DD253089A1 - Verfahren zur isolierung pathologischer proteine - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung pathologischer Proteine oder Proteide. Das erfindungsgemaesse Verfahren findet Anwendung auf dem Gebiet der Medizin, insbesondere der Dermatologie fuer diagnostische und therapeutische Zwecke. Ziel der Erfindung ist die spezifische Erfassung von pathologischen Proteinen oder Proteiden bei der Schuppenflechte (Psoriasis vulgaris) oder anderen mit Hyperkeratosen einhergehenden Hauterkrankungen zum Zwecke der Labordiagnostik oder der Isolierung. Das Wesen der Erfindung besteht in der Herstellung und Anwendung eines durch Immunisierung mit Extrakten aus den Hautschuppen der Erkrankten gewonnenen tierischen Antiserums, mit dem die immunchemische Praezipitation der pathologischen Komponenten nach elektrophoretischer Auftrennung erfolgt. Die bei der Immunelektrophorese in der erfindungsgemaessen Form erhaltenen Fraktionen dienen zur Erzeugung monospezifischer Antikoerper, die zur Analytik mittels Fluoreszenz-, Radio- oder Enzymimmunoassays oder zur Entfernung pathogener Komponenten aus dem Organismus zu therapeutischen Zwecken sowie zur Isolierung immunstimulatorisch wirkender Faktoren eingesetzt werden koennen.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung pathologischer Proteine. Anwendung findet das erfindungsgemäße Verfahren in der Pharmazie und medizinischen Laboratoriumsdiagnostik, insbesondere in der Dermatologie.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Eine relativ häufig auftretende, mit Hyperkeratose einhergehende Hauterkrankung ist die Schuppenflechte (Psoriasis vulgaris), weshalb die Aufklärung ihrer Entstehung, ihre Diagnostik und dieOptimierung ihrer Therapie seit langem Gegenstand medizinischer, biochemischer und immunopharmakologischer Forschungen sind (vgl. Kroger, H. u. G.Stüttgen: Current Research Problems in Psoriasis, Berlin 1984).

Die Labordiagnostik ist dabei auf die herkömmlichen Methoden angewiesen; beispielsweise dienen zur Bestimmung der Serumproteine die bekannten immunchemischen Verfahren mit kommerziell verfügbaren Immunpräparaten und Testbestecks. Damit können aber nur die Proteinkomponenten erfaßt werden, die auch im normalen Blut oder anderen Körperflüssigkeiten vorkommen, wobei die quantitativen Bestimmungsverfahren bei verschiedenen Erkrankungen Abweichungen von den Normalwerten ergeben haben. Das gilt auch für Hauterkrankungen wie die Schuppenflechte, bei der das Immunglobulin A erhöht gefunden wurde. Außer den bekannten, immunchemisch definierten Proteinen wurden bei verschiedenen Erkrankungen, darunter neben anderen Hautkrankheiten auch die Psoriasis vulgaris, Komponenten gefunden, die regulatorische Wirkungen auf das Immunsystem ausüben und mit dem Krankheitsgeschehen in Zusammenhang gebracht wurden. Hierfür sprechen auch Therapieerfolge bei Psoriasis vulgaris durch Plasmapherese und ähnliche Verfahren. Typisches Merkmal der Psoriasis vulgaris ist die intensive Bildung von Hautschuppen, aus denen eine Vielzahl von Proteinen isoliert werden konnte, wie sie auch im Blutserum vorkommen. Dieser Umstand sowie Beobachtungen über zelluläre Immunphänomene im Psoriasisherd waren der Anlaß dazu, auch in den Extrakten aus den Schuppen der psoriatischen Krankheitsherde solche Komponenten zu vermuten, die immunregulatorische Funktionen haben und möglicherweise auch aus dem Blut in den Psoriasisherd gelangen können. In verschiedenen zellulären Immuntests wurden solche Effekte mit Extrakten aus Psoriasisschuppen auch beobachtet [Langhof, H. u. Mitarb., Hautarzt 17 (1966) 101; Tagami, H. u. Mitarb., Brit. J. Dermatol. 97 (1977) 509; Westphal, H. u. Mitarb., Dermatol. Monatsschr. 170(1984)705; Liden,S. u. Mitarb., Arch. Dermatol. Res. 269(1980)93; Schwartze, G. u. Mitarb., Dermatol. Monatsschr. 172 (1986) 457]. Wenn dabei durch Elektrophorese, Gelchromatographie oder ähnliche Methoden hergestellte Fraktionen getestet wurden, konnten den immunbiologischen Wirkungen Trennbereiche oder Molekulargewichtsbereiche zugeordnet werden. Eine eindeutige Charakterisierung oder spezifische Isolierung einzelner Komponenten ist aber damit nur im günstigsten Fall möglich, d. h. wenn mit dem angewandten Trennverfahren zufällig eine einzelne Komponente ohne Überlagerung durch andere Substanzen isoliert werden kann — kenntlich an einem steilen Peak im Elutionsprofil—was aber aus der Literatur nicht bekannt ist.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist, die bei der Psoriasis vulgaris oder anderen mit Hyperkeratosen einhergehenden Hauterkrankungen pathologisch auftretenden Proteine oder Proteide für diagnostische, prognostische oder therapeutische Zwecke mit hoher Spezifität nachzuweisen oder quantitativ zu bestimmen bzw. zu isolieren oder spezifisch aus einer Körperflüssigkeit zu entfernen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, die bei schuppenden Hautkrankheiten, insbesondere den Formen der Psoriasis vulgaris, auftretenden pathologischen Proteine oder Proteide immunchemisch zu isolieren bzw. nachzuweisen oder quantitativ zubestimmen oder zu therapeutischen Zwecken aus dem Blut zu entfernen.

Erfindungsgemäß wird dies dadurch erreicht, daß die Hautschuppen der Erkrankten mit gepufferter Salzlösung extrahiert und diese Extrakte zur Immunisierung von Tieren, insbesondere Kaninchen, benutzt werden. Mit Hilfe des so gewonnenen Antiserums lassen sich die durch Gelelektrophorese, bei der der Startpunkt gegenüber den üblichen Formen der Elektrophorese anodenwärts verschoben ist, abgetrennten Fraktionen immunchemisch spezifisch durch Präzipitation erfassen. Diese Präzipitate können dann wieder zur Immunisierung von Tieren zwecks Herstellung monospezifischer Antiseren dienen. Unter den veränderten Elektrophoresebedingungen lassen sich in einem Psoriasisschuppenextrakt, aus dem die Serumproteine durch Absorption mit einem polyspezifischen Antiserum entfernt wurden, mit dem gewonnenen Antiserum mindestens fünf Fraktionen erfassen, unter denen als dominierende Komponente eine Fraktion hervortritt, die im Post-y-Bereich liegt, d. h. •jenseits der y-Globuline in Richtung der Kathode. Diese Fraktion ist unter den üblich'en Elektrophoresebedingungen und mit kommerziellen Antiseren nicht darzustellen.

Die durch Immunisierung von Tieren mit den erfindungsgemäß isolierten Proteinen oder Proteiden gewonnenen Antikörper können in Form von Testbestecken zur Analyse dieser pathologischen Komponenten zum Zwecke der Diagnostik, Prognostik und Therapiekontrolle im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten der betreffenden Hautkranken und außerdem zur spezifischen Elimination solcher Komponenten aus Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, dienen. So sind diese Antikörper für immunologische Untersuchungsverfahren bedeutungsvoll und ermöglichen umfangreiche ätiopathologische Untersuchungen mit großer Spezifität. Neben der Fluoreszenzmarkierung dieser Antikörper ist dabei auch eine Markierung mit Radioisotopen oder Enzymen oder eine Bindung der Antikörper an feste Träger möglich; außerdem kann die Empfindlichkeit der Immunreaktionen dadurch erhöht werden, daß die erfindungsgemäß isolierten Proteine zur Erzeugung monospezifischer Antikörper dienen. Andererseits können derartige pathologische Proteine oder Proteide auch als Immunzellstimulantien Einsatz finden.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachfolgend an 2 Beispielen erläutert:

1. Herstellung eines Antiserums gegen pathologische Proteine bei Psoriasis vulgaris, Fraktionierung und immunchemische Präzipitation

Hautschuppen von Patienten mit Psoriasis, die sich ohne körperliche Beeinträchtigung sammeln und bis zur Verarbeitung bei -20°C lagern lassen, werden mit vorgekühlter (+4⁰C) phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vom pH 7,2 im Verhältnis 1:10 (1g Schuppen pro 10 ml PBS) unter Kühlung mit Eiswasser homogenisiert. Das Homogenatwird 16 Stunden bei +4X unter langsamer Bewegung (Rühren oder Schütteln) gehalten, dann 20min bei maximal +4⁰C mit 8000 bis 10000g zentrifugiert und deropale Überstand durch Lyophilisation oder Ultrafiltration auf 0,1 des Ausgangsvolumens eingeengt, wobei im Falle der Lyophilisation die konzentrierte Lösung gegen physiologische Salzlösung im Überschuß zu dialysieren ist. Der Proteingehalt wird mit bekannten Methoden bestimmt, was für die weiteren Schritte (Immunisierung von Tieren, Kupplung mit Fluoreszenzbzw. Enzymmarkern) von Bedeutung ist.

Die Immunisierung von Kaninchen zur Gewinnung eines Antiserums erfolgte mit dem bei -2O⁰C gelagerten Extrakt unter Verwendung von komplettem Freuhdschen Adjuvans nach den Angaben von Ambrosius (in „Immunologische Arbeitsmethoden", Hrsg. H.Friemel,3.Aufl., Jena 1984, S.28ff.). Pro Kaninchen wurden 45 bis 50mg Gesamtprotein appliziert, bis bei den Tieren ein ausreichender Antikörpertiter erreicht war. Mit Hilfe eines so erzeugten polyspezifischen Antiserums konnten in einem Gesamtextrakt aus Psoriasisschuppen, aus dem die Serumproteine durch Immunabsorption mit einem polyspezifischen Antiserum abgetrennt worden waren, durch Elektrophorese in Agargel mit Barbituratpuffer pH 8,4 unter erfindungsgemäßen Bedingungen, d. h. mit anodenwärts verlagertem Startpunkt, fünf Fraktionen durch Präzipitation erfaßt werden, die in normalem Serum des Menschen nicht vorkommen. Für diese Proteinfraktionen wurden die elektrophoretischen Mobilitäten u InCm²V"¹ SeC^-1ZU 5,75 10~⁵; 4,51 · 10"⁵; 3,54· 10~⁵; 1,86 · 10"⁵ und 0,1 · 10~⁵ bestimmt, was unter Bezugnahme auf die bekannten Beweglichkeiten der Vergleichsproteine Albumin (u = 6,1 · 10~⁵) undTransferrin (u = 3,1 · 1Q~⁵), deren Wanderungsstrecken ebenfalls unter den erfindungsgemäßen Trennbedingungen ermittelt wurden, erfolgte (Immunologische Arbeitsmethoden, 3. Aufl.,Jena 1984, S.218). Dabei dominiert mengenmäßig im allgemeinen die Fraktion mit der geringsten elektrophoretischen Beweglichkeit (0,1 10~⁵), die sich der Beobachtung auf Grund ihrer Position jenseits der y-Globuline entzieht, wenn die Elektrophorese unter konventionellen Bedingungen erfolgt.

Die bei der Immunelektrophorese erhaltenen Präzipitate, die aus dem Gel herausgetrennt werden, dienen zur Immunisierung weiterer Tiere, wobei monospezifische Antiseren gegen die Einzelfraktionen erhalten werden.

2. Gewinnung der Post-y-Fraktion aus Psoriasisschuppen und Nachweis einer Wirkung derselben auf Immunzellen Die Isolierung einer präparativ aufarbeitbaren Menge der sogenannten Post-y-Fraktion mit einer elektrophoretischen Beweglichkeit von u = 0,1 · 10"⁵Cm²V"¹ see"¹ kann mittels präparativer Gelelektrophorese in Agar-oder Agarosegel unter erfindungsgemäßen Bedingungen erfolgen, d. h. es wird wie bei der Immunelektrophorese die Startlinie soweit anodenwärts verschoben, daß für die psoriatische Fraktion zwischen y-Bereich und Kathode genügend Raum zur Verfügung steht und ein Herauswandern derselben aus dem Gel vermieden wird. Auf einer Agargelplatte mit einer Schichtdicke von 0,7 mm und einer Größe von 12 χ 18cm lassen sich 0,5 bis 0,8 ml Extrakt unter Kühlung mit Leitungswasser bei einer Spannung von 15-20V · cm"¹ in 2 bis 3 Stunden trennen. Nach Lokalisation der Zonen an Hand eines Probestreifens werden die interessierenden Fraktionen herausgeschnitten, eluiert, eingeengt und gegen PBS dialysiert. Nach Einstellung auf das Ausgangsvolumen oder gegebenenfalls auf ein anderes Verdünnungsverhältnis kann die Wirkung der Fraktionen auf Immunzellen in den verschiedenen Testsystemen untersucht werden. Bei einer erfindungsgemäß hergestellten Post-y-Fraktion im E-Rosettentest mit Lymphozyten gesunder Spender wurde eine mittlere Rosettenzahl von 33% ermittelt gegenüber Kontrollansätzen mit einer Rosettenzahl von 66%, wobei dieser Unterschied im T-Test nach Mann und Whitney signifikant (<* = 0,05%) war.

Claims (4)

1. T. Verfahren zur Isolierung pathologischer Proteine, gekennzeichnet dadurch, daß mit einem Antiserum aus Tieren gegen Proteine oder Proteide aus den Schuppen von Patienten mit Psoriasis vulgaris oder anderen mit Hyperkeratosen einhergehenden Hauterkrankungen die immunchemische Präzipitation dieser Proteine oder Proteide nach gelenktrophoretischer Auftrennung erfolgt, wobei die Trennbedingungen den elektrophoretischen Wanderungseigenschaften einzelner Komponenten dadurch angepaßt werden, daß der Startpunkt anodenwärts verlagert wird und die dabei erhaltenen Präzipitate zur Erzeugung monospezifischer Antikörper gegen einzelne Fraktionen dieser pathologischen Proteine oder Proteide dienen.
2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Immunreaktion mit Hilfe von Antikörpern erfolgt, die mittels Fluoreszenzfarbstoffen, Radioisotopen oder Enzymen markiert bzw. an feste Träger gebunden sind.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die gewonnenen Antikörper in einem Testbesteck vorliegen.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, daß die hergestellten Antikörper zur Isolierung einer Fraktion dienen, die als Immunstimulans wirkt.