CN111650372A - 载脂蛋白c1在作为胃癌诊断及预后评价生物标记物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种诊断胃癌及其预后评价的标志物，其所述标志物含有载脂蛋白C1。本发明的标志物在胃癌患者中血清浓度明显正常人，而且该标志物在胃癌的蛋白表达水平明显高于正常组织。本发明的标志物与胃癌和患者生存密切相关，即载脂蛋白C1表达高的胃患者生存率低，载脂蛋白C1表达低的胃癌患者生存率高。因此，本发明为胃癌的诊断及其预后评价提供新的标志物。

Description

载脂蛋白C1在作为胃癌诊断及预后评价生物标记物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体是涉及一种肿瘤生物标志物及其在制备胃癌诊断和预后判断的用途。

背景技术

胃癌(gastric carcinoma)是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，胃癌是严重威胁全球健康的恶性肿瘤。我国胃癌同样占全球发病、死亡的近50％在我国各种恶性肿瘤中发病率居首位。胃癌可发生于胃的任何部位，其中半数以上发生于胃窦部，胃大弯、胃小弯及前后壁均可受累。绝大多数胃癌属于腺癌，早期无明显症状，或出现上腹不适、嗳气等非特异性症状，常与胃炎、胃溃疡等胃慢性疾病症状相似，易被忽略，因此，目前我国胃癌的早期诊断率仍较低。胃癌的预后与胃癌的病理分期、部位、组织类型、生物学行为以及治疗措施有关。目前胃癌的诊断目前主要是通过胃镜发现。做胃镜存在两个问题，一是病人很难受；二是发现多是晚期。胃癌的防治仍然存在大量亟待解决的问题，包括如何更早期发现、及时干预，如何实现疗效评估和监测，如何对术后患者做到实时准确的复发监控。

胃癌的防治仍然存在大量亟待解决的问题，包括如何更早期发现、及时干预，如何实现疗效评估和监测，如何对术后患者做到实时准确的复发监控。发展具有高灵敏度、特异性强，便利的胃癌诊断产品，是提高胃癌早期检出率，改善胃癌患者预后的关键之一。近年来发现载脂蛋白C 1(Apolipoprotein C-1)是极低密度脂蛋白胆固醇的主要载脂蛋白，也存在于高密度脂蛋白-胆固醇和低密度脂蛋白-胆固醇中，有4种不同的载脂蛋白C，即载脂蛋白CⅠ、载脂蛋白CⅡ、载脂蛋白CⅢ、载脂蛋白C IV，它是CM、VLDL他和HDL的少量结构蛋白。近年来还发现载脂蛋白C1的表达和胰腺癌相关。载脂蛋白C 1的过表达促进胰腺癌细胞的增值，反之siRNA降低载脂蛋白C 1的表达抑制细胞的增值。载脂蛋白C 1的表达胰腺癌患者的生存率密切相关。有两篇文献报道(Exp Ther Med.2012Jun；3(6):1005-1009.Epub2012Mar 14.和PLoS One.2011Jan 18；6(1):e14540.doi:10.1371/journal.pone.0014540)载脂蛋白C 1的表达在胃癌表达低。

到目前为止，没有载脂蛋白C 1在胃癌中高表达的报道，载脂蛋白C 1作为胃癌诊断和预后评价的标志物也未见报道。

发明内容

本发明的目的之一在证明载脂蛋白C 1在胃癌高表达，载脂蛋白C 1作为胃癌生物标记物中的应用，该应用为胃癌的诊断提高了新思路。

本发明的目的之二在证明载脂蛋白C 1的表达和胃癌病人的预后密切相关，载脂蛋白C 1能够作为胃癌病人预后判断的生物标记物。

本发明的技术方案提供了载脂蛋白C1(Apolipoprotein C-1，简写载脂蛋白C 1)在作为胃癌诊断或判断胃癌预后标志物中的应用。

所述的载脂蛋白C1在胃癌患者血清浓度明显高于正常人。

组织芯片免疫组化结果显示所述的载脂蛋白C1的蛋白表达在胃癌患者组织中表达明显高于癌旁和正常组织。

所述的胃癌组织中载脂蛋白C1的表达和胃癌生存密切相关。载脂蛋白C1表达高的患者生存率低，载脂蛋白C 1表达低的患者生存率高。

载脂蛋白C 1为诊断胃癌及其预后的生物标志物。

有益技术效果，本发明为胃癌的诊断及其预后评价提供新的生物标志物。

附图说明

图1是检测胃癌患者和正常对照血清载脂蛋白C 1的标准曲线方程式和相关系数R。

图2是北京协和医院32例胃癌患者和32例正常对照血清载脂蛋白C 1浓度。

图3是胃癌组织芯片胃癌患者，正常人载脂蛋白C 1的表达。

图4是胃癌组织芯片数据显示胃癌患者生存率和载脂蛋白C 1表达的关系。

具体实施方式：

实施例1.利用载脂蛋白C 1试剂盒分析胃癌患者和正常对照血清载脂蛋白C 1的含量

1.1载脂蛋白C 1试剂盒名称：人载脂蛋白C1(载脂蛋白C 1)酶联免疫吸附测定试剂盒。购自

公司(中国湖北武汉)，货号：E-EL-H0465c 96T

1.2载脂蛋白C 1试剂盒实验原理：本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法。用抗人载脂蛋白C 1抗体包被于酶标板上，实验时样品或标准品中的人载脂蛋白C 1会与包被抗体结合，游离成分被洗去。依次加入生物素化的抗人载脂蛋白C 1抗体和辣根过氧化物酶标记亲和素。抗人载脂蛋白C 1抗体与结合在包被抗体上的人载脂蛋白C 1结合、生物素与亲和素特异性结合而形成免疫复合物，游离的成分被洗去。加入显色底物(TMB)，TMB在辣根过氧化物酶的催化下呈现蓝色，加终止液后变成黄色。用酶标仪在450nm波长处测OD值，载脂蛋白C1浓度与OD450值之间呈正比，通过绘制标准曲线计算出样品中载脂蛋白C 1的浓度。

1.3试剂盒组成保存及试验所需其他试剂和仪器

试剂盒组成及保存：ELISA酶标板(可拆卸)Micro ELISA Plate(Dismountable)8孔×12条，冻干标准品Reference Standard 2支-20℃，可存放6个月，浓缩生物素化抗体(100×)Concentrated Biotinylated Detection Ab 1支120μL，浓缩HRP酶结合物(100×)Concentrated HRP Conjugate 1支120μL-20℃(避光)，可存放6个月，标准品&样品稀释液Reference Standard&Sample Diluent 1瓶20mL，4℃，可存放6个月，生物素化抗体稀释液Biotinylated Detection Ab Diluent 1瓶14mL，酶结合物稀释液HRP Conjugate Diluent1瓶14mL，浓缩洗涤液(25×)Concentrated Wash Buffer(25×)1瓶30mL，底物溶液(TMB)Substrate Reagent 1瓶10mL 4℃(避光)，反应终止液Stop Solution 1瓶10mL 4℃，封板覆膜Plate Sealer 5张。

试验所需其他试剂及仪器：酶标仪(450nm波长滤光片)，高精度移液器，EP管及一次性吸头：0.5-10μL,2-20μL,20-200μL,200-1000μL，37℃恒温箱，双蒸水或去离子水，吸水纸。

1.4样品收集方法

所用样品为血清：全血样品于室温放置2小时或4℃过夜后于1000×g离心20分钟，取上清即可检测，收集血液的试管应为一次性的无内毒素试管。

1.5检测前准备工作:

1.5.1请提前20分钟从冰箱中取出试剂盒，平衡至室温。读数前15分钟打开酶标仪预热。

1.5.2洗涤液：将浓缩洗涤液用双蒸水稀释(1:24)。

提示：从冰箱中取出的浓缩洗涤液可能有结晶，属于正常现象，可用40℃水浴微加热使结晶完全溶解后再配制洗涤液。当日使用。

1.5.3标准品工作液将标准品于10000×g离心1分钟，加入标准品&样品稀释液1.0mL至冻干标准品中，旋紧管盖，静置10分钟，上下颠倒数次，待其充分溶解后，轻轻混匀，配成600ng/mL的标准品工作液。然后根据需要进行倍比稀释。建议配制成以下浓度：600,300,150,75,37.5,18.75,9.38,0ng/mL。倍比稀释方法：取7支EP管，每管中加入500μL标准品&样品稀释液,从600ng/mL的标准品工作液中吸取500μL到其中一支EP管中混匀配成300ng/mL的标准品工作液，按此步骤往后依次吸取混匀。如下图。提示：最后一管直接作为空白孔，不需要再从倒数第二管中吸取液体。

1.5.4生物素化抗体工作液：实验前计算实验所需用量(以100μL/孔计算)，实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以生物素化抗体稀释液将100×浓缩生物素化抗体稀释成1×工作浓度。当日使用。

1.5.5酶结合物工作液：实验前计算当次实验所需用量(以100μL/孔计算)，实际配制时应多配制100-200μL。使用前15分钟，以酶结合物稀释液将100×浓缩HRP酶结合物稀释成1×工作浓度。当日使用。

1.6操作步骤

1.6.1.将标准品工作液依次加入到前两列孔中，每个浓度的工作液并列加两孔，每孔100μL。待测样品加入到其他孔,每孔100μL(若样本浓度高于检测范围，需用标准品&样本稀释液稀释后取样)。给酶标板覆膜，37℃孵育90分钟。

提示：加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，避免产生气泡。加样时间控制在10分钟内。

1.6.2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每个孔中加入生物素化抗体工作液100μL，混匀，酶标板加上覆膜，37℃温育1小时。

1.6.3.甩尽孔内液体，每孔加洗涤液350μL，浸泡1-2分钟，吸去或甩掉酶标板内的液体，在厚的吸水纸上拍干。重复此洗板步骤3次。

提示：此处与其他洗板步骤都可用洗板机。

1.6.4.每孔加酶结合物工作液100μL，加上覆膜，37℃温育30分钟。

1.6.5.弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。

1.6.6.每孔加90μL底物溶液(TMB)，酶标板加上覆膜37℃避光孵育15分钟左右。

提示：根据实际显色情况酌情缩短或延长，但不可超过30分钟。当标准孔出现明显梯度时，即可终止。

1.6.7.每孔加终止液50μL，终止反应。

提示：终止液的加入顺序应尽量与底物溶液的加入顺序相同。

1.6.8.立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度(OD值)。

1.7结果分析

1.7.1计算每组复孔的平均OD值。每个标准品的平均OD值减去空白孔的OD值作为矫正值。以浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在双对数坐标纸上绘出四参数逻辑函数的标准曲线(作图时去掉空白组的值)，。

1.7.2若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重测。

1.8.实验结果

1.8.1得到载脂蛋白C 1的标准曲线方程y＝0.2541x-0.0671和相关系数R＝0.9729(纵坐标为浓度，横坐标为OD值)，见图1。胃癌患者和正常对照血清载脂蛋白C 1的浓度根据各自所测OD值代入方程计算得到，见图1.

实施例2.免疫组化技术检测胃癌组织芯片载脂蛋白C 1的表达

2.1组织芯片购自西安百思达生物科技有限公司(中国陕西西安)。

所用胃癌组织芯片货号为ST291a。该芯片为胃癌及其边缘组织组合芯片，芯片含有TNM、临床分期和病理分级208/208点。

2.2免疫组化所用载脂蛋白C 1抗体购自美国Invitrogen公司的载脂蛋白C1polyclonal antibody(Cat#PA5-18706)。

2.3免疫组化所需其他试剂

二甲苯，30％H₂O₂，DAB显色剂(DAKO公司)，PBS，TBST，无水酒精，封片剂，Envision(DAKO)。

2.4免疫组化实验步骤：

2.4.1胃癌芯片常规脱蜡至水。

2.4.2 3％H2O2去离子水(无色液体)孵育10-30分钟，以灭活内源性过氧化物酶活性。

2.4.3蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟

2.4.4采用抗原修复：微波(建议30分钟内4次中火)、高压、酶修复方法。自然冷却，再用3分钟×3次。

2.4.5血清封闭：室温15-30分钟，尽可能与二抗来源一致。倾去，勿洗。

2.4.6滴加适当比例稀释的一抗，37℃孵育2～3小时或4℃过夜(最好复温)。PBS冲洗，3分钟×5次。

2.4.7滴加生物素标记的二抗，室温或37℃孵育30分钟-1h。

2.4.8PBS冲洗，3分钟×5次。

2.4.9滴加SP(链霉亲和素-过氧化物酶)，室温或37℃孵育30分钟-1h。

2.4.10PBS冲洗，3分钟×5次。

2.4.11显色剂显色(DAB等)。

2.4.12自来水充分冲洗。

2.4.13可进行复染，脱水，透明。

2.4.14选择适当的封片剂封片。

2.5实验结果。

2.5.1胃癌组织芯片免疫组化结果显示胃癌组织中载脂蛋白C 1的表达比胃正常组织高(见图3)。

2.5.2根据胃癌组织芯片免疫组化结果和患者临床信息分析发现胃癌患者载脂蛋白C 1表达高的生存率低，胃癌患者载脂蛋白C 1表达低的生存率高(见图4)。

Claims (6)

1.载脂蛋白C1在作为胃癌诊断及预后评价生物标记物中的应用。

2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的载脂蛋白C1在胃癌患者血清浓度明显高于正常人。

3.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的载脂蛋白C1的蛋白表达在胃癌患者组织中表达明显高于癌旁和正常胃。

4.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的胃癌组织中载脂蛋白C1的表达与胃癌患者生存密切相关。

5.根据权利要求4的应用，其特征在于，载脂蛋白C1表达高的胃癌患者生存率低，载脂蛋白C1表达低的胃癌患者生存率高。

6.根据权利要求1的应用，其特征在于，载脂蛋白C1为诊断胃癌及胃癌预后评价的生物标志物。

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