JP5288712B2 - ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼa1測定方法および検査試薬 - Google Patents
ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼa1測定方法および検査試薬 Download PDFInfo
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Description
(1)抗ヒトホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1抗体を用いたホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1の免疫化学的測定方法。
(2)前記ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1が完全長のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1、部分的に切断を受けたホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1または一部遺伝子の変異を受けたホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1であることを特徴とする、(1)の測定方法。
(3)前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、(1)または(2)の測定方法。
(4)前記抗体を検体と接触させ、検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1に結合あるいは結合しなかった抗体を検出することにより検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1濃度の測定を行なうこと特徴とする、(1)〜(3)のいずれか1項)の測定方法。
(5)前記抗体を検体と接触させ、抗体に結合あるいは結合しなかったホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1を検出することにより検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1濃度の測定を行なうことを特徴とする、(1)〜(4)のいずれかの測定方法。
(6)前記検体が、血清、血漿などのヒト体液あるいはヒト細胞、組織の抽出液であることを特徴とする、(4)または(5)の測定方法。
(7)前記測定方法が酵素標識、アイソトープ標識または蛍光標識を利用した競合法またはサンドイッチ法、蛍光偏光法等を利用したホモジニアス測定法、表面プラズモン共鳴分析法を利用した結合測定法のいずれかであることを特徴とする、(1)〜(6)のいずれかの測定方法。
(9)脳疾患が癲癇であるであることを特徴とする(8)の脳疾患検査方法。
(10)脳疾患が脳梗塞による虚血性脳疾患であることを特徴とする(8)の検査方法。
(11)(1)〜(7)のいずれかの測定方法によりホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1濃度を測定し、その値が健常人測定値からなる正常値に対し有意差をもって高値を示した場合に炎症を有するとすることを特徴とする、ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1測定による炎症の検査方法。
(12)炎症が敗血症であることを特徴とする(11)の検査方法。
(13)炎症が腹膜炎であることを特徴とする(11)の検査方法。
(14)(1)〜(7)のいずれかの測定方法によりホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1濃度を測定し、その値が健常人測定値からなる正常値に対し有意差をもって低値を示した場合に白血病を有する検査することを特徴とする、ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1測定による白血病の検査方法。
(15)(1)〜(7)のいずれかの測定方法を原理とすることを特徴とするホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1測定試薬。
(16)(15)の測定試薬からなる検査試薬。
本発明でいう「ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1」は完全長のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1のみならず、その特異的なホスホリパーゼ活性を有することを条件に、その部分的に切断を受けたホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1または一部遺伝子の変異を受けた、たとえばそれをコードする遺伝子の1また数個のヌクレオチドの付加、欠失もしくは置換により変異を受けた結果、天然ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1とは1また数個のアミノ酸の付加、欠失もしくは置換により異なるアミノ酸配列を有するホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1変異体をも意味する場合がある。
ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1(Genbank accession number NM015900)の塩基番号1−1371(配列番号1)をヒト肝臓cDNAライブラリーよりRT−PCRを用い常法に従いクローニングした。本cDNAをバキュロウイルス用トランスファーベクターpFASTBac−1(インビトロジェン)に導入し、Bac−to−Bacシステム(インビトロジェン)を用い、全長ヒトホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1発現用バキュロウイルスをプロトコールに従い調製した。この際、ポリヒスチジンを有するポリヒスチジン−タグ付ヒトホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1発現用バキュロウイルスもプロトコールに従い調製した。本バキュロウイルスを用い、常法に従い、sf9あるいはsf21などに感染させることにより全長ヒトホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1およびポリヒスチジン−タグ付ヒトホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1を含む発現培養上清を貯製することができる。
ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1をノックアウトしたマウスに対し、抗原250μgをフロイントの完全アジュバントと共に腹腔に免疫を行なった。細胞融合3日前に最終免疫を実施し、脾臓を採取し、B細胞を回収した。マウスミエローマ細胞株PAIとポリエチレングリコール存在下、細胞融合を常法に従い行い、約10日間のHAT培地による選択を行ない、ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1に対する反応性をELISA法により調べ、目的抗体産生細胞ハイブリドーマの選択を行った。スクリーニング陽性ウェル中の細胞を限界釈放法によりモノクローナル化を行いハイブリドーマとして樹立した。この際、HT培地により約10日間の培養を行った後、最終的にハイブリドーマ用培地により培養を続け、抗体回収のために培養上清を回収した。GIT培地(大日本住友製薬)500mLに対し、NCTC−109培地(インビトロジェン)27.5mL、不必須アミノ酸(インビトロジェン)5.5mL、ペニシリン/ストレプトマイシン/グルタミン酸(インビトロジェン)5.5mLをろ過滅菌し添加したものをハイブリドーマ細胞培養用培地とした。本培地にHAT(Sigma−Aldrich Co.,HYBRYMAX,Cat.No.H0262)を添加したものをHAT培地として、HT(Sigma−Aldrich Co.,HYBRYMAX,Cat.No.H0137)を添加したものをHT培地として用いた。
バキュロウイルス系を用い発現、精製したホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1を96穴イムノプレート(MaxiSorp;Nalge NUNC International,Cat.No.430341)に50ng/ウェルにてコーティングし4℃にて一昼夜保存した。続いてTBS(10mM Tris,150mM NaCl、pH7.4)により3回の洗浄後、3%−ウシ血清アルブミン(BSA;bovine serum albumin)を含むTBS溶液を200μL/ウェルにて各ウェルに添加し、室温で2時間放置した。TBSにより3回洗浄を行い、ハイブリドーマ細胞の培養上清を50μL/ウェルにより添加し、室温で2時間放置した。TBST(0.1%−Tween20を含むTBS)により6回洗浄を行なった後、HRP標識抗マウスIgG抗体(Zymed社)を0.1% Tween−20、1% BSAを含むTBSにて1/1000希釈したものを50μL/ウェルにて添加し、室温で2時間放置した。TBSTにより6回洗浄を行なった後、オルトフェニレンジアミン基質を50μl/ウェルで添加し室温30分放置し発色後、4N−硫酸にて反応を停止し492nmの吸光度を測定した。ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1のコーティングを施さない対照群に対し反応性を示したものを陽性クローンとして選択し25クローンのハイブリドーマを得た。
モノクローン化した抗体産生細胞の培養上清を回収し、HiTrap Potein G HP(Amersham Biosciences Corp,Cat.No.17−0405−01)により抗体の精製を行った。PBS(phosphate buffer saline;10mM リン酸、150mM NaCl、pH7.4)で緩衝液置換した上記カラムに対し、培養上清を流速20mL/minにて通過させた。カラム容量の5倍以上のPBSにより十分カラムを洗浄し、未結合蛋白質の除去を行った。この際、カラムを通過した緩衝液のOD280による吸光度が0.01以下になったことを確認することにより、未結合蛋白質が残っていないことの確認が可能である。カラム洗浄後、100mM グリシン、pH2.5溶出液により結合抗体を溶出させた。溶出抗体は速やかに1/10容量の1M Tris、pH8を添加し、中性にするとともにTBSにより速やかに透析を行った。精製抗体の一部は抗体評価用にEZ−Link Sulfo−NHS−LC−LC−biotin(Pierce Bioctechnology,Inc.,Cat.No.21338)によりビオチンによる標識を行った。
精製抗体ならびにビオチン標識抗体を用い、サンドイッチELISA測定系が構築可能な抗体の組み合わせ評価を行なった。96穴イムノプレート(NUNC)に、精製抗体1μg/mLを含むTBS溶液を50μL/ウェルにて添加し、一昼夜、4℃にて抗体プレートに結合させる。TBSにより3回洗浄後、3%BSAを含むTBSにてブロッキング処理を2時間行なう。続いてTBSにより3回洗浄後、組換えホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1をELISAアッセイ緩衝液(1%BSAを含むTBST)にて希釈し、50μL/ウェルにて添加した。室温で2時間放置後、TBSTにより3回洗浄し、1μg/mLのビオチン標識抗体を含むELISAアッセイ緩衝液を50μL/ウェルにて添加した。室温で2時間放置後、TBSTにより3回洗浄し、2000倍希釈したHRP標識ストレプトアビジン(Zymed社製)を含むELISAアッセイ緩衝液を50μL/ウェルにて添加した。1時間室温で放置後、TBSTにより6回洗浄し、TMB基質を100μl/ウェルで添加し室温30分放置し発色後、1N−リン酸100μl/ウェルにて反応を停止し450nmの吸光度を測定した。その結果、クローン名3C9および9H8の組み合わせにおいてサンドイッチELISAが構築可能な結果を得た。
実施例5にて選択したモノクローナル抗体3C9および9H8の組み合わせにおけるサンドイッチELISAの評価を実施した。サンプルとして健常人血清、本血清を抗ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1モノクローナル抗体1F12をCNBr活性化ビーズ(GEヘルスサイエンス社)に結合させた担体、ならびに抗体を結合させていないCNBr活性化ビーズにて処理したものの3種を測定した。その結果、図1に示すとおり、1F12抗体固定化ビーズにて処理し、ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1を吸着除去した血清のみ反応性が認められず、未処理血清、抗体を結合させていないビーズ処理血清では同等の反応性を示した。本結果から構築したサンドイッチELISAがホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1を特異的に検出していることが示された。
実施例5にて選択したモノクローナル抗体3C9および9H8の組み合わせにおけるサンドイッチELISAを用い癲癇患者および白血病患者の検体評価を行った。健常人血清としては医師により癲癇、脳梗塞などの脳疾患、敗血症、腹膜炎といった炎症性疾患や白血病を患っていないと診断された者(以下、単に「健常人」と称す)の血清を使用した。その結果、図2に示すとおり癲癇患者においては健常人測定値に対し高値を示し、そのほとんどが1.5倍以上の測定値を示した。また、白血病患者において低値を示し、そのほとんどが0.5倍以下の低値を示した。本結果より、癲癇ならびに白血病の検査に本測定方法が有効であることが示された。
本発明者はヒトホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1と同様の手法でマウスホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1に対するサンドイッチELISAも構築している。本測定系を用い、マウス炎症モデルでの評価を行った。ヒト敗血症モデルとしてマウス腹腔にリポポリサッカライド(LPS)を投与したマウスを、ヒト腹膜炎モデルとしてマウス腹腔にカゼインを投与したマウスを準備し、それぞれ血清中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1濃度を定量した。その結果、図3に示すとおり健常マウスの測定値に対し数倍から数十倍の高濃度のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1を検出した。このことからヒトにおいても敗血症、腹膜炎などの炎症時ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1濃度が上昇することが強く示唆される。
中大脳動脈閉塞術(MCAo)によりラット右大脳に対し虚血−再灌流を施し、巣状脳梗塞モデルとした。本モデルラットの右脳、左脳を経時的に採取しホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1に対するノーザンブロッティングとウエスタンブロッティングによりmRNAおよび蛋白質発現を検証した。使用した抗体はラットホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1を大腸菌にて発現させたものを抗原として作製した抗体である。その結果、図4に示すとおりmRNA、蛋白質いずれも梗塞を誘発した右脳のみで発現上昇が確認された。また、ウエスタンブロッティングではmRNAに遅れて蛋白質発現が認められ7日目においても強い発現が認められている。本結果より脳梗塞などの虚血性脳障害の検査にもホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1が診断マーカーとなることを示している。
Claims (8)
- 抗ヒトホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1抗体を用いたホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1の免疫化学的測定方法により、ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1濃度を測定し、その値が健常人測定値からなる正常値に対し有意差をもって高値を示した場合に、癲癇、脳梗塞による虚血性脳疾患、敗血症及び腹膜炎からなる群から選ばれる疾患を有するとし、その値が健常人測定値からなる正常値に対して有意差をもって低値を示した場合に白血病を有するとすることを特徴とする、ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1測定による疾患の検査方法。
- 前記ホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1が完全長のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1、部分的に切断を受けたホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1または一部遺伝子の変異を受けたホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1であることを特徴とする、請求項1記載の検査方法。
- 前記抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項1または2記載の検査方法。
- 前記抗体を検体と接触させ、検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1に結合あるいは結合しなかった抗体を検出することにより検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1濃度の測定を行なうこと特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項記載の検査方法。
- 前記抗体を検体と接触させ、抗体に結合あるいは結合しなかったホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1を検出することにより検体中のホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1濃度の測定を行なうことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項記載の検査方法。
- 前記検体が、血清又は血漿であることを特徴とする、請求項4または5記載の検査方法。
- 前記検査方法が酵素標識、アイソトープ標識または蛍光標識を利用した競合法またはサンドイッチ法、蛍光偏光法等を利用したホモジニアス測定法、表面プラズモン共鳴分析法を利用した結合測定法のいずれかであることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項記載の検査方法。
- 請求項1〜7記載のいずれか1項記載の検査方法を原理とすることを特徴とする抗ヒトホスファチジルセリン特異的ホスホリパーゼA1抗体より成る前記疾患を検出するための試薬。
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