DD253089A1

DD253089A1 - PROCESS FOR ISOLATING PATHOLOGICAL PROTEINS

Info

Publication number: DD253089A1
Application number: DD29492586A
Authority: DD
Inventors: Guenter Schwartze; Klaus-Dieter Wozniak
Original assignee: Univ Halle Wittenberg
Priority date: 1986-10-02
Filing date: 1986-10-02
Publication date: 1988-01-06

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung pathologischer Proteine oder Proteide. Das erfindungsgemaesse Verfahren findet Anwendung auf dem Gebiet der Medizin, insbesondere der Dermatologie fuer diagnostische und therapeutische Zwecke. Ziel der Erfindung ist die spezifische Erfassung von pathologischen Proteinen oder Proteiden bei der Schuppenflechte (Psoriasis vulgaris) oder anderen mit Hyperkeratosen einhergehenden Hauterkrankungen zum Zwecke der Labordiagnostik oder der Isolierung. Das Wesen der Erfindung besteht in der Herstellung und Anwendung eines durch Immunisierung mit Extrakten aus den Hautschuppen der Erkrankten gewonnenen tierischen Antiserums, mit dem die immunchemische Praezipitation der pathologischen Komponenten nach elektrophoretischer Auftrennung erfolgt. Die bei der Immunelektrophorese in der erfindungsgemaessen Form erhaltenen Fraktionen dienen zur Erzeugung monospezifischer Antikoerper, die zur Analytik mittels Fluoreszenz-, Radio- oder Enzymimmunoassays oder zur Entfernung pathogener Komponenten aus dem Organismus zu therapeutischen Zwecken sowie zur Isolierung immunstimulatorisch wirkender Faktoren eingesetzt werden koennen.The invention relates to a method for isolating pathological proteins or proteids. The method according to the invention finds application in the field of medicine, in particular dermatology for diagnostic and therapeutic purposes. The aim of the invention is the specific detection of pathological proteins or proteids in psoriasis (psoriasis vulgaris) or other dermatoses associated with hyperkeratosis for the purpose of laboratory diagnostics or isolation. The essence of the invention consists in the production and application of an animal antiserum obtained by immunization with extracts from the dander's skin flakes, with which the immunochemical precipitation of the pathological components takes place after electrophoretic separation. The fractions obtained in immunoelectrophoresis in the inventive form are used to generate monospecific antibodies that can be used for analysis by fluorescence, radio or enzyme immunoassay or for the removal of pathogenic components from the organism for therapeutic purposes and for isolating immunostimulatory acting factors.

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung pathologischer Proteine. Anwendung findet das erfindungsgemäße Verfahren in der Pharmazie und medizinischen Laboratoriumsdiagnostik, insbesondere in der Dermatologie.The invention relates to a method for isolating pathological proteins. Application of the method according to the invention in pharmacy and medical laboratory diagnostics, especially in dermatology.

Characteristic of the known technical solutions

Eine relativ häufig auftretende, mit Hyperkeratose einhergehende Hauterkrankung ist die Schuppenflechte (Psoriasis vulgaris), weshalb die Aufklärung ihrer Entstehung, ihre Diagnostik und dieOptimierung ihrer Therapie seit langem Gegenstand medizinischer, biochemischer und immunopharmakologischer Forschungen sind (vgl. Kroger, H. u. G.Stüttgen: Current Research Problems in Psoriasis, Berlin 1984).A relatively common skin disease associated with hyperkeratosis is psoriasis (psoriasis vulgaris), which has long been the subject of medical, biochemical and immunopharmacological research into the elucidation of its formation, diagnostics and optimization of its therapy (see Kroger, H. and G.K. Stüttgen: Current Research Problems in Psoriasis, Berlin 1984).

Die Labordiagnostik ist dabei auf die herkömmlichen Methoden angewiesen; beispielsweise dienen zur Bestimmung der Serumproteine die bekannten immunchemischen Verfahren mit kommerziell verfügbaren Immunpräparaten und Testbestecks. Damit können aber nur die Proteinkomponenten erfaßt werden, die auch im normalen Blut oder anderen Körperflüssigkeiten vorkommen, wobei die quantitativen Bestimmungsverfahren bei verschiedenen Erkrankungen Abweichungen von den Normalwerten ergeben haben. Das gilt auch für Hauterkrankungen wie die Schuppenflechte, bei der das Immunglobulin A erhöht gefunden wurde. Außer den bekannten, immunchemisch definierten Proteinen wurden bei verschiedenen Erkrankungen, darunter neben anderen Hautkrankheiten auch die Psoriasis vulgaris, Komponenten gefunden, die regulatorische Wirkungen auf das Immunsystem ausüben und mit dem Krankheitsgeschehen in Zusammenhang gebracht wurden. Hierfür sprechen auch Therapieerfolge bei Psoriasis vulgaris durch Plasmapherese und ähnliche Verfahren. Typisches Merkmal der Psoriasis vulgaris ist die intensive Bildung von Hautschuppen, aus denen eine Vielzahl von Proteinen isoliert werden konnte, wie sie auch im Blutserum vorkommen. Dieser Umstand sowie Beobachtungen über zelluläre Immunphänomene im Psoriasisherd waren der Anlaß dazu, auch in den Extrakten aus den Schuppen der psoriatischen Krankheitsherde solche Komponenten zu vermuten, die immunregulatorische Funktionen haben und möglicherweise auch aus dem Blut in den Psoriasisherd gelangen können. In verschiedenen zellulären Immuntests wurden solche Effekte mit Extrakten aus Psoriasisschuppen auch beobachtet [Langhof, H. u. Mitarb., Hautarzt 17 (1966) 101; Tagami, H. u. Mitarb., Brit. J. Dermatol. 97 (1977) 509; Westphal, H. u. Mitarb., Dermatol. Monatsschr. 170(1984)705; Liden,S. u. Mitarb., Arch. Dermatol. Res. 269(1980)93; Schwartze, G. u. Mitarb., Dermatol. Monatsschr. 172 (1986) 457]. Wenn dabei durch Elektrophorese, Gelchromatographie oder ähnliche Methoden hergestellte Fraktionen getestet wurden, konnten den immunbiologischen Wirkungen Trennbereiche oder Molekulargewichtsbereiche zugeordnet werden. Eine eindeutige Charakterisierung oder spezifische Isolierung einzelner Komponenten ist aber damit nur im günstigsten Fall möglich, d. h. wenn mit dem angewandten Trennverfahren zufällig eine einzelne Komponente ohne Überlagerung durch andere Substanzen isoliert werden kann — kenntlich an einem steilen Peak im Elutionsprofil—was aber aus der Literatur nicht bekannt ist.Laboratory diagnostics relies on conventional methods; For example, the known immunochemical methods with commercially available immuno-preparations and test sets are used to determine the serum proteins. Thus, however, only the protein components can be detected, which also occur in normal blood or other body fluids, the quantitative determination of different diseases have revealed deviations from the normal values. This also applies to skin diseases such as psoriasis, in which immunoglobulin A has been found to be elevated. In addition to the well-known, immunochemically defined proteins, components that have regulatory effects on the immune system and have been linked to the course of the disease have been found in various diseases, including, among other skin diseases, psoriasis vulgaris. Therapeutic success in psoriasis vulgaris is also supported by plasmapheresis and similar procedures. A typical feature of psoriasis vulgaris is the intensive formation of dander, from which a variety of proteins could be isolated, as they occur in the blood serum. This circumstance, as well as observations of cellular immune phenomena in the psoriasis, have led to suspicion in the extracts from the scales of the psoriatic centers of disease that components which have immunoregulatory functions and possibly also can pass from the blood into the psoriasis. In various cellular immunoassays, such effects have been observed with extracts of psoriatic scales [Langhof, H. u. Employee, dermatologist 17 (1966) 101; Tagami, H. u. Employee, Brit. J. Dermatol. 97 (1977) 509; Westphal, H. u. Employee, Dermatol. Monatsschr. 170 (1984) 705; Liden, S. u. Co-worker, Arch. Dermatol. Res. 269 (1980) 93; Schwartze, G. u. Employee, Dermatol. Monatsschr. 172 (1986) 457]. When fractions produced by electrophoresis, gel chromatography or similar methods were tested, the immunobiological effects could be assigned to separation ranges or molecular weight ranges. However, a clear characterization or specific isolation of individual components is thus possible only in the most favorable case, d. H. if, with the separation method used, a single component can be randomly isolated without being overlaid by other substances-indicated by a steep peak in the elution profile-but which is not known from the literature.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist, die bei der Psoriasis vulgaris oder anderen mit Hyperkeratosen einhergehenden Hauterkrankungen pathologisch auftretenden Proteine oder Proteide für diagnostische, prognostische oder therapeutische Zwecke mit hoher Spezifität nachzuweisen oder quantitativ zu bestimmen bzw. zu isolieren oder spezifisch aus einer Körperflüssigkeit zu entfernen.The aim of the invention is to detect or quantitatively determine or to isolate or to specifically remove from a body fluid the pathologically occurring proteins or proteids for diagnostic, prognostic or therapeutic purposes in psoriasis vulgaris or other skin diseases associated with hyperkeratosis.

Explanation of the essence of the invention

Aufgabe der Erfindung ist es, die bei schuppenden Hautkrankheiten, insbesondere den Formen der Psoriasis vulgaris, auftretenden pathologischen Proteine oder Proteide immunchemisch zu isolieren bzw. nachzuweisen oder quantitativ zubestimmen oder zu therapeutischen Zwecken aus dem Blut zu entfernen.The object of the invention is to immunologically isolate or detect or quantify the pathological proteins or proteids occurring in scaly skin diseases, especially the forms of psoriasis vulgaris, or to remove them for therapeutic purposes from the blood.

Erfindungsgemäß wird dies dadurch erreicht, daß die Hautschuppen der Erkrankten mit gepufferter Salzlösung extrahiert und diese Extrakte zur Immunisierung von Tieren, insbesondere Kaninchen, benutzt werden. Mit Hilfe des so gewonnenen Antiserums lassen sich die durch Gelelektrophorese, bei der der Startpunkt gegenüber den üblichen Formen der Elektrophorese anodenwärts verschoben ist, abgetrennten Fraktionen immunchemisch spezifisch durch Präzipitation erfassen. Diese Präzipitate können dann wieder zur Immunisierung von Tieren zwecks Herstellung monospezifischer Antiseren dienen. Unter den veränderten Elektrophoresebedingungen lassen sich in einem Psoriasisschuppenextrakt, aus dem die Serumproteine durch Absorption mit einem polyspezifischen Antiserum entfernt wurden, mit dem gewonnenen Antiserum mindestens fünf Fraktionen erfassen, unter denen als dominierende Komponente eine Fraktion hervortritt, die im Post-y-Bereich liegt, d. h. •jenseits der y-Globuline in Richtung der Kathode. Diese Fraktion ist unter den üblich'en Elektrophoresebedingungen und mit kommerziellen Antiseren nicht darzustellen.According to the invention this is achieved by extracting the dander's skin with buffered saline and using these extracts to immunize animals, especially rabbits. With the aid of the antiserum thus obtained, the fractions separated by gel electrophoresis, in which the starting point is shifted anode-wise in comparison with the conventional forms of electrophoresis, can be detected specifically immunochemically by precipitation. These precipitates can then again be used to immunize animals to produce monospecific antisera. Under the changed electrophoresis conditions, in a psoriasis flake extract from which the serum proteins have been removed by absorption with a polyspecific antiserum, at least five fractions can be detected with the recovered antiserum, of which the dominant component is a post-y region fraction. d. H. • beyond the y-globulins towards the cathode. This fraction is not to be represented under the usual electrophoresis conditions and with commercial antisera.

Die durch Immunisierung von Tieren mit den erfindungsgemäß isolierten Proteinen oder Proteiden gewonnenen Antikörper können in Form von Testbestecken zur Analyse dieser pathologischen Komponenten zum Zwecke der Diagnostik, Prognostik und Therapiekontrolle im Blut oder anderen Körperflüssigkeiten der betreffenden Hautkranken und außerdem zur spezifischen Elimination solcher Komponenten aus Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, dienen. So sind diese Antikörper für immunologische Untersuchungsverfahren bedeutungsvoll und ermöglichen umfangreiche ätiopathologische Untersuchungen mit großer Spezifität. Neben der Fluoreszenzmarkierung dieser Antikörper ist dabei auch eine Markierung mit Radioisotopen oder Enzymen oder eine Bindung der Antikörper an feste Träger möglich; außerdem kann die Empfindlichkeit der Immunreaktionen dadurch erhöht werden, daß die erfindungsgemäß isolierten Proteine zur Erzeugung monospezifischer Antikörper dienen. Andererseits können derartige pathologische Proteine oder Proteide auch als Immunzellstimulantien Einsatz finden.The antibodies obtained by immunizing animals with the proteins or the proteids isolated according to the invention can be used in the form of test kits for the analysis of these pathological components for the purpose of diagnostics, prognosis and therapy control in the blood or other body fluids of the affected skin patients and also for the specific elimination of such components from body fluids. especially blood, serve. Thus, these antibodies are meaningful for immunological examination procedures and allow extensive etiopathological investigations with great specificity. In addition to the fluorescent labeling of these antibodies, labeling with radioisotopes or enzymes or binding of the antibodies to solid supports is also possible; In addition, the sensitivity of the immune reactions can be increased by the fact that the proteins isolated according to the invention serve to generate monospecific antibodies. On the other hand, such pathological proteins or proteids can also be used as immune cell stimulants.

embodiment

Die Erfindung wird nachfolgend an 2 Beispielen erläutert:The invention is explained below with reference to two examples:

1. Herstellung eines Antiserums gegen pathologische Proteine bei Psoriasis vulgaris, Fraktionierung und immunchemische Präzipitation1. Preparation of an antiserum against pathological proteins in psoriasis vulgaris, fractionation and immunochemical precipitation

Hautschuppen von Patienten mit Psoriasis, die sich ohne körperliche Beeinträchtigung sammeln und bis zur Verarbeitung bei -20°C lagern lassen, werden mit vorgekühlter (+4⁰C) phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) vom pH 7,2 im Verhältnis 1:10 (1g Schuppen pro 10 ml PBS) unter Kühlung mit Eiswasser homogenisiert. Das Homogenatwird 16 Stunden bei +4X unter langsamer Bewegung (Rühren oder Schütteln) gehalten, dann 20min bei maximal +4⁰C mit 8000 bis 10000g zentrifugiert und deropale Überstand durch Lyophilisation oder Ultrafiltration auf 0,1 des Ausgangsvolumens eingeengt, wobei im Falle der Lyophilisation die konzentrierte Lösung gegen physiologische Salzlösung im Überschuß zu dialysieren ist. Der Proteingehalt wird mit bekannten Methoden bestimmt, was für die weiteren Schritte (Immunisierung von Tieren, Kupplung mit Fluoreszenzbzw. Enzymmarkern) von Bedeutung ist.Dander patients with psoriasis who gather without physical impairment and can store up to process at -20 ° C, (with pre-cooled (+4 ⁰ C) phosphate buffered saline (PBS) pH 7.2 1:10 1g Shed per 10 ml PBS) while cooling with ice water homogenized. The homogenate is kept at + 4X for 16 hours under slow agitation (stirring or shaking), then centrifuged at 8000 to 10000g for 20 min at a maximum of +4 ⁰ C, and the supernatant is concentrated by lyophilization or ultrafiltration to 0.1 of the initial volume, in case of lyophilization the concentrated solution is to be dialyzed against physiological saline excess. The protein content is determined by known methods, which is important for the further steps (immunization of animals, coupling with fluorescence or enzyme markers).

Die Immunisierung von Kaninchen zur Gewinnung eines Antiserums erfolgte mit dem bei -2O⁰C gelagerten Extrakt unter Verwendung von komplettem Freuhdschen Adjuvans nach den Angaben von Ambrosius (in „Immunologische Arbeitsmethoden", Hrsg. H.Friemel,3.Aufl., Jena 1984, S.28ff.). Pro Kaninchen wurden 45 bis 50mg Gesamtprotein appliziert, bis bei den Tieren ein ausreichender Antikörpertiter erreicht war. Mit Hilfe eines so erzeugten polyspezifischen Antiserums konnten in einem Gesamtextrakt aus Psoriasisschuppen, aus dem die Serumproteine durch Immunabsorption mit einem polyspezifischen Antiserum abgetrennt worden waren, durch Elektrophorese in Agargel mit Barbituratpuffer pH 8,4 unter erfindungsgemäßen Bedingungen, d. h. mit anodenwärts verlagertem Startpunkt, fünf Fraktionen durch Präzipitation erfaßt werden, die in normalem Serum des Menschen nicht vorkommen. Für diese Proteinfraktionen wurden die elektrophoretischen Mobilitäten u InCm²V"¹ SeC^-1ZU 5,75 10~⁵; 4,51 · 10"⁵; 3,54· 10~⁵; 1,86 · 10"⁵ und 0,1 · 10~⁵ bestimmt, was unter Bezugnahme auf die bekannten Beweglichkeiten der Vergleichsproteine Albumin (u = 6,1 · 10~⁵) undTransferrin (u = 3,1 · 1Q~⁵), deren Wanderungsstrecken ebenfalls unter den erfindungsgemäßen Trennbedingungen ermittelt wurden, erfolgte (Immunologische Arbeitsmethoden, 3. Aufl.,Jena 1984, S.218). Dabei dominiert mengenmäßig im allgemeinen die Fraktion mit der geringsten elektrophoretischen Beweglichkeit (0,1 10~⁵), die sich der Beobachtung auf Grund ihrer Position jenseits der y-Globuline entzieht, wenn die Elektrophorese unter konventionellen Bedingungen erfolgt.The immunization of rabbits to obtain an antiserum was carried out with the stored at -2O ⁰ C extract using Freund's complete adjuvant according to the instructions of Ambrosius (in "Immunological Working Methods", ed. H.Friemel, 3rd edition, Jena 1984, 45 to 50 mg total protein were administered per rabbit until the animals had reached a sufficient antibody titer With the help of a polyspecific antiserum produced in this way, it was possible to separate the serum proteins in a total extract from psoriasis scales by immunoabsorption with a polyspecific antiserum by electrophoresis in agar gel with barbiturate buffer pH 8.4 under conditions according to the invention, ie with an anode-shifted starting point, five fractions are detected by precipitation which do not occur in normal human serum .For these protein fractions the electrophoretic mobilities u InCm ² V " ¹ SeC ^-1 TO 5.75 10 ~ ⁵ ; 4.51 · 10 ^"5 3.54 x 10 ^-5 1.86 x 10" ⁵ ~ determined and 0.1 x 10 ^5, which (with reference to the mobilities of known proteins albumin compared u = 6.1 · 10 ~ ⁵ ) and transferrin (u = 3.1 · 1Q ~ ⁵ ), whose migration distances were also determined under the separation conditions according to the invention, was carried out (Immunologische Arbeitsmethoden, 3rd ed., Jena 1984, p.218). In general, the fraction with the lowest electrophoretic mobility (0.1 10 ~ ⁵ ) dominates quantitatively, which eludes observation owing to its position beyond the y-globulins, when the electrophoresis is carried out under conventional conditions.

Die bei der Immunelektrophorese erhaltenen Präzipitate, die aus dem Gel herausgetrennt werden, dienen zur Immunisierung weiterer Tiere, wobei monospezifische Antiseren gegen die Einzelfraktionen erhalten werden.The precipitates obtained in immunoelectrophoresis, which are separated from the gel, serve to immunize other animals, monospecific antisera to the individual fractions being obtained.

2. Gewinnung der Post-y-Fraktion aus Psoriasisschuppen und Nachweis einer Wirkung derselben auf Immunzellen Die Isolierung einer präparativ aufarbeitbaren Menge der sogenannten Post-y-Fraktion mit einer elektrophoretischen Beweglichkeit von u = 0,1 · 10"⁵Cm²V"¹ see"¹ kann mittels präparativer Gelelektrophorese in Agar-oder Agarosegel unter erfindungsgemäßen Bedingungen erfolgen, d. h. es wird wie bei der Immunelektrophorese die Startlinie soweit anodenwärts verschoben, daß für die psoriatische Fraktion zwischen y-Bereich und Kathode genügend Raum zur Verfügung steht und ein Herauswandern derselben aus dem Gel vermieden wird. Auf einer Agargelplatte mit einer Schichtdicke von 0,7 mm und einer Größe von 12 χ 18cm lassen sich 0,5 bis 0,8 ml Extrakt unter Kühlung mit Leitungswasser bei einer Spannung von 15-20V · cm"¹ in 2 bis 3 Stunden trennen. Nach Lokalisation der Zonen an Hand eines Probestreifens werden die interessierenden Fraktionen herausgeschnitten, eluiert, eingeengt und gegen PBS dialysiert. Nach Einstellung auf das Ausgangsvolumen oder gegebenenfalls auf ein anderes Verdünnungsverhältnis kann die Wirkung der Fraktionen auf Immunzellen in den verschiedenen Testsystemen untersucht werden. Bei einer erfindungsgemäß hergestellten Post-y-Fraktion im E-Rosettentest mit Lymphozyten gesunder Spender wurde eine mittlere Rosettenzahl von 33% ermittelt gegenüber Kontrollansätzen mit einer Rosettenzahl von 66%, wobei dieser Unterschied im T-Test nach Mann und Whitney signifikant (<* = 0,05%) war.2. Obtaining the post-y-fraction from psoriasis shed and detection of the same effect on immune cells The isolation of a preparative repulpable amount of so-called post-y-fraction with an electrophoretic mobility of u = 0.1 · 10 ^"5 cm ² V" ¹ see " ¹ can be carried out by preparative gel electrophoresis in agar or agarose gel under conditions according to the invention, ie it is moved as far as anodewärts as in immunoelectrophoresis that sufficient space is available for the psoriatic fraction between the y-region and cathode and a wandering of the same On an agar gel plate with a layer thickness of 0.7 mm and a size of 12 χ 18cm can be 0.5 to 0.8 ml extract under cooling with tap water at a tension of 15-20V · cm " ¹ separate in 2 to 3 hours. After localization of the zones on the basis of a sample strip, the fractions of interest are excised, eluted, concentrated and dialysed against PBS. After adjustment to the starting volume or, if appropriate, to another dilution ratio, the effect of the fractions on immune cells in the various test systems can be investigated. In a post-γ fraction produced according to the invention in the E rosette test with lymphocytes of healthy donors, a mean rosette number of 33% was determined in comparison to control batches with a rosette number of 66%, this difference being significant in the T test according to Mann and Whitney (<* = 0.05%).

Claims

T. Method for the isolation of pathological proteins, characterized in that with an antiserum from animals against proteins or proteids from the dandruff of patients with psoriasis vulgaris or other dermatoses associated with hyperkeratoses immunochemical precipitation of these proteins or proteids by gel electrophoresis separation takes place, the separation conditions the electrophoretic migration properties of individual components are adapted in that the starting point is moved anode forward and the resulting precipitates serve to produce monospecific antibodies against individual fractions of these pathological proteins or proteids.

2. The method according to claim 1, characterized in that the immune reaction by means of antibodies, which are marked by means of fluorescent dyes, radioisotopes or enzymes or bound to solid support.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the antibodies obtained are present in a test kit.

4. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the antibodies produced serve to isolate a fraction which acts as an immune stimulant.