JP2006096708A

JP2006096708A - Ｐｓ−ｐｌａ１阻害剤

Info

Publication number: JP2006096708A
Application number: JP2004285522A
Authority: JP
Inventors: Hiroyoshi Arai; 洋由新井; Atsuyoshi Aoki; 淳賢青木; Tomokazu Matsusue; 朋和松末
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2004-09-29
Filing date: 2004-09-29
Publication date: 2006-04-13

Abstract

【課題】アレルギー、特にＩ型アレルギー、例えば、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症等の予防治療剤として有用であると考えられるＰＳ−ＰＬＡ_１阻害剤の提供。
【解決手段】特定のオキサゾリジン骨格を有する化合物、それらの薬学的に許容される塩、および溶媒和物からなる群から選択される少なくとも一つを含有するＰＳ−ＰＬＡ_１阻害剤。
【選択図】なし

Description

ホスファチジルセリン特異的ホスフォリパーゼＡ_１（以下、ＰＳ−ＰＬＡ₁ということがある。）を特異的に阻害する活性を有する化合物を含有するＰＳ−ＰＬＡ_１阻害剤に関する。

ホスファチジルセリン特異的ホスフォリパーゼＡ１（ＰＳ−ＰＬＡ₁）（J. Biol. Chem. 272：2192-2198(1997) 、J. Biol. Chem. 274：11053-11059(1999) ）は、このＰＳの極性頭部のセリン残基を厳密に認識して１位の脂肪酸鎖を特異的に加水分解してリゾＰＳへと変換する酵素である。ラット及びヒトのＰＳ−ＰＬＡ₁は、これまで報告されているホスホリパーゼとは有意な相同性を示さず、リパーゼファミリー（セリンエステラーゼ）の一員と考えられている。構造的には、４５６アミノ酸からなり、セリン、アスパラギン酸、ヒスチジンで構成される活性中心をもつセリンエステラーゼの特徴をもち、Ｎ末端には２４アミノ酸からなる疎水性の分泌シグナル配列をもつ。
ＰＳ−ＰＬＡ_１は、ラット腹腔マスト細胞の脱顆粒を惹起することが報告されている（J. Biol. Chem. 276：29664-29670(2001））。しかしながら、ＰＳ−ＰＬＡ₁について生体の生理的機能の維持または病態にどのように関与しているかはほとんど解明されていない。

新井らは、ＰＳ−ＰＬＡ_１遺伝子ノックアウト（ＫＯ）マウスを作製して、表現形質の変化の有無を検討したところ、血液凝固能に変化のあることを認めた。
しかしながら、ＰＳ−ＰＬＡ_１を特異的に阻害する化合物及びそれを含有するＰＳ−ＰＬＡ_１阻害剤は知られていない。また、ＰＳ−ＰＬＡ_１またはリゾＰＳとアレルギーの関係は必ずしも明らかにはなっておらず、また、ＰＳ−ＰＬＡ_１阻害剤がアレルギー性疾患の予防／治療に有用であるか否かは明らかでなかった。
特開2003-319735号公報

今回、in vitro においてＰＳ−ＰＬＡ_１阻害活性を有する化合物を取得し、その薬効を検討したところ、マウスにおいて、Ｉ型アレルギー反応の一種である受動皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）反応を抑制することを見出した。
一方、ＰＳ−ＰＬＡ_１ノックアウト（以下、ＫＯという。）マウスにおいてさらなる表現形質の変化の有無を検討するため、ＰＣＡ反応を試験した結果、ＫＯマウスにおいてはＰＣＡ反応が顕著に減弱していること、及び、減弱したＰＣＡ反応がＰＳ−ＰＬＡ_１の投与により回復することを認めた。
本発明は、オキサゾリン骨格を有する特定の化合物を有効成分とするＰＳ−ＰＬＡ_１阻害剤を提供する。

本発明は、下記式Ｉ〜IIIで示されるオキサゾリン骨格を有する化合物、それらの薬学的に許容される塩、および溶媒和物からなる群から選択される少なくとも一つを含有するＰＳ−ＰＬＡ_１阻害剤である。

また本発明は、上記式Ｉ〜IIIの化合物、それらの薬学的に許容される塩、および溶媒和物からなる群から選択される少なくとも一つを有効成分とするアレルギー疾患、特にＩ型アレルギー性疾患の予防／治療剤を提供する。
さらに、ＰＳ−ＰＬＡ_１阻害剤を有効成分とするアレルギー性疾患、特にＩ型アレルギー性疾患の予防／治療剤を提供する。

本発明のＰＳ−ＰＬＡ_１阻害剤は、アレルギー、特にＩ型アレルギー、例えば、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症等の予防治療剤として有用である。また、アレルギー、特にＩ型アレルギー、例えば、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症等の機序等の解明・研究に有用である。

本発明のＰＳ−ＰＬＡ_１阻害剤は、式Ｉ〜IIIで示されるオキサゾリン骨格を有する化合物、それらの薬学的に許容される塩および溶媒和物のいずれかを含有する。その他の好ましい化合物は実施例に記載されている。該化合物は、公知の方法、例えば、コンビナトリアル合成の手法を応用することによって調製できる。また、市販品を購入することで入手可能である。

本発明の阻害剤は、ＰＳ−ＰＬＡ_１、例えば、ヒト、ラットまたはマウスＰＳ−ＰＬＡ_１、好ましくはヒトＰＳ−ＰＬＡ_１を特異的に阻害する。また、好ましくは、他のリパーゼファミリーの酵素に対する作用との間にＰＳ−ＰＬＡ_１選択性を有する。他のリパーゼファミリーの酵素としては、ホスファチジン酸特異的ホスフォリパーゼＰＡ−ＰＬＡ_１α及びＰＡ−ＰＬＡ_１β（国際公開公報ＷＯ０２／０２７６２及びＷＯ０２／３１１３１）等が挙げられる。また、これらの酵素に対する化合物の阻害活性は、公知の方法（国際公開公報ＷＯ０２／０２７６２及びＷＯ０２／３１１３１）に準じて測定できる。

ＰＳ−ＰＬＡ_１活性またはＰＳ−ＰＬＡ_１阻害活性は公知の方法に従って実施可能であり、例えば、ＲＩ標識した合成基質を用いた方法（J. Biol. Chem. 272：2192-2198(1997)、J. Biol. Chem. 274：11053-11059(1999)）等が挙げられる。具体的には、実施例に記載の方法に従うことができる。

本発明の予防／治療剤は、ＰＳ−ＰＬＡ_１阻害剤、好ましくは、オキサゾリン骨格を有しかつＰＳ−ＰＬＡ_１を特異的に阻害する化合物を有効成分として含有する。特に好ましくは、式Ｉ〜IIIで示されるオキサゾリン骨格を有する化合物、それらの薬学的に許容される塩、溶媒和物のいずれかを含有する。その他の好ましい化合物は実施例に記載されている。

本発明のＰＳ−ＰＬＡ_１阻害剤は、ＰＳ−ＰＬＡ_１を特異的に阻害することにより、アレルギー性疾患、特にＩ型アレルギー性疾患、例えば、気管支喘息、アトピー性皮膚炎、アレルギー性鼻炎、花粉症等の予防治療剤として有用である。本発明のＰＳ−ＰＬＡ_１阻害剤の治療効果等は、公知の適当なアレルギー性疾患、特にＩ型アレルギー性疾患の動物モデル等を用いた薬理試験において確認できる。例えば、マウス等を用いた受動皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）試験が挙げられ、具体的な方法は実施例に示されている。

本発明の有効成分の化合物は、無機酸または有機酸との塩を形成することができる。これらの塩の例としては、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの無機酸との塩、酢酸塩、クエン酸塩、蓚酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩などの有機酸との塩、などがあげられる。置換基の種類によっては無機塩基または有機塩基との塩を形成することもできる。炭酸ナトリウム、炭酸カリウム等の無機塩基との塩、トリエチルアミン、ジエチルアミン、ピリジン等の有機塩基との塩、などがあげられる。これらの塩は常法、例えば、当量の有効成分の化合物と所望の酸、あるいは塩基を含む溶液を混合し、所望の塩を濾取するか溶媒留去して集めることにより得ることができる。

また、本発明の化合物またはその塩は、水、エタノール、グリセロールなどと溶媒和物を形成することができ、このような溶媒和物も本発明に含まれる。尚、本発明の溶媒和物はこれらに限定されるものではない。

１．ＰＳ−ＰＬＡ_１の発現および精製
（１）ラットＰＳ−ＰＬＡ_１の発現
Satoら（J. Biol. Chem. 272：2192-2198(1997)）の方法に従って実施した。まず、公知のラットＰＳ−ＰＬＡ₁cDNAのコード領域を含むDNA（塩基位置−１３〜１７２９に対応）をbaculovirus transfer vector pVL1393 (PharMingen, San Diego, CA)のSmaI及びEcoRIサイトに挿入した。次に、BaculoGold system (PharMingen)を用いて組換ウイルス（Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (AcNPV)）を調製した。Sf9細胞を液体培地（EX-CELL420、JRH Biosciences）にて1x10⁶ cells/mLの濃度に調製し培養を行い、翌日、組換ウイルスを含む液体培地と交換した。その後27℃、4日間培養を続け、培養上清中に組換ラットＰＳ−ＰＬＡ₁を分泌発現させた（実施例１）。

（２）組換ラットＰＳ−ＰＬＡ_１の精製
得られた培養上清は100mM NaCl/10mM Tris-HCl(pH7.4)のバッファーで平衡化した陰イオン交換カラム（Q-Sepharose FF、Amersham Biosciences）に供し、その非吸着画分を同バッファーで平衡化したヘパリンカラム（Heparin Sepharose 6 FF、Amersham Biosciences）に吸着させ、NaClの濃度勾配（100mM-2000mM）によって溶出を行った。得られた画分のＰＳ−ＰＬＡ₁抗原量をEIAにより測定し、目的とする画分をプールし、ＰＳ−ＰＬＡ₁活性を測定した。

２．ＰＳ−ＰＬＡ_１阻害活性化合物の同定
（１）化合物
実施例１で調製したＰＳ−ＰＬＡ₁粗精製品、及び検索対象化合物として、市販の化合物（Chemical Diversity Labs, Inc）を購入して使用した。

（２）ＰＳ−ＰＬＡ_１阻害活性の確認方法
ＰＳ−ＰＬＡ₁阻害活性は、公知の方法（Higashi, S. et al. J. Biochem. 103, 442-447 (1988)、Yokoyama, K. et al. J. Biochem. 117, 1280-1287 (1995) ）に準じて測定する。基質とする1-[1-¹⁴C] オレオイル-sn-グリセロ-3- フォスフォセリンは公知の方法（Horigome, K.et al. J. Biochem. 101, 53-61 (1987)）に従って調製する。０．４ｍＭ塩化カルシウムを含む１００mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5)に４０mMの基質とPS-PLA1を加え３７℃で適当な時間（例えば、15分）反応させた後、Doleの溶液（Dole, V. P. and Meinertz, H. J. Biol. Chem. 235, 2595-2599 (1960) ）を加えて反応を停止、遊離された脂肪酸を抽出した後、放射能を測定する。披験化合物を添加しない対照群との比較により５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）を求める。

（３）ＰＳ−ＰＬＡ_１阻害活性化合物
本発明の活性化合物4-(2,3-ジメトキシベンジリデン)-2-(2-メトキシフェニル)-4H-オキサゾール-5-オン、2-(2-フルオロフェニル)-4-((5-メチルフラン-2-イル)メチレン)-4H-オキサゾール-5-オン、4-((5-メチルフラン-2-イル)メチレン)-2-(2-ニトロフェニル)-4H-オキサゾール-5-オン（式Ｉ）、4-(2-メトキシベンジリデン)-2-(2-メトキシフェニル)-4H-オキサゾール-5-オン、2-(2-ブロモフェニル)-4-((5-メチルフラン-2-イル)メチレン)-4H-オキサゾール-5-オン、4-(4-メトキシベンジリデン)-2-(2-メトキシフェニル)-4H-オキサゾール-5-オン、4-(3-メトキシベンジリデン)-2-(2-メトキシフェニル)-4H-オキサゾール-5-オン、4-ベンジリデン-2-(2-メトキシフェニル)-4H-オキサゾール-5-オン（式II）、4-(2,4-ジメトキシベンジリデン)-2-(2-メトキシフェニル)-4H-オキサゾール-5-オン、4-((フラン-2-イル)メチレン)-2-フェニル-4H-オキサゾール-5-オン、4-((5-ブロモフラン-2-イル)メチレン)-2-(2-フルオロフェニル)-4H-オキサゾール-5-オン（式III）は、10μg/mL以下のＩＣ₅₀値を示す。

３．受動皮膚アナフィラキシー（ＰＣＡ）反応試験
（１）ＰＣＡ試験方法
C57BL/6 マウス（オス♂、8〜10週令）にネンブタール（大日本製薬）0.05mg/gB.W.を腹腔内投与し、シェーバー（夏目製作所）で背部皮膚の剃毛をした。滅菌PBSで希釈した抗DNPモノクローナルIgE抗体（clone SPE-7, Sigma）15ngまたは150ngを、注射針（27G）付シリンジで 50μl/spotとなるように皮内投与した。2時間後に抗原2, 4-dinitrophenylated Ascaris（DNP-As）（Hara K, et al. Biol Pharm Bull.17,1121-3(1994)）200μgを1%エバンスブルー（東京化成）／PBS溶液として200μl静注し、さらに30分後背部の皮膚を切り取って反転し、色素漏出斑を観察した。IgE抗体と抗原はそれぞれ投与直前に約5分37℃でインキュベーションしてから用いた。
また、作用の特異性を確認するため、マウスの背部の皮膚にヒスタミン(1、10、100μg/mL PBS)またはCompound 48/80(0.1,1μg/ml)を50μL/spotで皮内投与し、５分後にエバンスブルー1％溶液200μLを静注した。その３０分後、マウスの背部の皮膚を切り取って反転し、色素漏出斑を観察した。

（２）ＰＳ−ＰＬＡ_１阻害化合物のＰＣＡ反応抑制試験
ＰＳ−ＰＬＡ₁阻害活性が同定された化合物（式Ｉ〜III）を、上記（１）のＰＣＡ試験に供し、それらの抑制効果の有無を確認した。各化合物は、０．８、０．４、０．２または０．１mg／mLの濃度で５０μLを、ＩｇＥ抗体と混合して皮下投与し、化合物投与群における色素漏出斑を、等量の生理食塩水を投与した対照群のそれと比較することにより抑制効果の有無を評価した。その結果、各化合物について、対照群と比較して、ＰＣＡ反応の抑制効果が認められ、特に、式Ｉ及びIIの化合物は用量依存的にＰＣＡ反応を抑制した（図１Ｂ）。一方、これらの化合物は、マスト細胞を直接活性化して脱顆粒を引き起こし、IgE/ IgE受容体を介した刺激とは異なった刺激伝達系を介してヒスタミン遊離を非特異的に促進するヒスタミン遊離促進剤であるCompound 48/80（0.1μg/mL）またはヒスタミンによる色素の漏出に対しては影響を及ぼさなかったことから、ＰＣＡに対する特異性を有すると考えられた（図１Ａ）。

４．ＰＳ−ＰＬＡ_１ノックアウト（ＫＯ）マウスの作製
ＰＳ−ＰＬＡ₁遺伝子の機能が欠損したマウス、すなわち、ＫＯマウスは、公知の方法（特開2003-319735号公報）に従って作製した。概略は以下のとおりである。ＰＳ−ＰＬＡ₁遺伝子を含むゲノムDNA領域の塩基配列を基にＰＳ−ＰＬＡ₁遺伝子を不活化するターゲティングベクターを作製し、相同組換法を用いてマウス胚性幹細胞に導入した。その結果、遺伝子の機能が欠損した変異ＰＳ−ＰＬＡ₁遺伝子を有し、多分化能を保持した細胞を得た。引き続き該細胞を、胚盤胞期胚に挿入し、キメラ胚を作製した。該キメラ胚を偽妊娠雌の子宮に移植し、キメラマウスを出産させた。このキメラ個体と他の正常な個体と交配させ、ヘテロ変異体を得た。ヘテロ変異体同士を交配させ、対立遺伝子の両方において変異ＰＳ−ＰＬＡ₁遺伝子を有する個体（ホモ変異体）を得た（実施例４）。

５．ＰＳ−ＰＬＡ_１ノックアウトマウスにおけるＰＣＡ反応の低下
実施例４で作製したＰＳ−ＰＬＡ_１ノックアウトマウス（ホモ変異体）を用いて、３．（１）のＰＣＡ反応試験を実施したところ、正常なＰＳ−ＰＬＡ_１遺伝子を有する野生型のマウスに比較して、ＰＣＡ反応が著しく減弱していた（図２）。一方、Compound48/80またはヒスタミンに対する応答性には野生型マウスとの差が認められなかった。

ＰＳ−ＰＬＡ_１阻害化合物のＰＣＡ反応試験における抑制効果を示す図である。野生型（Wild-type）のマウスに比較して、ＰＳ−ＰＬＡ_１ノックアウトマウス（ＰＳ−ＰＬＡ₁-/-）においてＰＣＡ反応が著しく減弱していることを示す図である。

Claims

下記式Ｉ〜IIIの化合物、それらの薬学的に許容される塩、および溶媒和物からなる群から選択される少なくとも一つを含有するＰＳ−ＰＬＡ_１阻害剤。