제제는 사용전에 무균 여과될 수 있다. 이와 같은 용액은 또한 완충액, 염, 부형제, 방부제 등과 같으나 이들에 한정되지 않는 적절한 약제학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다.

일부 구체예로, 서방성 경구 제제는 본 발명의 방법으로 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하기 위해 사용된다. 이들 제제는 일반적으로 혈류에의 흡수를 지연시키기 위해, 용해도가 낮은 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 그에 더하여, 이들 제제는 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 흡수를 또한 지연시킬 수 있는 다른 성분, 제제, 담체 등을 포함할 수 있다. 생체내분해가 가능 또는 불가능한 마이크로캡슐화, 중합체 포획 시스템 및 삼투성 펌프가 또한 캡슐 또는 매트릭스로부터의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 확산을 지연시키거나 조절하기 위해 사용된다.

셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염은 단독 또는 다른 제제의 일부로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 또한 신경변성 질환 치료용 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 제제가 예기된다.

본 발명의 본질이 보다 보다 명백하게 이해될 수 있고 실제적 효과를 발휘할 수 있도록, 본 발명의 특정의 바람직한 구체예를 다음의 비한정적인 실시예와 관련하여 지금부터 설명한다.

도면의 간단한 설명

도 1A는 PC3 세포에 대하여 무손상 세포 및 무세포 환경 모두에서 처리한 후의 인산화 Akt의 수준을 나타낸 비교 표시도이다.

도 1B는 칼바이오켐(Calbiochem) K-LISA^TMAkt 활성 키트(activity kit)를 사용하여 재조합 인간 Akt1의 효소적 활성에 대한 셀렌산 나트륨 및 강력하지만 비특이적 단백질 키나제 억제제인 스타우로스포린(staurosporine)의 영향을 비교한 그래프 표시도이다.

도 2A는 셀렌산 나트륨, 또는 적조류(red-tide algae)로부터의 폴리에테르 독소이자 인-단백질 포스파타제 PP1 및 PP2A를 억제하는 오카다인산(okadaic acid)의 존재하에서의 Ser⁴⁷³의 Akt 인산화를 나타낸 비교 표시도이다.

도 2B는 셀렌산 나트륨 또는 다수의 인-단백질 포스파타제 억제제인 타우타마이신(tautamycin), 오카다인산, 엔도살(endothall) A, 칼리쿨린(calyculin) A 및 사이클로스포린(cyclosporine) A의 존재하에서의 Ser⁴⁷³의 Akt 인산화를 나타낸 비교 표시도이다.

도 2C는 셀렌산염(ATE) 또는 소태아혈청(FCS, fetal calf serum)의 부재하(대조군) 및 존재하에 PP2A와 복합화된 Akt의 양을 나타내는, PC3 세포로부터 Akt의 면역침전(immunoprecipitation)을 나타내는 표시도이다.

도 2D는셀렌산 나트륨의 존재하 및 부재하에 PC3 세포에서의 포스파타제 PP2A 활성을 나타낸 그래프 표시도이다.

도 3은 PP2A 포스파타제 활성 및 기질 특이성(LCMT - 류신 카르복시메틸 전이효소, PME-1 - 포스파타제 메틸에스테라제 1, PTPA - 포스포릴로실 포스파타제 활성제)의 번역후 조절을 나타내는 개략적인 표시도이다.

도 4A(i)는 셀렌산 나트륨 또는 오카다인산(OKA)의 부재하(대조군) 또는 존재하에서의 상대적인 PP2A 포스파타제 활성을 나타내는 그래프 표시도이다.

도 4A(ii)는 PP2A의 포스파타제 작용에 의해 세린 포스포펩타이드로부터 방출되는 무기 인산염의 농도에 대한 셀렌산 나트륨의 영향을 나타내는 그래프 표시도이다.

도 4B는 PP1의 포스파타제 활성에 대한 셀렌산 나트륨의 영향을 나타내는 그래프 표시도이다.

도 5A는 산화 환경에서 PP2A의 불활성화를 나타내는 개략적인 표시도이다.

도 5B는 Akt 인산화의 수준에 대한 과산화수소 및 셀렌산 나트륨의 영향을 나타내는 표시도이다.

도 5C는 N-에틸말레이미드(NEM), 과산화수소, 셀렌산 나트륨 및 과산화수소와 함께 셀렌산 나트륨의 존재하에 PP2A 포스파타제에 존재하는 유리 설프하이드릴기의 그래프 표시도이다.

도 5D는 과산화수소 함유하거나 함유하지 않고 셀렌산 나트륨 또는 N-아세틸시스테인(NAC)으로 처리한 세포에 대한 형광 분포 막대그래프를 나타내는 그래프 표시도이다.

도 5E는 과산화수소, 셀렌산 나트륨, 과산화수소와 셀렌산 나트륨, NAC, 및 과산화수소와 NAC로 처리시 형광 세포의 평균 비율을 그래프로 나타낸 것이다.

도 6A는 셀렌산 나트륨(ATE 500 μM) 또는 엔도살 A(ETA 100 μM)를 함유하거나 첨가제를 함유하지 않는(대조군) 면역침전된 PP2A의 상대 포스파타제 활성을 그래프로 나타낸 것이다.

도 6B는 오카다인산(OKA 500 nM)으로 예비처리하거나 예비처리하지 않고 LY294003(LY 50 μM) 또는 셀렌산 나트륨(ATE 500 μM)으로 처리한 후 인산화된 p7OS6K의 수준을 나타낸 비교 표시도이다.

도 6C는 Akt를 인지하는 항체와 PP2A의 상이한 B 계통(family) 아단위(B 및 B')의 프로빙(probing)을 나타내는 비교 표시도이다. Akt는 PP2A의 B 계통 아단위와만 공침전하였다.

도 7은 GSK3β 활성화에 대한 셀렌산 나트륨의 영향을 나타내는 표시도이다.

도 8은 셀레노메티오닌이 Akt 인산화의 수준에 영향을 미치지 않은 반면, 셀렌산염은 Akt 인산화를 억제하였음을 나타내는 비교 표시도이다.

도 9는 Akt의 활성화에 대한 상이한 셀레늄 화합물의 영향을 나타내는 그래프 표시도이다. 처리: 대조군(con); 셀렌산 나트륨(ATE); 셀레노스산(Sel acid); 아셀렌산 나트륨(ITE); 이산화셀레늄(SeO₂); 셀레늄 황화합물(SeS₂); 메틸 셀레노시스테인(MSC); 및 셀레노시스테인(SeC). 총 Akt 단백질 수준과 상관관계가 있는 상대 활성 Akt 신호 강도를 y-축에 도시하였다. 본 그래프는 셀렌산 나트륨(ATE)만이 Akt의 활성화를 억제하여 인산화 Akt의 수준을 대조군(con) 수준 이하로 감소시킨다는 것을 나타내는 것이다. 반대로, 셀레노스산(Sel acid), 아셀렌산 나트륨(ITE), 이산화셀레늄(SeO₂), 셀레늄 황화합물(SeS₂), 메틸 셀레노시스테인(MSC), 셀레노시스테인(SeC) 모두는 Akt의 활성화를 대조군(con) 수준 이상으로 유도하였다.

도 1OA 및 1OB는 기질로서 pNPP(도 10A) 또는 세린 포스포펩타이드(도 10B)를 사용하여 pNPP 가수분해 에세이에서 PP2A 포스파타제 활성에 대한 셀렌산 나트륨(ATE), 아셀렌산 나트륨(ITE) 및 셀레노메티오닌(SeMet)의 영향을 나타낸 그래프 표시도이다.

도 11은 다양한 코팅 조건하에서 셀렌산 나트륨의 존재(＋) 또는 부재(-)하에 인간 신경모세포종 BE2M17 세포주를 항-인간 PHF-타우 항체로 면역블롯팅(immunoblotting)하는 것을 나타내는 비교 대표도이다.

도 12는 다양한 코팅 조건하에서 셀렌산 나트륨의 존재(＋) 또는 부재(-)하에 인간 신경모세포종 SY5Y 세포주를 항-인간 PHF-타우 항체로 면역블롯팅하는 것을 나타내는 비교 대표도이다.

도 13은 셀렌산 나트륨의 존재(＋) 또는 부재(-)하에 14 주령 Balb/c Nu Nu 수컷 마우스로부터의 총 뇌용해물을 항-인간 PHF-타우 항체인 AT1OO(도 13A), AT180(도 13B), AT270(도 13C) 및 HT-7(도 13D)로 면역블롯팅하는 것을 나타내는 비교 대표도이다.

도 14는 1회(도 14A) 및 2회(도 14B)의 오픈 필드(Open Field)(접촉주성)에서 시험된 행동에 대한 셀렌산 나트륨으로 처리한 영향을 나타내는 그래프 표시도이다.

도 15는 탈출 잠재시간(escape latency)(시간(초), 도 15A) 및 수영 경로(길이(미터), 도 15B)에 의해 측정된 바와 같이, 모리스 수중 미로 과제(Morris Water Maze task)에서 학습 및 기억 시험에 대한 셀렌산 나트륨의 처리 영향을 나타낸 대표 표시도이다.

도 16은 hTAU441 유전자이식 TMHT 마우스에서 HT7 면역조직화학에 의해 결정된 바와 같이, 해마(hippocampus)(도 16A) 및 편도체(amygdala)(도 16B)에서의 타우 로딩에 대한 셀렌산 나트륨의 영향을 나타낸 그래프 표시도이다.

도 17은 hTAU441 유전자이식 TMHT 마우스에서 AT180 면역조직화학에 의해 결정된 바와 같이, 해마(도 17A) 및 편도체(도 17B)에서의 타우 로딩에 대한 셀렌산 나트륨의 영향을 나타낸 그래프 표시도이다.

실시예 1

셀렌산 나트륨은 간접 메카니즘에 의해 Akt를 탈인산화한다.

셀렌산 나트륨은 무손상 전립선 암종 세포에서 Akt의 탈인산화를 일관되게 유도한다. 이러한 탈인산화는 Akt 단백질 자체에 대한 직접적인 억제 효과의 결과일 수 있거나, 다르게는 Akt 인산화의 음성 조절인자를 증가시키거나 Akt 인산화의 양성 조절인자를 억제함으로써 간접적으로 유사하게 달성될 수 있다. 직접 및 간접 메카니즘을 구별하기 위해, 무세포 환경에서의 활성 및 Akt 인산화에 대한 셀렌산 나트륨의 영향을 결정하였다. PC3 전립선 암종 세포를 100 ㎜ 디쉬에 플레이팅하고(plated), 70-80% 융합성 혈청을 밤새 고갈시켰다. 무손상 세포에서 Akt 인산화에 대한 영향을 결정하기 위해, PC3 세포를 신선한 무혈청 배지에서 1 시간동안 셀렌산 나트륨 500 μM으로 처리하였다. 세포를 용해시키고 활성화 특이 항체를 사용하여 면역블롯팅 분석에 의해 Akt Ser473 인산화의 수준을 결정한 다음 발현된 Akt 단백질의 수준을 비교하였다. 정제 Akt에 대한 영향을 결정하기 위해, 유사하게 플레이팅한 미처리 PC3 세포를 RIPA(음성 포스파타제 억제제)에 용해시키고, 엄격 세포(stringent cell)를 단백질-단백질 복합체의 유지를 최소화하는 완충액에 용해시켰다. pan-Akt 단일클론 항체를 사용하여 면역침전에 의해 동량(40-500 ㎍)의 완전 세포 용해물(whole cell lysate, WCL)로부터 Akt를 정제한 다음, 37℃의 가열 블록에서 1 시간동안 500 μM 셀렌산 나트륨과 함께 인큐베이션시켰다. 이어 면역침전된 단백질을 재용해시킨 다음 활성화된 Akt의 수준을 상술한 바와 같이 면역블롯팅 분석에 의해 결정하였다. 도 1A는 PC3 세포에 대하여 무손상 세포 및 무세포 환경 모두에서 처리한 후의 인산화 Akt의 수준을 비교한 것이다. 무손상 PC3 세포를 500 μM 셀렌산 나트륨으로 1 시간동안 처리하였더니 Akt 인산화가 현저하게 감소하였다.

이러한 발견내용을 확인하기 위해, 재조합 인간 Akt1의 효소적 활성에 대한 셀렌산 나트륨의 영향을 칼바이오켐(Calbiochem) K-LISA^TMAkt 활성 키트를 사용하여 측정한 다음 이것을 강력하지만 비특이적 단백질 키나제 억제제인 스타우로스포린의 영향과 비교하였다. 이러한 ELISA 기초 분석은 Akt에 의해 제 2 세린에서 인산화되는 바이오틴화 펩타이드 기질(GRPRTSSFAEG)을 사용한다. 셀렌산 나트륨 500 μM 또는 스타우로스포린 1 μM을 함유하거나 함유하지 않는 재조합 인간 Akt1 250 ng을 30℃에서 30 분동안 스트렙타비딘-코팅 웰에서 바이오틴화-Akt 기질과 함께 인큐베이션하였다. 이어, 결합 인산화 기질을 인-세린 검출 항체 이어 HRP-항체 접합체(antibody conjugate)로 검출하고, TMB 기질액으로 발색시켰다. 흡광도는 590 nm에 관련하여 450 nm에서 측정하였다. 흡광도의 평균 계산치((A₄₅₀-A₅₉₀-공시험(blank))로서 요약한 3 개의 독립적인 실험의 결과를 도 1B에 도시하였다. 상술된 관찰과 일치하게, 셀렌산 나트륨은 재조합 인간 Akt의 키나제 활성에 대하여 측정가능한 정도의 직접적인 영향은 미치지 않았다. 반대로, 비특이적 억제제 스타우로스포린은 Akt의 키나제 활성을 강하게 억제하였다.

요약하면, 이들 데이터에 따르면 셀렌산 나트륨이 Akt 활성에 대해 직접적인 억제 효과는 가지지 않는 것으로 나타났는데, 이는 관찰된 탈인산화는 간접적인 메카니즘을 통해 이루어졌음을 나타내는 것이다.

실시예 2

셀렌산 나트륨은 PP2A의 포스파타제 활성을 자극하여 Akt를 탈인산화한다.

최종(net) Akt 활성의 감소는 초기 Akt 인산화를 방지하거나 다르게는 Akt 탈인산화를 증가시킴으로써 간접적으로 달성될 수 있었다[Kohn et. al. 1996]. 그러나, 셀렌산 나트륨에 의해 유도된 Akt 인산화의 2상 반응(초기 일시적으로 증가한 다음 지속적으로 충분히 감소)이 제시된 바, 셀렌산 나트륨이 Akt 인산화에 대한 상향 키나제의 능력을 간단히 감소시킴으로써 작용하는 것처럼 보이지는 않았다. 따라서, 셀렌산 나트륨의 Akt 탈인산화 유도능에 대한 단백질 포스파타제 억제의 영향을 결정하였다. 먼저, 적조류로부터의 폴리에테르 독소이면서, Akt 탈인산의 조절에 관여하는 2 가지 포스파타제인 인-단백질 포스파타제 PP1 및 PP2A를 억제하는 오카다인산을 사용하였다[Fernandez et al., 2002]. 5×10⁵의 PC3 전립선 암종 세포를 6 웰 플레이트의 웰에 플레이팅하고 8 시간동안 부착시킨 다음 혈청을 밤새 고갈시켰다. 세포를 신선한 무혈청 배지에서 30 분동안 오카다인산 5 nM 또는 1000 nM을 사용하거나 사용하지 않고 예비처리한 다음 최종농도 500 μM이 되도록 1 시간동안 셀렌산 나트륨을 첨가하였다. 용해시킨 세포를 SDS-PAGE에 의해 분석한 다음, Ser473 잔기 부위가 인산화되었을 때 Akt를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 면역블롯팅 분석에 의해 Ser473 잔기에서의 Akt 인산화에 대하여 프로빙하고, 발현된 총 Akt 단백질의 수준을 비교하였다(도 2A). PTEN 결핍 PC3 세포를 셀렌산 나트륨으로 처리하였더니, 예측했던 대로 본 세포주에서 관찰된 만성적인 Akt 인산화의 높은 수준이 두드러지게 감소하였고, 이러한 감소는 5 nM 오카다인산과 함께 인큐베이션하기 전에는 영향을 받지 않았다. 반대로, 1000 nM의 오카다인산에 의한 예비처리는 셀렌산염 무함유 대조군에서 Akt 인산화를 증가시킬 뿐만 아니라 셀렌산 나트륨의 억제 효과를 완전히 제거한다.

관련된 포스파타제를 추가로 정제하기 위해, PPP 억제에 대한 그의 특이성이 상이한 넓은 패널의 인-단백질 포스파타제(PPP) 억제제를 셀렌산 나트륨의 Akt 인산화 억제 효과 제거능에 대하여 스크리닝하였다. 본 패널에는 타우타마이신 500 nM(PP1), 오카다인산 500 nM(저 투여량 PP2A>PP1), 엔도살 A(PP2A) 100 μM, 칼리쿨린 A 2 nM(저 투여량 PP1>PP2A), 칼리쿨린 A 10 nM(고 투여량은 PP1 및 PP2A) 및 사이클로스포린 A 400 ng/㎖(PP2B)이 포함되었다. PC3 전립선 암종 세포를 본질적으로 상술된 바와 같이 플레이팅하고, 마찬가지로 PPP 억제제를 사용하여 앞서 30 분동안 예비처리하거나 예비처리하지 않고 셀렌산 나트륨 500 μM으로 1 시간동안 처리하였다. 다시, 용해시킨 세포를 SDS-PAGE에 의해 분석한 다음, Ser⁴⁷³ 잔기 부위가 인산화되었을 때 Akt를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 면역블롯팅 분석에 의해 Ser⁴⁷³ 잔기에서의 Akt 인산화에 대하여 프로빙하고, 발현된 총 Akt 단백질의 수준과 비교하였다. 도 2B에 나타낸 바와 같이, PPP 억제제로 예비처리하지 않은 세포 또는 PP1 또는 PP2B에 특이적이었던 PPP 억제제로 처리한 세포에서, 셀렌산 나트륨에의 노출로 인해 Akt 인산화가 크게 감소한다. 반대로, PP2A에 특이적이거나 비교적 특이적 억제제인 저 투여량의 오카다인산 또는 엔도살 A로 처리한 세포는 셀렌산 나트륨에 의해 유도된 Akt 탈인산화를 완전히 차단하였다.

셀렌산 나트륨은 PP2A와 Akt 사이에 복합체 형성률을 증가시키거나, PP2A에 미리 결합된 PP2A의 고유 포스파타제 활성을 증가시키거나, 둘 다에 의해 PP2A 매 개 Akt 탈인산화를 증가시킬 수 있다. 이들 메카니즘의 구별을 돕기 위해, 셀렌산 나트륨이 PP2A와 Akt 사이의 복합체 형성 수준을 증가시키는 지를 먼저 결정하였다. 1×10⁶의 PC3 전립선 암종 세포를 6 ㎝ 디쉬에 플레이팅하고 8 시간동안 부착시킨 다음 혈청을 밤새 고갈시켰다. 세포를 신선한 무혈청 배지 또는 10% FCS에서 1.5 시간동안 500 μM 셀렌산 나트륨으로 처리하고 ELB 완충액에 용해시켰다. 총 Akt를 단일클론 항-Akt 항체를 사용하여 각각의 완전 세포 용해물 400 ㎍로부터 면역침전시키고 단백질 A-세파로스 비드(bead)로 포획하였다. 음성 대조군 용해물(공시험)은 면역침전 항체를 뺀 것이다. 비특이적 결합을 감소시키기 위해 세척한 후, 비드를 3X SDS 단백질 로딩 완충액에서 5 분간 비등시키고, 고속으로 원심분리 한 다음 성청액을 SDS-PAGE에 의해 분석하였다. 포스파타제의 촉매 아단위를 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 면역블롯팅 분석에 의해 PP2A 결합의 수준을 결정하고, 감소된 Akt 양 및 항체(IgG)의 침전 농도와 비교하였다. 도 2C에 나타낸 바와 같이, 미처리 PC3 세포로부터 Akt의 면역침전은 상기 비드(공시험)와 비특이적 결합한 것 보다 검출가능한 정도로 PP2A 촉매 아단위의 양을 증가시키는데, 이는 Akt 인산화 수준이 높은 기저 상태에서 조차 적어도 일부 Akt가 PP2A와 복합화된다는 것을 나타내는 것이다. 셀렌산 나트륨으로 처리하였더니 Akt와 PP2A 촉매 아단위의 회합이 증가하는 반면, 혈청에 의한 자극은 기저 수준 아래로 복합체 형성을 감소시킨다. 이와 같은 복합체 형성의 증가를 정량하기 위해, 3 개의 독립적인 실험으로부터의 대표적인 면역블롯팅을 디지털화한 다음 농도계측 분석(densitometric analysis)을 실시하고 각각의 실험에 대하여 대조군으로 표준화시켰다. 이어, 총 면역침전 Akt 단백질에 대한 PP2A 촉매 아단위의 평균 비율±SEM을 결정하였다. 도 2C에 도시된 바와 같이, 셀렌산 나트륨으로 처리한 후 Akt 단백질에 대한 PP2A 촉매 아단위의 결합이 대략 50% 증가한 것이 관찰되었다.

Akt 탈인산화에 대한 셀렌센 나트륨의 영향을 두 단백질간 회합의 단순 증가에 의해 충분히 설명될 수 있는지 결정하기 위해, Akt-관련 포스파타제 활성에 대한 셀렌산 나트륨의 영향을 측정하였다. 2×10⁶의 PC3 세포를 10 ㎝ 플레이트에 플레이팅하고 8 시간동안 부착시킨 다음 혈청을 밤새 고갈시켰다. 세포를 신선한 무혈청 배지에서 1 시간동안 500 μM 셀렌산 나트륨을 사용하거나 사용하지 않고 처리한 다음 낮은 인산 완충액에 용해시켰다. 이어 총 단백질 500-600 ㎍을 항-Akt (1:100) 단일클론 항체 및 30 ㎕의 단백질 A 슬러리로 면역침전시키고, 세척후 말라카이트 그린(Malachite Green)과 최종 세척 완충액 25 ㎕의 인큐베이션에 의해 유리 인산염 오염에 대하여 조사하였다. 교반하면서 30℃에서 10 분동안 500 μM 합성 인-트레오닌 펩타이드와 인큐베이션함으로써 포스파타제 활성에 대한 면역침전을 측정하였다. 유리 인산염이 말라카이트 그린 용액의 첨가에 의해 검출되었고, 각각의 시료에 대해 이중으로 590 ㎚에서의 흡광도를 판독하였다. 3 개의 독립적인 실험으로부터의 평균 포스파타제 활성±SEM을 도 2D에 도시하였다. 셀렌산 나트륨에 의한 PC3 세포의 처리는 면역침전 Akt 단백질과 관련된 포스파타제 활성의 배 이상으로 증가시켰고, 이는 앞서 관찰된 PP2A 결합의 단순 증가보다 유의적으로 크 다.

요약하면, 이들 데이터는 셀렌산 나트륨이 인-단백질 포스파타제, 특히 PP2A를 통해 Akt 탈인산화를 간접적으로 유도한다는 것을 입증하는 것이다. 셀렌산 나트륨이 Akt와 결합하는 PP2A의 양을 증가시키는데, 회합된 포스파타제 활성의 상대적 증가는 거의 2 배였고, 이는 셀렌산 나트륨이 주로 효소 활성에 영향을 줄 수 있다는 것을 나타내는 것이다.

실시예 3

셀렌산 나트륨은 PP2A 핵심 이량체의 포스파타제 활성을 직접적으로 증가시킨다.

PP2A의 핵심 구조는 36kDa의 촉매 아단위(PP2Ac) 및 65kDa의 조절 아단위(PR65 또는 A 아단위)로 이루어진다. 제 3 조절 B 아단위는 기질 특이성을 조절한다[Wera and Hemmings, 1995]. PP2A 포스파타제 활성은 변역후 수식에 의해 조절될 수 있으며, 이에 대해 도 3에 개략적으로 나타내었다. PP2Ac는 수용체 및 비수용체 티로신 키나제, 이를 테면 EGFR, 인슐린 수용체, p60v-src 및 p561ck 모두에 의해 시험관내에서 인산화되는 것으로 나타났다[Chen et al., 1992]. 이러한 인산화는 Tyr307에서 특이적으로 일어나며 포스파타제 활성 손실 90% 이상으로 회합된다[Chen et al., 1992]. 이러한 인산화는 또한 생체내에서 확인되며 혈청 또는 EGF로 자극시키거나 p60v-src로 형질전환시킨 섬유모세포에서 증가하는 반면, 혈청 고갈에 의해 감소된다[Chen et al., 1994]. 인접하는 Thr304의 인산화는 또한 포스파타제 활성의 유의적인 손실과 관련이 있다[Guo and Damuni, 1993]. Tyr307과는 반 대로, Thr304는 자기인산화에 의해 활성화된 단백질 키나제에 의해 인산화되고, 그로 인해 초기 억제 신호를 증폭시키는 것으로 생각된다. 두 경우 모두, 오카다인산 또는 마이크로시스틴(microcystin)-LR에 의한 약리학적 억제가 인산화를 증가시키므로, PP2A는 그 각각의 포스파타제로서 작용한다[Chen et al., 1994, Guo and Damuni, 1993]. 따라서, 억제 자극의 제거후, PP2A는 두 인산기를 가수분해하여 활성 포스파타제를 신속하게 재생한다. PP2Ac는 또한 카르복시 말단 리신 잔기 L309의 가역적 메틸화에 의해 조절된다. 메틸화 반응은 류신 카르복실 메틸 전이효소에 의해 촉매되고[Xie and Clarke, 1994], 활성 삼량체를 형성하기 위해서는 아단위의 정확한 회합이 필요한 것으로 보인다[Wu et al., 2000, Tulstylch et al., 2000, Bryant et al., 1999]. PP2Ac는 포스파타제 메틸에스테라제 1 (PME-1)에 의해 탈메틸화된다[Lee et al., 1996]. 흥미롭게도, PME-1은, 또한 PP2A 티로실 포스파타제 활성을 자극하는 최초 확인된 단백질인 인-티로실 포스파타제 활성제(PTPA)에 의해 역전되는 상태인 불활성 형상으로 PP2a 이량체 및 삼량체에 결합하고 이들을 강력하게 안정화시키는 것으로 보고되었다[Cayla et al., 1994, Langin et al., 2004, Van Hoof et al., 2005].

셀렌산 나트륨에 의해 관찰된 PPA 포스파타제 활성의 증가가 번역후 조절과 연관이 있는 상향 성분에 대한 영향과 독립적인 지를 결정하기 위해, 셀렌산 나트륨의 존재하 또는 부재하에 인큐베이션시킨 적혈구로부터 정제된 인간 PP2A A-C 헤테로이량체의 효소 활성을 결정하였다. 초기 측정에서, 포스파타제 효소 작용의 화학적 기질이자 인산 부분의 가수분해후에는 알칼리 조건하에서 가용되는 진한 황색 색소원인 파라-니트로페놀을 생성하는 파라-니트로페닐포스페이트(para-nitrophennylphosphate, pNPP)를 사용하였다. 0.05U의 정데 인간 PP2A 이량체를 5 nM 셀렌산 나트륨 또는 500 nM 오카다인산의 존재하에 총 30 분동안 37℃에서 인큐베이션한 다음 생성된 파라-니트로페놀의 양을 포스파타제 활성의 판독치로서 측정한 다음 미처리 대조군 시료와 비교하였다. 각 시료에 대한 흡광도를 590 ㎚를 기준으로 하여 405 ㎚에서 이중으로 측정하였다. PP2A 활성을 하기 식을 사용하여 계산하였다:

활성 = [시료 부피(ℓ)]×A₄₀₅/1.78×10₄M^-1㎝^-1(흡광 계수)×0.25㎝×15분×0.05U 효소

데이터는 적어도 3 개의 독립적인 실험으로부터 평균 상대 포스파타제 활성±SEM으로 나타내었다. 도 4A(i)에 도시된 바와 같이, 이러한 저농도의 정제 효소의 경우 조차 포스파타제 활성을 쉽게 볼 수 있었고, 이는 오카다인산과의 인큐베이션에 의해 완전히 제거되었다. 반대로, 셀렌산 나트륨과 PP2A의 인큐베이션에 의해 관찰된 포스파타제 활성이 거의 3 배가 되었다.

다음으로, 내부의 트레오닌 잔기가 인산화된, 6 개의 합성 아미노산 펩타이드로부터의 무기 인산염의 PP2A A-C 이량체에 의한 유리(liberation)에 대한 셀렌산 나트륨의 영향을 측정함으로써, 포스파타제 활성의 증가가 기질 특이적인 지를 결정하였다. 50 μM 셀렌산 나트륨를 사용하거나 사용하지 않고, 0.01-0.05U의 PP2A를 37℃에서 15 분동안 500 μM의 포스포펩타이드와 인큐베이션하였다. 효소 활성에 의해 방출된 무기 인산염의 양을 말라카이트 그린의 첨가에 의해 결정하고, 590 ㎚에서 흡광도를 판독하였다. 말라카이트 그린은 몰리브덴산염 및 오르토인산염의 존재하에 안정한 녹색 복합체를 형성하며, 존재하는 무기 인산염의 농도를 측정가능하도록 한다. 데이터는 적어도 3 개의 독립적인 실험으로부터 590 ㎚에서의 평균 흡광도±SEM로서 나타내었다. 도 4A(ii)에 도시된 바와 같이, 셀렌산 나트륨은 또한 PP2A의 포스파타제 작용에 의해 세린 포스포펩타이드로부터 방출된 무기 인산염의 농도를 2 배이상 증가시켰다.

PP1의 촉매 아단위는 PP2A의 촉매 아단위와 대략 50%의 서열 상동성을 공유하며, 관련 포스파타제 중 최고이다[Barton et al., 1994]. 셀렌산 나트륨에 의해 자극시킨 포스파타제 활성의 증가가 PP2A에 특이적인 지를 결정하기 위해, PP1 활성에 대한 그의 영향을 결정하였다. 골격근으로부터 정제한 0.05U의 래트 PP1을 50 μM 셀렌산 나트륨을 사용하거나 사용하지 않고 500 μM 인-트레오닌 합성 펩타이드와 37℃에서 15 분동안 인큐베이션한 다음 유리 인산염의 농도를 상술한 바와 같이 말라카이트 그린을 사용하여 결정하였다. 데이터는 적어도 3 개의 독립적인 실험으로부터 590 ㎚에서의 평균 흡광도±SEM으로 나타내었다. 도 4B에 도시된 바와 같이, 셀렌산 나트륨은 PP1의 포스파타제 활성에 영향을 미치지 않았다.

실시예 4

셀렌산 나트륨은 PP2A의 산화환원 조절에 영향을 미치지 않는다.

단백질 포스파타제를 음성적으로 조절하는 통상의 메타니즘이 가역적 산화라는 것을 제시하는 일련의 연구가 증가하고 있다[Wang et al., 1996, Barrett et al., 1999, Sohn and Rudolph 2003]. 촉매 도메인에 있는 보존 시스테인 잔기는 그의 효소적 활성에 결정적이지만, 산화 미환경(oxidating microenvironment)에서 이것은 분자내 디설파이드 또는 설페닐-아미드 결합의 형성에 의해 변형되어(도 5A), 포스파타제 활성을 손실시킨다[Salmeen et al., 2003, Kwon et al., 2004]. 셀레늄 화합물이 세포의 산화환원 상태에 영향을 미칠 수 있다고 제시된 바, 셀렌 나트륨이 산화의 억제 효과를 경감시킴으로써 PP2A를 자극하였을 가능성을 조사하였다.

먼저, 셀렌산 나트륨에 의해 유도된 Akt의 탈인산화가 세포의 산화환원 상태에 민감한지를 결정하였다. 5×10⁵의 PC3 전립선 암종 세포를 6-웰 플레이트의 웰에 플레이팅하고 8 시간동안 부착시킨 다음 혈청을 밤새 고갈시켰다. 세포를 신선한 무혈청 배지에서 500 μM 셀렌산 나트륨을 사용하거나 사용하지 않고 처리한 다음 10 분동안 0.25 mM 또는 1 mM의 과산화수소에 노출시켰다. 동량의 완전 세포 용해물을 재용해시킨 다음 면역블롯팅 분석하여 인산화된 Akt Ser⁴⁷³의 수준을 결정하였다. 이어, 발현된 총 Akt 단백질의 수준과 비교하였다. 도 5B에 도시된 바와 같이, 세포를 셀렌산 나트륨으로 처리하였더니 Akt 인산화의 수준이 크게 감소되었는데, 이는 0.25 mM의 과산화수소의 실제 첨가에 의해 영향을 받지 않았다. 반대로, 고 투여량의 1 mM의 과산화수소에 실제 노출된 경우 셀렌산 나트륨의 탈인산화 효과는 완전히 제거할 수 있었는데, 이것은 이 블록이 산화환원에 민감하다는 것을 나타내는 것이다.

단백질 포스파타제의 가역적 산화를 불활성화시키면 촉매 도메인내의 중요한 시스테인 잔기가 변형되어, 궁극적으로는 분자내 디설파이드 또는 설페닐-아미드 결합의 형성을 유도한다. 셀렌산 나트륨이 PP2A내 시스테인 잔기에 대해 임의의 변형 효과를 가지는 지를 결정하기 위해, 정제된 인간 PP2A A-C 이량체에 있는 유리 설프하이드릴기의 수를 엘만 측정법(Ellman's assay)을 사용하여 다양한 처리후 정량하였다[Ellman, 1958]. 엘만 시약(5,5'-디티오-비스(2-니트로벤조산), DTNB)은 색소원 티올레레이트 이온의 방출과 함께 유리 설프하이드릴기와 디설파이드 결합을 신속하게 형성한다. 0.01U의 PP2A를 N-에틸말레이미드(NEM) 10 mM 또는 과산화수소 10 mM 또는 셀렌산 나트륨 10 mM, 또는 셀렌산 나트륨 10 mM와 과산화수소 10 mM과 37℃에서 15 분동안 인큐베이션하였다. 이어, 포스파타제내에 존재하는 유리 설프하이드릴기의 양을 엘만 시약의 첨가에 의해 결정한 후, 412 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다(도 5C). 설프하이드릴 알킬화제인 NEM 및 과산화수소 둘 다와 함께 인큐베이션하였더니 존재하는 유리 설프하이드릴기의 수가 크게 감소하였다. 반대로, 셀렌산 나트륨과 인큐베이션한 경우 영향이 없으며, 특히 과산화수소 매개된 설프하이드릴기의 변형으로부터 PP2A를 보호하지 못했다. 실제, 과산화수소에 의한 설프하이드릴기의 변형은 셀렌산 나트륨의 존재하에서 훨씬 더 효과적이었다.

다음으로, 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFDA)를 사용하여 셀렌산 나트륨이 무손상 세포의 산화환원전위에 영향을 미쳤는지를 결정하였다. DCFDA는 비형광성이며 자유자재로 세포를 투과할 수 있지만 활성 산소종(ROS, reactive oxygen specie)의 존재하에서는 세포를 투과할 수 없으나 형광성이 높은 2',7'-디클로로플루오레세인(DCF)으로 신속히 전환된다[Bass et al., 1983]. 1×10⁶의 PC3 전립선 암종 세포를 60 ㎜ 디쉬에 플레이팅하고 8 시간동안 부착시킨 다음 혈청을 밤새 고갈시켰다. 세포를 처리하기 전에 15 분동안 DCFDA 5 μM과 인큐베이션하였다.

세포를 500 μM의 셀렌산 나트륨 또는 1 mM의 N-아세틸시스테인(NAC)으로 1 시간동안 처리한 다음 500 μM의 과산화수소에 10 분동안 노출시켰다. 이어, 형광성 세포의 비율을 유세포 분석기(flow cytometry)에 의해 결정하였다. 도 5D는 각각의 처리군에 대한 대표적인 형광분포 막대그래프이고, 3 개의 독립적인 실험으로부터 형광성 세포의 평균 비율＋SEM을 도 5E에 요약하였다. 과산화수소에 대한 PC3 세포의 노출에 의해 예상대로 세포내 산소 자유 래디칼의 발생이 크게 증가되었는데, 이는 분포 막대그래프에서 우측으로의 이동에 의해 나타내어졌다. 셀렌산 나트륨에 의한 세포의 예비처리는 형광성 세포의 기본 비율에 영향을 미치지 않았고, 과산화수소에의 노출이후 ROS의 발생으로부터 세포를 보호하지 못했다. 반대로, 수소 공여체 NAC에 의한 예비처리는 형광성 세포의 기본 비율을 약간 감소시켰고, 특히 과산화수소에 의한 ROS 생성을 크게 약화시켰다.

요약하면, 이들 데이터는, 셀렌산 나트륨에 의해 유도된 Akt의 탈인산화는 세포의 산화환원 상태에 민감하지만 셀렌산 나트륨은 고유하나 가역적인 억제 산화를 감소시킴으로써 PP2A의 포스파타제 활성을 증가시키지 않는다는 것을 나타낸다.

실시예 5

셀렌산 나트륨 자극 PP2A 포스파타제 활성은 기질 특이성을 설명한다.

PP2A는 총 세포 단백질 중 0.1-1%를 차지하는 것으로 추정되는 발현도가 높은 편재된 단백질이며[Gallego M and Virshup 2005; Cohen, 1997], 계속 증가하는 단백질 기질의 수의 조절과 관련이 있다[Zhu et al., 2004; Woetmann et al., 2003; Silverstein et al., 2002]. PP2A 기질 특이성을 제어하는 메카니즘이 완전하게는 이해되지 않지만, 특이적 조절 B 아단위의 상이한 결합은 중요한 것으로 여겨진다[Van Kanegan et al., 2005]. 셀렌산 나트륨에 의해 자극된 증가된 PP2A 포스파타제 활성이 무차별적인지 또는 특정의 헤테로삼량체에 특이적인지를 결정하였다.

셀렌산 나트륨이 PC3 전립선 암종 세포로부터 면역침전된 Akt와 관련된 포스파타제 활성을 증가시키는 것과, 셀렌산 나트륨이 정제된 PP2A A-C 이량체의 포스파타제 활성을 직접적으로 자극한다는 것이 위에서 입증되었다. 이와 같은 포스파타제 활성의 증가가 일반적인 지를 결정하기 위해, PP2A 촉매 아단위에 대하여 단일클론 항체를 사용하여 셀렌산 나트륨500 μM 또는 엔도살 A 100 μM으로 1 시간동안 처리한 PC3 세포로부터 PP2A를 면역침전시켰다. 세포 용해물을 탈염 컬럼(desalting column)에 통과시켜 유리 인산염을 제거하고, 인-세린 펩타이드 및 말라카아트 그린을 사용하여 포스파타제 활성을 측정하였다. 상이한 조건하에 면역침전된 PP2A의 상대 포스파타제 활성을 도 6A에 3 개의 독립적인 실험의 평균 흡광도＋SEM으로서 도시하였다. 셀렌산 나트륨에 의한 PC3 세포의 처리는 세포내 PP2A의 일반 풀(general pool)의 포스파타제 활성에 영향을 미치지 않았다. 반대로, PP2A 특이적 포스파타제 억제제 엔도살 A에 의한 처리는 포스파타제 활성을 크게 감소시켰다.

PP2A의 또 다른 공지된 기질인 p70S6K에 대한 셀렌산 나트륨의 영향을 조사하였다[Peterson et al., 1999]. 5×10⁵의 PC3 전립선 암종 세포를 6 웰 플레이트의 웰에 플레이팅하고 8 시간동안 부착시킨 다음 혈청을 밤새 고갈시켰다. 세포를 앞서 30 분동안 오카다인산 500 nM으로 예비처리하거나 하지 않고 LY294003 50 μM 또는 셀렌산 나트륨 500 μM으로 1 시간동안 처리하였다. 동량의 완전 세포 용해물(75 ㎍)을 SDS-PAGE에 의해 분석하고 Thr389가 인산화되었을때 p70S6K 단백질을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 면역블롯팅 분석에 의해 p705S6의 인산화 수준을 결정하였다. 단백질 로딩 대조군 β 튜불린과 비교하였다. 도 6B에 도시된 바와 같이, 기저 조건하에서 조차 p70S6K 인산화를 쉽게 볼 수 있었고, 이것은 PI3K 억제제 LY294002에 의한 처리에 의해 제거되었다. p70S6K 인산화의 음성 조절인자로서의 그의 공지된 역할과 일치하게, 오카다인산에 의한 PP2A의 억제는 관찰된 인산화의 수준을 증가시킨다. 그러나, 셀렌산 나트륨에 의해 유도된 Akt의 탈인산화와는 반대로, p70S6K의 인산화는 유사한 조건에서 영향을 받지 않았다.

기질 특이성의 일차 결정인자(primary determinant)는, A 및 촉매 아단위와 함께 생체내에서 관찰된 삼량체 복합체를 포함하는 조절 B 아단위에 존재하는 것처럼 보인다.

전립선 암종 세포에서 Akt와 복합체를 형성하는 지를 결정하기 위해 시도하였다. 2×10⁶의 PC3 전립선 암종 세포를 100 ㎜ 디쉬에 플레이팅하고 8 시간동안 부 착시킨 다음 혈청을 밤새 고갈시켰다. 이어 세포를 온화한 세정 완충액인 ELB로 용해시키고, 총 Akt를 pan-Akt 단일클론 항체(1:100) 및 30 ㎕의 단백질 A-세파로스를 함유하는 용해물 500 ㎍로부터 면역침전시켰다. 음성 대조군(공시험)은 면역침전 항체를 뺀 것이다. 비드를 반복 세정한 후 3X SDS 단백질 로딩 완충액에서 5 분동안 비등시키고, 고속으로 원심분리한 다음 생성된 상청액을 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 100 ㎍의 완전 세포 용해물이 비교를 위해 동일한 겔위에서 수행되었고, 생성된 막을 아단위의 B 또는 B' 부류의 구성원을 특이적으로 인식하는 항체로 프로빙하였다. Akt의 성공적인 강하가 동일한 블롯을 pan-Akt를 인식하는 항체로 프로빙함으로써 확인되었다. 도 6C에 도시된 바와 같이, 본 시스템에서는 B 부류의 조절 아단위만이 Akt와 공침전되었는데, 이는 R2 B 아단위 부류의 구성원, A 및 PP2Ac의 삼량체가 이들 세포에서 Akt 탈인산화를 매개한다는 것을 제시하는 것이다.

실시예 6

글리코겐 합성에 대한 인슐린의 대사 효과는 Akt의 직접적인 하향 기질인 글리코겐 신타제 키나제-3 (GSK-3)에 의해 매개된다. GSK-3는 글리코겐 신타제를 인산화하고 불활성화하는, 편재적으로 발현된 세린/트레오닌 키나제이다. 인슐린 수용체의 활성화에 반응하여, Akt는 억제자 GSK-3를 인산화하고 불활성화함으로써 글리코겐 신타제를 자극한다[Cross et al., 1995]. 그에 더하여, GSK-3는 단백질 번역, 세포주기의 진행 및 Wnt 신호전달의 제어에 관여한다[Diehl et al., 1998, Welsh et al., 1996, He et al., 1995]. GSK-3β 활성화에 대한 셀렌산 나트륨의 처리 효과를 결정하기 위해, PC3 전립선 암종 세포를 플레이팅하고 혈청을 밤새 고갈시킨 다음 나타낸 바와 같이(도 7) 다양한 시간동안 신선한 배지에서 셀렌산 나트륨 500 μM으로 처리하였다. 완전 세포 용해물을 그의 키나제 활성에 있어서 중요한 부위인 Ser9가 인산화되었을 때만 GSK-3β를 특이적으로 인식하는 항체로 면역블롯팅 분석에 의해 분석하고, 로딩 대조군으로서 세포골격 단백질 β-튜불린과 비교하였다. 대조군 레인에서 관찰된 고도의 인산화에 의해 나타낸 바(0 시간), PC3 세포는 GSK-3β 활성화의 높은 기저 수준을 가진다. 셀렌산 나트륨으로 처리하였더니 인산화가 크게 감소하였는데 1 시간 및 3 시간에서 최대였고, 시점 6 시간에는 기저 수준으로 회복되었다. 셀렌산 나트륨이 유도한 억제도를 정량하기 위해, 3 시간동안의 셀렌산 나트륨 500 μM의 효과를 1 시간동안의 LY294002 50 μM와 비교하는 디지털화된 면역블롯팅을 준비하고, 농도계측기에 의해 GSK-3 β의 인산화 정도를 발현된 단백질의 비율로서 결정하였다. 평균적으로, 셀렌산 나트륨은 GSK-3β를 20% 이상까지 감소시킨 반면, LY294002는 인산화 수준이 거의 60% 감소되었다.

실시예 7

셀레노메티오닌이 아닌 셀렌산 나트륨은 Akt/단백질 키나제 B 활성화를 강력하게 억제한다.

셀렌산 나트륨이 PI3K 경로의 활성을 간섭할 수 있는지를 결정하기 위해, 무혈청 PC3 세포를 500 μM 셀렌산 나트륨으로 다양한 시간동안 처리하였다. 완전 세포 용해물에서 Akt의 인산화 상태는 활성화 특이 항체를 사용하여 결정하였다. PTEN의 손실 때문에, 추가적인 혈청의 부재하에서 조차 Ser473 및 Thre308 부위 둘 다에서 Akt가 강하게 활성화되었다. 셀렌산 나트륨의 첨가에 의해 노출 10 분이내에 두 부위 모두에서 Akt 인산화의 일시적 증가가 유도되었다. 이어 이러한 증가의 후에는 장기간의 현저한 불활성화가 이어졌지만, 총 세포 Akt 수준(pan Akt)은 본질적으로 변하지 않은 채로 유지되었다.

PC3 세포에서 Akt 활성화에 대한 셀렌산 나트륨의 영향을, 다양한 시점에 대해 각각의 화합물 500 μM으로 처리하고 Ser473에서의 Akt 인산화를 평가함으로써 셀레노메티오닌의 것과 비교하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 셀레노메티오닌은 측정한 모든 시간에서 Akt의 인산화 수준에 영향을 미치지 않은 반면, 셀렌산 나트륨은 Akt 인산화를 크게 억제하였다.

실시예 8

Akt 탈인산화 유도능은 셀렌산 나트륨에 특유하다.

셀레노메티오닌은 영향을 미치지 않지만 셀렌산 나트륨은 중요한 키나제 Akt를 일관적으로 충분히 탈인산화시키는 바, 이러한 능력이 셀렌산 나트륨에 특유한 것인지 아니면 다른 화학적 형태의 셀레늄에 공통적인 것인 지를 결정하였다. 다른 무기산(아셀렌산 나트륨, 이산화셀레늄, 셀레늄 설파이드 및 셀레노스산) 및 유기산(메틸셀레노시스테인, 셀레노시스틴) 셀레늄 종을 Akt 활성화에 영향을 미치는 그의 능력에 대하여 시험하였다. 모든 형태를 물에 용해시키고(단, 셀레늄 설파이드는 DMSO에 용해시킴), 농도 500 μM의 혈청 고갈 PC3 세포에 1 시간동안 첨가하였다. 이어, 완전 세포 용해물을 재용해시키고, 총 Akt 발현 수준(pan Akt) 뿐만 아니라 Ser473 부위가 인산화되었을 때 Akt를 특이적으로 인식하는 항체로 면역블롯팅함으로써 Akt의 활성화 상태를 결정하였다. Akt의 활성화 정도를 정량하기 위해, 면역블롯팅을 디지털화하고 총 Akt에 대한 인산화 Akt의 비율을 농도계측기에 의해 결정하였다. 3 개의 독립적인 실험으로부터의 총 Akt 단백질 수준에 대한 인산화 Akt의 평균 비율±SEM을 도 9에 요약하였다. 500 μM의 셀렌산 나트륨으로 1 시간동안 PC3 세포를 처리하였더니 Ser473에서의 Akt 인산화가 미처리 세포에 비해 80% 이상 감소하였다(p<0.05, 스튜던트 t-검정). 반대로, 동일한 조건하에서 투여된 셀레늄의 다른 무기산 및 유기산 형태로 PC3 세포를 처리하였더니 Akt 활성화도에는 유의적인 영향을 미치지 않았다. 요약하면, 이들 데이터는 Akt 탈인산화를 유도하는 능력이 셀렌산 나트륨에 특유하다는 것을 나타내는 것이다.

실시예 9

PP2A 활성을 증가시키는 능력은 셀렌산 나트륨에 특유하다.

실시예 7에서, 시험된 모든 화학적 형태의 셀레늄을 설명하는 데이터에 의해 셀렌산 나트륨만이 Akt의 탈인산화를 유의적으로 유도하였다는 것이 제시되었다. PP2A 활성에 대한 상이한 영향이 이러한 특성을 설명할 수 있는 지를 결정하기 위해, PP2A 포스파타제 활성에 대한 셀렌산 나트륨(5 mM 또는 50 μM), 아셀렌산 나트륨(5 mM 또는 50 μM) 및 셀레노메티오닌(5 mM 또는 50μM)의 영향을 기질로서 각각 pNPP 및 세린 포스포펩타이드을 사용하여 pNPP 가수분해 측정법에서 비교하였다(도 1OA 및 도 10B). 셀렌산 나트륨으로 관찰된 포스파타제 활성은 뚜렷히 증가한 반면, 아셀렌산 나트륨이나 셀레노메티오닌은 PP2A 포스파타제 활성에 그다지 영향을 미치지 않았다.

실시예 1 내지 9에 대한 재료 및 방법

시약

세포주

실험 과정에 사용된 포유동물 세포주의 상세한 설명은 표 1에 제공되어 있다.

표 1

세포주	기원	공급원	참고
Pc3	62세 백인 남성의 IV급 전립선 샘암종의 골전이로부터 유래	ATCC	(Kaighn ME et al., 1979)

모든 세포 배양액은 L-글루타민[기브코 인비트로겐(Gibco Invitrogen) #11875-119]을 함유하는 RPMI 1641에서 37℃, 5% 또는 10% 이산화탄소로 포르마 사이언티픽 인큐베이터(Forma Scientific Incubator)에서 유지하였다. 페니실린(100 U/㎖), 스트렙토마이신(100 ㎍/㎖) 및 암포테리신(amphotericin) B(25 ng/㎖)[기브코 인비트로겐(Gibco Invitrogen) #15240-062]을 표준으로서 배지에 첨가하였다. 통상적으로, 달리 언급되지 않는한 세포는 5% 또는 10% 소태아혈청[기브코 인비트로겐(Gibco Invitrogen) #10099-141]의 존재하에 유지하였다. 미혼탁 세포는 0.5% 트립신-EDTA에 통과시켰다[기브코 인비트로겐(Gibco Invitrogen) #15400-054].

상업적으로 입수가능한 항체

다수의 상업적으로 입수가능한 일차 양고추냉이 과산화 효소(horseradish peroxidase, HRP) 접합 또는 형광표지 또는 바이오틴화된 이차 항체를 개시된 실험 작업에 사용하였고, 그에 대한 상세한 설명을 아래에 요약하였다:

항-Akt 항체 토끼 다클론, Cat No. 9272, 세포 신호전달 기술(Cell Signalling Technology, CST);

항-Akt (5G3) 마우스 단일클론, Cat No. 2966, CST;

항-인 Akt (ser473) 토끼 다클론, Cat No. 9271, CST;

항-인 GSK3β (ser9) 토끼 다클론, Cat No. 9336, CST;

상이한 항-PP2A 항체, Cat Nos. 05-421, 06-2221, 07-334 및 05-592, 업스테이트(Upstate).

키나제 및 키나제 억제제, 포스파타제 억제제 및 정제 포스파타제

표 2: 키나제 및 포스파타제 억제제

	명칭	억제 효소	공급원	Cat. No	희석제	원액 농도	작업 농도
카나제 억제제	LY294002	PI2K	프로메가 (Promega)	V1201	DMSO	50mM	10-50μM
포스파타제 억제제	타우토마이신	PP1	바이오몰 (Biomol)	109946-35-2	에탄올	500μM	500μM
포스파타제 억제제	엔도살	PP2A	칼바이오켐 (Calbiochem)	324760	H₂O	100mM	100μM
포스파타제 억제제	칼리쿨린 A	PP2A=PP1	칼바이오켐 (Calbiochem)	208821	DMSO	80μM	10nM
포스파타제 억제제	오카다인산	PP2A>>PP1	칼바이오켐 (Calbiochem)	495604	에탄올	50mM	500nM
포스파타제 억제제	사이클로스포린	PP2B	칼바이오켐 (Calbiochem)	239835	DMSO	400㎍/㎖	400㎍/㎖

표 3 : 정제 포스파타제 및 재조합 키나제

	명칭	종	공급원	Cat. No	작업 농도
정제 포스파타제	PP2A	인간	업스테이트 (Upstate)	14-111 (lot #28002)	0.01-0.05U
정제 포스파타제	PP1	토끼	업스테이트 (Upstate)	14-110 (lot #26200)	0.05U
재조합 키나제	Akt1	인간	업스테이트 (Upstate)	14-276 (lot #25089BU)

완충액, 용액 및 매질

달리 언급하지 않는한, 모든 용액은 실온(RT)에서 저장하였다.

EDTA 0.5M

dH₂O 1ℓ에 용해시킨 Na₂EDTA.2H₂O 186.1g, NaOH로 pH를 8.0으로 조정함

ELB (Egg Lysis Buffer)	250mM NaCl, 50mM Hepes pH7.0, 5mM EDTA, 1mM DTT, 10% Triton-X100
NaCl 5M	dH₂O 1ℓ에 용해시킨 292.2g NaCl, 가압멸균시킴
PBS	NaCl 8.0g, KCl 0.2g, Na₂HPO₄ 144g, KH₂PO₄ 0.24g, 최대 1ℓ로 제조함, pH 7.4
RIPA 용해 완충액	10% 글리세롤, 20mM Tris-HCl pH 7.5, 2mM EDTA, 1% Triton-X100, 1% NP4O, 137mM NaCl, 0.1% SDS. 얼음위에서 신선하게 제조함.
SDS 20%	dH₂O 1ℓ에 용해시킨200g SDS
SDS-PAGE 러닝(Running) 겔	0.375M Tris pH 8.8, 0.1% SDS, APS, TEMED 및 6-14.5% 아크릴아미드
SDS-PAGE 시료 완충액 4x	15% 글리세롤, 0.6M 2-머캅토에탄올, 2% SDS, 62.5mM Tris-HCl pH 6.8 및 0.1% w/v 브로모페놀 블루.
SDS-PAGE 퇴적용 (stacking) 겔	0.125M Tris pH 6.8, 0.1% SDS, 4.8% 아크릴아미드(바오로래드(Biorad)), 암모늄 퍼설페이트(APS) 및 TEMED
SDS-PAGE 러닝 완충액	9g Tris 염기(25mM) pH 8.3, 43.2g 글리신(0.19M) 및 3g SDS(0.1%), dH₂O 중에서 500㎖로 제조함.
TBS 10X	80g NaCl, 2g KCl, 30g Tris pH 7.4, dH₂O 중에서 1ℓ로 제조함.
TBS-T 0.1%	500㎖ TBS 10x, 5㎖ Tween-20, dH₂O 중에서 1ℓ로 제조함.

Tris-HCl	dH₂O 1ℓ에 용해시킨 121.1g Tris, 진한 HCl로 pH를 6.0-8.8로 조정함. 가압멸균시킴
웨스턴(western) 이동 완충액	14.4g 글리신, 3.03g Tris, 800㎖ dH₂O 및 200㎖ 메탄올
웨스턴 이동 완충액	200㎖ 메탄올을 함유하는 800㎖ dH₂O 중 14.4g 글리신, 3.03g Tris 염기
웨스턴 시료 완충액 4x	1㎖ 0.5M Tris pH 6.8, 800㎕ 글리세롤, 800㎕ 20% SDS, 400㎕ β-머캅토에탄올, 400㎕ 1% 브로모페놀 블루

셀레늄 화합물

셀렌산 나트륨은 시그마(Sigma)로부터 구입하였다. 모든 용액은 dH₂O 중에서 신선하게 제조하였고, 지시된 농도로 사용하였다.

단백질 발현

SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)

특정의 처리후, 배양액 중 세포를 PBS로 1회 세척한 다음 셀 스크래퍼(cell scraper)를 사용하여 4℃에서 15 분동안 포스파타제 억제제(10 mM 나트륨 오르토바나데이트 및 10 mM 불화나트륨) 및 프로테아제 억제제 칵테일[칼바이오켐(Calbiochem) 프로테아제 억제제 칵테일 Set 1 #539131)을 함유하는 RIPA 용해 완충액 또는 에그 용해 완충액(ELB, Egg Lysis Buffer)에 용해시켰다. 4℃에서 15 분동안 14,000 rpm으로 원심분리하여 시료를 정화시키고, 분석을 위해 상청액을 사용하였다. 시료 단백질 농도를 비신코닌산 용액 분석법(Bicinchoninic Acid Solution Assay, BCA)에 의해 결정하였다. 1 ㎕의 용해물을 96-웰 플레이트에서 dH₂O로 1:25로 희석하였다. 비신코닌산 용액 및 4% (w/v) 황산구리의 80:1 용액 200 ㎕를 각각의 시료에 첨가하고 37℃에서 30 분동안 인큐베이션하였다. 일련의 단백질 표준에 대해 590m에서 흡광도를 측정하였다(Perkin Elmer MBA2000).

단백질 시료를 퇴적용 겔(stacking gel) 및 분리용 겔(resolving gel)로 이루어진 변성 SDS-폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 50-100 ㎍의 단백질을 다양한 농도의 SDS-PAGE 위에 로딩하였다. SDS 시료 완충액을 같은 부피로 시료에 첨가하고 로딩하기 전에 100℃에서 5 분동안 비등시켰다. 겔 전기영동을 약 100V, 러닝 완충액에서 수행하였다. 관심의 대상이 되는 단백질의 분자량을 각 겔과 함께 로딩된 단백질 크기 지표[바이오래드 칼레이도스코프(Biorad Kaleidoscope)]에 의해 평가하였다.

웨스턴 블롯 측정법

이어, 분리 단백질(resolution protein)을 PVDF 막[밀리포어(Millipore), Immobilon P]으로 이동시켰다. 막을 100% 메탄올에 10 초간 침지하여 준비하고, 증류수에서 세정한 다음 웨스턴 이동 완충액(transfer buffer)에서 평형화시켰다. 이동은 100V, 실온에서 1.5 시간 또는 4℃에서 밤새 일어났다. 막을 TBS-T에서 5 분동안 세척하고 1 시간동안 건조시켰다. 이어, 막을 0.1% Tween을 함유한 TBS 중 3% 탈지유로 실온에서 1 시간동안 차단하였다. 막을 TBS-T로 5 분동안 3 회 세척한 다음 부드럽게 교반하면서 실온에서 1-2 시간 또는 4℃에서 밤새 3% 탈지유/0.1% TBS-T 또는 3% BSA/0.1% TBS-T에 희석시킨 일차 항체와 인큐베이션하였다. 0.1% TBS-T에서 3 회 5 분 세척후, 차단 완충액 중에서 양고추냉이 과산화 효소 접합 이차 항체와 인큐베이션하였다. 막을 다시 5 분동안 3 회 세척한 다음, Super Signal^® West Dura 기간 확장 기질(Extended Duration substrate)(Pierce #34075) 또는 ECL 웨스턴 블롯팅 검출제(Western Blotting Detection Agent)(Amersham Biosciences #RPN2106)를 사용하여 증대된 화학발광에 의해 항체 결합을 검출하였다. CL-노출 필름(exposure film)[코닥(Kodak)]을 사용하여 자가방사기록법(autoradiography)에 의해 발광을 기록하였다. 초기 분석후 면역 블롯을 막 박리 완충액(Membrane Stripping Buffer)(62.5 mM Tris pH 7, 2% SDS, 7% β-머캅토에탄올)으로 60℃에서 15 분동안 박리하고, TBS-T로 3 회 세척한 다음 다시 차단시키고 재프로빙(reprobing)하였다.

농도계측 분석

관련 면역블롯을 비스타 디지털 스캐너(Vista digital scanner)(Umax)를 사용하여 코렐 포토-페인트 버젼 8(Corel Photo-Paint Version 8)[코렐 코포레이션 (Corel Corporation)]에서 .tif 파일로 전환시켰다. 윈도우용 Image-Pro-Plus V4.5.1.22[미디어 사이버네틱스(Media Cybernetics)]에서 농도계측 분석을 수행하였다. 백색은 수치 0에 흑색은 수치 255에 할당하는 선형 보정(linear calibration)을 사용하여, 관련 밴드에 상응하는 관심의 대상이 되는 구역을 선택하고 신호 강도를 결정하였다.

면역침전

100-600 ㎍의 완전 세포 용해물을 지적된 바와 같이 회전 휠상의 마이크로퓨지 관(microfuge tube)에서 1:10 희석률의 다양한 항체와 실온에서 1-2 시간 또는 4℃에서 16 시간동안 인큐베이션하였다. 간단히 원심분리한 후, 30-40 ㎕의 예비-세척된 50% 단백질-A 세파로스 고속류 비드(Fast Flow bead)(Sigma #9424)를 각각의 튜브에 첨가하고 실온 또는 4℃에서 1 시간동안 회전시켰다. 간단히 원심분리한 후, 상청액을 제거하고 펠렛을 500 ㎕의 세포 용해 완충액으로 세척하였다. 이러한 3 회의 세척후, 효소 측정을 위해 비드를 사용하거나 비드를 3x SDS 단백질 로딩 완충에서 5 분동안 비등시킴으로써 단백질을 용리한 다음 SDS-PAGE 겔상에서 분리하였다.

포스파타제 측정법

제공된 희석용 완충액을 사용하여 정제된 인간 PP2Ac 및 토끼 PP1을 0.01 U/㎕로 희석하고 부분표본(aliquot) -20℃에 저장하였다.

정제된 포스파타제를 사용한 포스포펩타이드 측정법

1 ㎎의 합성 포스포펩타이드 K-R-pT-I-R-R(업스테이트 #12-219) 및 R-R-A-pS-V-A(업스테이트 #12-220)를 1.10-1.285 ㎖의 dH₂O에 용해시켜 1 mM 용액을 제조한 다음, 부분표본을 취하고 사용할 때까지 -20℃에 저장하였다. 인간 적혈구로부터 정제한 0.01-0.05 U의 정제 PP2A A-C 이량체 또는 골격근으로부터 정제한 0.05 U의 토끼 PP1을 500 μM의 포스포펩타이드와 혼합하고 가열 블록 위에서 37℃로 지 적된 바와 같이 다양한 처리의 존재하에 15 분동안 인큐베이션하였다. 각각의 반응은 pNPP 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 7.0, 100 μM CaCl₂)을 사용하여 총 부피 25 ㎕로 제조하였다. 100 ㎕의 말라카이트 그린 용액(10 mM 몰리브덴산 암모늄 중 0.034% 말라카이트 그린, 1N HCl, 3.4% 에탄올, 0.01% Tween-20)을 첨가하여 효소 반응을 종결시켰다. 말라카이트 그린은 몰리브덴산염 및 오르토인산염의 존재하에 안정한 녹색 복합체를 형성하는데, 이는 무기 인산염의 양을 측정가능하게 한다. 각각의 시료에 대하여 590 ㎚에서 이중으로 흡광도를 판독하였다.

PP2A 면역침전 및 포스파타제 측정법

1×1O⁶의 PC3 세포를 60 ㎜ 플레이트에 플레이팅하고 8 시간동안 부착시킨 다음 혈청을 밤새 고갈시켰다. 지적된 바와 같은 다양한 처리후, 매질을 흡인하고 세포를 TBS로 1회 세척하였다. 세포를 0.3 ㎖의 용해 완충액(2O mM Tris-HCl, pH 7.0, 1% Igepal-CA, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 1x 완전 프로테아제 억제제 칵테일)에 용해시킨 다음 용해물을 2 ㎖ 제바 탈염 스핀 컬럼(Zeba Desalt Spin Column)(Pierce #89890)에 통과시켜 인산염을 제거하였다. 탈염 용해물의 단백질 농도를 앞서 기술된 BCA 측정법에 의해 결정하였다. 총 단백질 100-150 ㎍을 4 ㎍의 항-PP2A 단일클론 항체 및 30 ㎕의 단백질 A-세파로스 슬러리로 4℃에서 2 시간동안 면역침전시켰다. 이어, 시료를 14,000 rpm에서 1 분동안 펠렛화한 다음, 과량의 TBS로 3회 및 pNPP 측정 완충액으로 1회 세척하였다. 최종 회전후, 모든 상청액을 주의깊게 제거하고, 최종 부피 80 ㎕ 중 500 μM 인-트레오닌 펩타이드를 비드 에 첨가하였다. 시료를 교반하면서 30℃에서 10 분동안 인큐베이션한 다음 말라카이트 그린 용액을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 각각의 시료에 대하여 590 ㎚에서 이중으로 흡광도를 판독하였다.

pNPP 가수분해 측정법

파라-니트로페닐포스페이트(pNPP)는, 인산염 부분의 가수분해후 알칼리 조건하에서 가용하는 진한 황색 색소원 파라-니트로페놀을 생성하는 포스파타제 효소의 화학적 기질이다. 상대 포스파타제 활성을 측정하는 측정법에서, 0.05 U의 정제 PP2A를 미세원심분리관에서 5 ㎕의 40 mM NiCl₂ 및 5 ㎕의 BSA 용액(5 ㎎/㎖)과 혼합하였다. 지적된 바와 같이 다양한 처리를 가하고, pNPP 측정 완충액을 사용하여 부피를 80 ㎕로 조정하였다. 시료를 37℃에서 15 분동안 예비인큐베이션하였다. 1.5 ㎎/㎖ pNPP를 pH 7.0, 50 mM Tris-HCl에 용해시킴으로써 각각의 측정 이전에 pNPP 기질을 신선하게 제조하였다. 포스파타제 반응을 개시하기 위해, 120 ㎕의 pNPP 기질을 첨가하고, 시료를 37℃에서 추가로 15 분동안 인큐베이션하였다. 각 시료의 흡광도를 기준을 590 ㎚로 하고 405 ㎚에서 이중으로 측정하였다. PP2A 활성은 하기 식을 사용하여 계산하였다: 활성 = [시료 부피(ℓ)]×A₄₀₅/ 1.78×10⁴M^-1㎝^-1(흡광 계수)×0.25 ㎝×15 분×0.05 U 효소.

총 유리 설프하이드릴기의 측정

다양한 처리후 정제 PP2A 중 유리 설프라이드릴기의 변화를 엘만 시약을 사 용하여 결정하였다. 0.01 U의 PP2A를 37.5 ㎕의 희석 완충액(30 mM Tris-HCl, 30 mM EDTA, pH 8.2), 12.5 ㎕의 DTNB 시약(엘만 시약) 및 200 ㎕의 메탄올에 첨가하였다. 시료를 RT에서 5 분동안 인큐베이션한 다음 소멸을 412 nm에서 각각에 대하여 이중으로 측정하였다. 결과를 N-아세틸시스테인으로 생성한 표준 곡선과 비교하였다.

Akt 키나제 활성 측정법

K-LISA^TMAKT 활성 키트[칼바이오켐(Calbiochem) #CBA019]를 사용하여 재조합 인간 Akt1 키나제 활성에 대한 셀렌산 나트륨의 영향을 결정하였다. 이것은 Akt1, Akt2, Akt3, SGK(혈청 글루코코르티코이드 키나제) 및 MSK1에 의해 제 2 세린이 인산화된 바이오틴화 펩타이드 기질(GRPRTSSFAEG)을 이용한 ELISA 기초 측정법이다. 바이오틴화 Akt 기질 및 Akt 시료를 스트렙타비딘-코팅된 96-웰 플레이의 웰에서 ATP의 존재하에 인큐베이션하였는데, 단일 단계로 인산화 및 기질 포획(substrate capture)이 가능하였다. 인산화 기질을 인-세린 검출 항체 이어 HRP-항체 접합체로 검출한 다음 TMB 기질액으로 발색시켰다.

각각의 측정법 개시시, dH₂O를 사용하여 원액을 1:100으로 희석시켜 바이오틴화 Akt 기질 작업 용액의 새로운 부분표분을 제조하였다. 이어, 각 웰에 본 순서에 따라 하기한 것을 첨가하였다: 웰 당 총 부피가 50 ㎕가 되도록, 10 ㎕의 5x 키나제 측정 완충액; 10 ㎕의 바이오틴화 Akt 기질 작업 용액; 10 ㎕의 dH₂O 중 250 ng의 재조합 인간 Akt1; 10 ㎕의 dH₂O 중 500 μM 셀렌산 나트륨 또는 1 μM 스타우 로스포린, 또는 양성 대조군으로서 dH₂O; 10 ㎕의 5x ATP/MgCl₂ 혼합물. 플레이트를 플레이트-밀봉제(plate-sealer)로 밀봉하고, 마이크로플레이트 쉐이커(microplate shaker)에서 간단히 혼합한 다음 30℃에서 30 분동안 인큐베이션하였다. 이어, 각 웰에 10 ㎕의 키나제 정지액을 첨가하여 키나제 반응을 중지시켰다. 각 웰의 내용물을 버린 다음 1x ELISA 세척액(원액 ELISA를 dH₂O를 사용하여 1:20으로 희석하여 제조함)으로 3회 세척하고, 역전시킨 다음 건조될 때까지 블롯팅 페이퍼(blotting paper) 위에 탭핑하였다(tapped). 이어, 100 ㎕의 인-세린 검출 항체 작업 용액(각각의 측정을 위해, dH₂O를 사용하여 인-세린 항체 원액을 1:1000으로 희석시켜 신선하게 제조함)을 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 1 시간동안 인큐베이션하였다. 이어, 플레이트를 상술한 바와 같이 세척하였다. 100 ㎕의 HRP-항체 접합 작업 용액(각각의 측정을 위해, dH₂O를 사용하여 HRP-항체 원액을 1:1000으로 희석시켜 신선하게 제조함)을 각 웰에 첨가하고 실온에서 1 시간동안 인큐베이션하였다. 이어,플레이트를 다시 상술한 바와 같이 세척하였다. 이어, 100 ㎕의 TMB 기질액을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 20 분동안 발색시켰다. 각 웰에 100 ㎕의 ELISA 정지액을 첨가하여 반응을 중지시키고, 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 흡광도를 590 ㎚를 기준으로 하여 450 ㎚에서 이중으로 측정하였다.

세포내 산화환원 상태 측정법

2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트(DCFDA)를 사용하여 세포내 산화환원 상태를 결정하였다. DCFDA는 비형광성이며 자유자재로 세포를 투과 할 수 있지만 활성 산소종(ROS)의 존재하에서는 세포를 투과할 수 없으나 형광성이 높은 2',7'-디클로로플루오레세인(DCF)으로 신속히 전환된다. 다양한 처리 이전에 세포를 15 분동안 DCFDA 5 μM으로 평형화하였다. 이어, 인접한 세포를 수확하고 PBS로 2회 세척한 다음 형광성 세포의 비율을 유세포 분석기(flow cytometry)에 의해 즉시 결정하였다.

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실시예 10

마우스 뇌 조직 및 인간 신경모세포종 세포주 모두에서 타우 인산화 활성에 대한 셀렌산염의 영향

재료 및 방법

세포 배양. 인간 신경모세포종 SY5Y 및 BE2M17 세포주를 자넷타 컬베 너(Janetta Culvenor)[빅토리아 맬버른 유니버시티 병리학부]로부터 입수하였다. SY5Y 세포를 10% 소태아혈청(FBS, 인비트로겐(Invitrogen), 기브코(GIBCO)), 1% 비필수 아미노산(미국 미주리 세인트루이스 소재 시그마(Sigma)), 1O mM HEPES(인비트로겐(Invitrogen), 기브코(GIBCO)), 1 mM 피루브산나트륨(인비트로겐(Invitrogen)) 및 1% 항생제/항곰팡이제 혼합물(인비트로겐(Invitrogen), 기브코(GIBCO))로 보충한 RPMI 1640 배지(뉴질랜드 오클랜드 인비트로겐(Invitrogen))에서 통상적으로 배양하였다. BE2M17 세포를 10% 소태아혈청(FBS, 인비트로겐(Invitrogen), 기브코(GIBCO)), 1% 비필수 아미노산(미국 미주리 세인트루이스 소재 시그마(Sigma)), 1 mM 피루브산 나트륨(인비트로겐(Invitrogen), 기브코(GIBCO)) 및 1% 항생제/항곰팡이제 혼합물(인비트로겐(Invitrogen), 기브코(GIBCO))로 보충한 OPTI-MEM I 감소 혈청 배지(인비트로겐(Invitrogen), 기브코(GIBCO))에서 배양하였다. 세포를 5% CO₂ 중 37℃에서 배양하였다. 셀렌산 나트륨은 시그마(Sigma, 미국 미주리 세인트루이스 소재)로부터 얻었다.

항체: 달리 언급되지 않는한, 다음의 항체는 피어스 엔도겐(Pierce Endogen)(미국 록포드 소재)으로부터 입수하였다: 항-인간 PHF-타우 단일클론(클론 AT100; AT180; AT270), 및 항-인간 타우 단일클론(클론 HT-7). 다클론 염소 항-마우스 면역글로불린/HRP(덴마크 다코(Dako)) 및 항-튜불린(G712A, 프로메(Promega)).

시험관내: 2×10⁵의 SY5Y 또는 BE2M17 세포를 그 표면이 코팅되거나 코팅되 지 않은 팔콘(Falcon) 6-웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하고, 완전 성장 배지(상술된 바와 같음)에서 5% CO₂/37℃에서 밤새 부착시켰다. 배지를 100 μM 농도의 셀렌산 나트륨을 함유하는 신선한 완전 성장 배지로 대체하고 3 시간동안 배양하였다. 세포를 그 표면이 0.1% 젤라틴(미국 미주리 세인트루이스 소재 시그마(Sigma)), 마트리겔(matrigel)(cat # 354234, 오스트레일리아 뉴사우스웨일즈 소재 비디(BD)) 또는 0.5 ㎍/㎖의 피브로넥틴(fibronectin)((미국 미주리 세인트루이스 소재 시그마(Sigma))로 코팅된 팔콘 6-웰 플레이트 위에서 배양하였다.

생체내: 14 주령 Balb/C Nu Nu 수컷 마우스를 에이알시(ARC)로부터 구입하였다. 마우스에게 PBS 200 ㎕ 당 300 ㎍ 셀렌산 나트륨을 단일 피하 주사하였다. 주사한 후 다양한 시점에 마우스를 희생시키고 혈액 및 뇌 조직 표본을 수집하였다.

용해물 제조 및 면역블롯팅: 세포를 차가운 PBS로 2회 세척하고 150 ㎕의 차가운 RIPA 완충액(10% 글리세롤, 20 mM Tris, 137 mM NaCl, 0.1% SDS, 0.05% IGEPAL, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 10% NaV, 2% NaF 및 4X 프로테아제 억제제를 함유함)에 용해시키고, 마찬가지로 뇌 조직을 유발 및 유봉을 사용하여 드라이 아이스에서 균질화시켜 150 ㎕ RIPA 완충액에 용해시켰다. 시료를 30 분동안 얼음위에서 인큐베이션하고, 13000 rpm/10 분/4℃에서 원심분리하였다. 성청액을 수집하고 BCA 시약(시그마(Sigma))를 사용하여 각 시료에 대한 단백질을 평가하였다. 동량의 단백질을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔의 각 레인에 로딩하였다. 단백질을 PVDF(밀리포어(Millipore)) 막으로 이동시키고 5% 탈지유 블로토(blotto)로 2 시간 동안 차단하였다(blocking). 막 차단후, 일차 항체: 항-인간 PHF-타우(1:200에서 AT1OO, 1:1000에서 AT180, 및 1:2500에서 AT270) 또는 항-인간 타우(1:1000에서 HT-7)를 5% 탈지유 블로토하에 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 이차 항체를 인큐베이션하기 전에, 막을 3x 세정한 다음 실온에서 0.01% Tween과 함께 Tris-완충 식염수로 3x5 분 세척하였다. 그후 이차 항체 다클론 염소 항-마우스(덴마크 다코(Dako))를 1 시간 배양하여 실온에서 5% 탈지유 블로토에 1:10000으로 희석시킨 양고추냉이 과산화효소(HRP)에 결합시켰다. 막을 상술한 바와 같이 세척하고 애머샴(Amersham) ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약[영국 버킹엄셔 소재 애머샴 바이오사이언스(Amersham Bioscience)]을 사용하여 검출하였다. 2% SDS/β-머캅토에탄올 박리 완충액을 사용하여 막을 박리하고 튜블린(프로메가)에 대해 재프로빙하여 단백질 로딩을 확인하였다.

다양한 코팅 표면하에 셀렌산 나트륨의 존재하(＋) 또는 부재하(-)에서의 항-인간 PHF-타우에 의한 인간 신경모세포종 BE2M17 세포주의 면역블롯팅을 도 11에 도시하였다. 100 μM의 셀렌산 나트륨을 BE2M17 완전 성장 배지에서 제조하였다. 세포를 피브로넥틴, 비코팅(플라스틱) 또는 마트리겔(방법 설명부에 기술된 바와 같이)에서 3 시간동안 셀렌산 나트륨과 함께 배양하였다.

결과:

항-인간 PHF-타우 클론 AT100은 68kDa에서 검출되었다. 셀렌산 나트륨의 존재하에, PHF-타우 신호는 비-셀렌산염 처리 세포에 비해 피브로넥틴 및 마트리겔에서 배양한 세포에서 감소하는 것처럼 보였다.

항-인간 PHF-타우 클론 AT180은 71 및 67kDa 둘 다에서 검출되었다. 피브로넥틴, 플라스틱(비코팅) 및 마트리겔에서 배양된 셀렌산염 처리 세포는 셀렌산염 비처리 세포에 비해 약한 PHF-타우 신호를 가지는 것으로 나타났다. 마트리겔에서 배양된 세포의 PHF-타우 신호는 67kDA에서 피브로넥틴 및 플라스틱에서 배양된 세포에 비해 더 강했다.

항-인간 PHF-타우 클론 AT270은 66 및 63kDa 모두에서 검출되었다. 피브로넥틴, 플라스틱(비코팅) 및 마트리겔에서 배양된 셀렌산염 처리 세포의 PHF-타우 신호는 셀렌산염 비처리 세포에 비해 더 약한 것으로 나타났다. 마트리겔에서 배양된 셀렌산염 처리와 비처리 세포 사이에는 겨우 약간 차이가 난다는 것을 유념하기 바란다.

항-인간 타우 클론 HT-7 은 68, 64 및 57kDa에서 검출되었다. 셀렌산염과 함께 피브로넥틴에서 배양된 세포는 타우 발현이 감소하는 것으로 나타났다.

항-튜불린 은 동일한 단백질 로딩을 보이는 것으로 검출되었다.

다양한 배양 표면하에 셀렌산 나트륨의 존재하(＋) 또는 부재하(-)에서의 항-인간 PHF-타우에 의한 인간 신경모세포종 SY5Y 세포주의 면역블롯팅을 도 12에 도시하였다. 100 μM의 셀렌산 나트륨을 SY5Y 완전 성장 배지에서 제조하였다. 세포를 젤라틴, 피브로넥틴, 비코팅(플라스틱) 또는 마트리겔(방법 설명부에 기술된 바와 같이)에서 3 시간동안 셀렌산 나트륨과 함께 배양하였다.

결과:

항-인간 PHF-타우 클론 AT270은 70kDa에서 특이적으로 검출되었다. 젤라틴 및 피브로넥틴에서 배양된 셀렌산염 처리 세포의 PHF-타우 신호는 셀렌산염 비처리 세포에 비해 약한 것으로 나타났다.

항-인간 타우 클론 HT-7 은 60kDa에서 검출되었다. 마트리겔 및 피브로넥틴 모두 항-타우 신호가 감소된 것으로 나타났다. 특히, 셀렌산염과 함께 피브로넥틴에서 배양된 세포의 항-타우는 셀렌산염없이 배양된 것보다 약한 것으로 나타났다.

항-튜불린 은 비교적 동일한 단백질 로딩을 보이는 것으로 검출되었다.

셀렌산 나트륨의 존재하(＋) 또는 부재하(-)에서 14 주령 Balb/C Nu Nu 수컷 마우스로부터의 총 뇌 용해물의 항-인간 PHF-타우(나타낸 바와 같이)에 의한 면역블롯팅을 도 13에 도시하였다. 셀렌산 나트륨으로 처리한 마우스에 1.5 ㎍/㎖로 피하 주사하였다. 셀렌산 나트륨의 부재하(-)에서, 마우스에는 PBS와 동시에 주입되었다. 다양한 시점 0, 2 및 6 시간에 뇌조직을 수집하였다(방법 설명부에 기술된 바와 같이).

결과:

PBS는 연구한 클론 모두(AT100, AT180 및 AT270)에 대해 항-인간 PHF 타우 신호에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 동일한 단백질 로딩을 확인하기 위해, 모든 막을 박리하고 방법 설명부에 개시된 바와 같이 튜불린에 대해 재프로빙하였다.

도 13A는 6OkDa에서의 항-인간 PHF 타우 클론 AT100의 면역반응성을 보여준다. 셀렌산 나트륨의 존재하에, PHF 타우 신호는 셀렌산염 비처리 세포에 비해 시점 2 및 6 시간에서 감소한 것으로 나타났다.

도 13B는 60kDa에서의 항-인간 PHF 타우 클론 AT180의 면역반응성을 보여준 다. 셀렌산 나트륨의 존재하에, PHF 타우 신호는 셀렌산염 비처리 세포에 비해 시점 2 및 6 시간에서 뚜렷하게 감소하였다.

도 13C는 AT180 클론과 비교하여 AT270의 유사한 면역반응성 신호를 나타낸다. 73, 70 및 6OkDa에서 PH 타우의 3 가지 아형일 검출된 것으로 나타났다.

도 13D는 셀렌산 나트륨의 존재하(＋) 또는 부재하(-)에 마우스 뇌의 총 용해물에서 타우 단백질의 발현을 나타낸다. 마우스 뇌 조직에서 항-인간 타우, 특히 클론 HT-7은 비특이적인 것으로 나타났다.

실시예 11

인간 TAU441을 과발현하는 유전자이식 마우스(TMHT)의 행동 및 타우 뇌 병증에 대한 셀렌산 나트륨의 영향

방법

도입

본 연구는 뇌 특이 뮤린 Thy-1 촉진제의 제어하에 두 개의 돌이변이체 V337M 및 6406W를 가진 인간 TAU441 유전자를 과발현하는 TAU441 유전자이식(Tg) TMHT 마우스(C57BL6 백그라운)의 행동 및 뇌 형태에 대한 셀렌산 나트륨 처리의 영향을 평가하기 위해 설계되었다. 오픈 필드(Open Field, OF) 시험, 로타 로드(Rota Rod, RR) 시험 및 노즈 포케 호기심과 활성 시험에서 처리하고 1.5 및 3 개월후에 모든 Tg 마우스의 행동을 평가하였고, 이후 호기심 행동으로 평가하였다. 처리 말기에 추가로 모리스 수중 미로(Morris Water Maze, MWM) 작업에서 기억 및 학습력을 평가하였다. 기준 그룹의 비처리 마우스를 또한 OF 시험, RR 시험, 노즈 포케 시험 및 MWM 작업에서 시험하였다. 뇌 타우병증을 초기 처리군 당 3 마리의 동물로 결정하였다.

동물

뇌 특이 뮤린 Thy-1 촉진제의 조절 제어하에 과오돌연변이 V337M 및 R406W을 가진 인간 TAU441을 발현하는 수컷 및 암컷 Tg TMHT 마우스를 사용하였다. 마우스는 오스트리아 그래즈 소재 제이에스더블유-리서치(JSW-Research)에서 발생 및 사육하였다. 이들 마우스에 대한 C57BL/6 백그라운드는 우수한 학습자로서 알려진 마우스를 생성하였다. 이러한 마우스 모델은 인간 알츠하이머병 타우-병증과 유사성이 있다. 처리 개시에, 마우스의 나이는 5 개월＋2 주였고, 이는 또한 기준 그룹의 나이였다.

동물 식별 및 사육장

귀 표식(marking)으로 마우스를 식별하였다. 이들을 ABEDD^®에 의해 공급된 표준 설치류 잠자리에 공기가 통하는 개별 케이지(individual ventilated cage, IVC)에서 살게 하였다. 각 케이지에는 최대 5 마리의 마우스를 넣었다. 국제 기준에 기초하는 표준 작동 방법에 따라 마우스를 보호하였다.

각각의 케이지는 스크리닝 날짜 및 처리군 배분 뿐만 아니라 연구 번호, 성별, 동물 개개의 등록 번호(IRN, individual registration number), 출생일을 나타내는 색카드로 식별하였다

연구하는 동안 온도는 대략 24℃로 유지하였고, 상대 습도는 대략 40-70%로 유지하였다. 일정한 명-암 주기(12 시간 명/암)하에 동물을 사육하였다.

건조 펠렛형 표준 설치류 먹이(Altromin^®) 및 보통의 수돗물은 임의로 동물이 먹게 하였다.

처리

마우스를 그룹 A(셀렌산 나트륨), B(비히클) 및 C(기준)에 무작위적으로 배분하였다. 처리군 A에게는 12 주동안 음료수를 통해 셀렌산 나트륨을 공급한 반면, 대조군 마우스(B)에는 보통의 수돗물을 먹게 하였다. 적용을 위해, 1.2 ㎎의 셀렌산 나트륨을 멸균수 100 ㎖에 용해시켰고, 체중을 기록하였으며, 병을 케이지내에 배치하였다. 이러한 작업은 월요일, 수요일 및 금요일 마다 수행하였고, 소비량을 측정하기 위해 교환시 물의 중량을 재었다.

행동 시험

오픈 필드 시험

운동 기능의 가장 표준화된 일반적인 측정법은 오픈 필드(Open Field, OF)에서의 자발 활성이다. 본 조사를 위해, 플렉시글라스 오픈 필드(Plexiglas Open Field)(48×48 cm; TSE-System^®)를 사용하였다. 적외선광 빔을 상자 둘레에서 1.4 ㎝ 떨어진 곳에 배치하였다. 육성(rearing)을 감지하기 위해(후족부(hind paw)에서)), 또 다른 광 빔을 첫번째 것 보다 4 cm 위에 배치하였다. 새로운 환경에서 마우스의 행동 및 습관을 체크하기 위해 시험 시간은 5 분동안 지속하였다. 그후, 감정의 척도로써 배설물 덩어리의 수를 계수하였다. 마우스 마다 냄새 흔적을 제거한 후 OF는 70%로 세정하였다. 일주기성 주기(circadian cycle)의 광을 조사하는 동안 표준실 조명 조건하에 시험을 수행하였다.

로타 로드(Rota Rod) 시험

본 시험은 타우 Tg 마우스의 가능한 운동 장애를 검출하기 위해 사용되었다. 조사는 가속 5-레인-로타 로드(five-lane-Rota Rod)(TSE-Systems^®)에서 조사하였다. 마우스는 최대 300 초동안 프로그램을 완료해야 했다. 이들은 5 rpm의 속도로 시작하였고, 120 초후 로드의 속도는 60rpm에 도달하였다. 이와 같이 주행후, 낙하 잠재시간(latency) 및 그 때의 로드의 속도를 산출하였다.

노우즈 포케 호기심 및 활성 시험(Nose Poke Curiosity and Activity Test)

홀-보드(hole-board) 장치는 새로운 환경에 대한 마우스의 반응을 측정하는 간단한 방법을 제공하는 것으로, 마우스의 호기심 및 코를 홀에 넣으려는 경향을 이용하는 것이다. 호기심 행동의 조사는 홀-보드가 구비된 OF 박스에서 수행되었다(보드당 16개의 홀). 홀에 머리를 넣게 되면 각 홀의 가장자리 바로 아래에서 적외선 빔을 차단한다. 머리를 넣은 횟수 및 기간을 각 동물에 대하여 5 분동안 산출하였다.

모리스 수중 미로[Morris Water Maze, MWM]

모리스 수중 미로 과제는 직경 100 ㎝의 흑색 원형풀에서 수행하였다. 풀에 22±1℃의 수돗물을 채웠고, 풀을 실제로 부채꼴형상의 4 개 구역으로 나누었다. 수면에서 약 0.5 ㎝ 아래에 투명한 플랫폼(직경 8㎝)을 배치하였다. 예비시험을 제 외한 전체 실험 시간동안, 플랫폼은 풀의 남서쪽 사분원(quadrant)에 위치시켰다.

4 일의 지속적인 훈련 기간 하루 전에, 각 동물의 시력이 정상임을 확인하기 위해 동물에게 소위 "예비시험(60초씩 2회 시험)"을 수행하도록 하였다. 이 과제를 충족시킨 동물만 MWM 시험을 계속하였다.

MWM 과제에서, 각각의 마우스는 3 회의 시험을 4 일 연속으로 수행해야 했다. 하나의 실험은 최대 1 분동안 지속하였다. 이 시간동안, 마우스는 숨겨진 투명한 표적을 찾아야 했다. 동물이 물 밖으로 나오는 "길"을 찾지 못했을 경우, 조사자가 마우스에게 안내하거나 마우스를 플랫폼에 두었다. 각각의 시험후, 마우스를 플랫폼에서 10-15 초간 쉬게 하였다. 이 시간동안, 마우스는 주위 환경에 적응할 기회를 가졌다. 악영향으로부터 추적 시스템을 보호하기 위해 조사는 빛을 어둡게 한 조건하에서 실시하였다(Kaminski; PCS, Biomedical Research Systems). 풀을 둘러싸는 벽에는 검은색의 진한 기하학적 기호(예, 원 및 정사각형)를 고정하여, 마우스가 위치확정을 위한 상징으로서 사용할 수 있게 하였다.

약 5 내지 10 분의 시행간 간격(intertrial time)을 확보하기 위해, 시험 1회당 하나의 수영 그룹은 5 내지 6 마리의 마우스로 구성하였다.

탈출 잠재시간(마우스가 숨겨진 플랫폼을 찾아 물로부터 탈출하는데 필요한 시간(초)), 경로(표적에 도달하기 위한 궤적의 길이(미터)) 및 목적지 사분원에 체재시간(abidance)을 정량하기 위해, 컴퓨터 추적 시스템을 하용하였다. 컴퓨터는 풀 중심 위에 배치한 카메라에 연결하였다. 카메라는, 마우스 꼬리에 작은 머리핀으로 고정된 발광다이오드(light emitting diode, LED)의 신호를 검출하였다.

프로브 시험(Probe Trial)

4 일째 마지막 시험하고 1 시간후, 마우스를 소위 프로브 시험라는 시험을 수행하게 하였다. 이 때, 풀로부터 플랫폼을 제거하였고, 1분 프로브 시험동안 실험자는 이전의 표적 위치로 건너가는 횟수를 계수하였다. 추가로, 이 사분원에 체재한 시간을 측정하였다.

조직 표본 및 표본추출

처리 기간 말기에 그리고 모든 행동 시험을 실시한 후, 각 동물을 희생하고 혈액(혈장 및 혈청), CSF 및 뇌를 얻어 즉시 추가 실험을 진행하거나 추가 실험을 위해 저장하였다.

목적을 위해, 모든 마우스를 표준 흡입 마취에 의해 진정시켰다(이소플루란, 백스터(Baxter)). 비절개박리(blunt dissection) 및 대후두공(foramen magnum)에 의해 뇌척수액을 얻었다. 노출시, 파스퇴르(Pasteur) 피펫을 대후두공에 깊이 약 0.3-1 ㎜로 삽입하였다. 완전히 유출될 때까지 CSF를 흡인 및 모세관 작용에 의해 수집하였다. 각각의 시료를 즉시 냉동시키고 ELISA 기술에 의해 추가로 분석할 때까지 -80℃로 유지하였다.

CSF 표본추출후, 각각의 마우스를 등이 닿도록 누이고, 1 ㎖의 주사기에 부착된 26-게이지 바늘을 횡경막을 통하여 대략 2 ㎝의 깊이로 흉부에 삽입하였다. 약한 흡입을 바늘에 적용하였고, 마우스의 심방실(심실)에의 유치(placement)는 주사기로 흘러들어가는 혈액에 의해 확인하였다. 유출이 멈출때 까지 혈액을 흡인하여 EDTA 바이얼에 수집한 다음 후일 사용을 위해 -20℃에 저장하였다.

혈액 표본추출후, 유전자이식 마우스에 0.9% 염화나트륨을 심장내 관류시켰다. 뇌를 신속히 제거하여 오른쪽 반을 신선하게 제조한 4% 파라포름알데히드에 24 시간동안 침지고정하고, 조직학적 조사를 위해 파라핀에 포매하였다(embed). 왼쪽 반구를 드라이 아이스에서 동결시키고 아마도 후일 생화학적 분석을 위해 -80℃에 저장하였다.

먼저, 타우 병증을 정성적으로 및 정량적으로 평가하기 위해 아홉(9) 개의 뇌반구(Tg 동물군 당 3 개 이상)에 대하여 조직학적 평가를 수행하였다.

열 다섯개(15)의 관상 연속 절편(coronal consecutive section)(Leica SM 2000R)을 브레그마(Bregma) -1.82 내지 -1.34 mm 사이의 5 개의 상이한 뇌층 각각에서 절단하였는데(5 ㎛ 두께), 이는 갈리아스 염색(Gallyas staining)을 위해 그리고 특이 항체(AT180 및 HT7)로 타우 병증을 결정하기 위해 문헌[morphology atlas "The Mouse Brain" from Paxinos and Franklin (2nd edition)]에 따라 선택되었다. 조사된 모든 유전자이식 동물의 조직을 방법의 변형으로 인한 치우침(bias)를 피하기 위해 동일한 방식으로 정확하게 처리하였다. 사용하지 않아서 남아있는 뇌반구 또는 뇌조직을 모으고, 후원자가 진행방법을 결정할 때까지 또는 연구의 마지막까지 저장하였다.

타우 병증의 면역조직화학적 결정

타우 침착을 단일클론 타우-항체 AT180 및 HT7[피어스 엔도겐(Pierce Endogen^®)]을 사용하여 결정하였다. A180은 PHF-타우 및 농축체 유사 형성[본 항체 의 항원결정인자는 인산화 Thr231 잔기이다]을 인식하고, HT7는 정상 인간 타우 및 PHF-타우[이 항체의 항원결정인자는 잔기 159 내지 163 사이에 지도화되었음]를 인식한다.

5 개의 상이한 층 각각으로부터 취한 두께 5 ㎛의 관상 파라핀 절편을 상술한 단일클론 마우스 항-인간 타우-항체(AT180 - 1:100; HT7 - 1:1000)로 염색하고 이차 항-마우스 Cy3[1:500, 잭슨 라보라토리즈(Jackson Laboratories^®)]를 사용하여 가시화하였다. 상세한 염색 프로토콜은 아래와 설정된다:

인간 PHF-TAU 침착 결정을 위한 AT180 인큐베이션 프로토콜

1.) 티슈 클리어(Tissue Clear)[사쿠라(Sakura^®)] 및 등급 알코올(graded alcohol)[머크(Merck^®)] 시리즈를 통해 조직 절편을 탈파라핀화하고 수화시킨다.

2.) 아쿠아 비데스트(Aqua bidest)[프레세니우스-카비(Fresenius-Kabi^®)]에서 2 분동안 세척한다.

3.) 항원 박리(antigen unmasking)를 위해 조직 절편을 95℃ 스팀기에서 10% 시트르산 완충액[랩비젼(Labvision^®)]에 15 분동안 도입하고 실온에서 15 분동안 냉각시킨다.

4.) 절편을 2 x 5 분동안 PBS에서 세척한다.

5.) 내인성 과산화효소를 메탄올[머크(Merck^®)]에서 10 분동안 실온에서 1% 과산화수소[린나리스(Linaris^®)]로 차단시킨다.

6.) 절편을 2 x 5 분동안 PBS에서 세척한다.

7.) 습기찬 챔버에서 60 분동안 실온에서 MOM-차단 시약(Blocking Reagent)[벡터(Vector^®)]으로 비특이적 결합을 차단한다.

8.) 절편을 2 x 5 분동안 PBS에서 세척한다.

9.) 실온에서 5 분동안 MOM-희석제(Diluent)[벡터(Vector^®)]로 비특이적 결합을 차단한다.

10.) 습기찬 챔버에서 60 분동안 실온에서 AT180[피어스 엔도겐(Pierce Endogen^®); 1:100 MOM-희석제 중]과 인큐베이션한다.

11.) 절편을 3 x 5 분동안 PBS에서 세척한다.

12.) 습기찬 챔버에서 10 분동안 실온에서 10% 비면역성 염소-정상 혈청[Non-Immune Goat-Normal Serum(다코(Dako^®)) ]으로 비특이적 결합을 차단한다.

13.) 절편을 2 x 5 분동안 PBS에서 세척한다.

14.) 습기찬 챔버에서 60 분동안 실온에서 Cy3 염소 항-마우스[잭슨(Jackson^®); 1:500 MOM-희석제 중]와 인큐베이션한다.

15.) 절편을 5 분동안 PBS에서 세척한다.

16.) 절편을 5 분동안 아쿠아 비데스트(Aqua bidest)에서 세척한다.

17.) 절편을 모비올(Moviol) 및 커버슬립(coverslip)으로 덮는다.

화학약품 및 시약:

메탄올 중 1% 과산화수소:

60 ㎖ 메탄올＋2 ㎖ 30% 과산화수소＋0.6 ㎖ Triton X-100[엠레스코(Amresco^®)].

MOM-차단 시약:

2 방울의 MOM-마우스 IgG 차단 시약[MOM-키트(Vector^®)로부터]＋2.5 ㎖ PBS.

MOM-희석제:

10 ㎖ PBS＋800 ㎕ 단백질 농축물[MOM-키트(Vector^®)로부터].

항체 AT180:

MOM-희석제 중 1:100

항체 Cy3 염소 항-마우스:

MOM-희석제 중 1:500

정상 인간 타우 및 PHF-타우 침착물의 결정을 위한 HT7 인큐베이션 프로토콜

3.) 항원 박리(antigen unmasking)를 위해 조직 절편을 95℃ 스팀기에서 1% 시트르산 완충액[랩비젼(Labvision^®)]에 15 분동안 도입하고 실온에서 15 분동안 냉각시킨다.

4.) 절편을 2 x 5 분동안 PBS에서 세척한다.

6.) 절편을 2 x 5 분동안 PBS에서 세척한다.

8.) 절편을 2 x 5 분동안 PBS에서 세척한다.

10.) 습기찬 챔버에서 60 분동안 실온에서 HT7[피어스 엔도겐(Pierce Endogen^®); 1:100 MOM-희석제 중]과 인큐베이션한다.

11.) 절편을 3 x 5 분동안 PBS에서 세척한다.

13.) 절편을 2 x 5 분동안 PBS에서 세척한다.

15.) 절편을 5 분동안 PBS에서 세척한다.

17.) 절편을 모비올(Moviol) 및 커버슬립(coverslip)으로 덮는다.

화학약품 및 시약:

메탄올 중 1% 과산화수소:

MOM-차단 시약:

MOM-희석제:

10 ㎖ PBS＋800 ㎕ 단백질 농축물[MOM-키트(Vector^®)로부터].

항체 HT7:

MOM-희석제 중 1:1000

항체 Cy3 염소 항-마우스:

MOM-희석제 중 1:500

평가

행동

오픈 필드(OF)에서, 수평 및 수직 활성, 배설물 덩어리의 수, 사육의 수 및 기간, 과다활동 및 오픈 필드의 중심에서 소비한 시간 대 주변에서 소비한 시간을 측정하였다.

노우즈 포케 호기심 및 활성 시험에서, 머리를 넣은 횟수 및 기간을 계산하였다.

로타 로드 시험에서, 낙하 잠재시간 및 그 때의 로드의 속도를 계산하였다.

모리스 수중 미로 시험에서, 수영 경로의 길이 및 탈출 잠재시간을 기록하였다. 수영 속도는 수영 경로를 탈출 잠재시간으로 나누어 계산하였다. 플랫폼을 제거한 프로브 시험에서, 풀의 각각의 사분원에서 소비한 시간 뿐만 아니라 이전의 표적 위치로 건너가는 횟수를 테이터 기록용지에 기록하였다.

신경병리학

해마 및 편도체에서 타우 면역반응성의 정도를 결정하기 위해, 특수 영상 분석 소프트웨어[specialized image analysis software(이미지 프로 플러스(Image Pro Plus), version 4.5.1.29)]를 사용하였다. 다음의 파라미터를 평가 및 계산하였다:

* 각 절편에서 해마 및 편도체의 구역 영역

* 특정의 뇌 구역 해마 및 편도체에서 면역반응성 양성 세포의 절대 영역

* 해마 및 편도체의 특정의 뇌 구역 영역에 대한 면역반응성 양성 영역의 수

정량화 과정:

a) 이미지에 콘트라스트를 적용하지 않고 절편 형태의 우수한 시각화를 위해 이미지를 콘트라스팅한다(contrasting).

b) 해마 영역(=구역 영역)의 측정 및 해마 외형(outline)의 쌍방향 제도(interactive drawing).

c) 강도에 기초한 역치(threshold) 수준 이상으로 염색된 대상이 검출되는 관심 영역(area of interest, AOI)의 쌍방향 제도. 역치값을 결정하기 위해, 선형 막대그래프를 가시적인 면역반응이 없는 영역에서의 AOI에 가깝게 쌍방향 제도하였다. 선형 막대그래프의 모든 픽셀로부터 얻은 평균 강도 수준을 일정하게 정의된 강도 역치 수준과 합한다. 크기 7 ㎛² 이하의 대상은 배재하였다.

d) AOI에서의 염색 영역의 합 및 각 대상의 영역의 측정.

e) 편도체에 대해 a-d) 과정을 반복.

f) 상대적인 타우 면역반응 영역의 계산(="타우 면역반응성 영역의 합/구역 영역*100").

g) 이미지 명칭, 구역 영역, 총 타우 영역 및 타우 영역(%)을 포함하는 엑셀 스프레드 시트(Excel spread sheet)에 자동화 데이터 전문화. 리마크용 필드를 사 용하여 이미지 품질 및 제외 기준을 각각 기록하였다. 제외 기준은 절편의 결손부, 다수의 주름 또는 지배적인 균열이었다.

h) 이미지를 저장하지 않고(원 데이터를 유지하기 위해) 종료.

통계학

평균, 표준 편차 또는 SEM을 모든 측정 파라미터에 대해 계산하였다.

결과

일반적인 의견

일반적으로, 셀렌산 나트륨에 의한 처리는 어떠한 부작용을 일으키지도 않았고 어떠한 조기 사망도 야기하지 않았음을 확언할 수 있다.

행동 결과

오픈 필드

활성 파라미터(활성, 과다활동, 육성 행동(rearing behaviour))는 셀렌산 나트륨 처리에 의해 영향을 받지 않았지만, 셀렌산 나트륨 처리된 마우스는 최초 OF 기간동안 산만한 접촉주성 행동을 보였다. 이는 첫 번째 비히클 및 셀렌산 나트륨 처리 동물사이에 의미없는 접촉주성인 오픈 필드 박스 중심에서 유의적으로 높은 체재시간을 생성하였다(도 14 - "접촉주성", 처리 동물을 위한 T-시험을 참고할 수 있다: p = 0.019). 두 번째 처리 말기에, 접촉주성 행동을 비히클 대조군의 수준으로 표준화하였다.

기준 동물은 OF 시험에서 높은 배변률 특징을 보인 반면, 처리군 그룹 모두는 한달 반 이후에 조사되었는데(ANOVA: p = 0.018, 두 처리군 그룹 모두에 대해 p<0.05), 이는 시험 과정에 대한 감정 반응이 높았다는 것을 나타낸다.

로타 로드

운동 능력은 셀렌산 나트륨 처리에 의해 변하지 않고 그대로 유지하였다.

노우즈 포케 호기심 및 활성 시험

호기심 행동은 셀렌산 나트륨 처리에 의해 변하지 않고 그대로 유지하였다.

모리스 수중 미로

두 개의 상이한 처리군 그룹과 기준(5 개월령 동물 처리)에 대해 모리스 수중 미로(MWM)을 수행한 결과를 통계학적 분석 결과를 나타내는 표 4 및 도 15에 나타내었다. MWM 과제를 통해, 비히클 그룹에 비해 그리고 심지어 3 개월령의 어린 기준 그룹에 비해 셀렌산 나트륨 처리 동물들 사이에서 훨씬 유의적인 차이를 보인 것으로 일부의 경우(표 4 참조) 명백히 나타났다.

표 4: 모리스 수중 미로 결과에 대한 맨 위트니 U-시험(Mann Whitney U-test) 결과의 표

결과는 셀렌산 나트륨의 인지기능 개선 가능성을 보여주는 것이다.

뇌 조직학 및 면역조직화학의 결과

일반적인 결과

AT180 및 HT7 IHC의 정량에 있어서, 모든 조사 뇌에서 해마 및 편도체의 구역 영역은 매우 일정하였는데, 이는 면역조직화학적 염색 단계에서의 조직에 대한 부작용(예, 주름, 상이한 절단 환경)을 배제하고, 더 나아가 어떤 처리도 위축증을 유도하지 않는다는 암시이다. 특정된 타우 로딩 데이터는 최소한의 차이를 극복할 수 있도록 절편의 개개 구역 크기와 관련이 있다.

HT7 및 AT180

해마에서의 상대적 HT4-타우 영역의 비율은 비히클(ANOVA: p<0.05, 처리군 그룹의 T-시험: p=0.04) 및 비처리군 기준 그룹(ANOVA: p<0.05; 도 16A 참조)에 비해 셀렌산 나트륨(1.2 ㎎)으로 처리한 동물에서 유의적으로 감소하였다. 이러한 효과는 편도체에서 더욱 두드러졌는데(도 16B 참조), 여기서 셀렌산 나트륨 처리 마우스는 미처리 기준 그룹(ANOVA: p<0.01) 및 비히클 처리 동물(ANOVA: p<0.05; 처리 동물에 대해서만 T-시험: p = 0.0018)에 비해 상대적인 HT7-타우 영역의 비율이 크게 감소한 것으로 나타났다.

또한 HT7-타우와 유사하게, 해마에서의 상대적 AT180-타우의 비율은 비히클에 비해 셀렌산 나트륨(1.2 ㎎)으로 처리한 동물에서 감소하였지만(처리군 그룹의 T-시험: p=0.04, 도 17A 참조), 유의 수준이 낮다. 또한, 이러한 효과는 편도체에서 더욱 두드러졌으며(도 17B 참조), 여기서 셀렌산 나트륨 처리 마우스는 비히클 그룹에 비해 상대적 HT7-타우의 비율이 유의적으로 감소한 것으로 나타났지만(ANOVA: p<0.05, 처리군 그룹의 T-시험: p=0.0045) 미처리 기준 그룹에 대해서는 그렇지 않았다.

해마 및 편도체에서 AT180 및 HT7 면역반응성 양성 신경세포는 신경 체세포(neuronal soma)에서 대량의 타우 침착이 나타났으며, 이는 PHF 타우로 조밀하게 채워져 있다. 셀렌산 나트륨 처리는 해마 CA1 구역의 신경세포층 및 편도체에서의 타우 양성 세포 뿐만아니라 타우 로딩(tau load)을 명백하게 감소시켰다.

효과 및 결론의 요약

＊ 처리 개시하고 1 개월 반 이후 낮은 접촉주성은 셀렌산 나트륨 처리 유전자이식 마우스에서의 편도체 구조와 관련된 공포감의 변화를 암시한다. 장기간 셀렌산 나트륨 처리후, 마우스는 희생되기 전 두 번째 오픈 필드 시험에서 비히클 처리 대조군에 필적하는 정상의 접촉주성 행동을 회복하였다.

＊ 로타 로드 기능, 오픈 필드 활성, 과다활동 및 육성 행동과 같은 모든 운동 파라미터는 셀렌산 나트륨에 의해 영향을 받지 않았다.

＊ 셀렌산 나트륨 처리가 모리스 수중 미로에서 시험된 인지능력을 개선시킬 수 있었다. 1, 2 및 3 일째, 셀렌산 나트륨 처리군 동물은 비히클 동물보다 훨씬 유의적으로(p≤O.Ol) 빠르게 플랫폼을 찾을 수 있었고, 1 일째 또한 기준 그룹의 3 개월 어린 동물보다 빨리 플랫폼을 찾을 수 있었다.

＊ TMHT Tg 마우스의 해마 및 편도체에서 타우 로딩 및 HT7 면역양성 타우 침착을 계산했을 때 셀렌산 나트륨 처리에 의한 뚜렷한 효과를 볼 수 있다.

처리에 의해 미처리 기준 그룹에 대해서는 해마 및 편도체에서 또는 비히클(H₂O) 처리 대조군에서는 오히려 편도체에서 HT7 양성 타우 영역이 크게 감소하였음을 볼 수 있다.

＊ HT7-타우 침착에 대한 결과는 AT180 인큐베이션에 의해 뒤받침된다. 여기서, 해마 및 편도체에서 비히클(H₂O) 처리 대조군에 비해 셀렌산 나트륨으로 처리후 AT180 양성 타우가 유의적으로 감소하였음을 볼 수 있다.

참고문헌

Claims

대상에서 신경변성 질환을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 대상에게 유효량의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염을 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 신경변성 질환이 타우병증(tauopathy) 또는 α-시뉴클레오병증(α-synucleopathy)인 방법.
제2항에 있어서, 상기 타우병증은 초로 치매, 노년 치매, 알츠하이머병, 염색체 17과 연관된 파킨슨증(FTDP-17), 진행성 핵내 마비(progressive subnuclear palsy), 피크병(Pick's disease), 원발성 진행성 실어증, 전두측두 치매 및 피질기저핵(corticobasal) 치매 중에서 선택되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 타우병증은 초로 치매, 노년 치매 및 알츠하이머병 중에서 선택되는 것인 방법.
제2항에 있어서, 상기 α-시뉴클레오병증은 파킨슨병, 치매를 지닌 파킨슨병, 루이 소체를 지닌 치매, 피크병, 다운 증후군, 다계통 위축증(multiple system atrophy), 근위축성 축삭 경화증(ALS, amyotrophic lateral sclerosis) 및 할러보 르덴-스파츠 증후군(Hallervorden-Spatz syndrome) 중에서 선택되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 α-시뉴클레오병증이 파킨슨병인 방법.
제1항에 있어서, 신경변성 질환을 치료하거나 예방하기 위한 또 다른 치료제 또는 신경변성 질환의 증상을 경감시키기 위한 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
신경세포, 신경교 세포 또는 루이 소체에서 타우 단백질의 인산화를 억제하거나 감소시키는 방법으로서, 신경세포 또는 신경교 세포를 유효량의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염에 노출시키는 단계를 포함하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 타우 단백질이 미세소관-관련 타우 단백질인 방법.
제8항에 있어서, 상기 타우 단백질은 신경원섬유 농축체(neurofibrillary tangle)에 존재하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 타우 단백질의 과인산화가 억제되거나 예방되는 것인 방법.
PP2A의 활성을 증대시키는 방법으로서, PP2A를 유효량의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염에 노출시키는 단계를 포함하는 방법.
제12항에 있어서, 상기 PP2A가 Akt를 탈인산화시키는 아형(isoform)인 방법.
제12항에 있어서, 상기 PP2A가 타우 단백질을 탈인산화시키는 아형인 방법.
제14항에 있어서, 상기 타우 단백질이 신경세포, 신경교 세포 또는 루이 소체에서 발견된 미세소관-관련 타우 단백질인 방법.
신경세포 또는 신경교 세포에서 GSK3β의 활성을 억제하는 방법으로서, 신경세포 또는 신경교 세포를 유효량의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염에 노출시키는 단계를 포함하는 방법.
신경변성 질환을 치료하거나 또는 예방하기 위한 의약의 제조에서의 셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 용도.
셀렌산염 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 신경변성 질환을 치료하거나 예방하기 위한 또 다른 제제를 포함하는 약학 조성물.
제18항에 있어서, 상기 다른 제제는 콜린에스테라제 억제제, N-메틸-D-아스파라긴산염 수용체 길항제, 에스트로겐 제제, 비스테로이드성 항염증성 약물, 레보도파(levodopa), 도파 데카르복실라제 억제제, 도파민 작용제, 모노아민 옥시다제 B 억제제, 항콜린작용성 제제 및 COMT 억제제 중 하나 이상으로부터 선택되는 약학 조성물.
제18항에 있어서, 상기 다른 제제는 타크린(tacrine), 도네페질(donepezil), 갈란타민(galantamine), 리바스티그민(rivastigmine), 메만틴(memantine), 프레마린(premarin), 아스피린(aspirin), 이부프로펜(ibuprofen), 레보도파(levodopa), 카비도파(carbidopa), 벤세라지드(benserazide), 브로모크립틴(bromocriptine), 페르골리드(pergolide), 프라미펙솔(pramipexole), 로피니롤(ropinirole), 카베르골린(cabergoline), 아포모르핀(apomorphine), 리수리드(lisuride), 셀레길린(selegiline), 라사실린(rasasiline), 벤조트롭핀 메실레이트, 트리헥실페니딜 히드로클로라이드, 엔타캅폰(entacapone), 톨라캅폰(tolacapone) 및 아만타딘(amantadine) 중에서 선택되는 것인 약학 조성물.