CN115698718A - 胰腺癌的检测方法和检测试剂 - Google Patents

胰腺癌的检测方法和检测试剂 Download PDF

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Abstract

本发明的课题在于，提供检测胰腺癌的方法、及能用于前述方法的试剂。一种检测胰腺癌的方法，其特征在于，测定由待检体采集的体液中的TFPI2量。另外，胰腺癌的检测试剂中包含TFPI2加工多肽和特异性识别完整TFPI2的抗体。

Description

胰腺癌的检测方法和检测试剂
技术领域
本发明涉及以组织因子通路抑制剂2(Tissue Factor Pathway Inhibitor 2；TFPI2)作为测定对象的胰腺癌的检测方法和检测试剂。
背景技术
胰腺癌每年在全世界有约45万、在日本有约4万新患者发病(GLOBOCAN2018)。胰腺癌的5年相对存活率男性为7.9％、女性为7.5％，10年相对存活率男性为4.6％、女性为4.8％，被认为是预后最差的癌症。
作为代表性的胰腺癌标记物的CA19-9在胰腺癌、胆道癌等中的阳性率高，且认为可用于化学疗法的有效性评价、复发监测。然而指出存在如下课题：(1)在早期阶段的阳性率低；(2)在大肠癌、肺癌、乳腺癌等中也显示阳性；(3)在Lewis阴性血型的患者中检测不到；(4)在胆道梗阻、胆管炎、肝硬化、糖尿病等中也上升。作为其它胰腺癌生物标记物，有DUPAN-2、SPan-1等，DUPAN-2被认为可用于Lewis血型抗原阴性所致的CA19-9假阴性病例，但这些标记物对早期胰腺癌的检测性能均低，迫切期望开发出有助于胰腺癌诊疗的新型生物标记物。
对于载脂蛋白A2(apoA2)亚型，确认了与健康的人相比在早期胰腺癌患者的血液中含量降低，报道了与CA19-9相比能够以高精度检测I期、II期胰腺癌(非专利文献1)，面向临床应用的大规模临床研究正在进行中。
组织因子通路抑制剂2(TFPI2)是与胎盘蛋白5(Placental Protein 5；PP5)同源的蛋白质，是包含3个Kunitz型蛋白酶抑制剂结构域的胎盘来源丝氨酸蛋白酶抑制剂。TFPI2在卵巢癌细胞株中是由透明细胞癌细胞株特异性产生的，证实了卵巢癌患者组织中的基因表达仅在透明细胞癌患者中特异性亢进(专利文献1)，开发出了通过测定血液中TFPI2来检测卵巢透明细胞癌的方法(专利文献2和3、非专利文献2和3)。另外，公开了通过测定待检体中的TFPI2量来检测肾癌的方法(专利文献4)。
对于TFPI2，明确了在多种癌症类型中TFPI2 DNA启动子会受到甲基化修饰，作为以甲基化修饰为指标的基因诊断靶标的临床研究得以发展(非专利文献4～7)。在胰腺癌中，调查了各种胰腺癌细胞株中的TFPI2 DNA启动子的甲基化修饰，结果证实了：根据细胞株不同，受到完全甲基化、部分甲基化或者非甲基化修饰，且在胰腺癌组织中TFPI2 DNA启动子甲基化和非甲基化混杂存在(非专利文献8)。然而至今尚不清楚体液中的TFPI2蛋白能否用于胰腺癌检测。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第5224309号公报
专利文献2：日本专利第6074676号公报
专利文献3：国际公开第2016/084912号小册子
专利文献4：国际公开第2019/142636号小册子
非专利文献
非专利文献1：Honda,K.,et al.,Scientific reports,5,15921.
非专利文献2：J.Proteome Res.,2013,12(10),pp 4340-4350
非专利文献3：PloS one 11.10(2016)：e0165609.
非专利文献4：Takada,H.,et al.,Cancer genetics and cytogenetics,197(1),16(2010)
非专利文献5：Hibi,K.,et al.,Anticancer research,30(4),1205(2010)
非专利文献6：Sun,F.K.,et al.,Digestive diseases and sciences,58(4),1010(2013)
非专利文献7：Nigro,C.L.,et al.,Journal of Investigative Dermatology,133(5),1278(2013).
非专利文献8：Sato,N.,et al.,Oncogene,24.5,(2005)：850.
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于，提供胰腺癌的检测方法、及能用于前述方法的试剂。
用于解决问题的方案
本发明人等进行了深入研究，结果发现：与健康的人相比，在胰腺癌患者中血液中TFPI2值显著增大，想到TFPI2能够以高特异性检测胰腺癌，完成了本发明。
即，本发明包括以下的方式。
[1]一种检测胰腺癌的方法，其包括测定采集的体液中的TFPI2量的步骤。
[2]根据[1]所述的方法，其中，前述TFPI2量的测定值超过预先设定的基准值的情况下，作为检测到胰腺癌。
[3]根据[1]或[2]所述的方法，其中，前述TFPI2量为TFPI2加工多肽量和完整TFPI2量的总计。
[4]根据[1]～[3]中任一项所述的方法，其中，前述TFPI2量的测定通过使用了抗体的抗原抗体反应来进行，所述抗体与序列号1的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合。
[5]根据[4]所述的方法，其中，前述抗体是识别TFPI2的Kunitz结构域1的抗体。
[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其使用质谱分析法进行测定。
[7]根据[1]～[6]中任一项所述的方法，其还包括测定前述体液中除TFPI2以外的胰腺癌标记物和/或胰酶的量的步骤。
[8]一种用于检测胰腺癌的试剂，其包含：与序列号1所示的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合的抗体。
发明的效果
根据本发明，提供：简便且高精度检测胰腺癌的方法、及能用于前述方法的试剂。
附图说明
图1是示出健康的人组、胰腺癌患者、良性(胰腺囊性肿瘤)中的TFPI2测定值的箱形图(Box Plot)的图。纵轴表示血液中TFPI2量。
图2是示出健康的人组和胰腺癌组的受试者工作特征(ROC)曲线的图。纵轴表示灵敏度、横轴表示1-特异性。
图3是对胰腺癌发病部位进行比较的图。纵轴表示血液中TFPI2量。
图4是对胰腺癌患者的性别差异进行比较的图。纵轴表示血液中TFPI2量。
图5是示出胰腺癌患者组中的TFPI2与CA19-9的相关性的图。纵轴表示CA19-9测定值、横轴表示TFPI2测定值。
图6是示出胰腺癌患者组中的TFPI2与CA19-9的相关性的图。纵轴表示CA19-9测定值、横轴表示TFPI2测定值(●：分期1的病例、▲：分期2、3的病例)。
图7是示出胰腺癌患者组中的TFPI2与CEA的相关性的图。纵轴表示CEA测定值、横轴表示TFPI2测定值(●：分期1的病例、▲：分期2、3的病例)。
图8是示出胰腺癌患者组中的TFPI2与SPan-1的相关性的图。纵轴表示SPan-1测定值、横轴表示TFPI2测定值(●：分期1的病例、▲：分期2、3的病例)。
图9是示出胰腺癌患者组中的TFPI2与DUPAN-2的相关性的图。纵轴表示DUPAN-2测定值、横轴表示TFPI2测定值(●：分期1的病例、▲：分期2、3的病例)。
具体实施方式
<1>本发明的检测胰腺癌的方法
本发明的第一方式为检测胰腺癌的方法，其包括测定待检体中TFPI2量的步骤。该方法是基于：与健康的人相比，在血液等胰腺癌患者生物试样中，TFPI2的存在有所上升。待检体中的TFPI2量的测定通常在体外(in vitro)进行。如后述的实施例所述，利用该方法能够以高精度检测胰腺癌。特别是与现有的胰腺癌标记物相比，本发明的方法对非进行性胰腺癌(分期1～3)具有优异的检测性能，特别是对早期的胰腺癌(分期1)具有优异的检测性能。
需要说明的是，本发明的方法包括到检测胰腺癌为止，不包括关于胰腺癌的诊断的最终判断行为。医师参考基于本发明的方法的检测结果等来诊断胰腺癌并制定治疗方针。
本发明中测定的TFPI2没有特别限定，例如可以为完整TFPI2(以下也记为“I-TFPI2”)、TFPI2加工多肽(以下也记为“NT-TFPI2”)、或者这两者。
序列号1示出基于人TFPI2的cDNA的氨基酸序列。序列号1中，信号肽是从起始蛋氨酸到第22残基的甘氨酸。
“完整TFPI2”是指：由序列号1的氨基酸序列的第23残基到第235残基表示的肽。
另外，如专利文献3中记载所述，“NT-TFPI2”是指包含位于完整TFPI2的N末端侧的Kunitz结构域1的肽片段。更具体而言，NT-TFPI2是至少包含序列号1的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸的序列的肽、或是包含与前述序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列的肽。前述同一性优选为90％以上、更优选为95％以上。另外，该多肽可以是由前述序列中缺失、置换、插入和/或添加了1个或多个氨基酸的氨基酸序列组成的多肽。需要说明的是，多个是指：优选为2～20个、更优选为2～10个、进一步优选为2～5个。另外，前述序列的两侧可以具有其它肽片段，但优选不具有识别TFPI2的Kunitz结构域3的抗体的抗原决定簇。
本发明中的待检体(被检试样)是从待检者(待检体)中采集的体液，例如可列举出全血、血细胞、血清、血浆等血液成分、尿液、脑脊液、腹水等。待检者(待检体)通常可列举出怀疑患有胰腺癌的人、被诊断为胰腺癌的患者等，没有特别限定。若将血液成分、尿等体液用作待检体，则能够简便且非侵入地进行，故而优选，考虑到待检体采集的容易性、与其它检测项目的通用性，特别优选将血液成分用作待检体。根据使用的待检体的种类、状态，待检体的稀释倍率从无稀释到100倍稀释中适宜选择即可。
本发明的胰腺癌检测方法中，也可以组合使用检测TFPI2的方法与检测其它胰腺癌标记物和/或胰酶的方法。其组合方法没有特别限制。作为本发明的胰腺癌检测方法中的、检测TFPI2的方法与检测其它胰腺癌标记物和/或胰酶的方法的组合方式的一例，可列举出：
(A)对于测定对象待检体，同时(并列)进行或分别进行检测TFPI2的方法和检测其它胰腺癌标记物和/或胰酶的方法，由此检测胰腺癌的方法；
(B)对于测定对象待检体，首先应用检测TFPI2的方法，对于其结果判断为阴性的待检体，利用检测其它胰腺癌标记物和/或胰酶的方法检测胰腺癌的方法；
(C)对于测定对象待检体，首先应用检测其它胰腺癌标记物和/或胰酶的方法，对于其结果判断为阴性的待检体，利用检测TFPI2的方法检测胰腺癌的方法；(B)或(C)的方法在不浪费检测时使用的试剂方面是优选的。(A)的方法在能够迅速地检测胰腺癌方面是更优选的。
需要说明的是，此处检测TFPI2、其它胰腺癌标记物或胰酶包括测定它们的量。
此处所检测的其它胰腺癌标记物例如可以从现有已知的标记物中适宜选择，作为一例，可列举出癌抗原19-9(CA19-9)、人胰腺癌相关抗原(SPan-1)、人癌相关糖链抗原(DUPAN-2)、癌抗原50(CA50)、癌胚抗原(CEA)。另外，此处所检测的胰酶例如可以从现有已知的标记物中适宜选择，作为一例，可列举出淀粉酶(胰淀粉酶)、弹性蛋白酶、脂肪酶、胰蛋白酶。其中，特别是作为胰腺癌标记物最常用的CA19-9已经建立了临床有用性，从这方面考虑，优选作为此处所使用的胰腺癌标记物。另外，此处检测的肿瘤标记物或胰酶可以为仅1种，也可以为2种或其以上。
从能够在早期检测出胰腺癌的观点出发，优选检测TFPI2与CA19-9或SPan-1的组合。另一方面，从能够检测到用其它标记物无法检测到的胰腺癌的观点出发，更优选：在TFPI2与CA19-9或SPan-1的组合的基础上进一步组合检测DUPAN-2。
另外，本发明中的待检体的采集时期没有特别限定。例如，可以是从黄疸等临床症状或图像诊断等中怀疑胰腺癌而实施精密检测的术前时开始到通过活检或术后的病理检测确诊为胰腺癌后的经过观察时为止的任意期间，即使是在确定诊断前后、治疗开始前后等任意阶段采集的待检体，也能够供于本发明的方法。
本发明的检测方法中，优选：在通过测定得到的TFPI2量超过预先设定的基准值(截止值)的情况下，判定为检测出胰腺癌。此处，TFPI2量可以是完整TFPI2量、NT-TFPI2量、或完整TFPI2量和NT-TFPI2量的总计中的任意者，但从兼顾测定容易度与充分的灵敏度/特异性的观点出发，更优选完整TFPI2量和NT-TFPI2量的总计。
判定中使用的基准值可以是测定值或者换算浓度值中的任意者。需要说明的是，换算浓度值是基于将TFPI2作为标准试样制作的校准曲线由测定值换算而得到的值。
对于用于判定胰腺癌的基准值(截止值)，可以分别测定健康的人和胰腺癌，根据受试者工作特征(ROC)曲线解析适宜设定为显示出最适灵敏度和特异性的测定值。例如，TFPI2的基准值(截止值)可以如后述的实施例所述，设定为200pg/mL，但不限定于此。
以下对TFPI2的测定方法进行说明。
本发明中，可以分别测定待检体中的NT-TFPI2量或完整TFPI2量，也可以将这些值相加而作为总计量。另外，可以利用能够一次性地测定待检体中的NT-TFPI2和完整TFPI2的总计量的测定系统进行测定。或者，如后所述，也可以由两者的测定总计量和完整TFPI2单独的测定量间接地测定NT-TFPI2量。
本发明的方法中，测定NT-TFPI2量和/或完整TFPI2量的方法没有特别限制。例如可以示例出：利用使用识别NT-TFPI2和/或完整TFPI2的抗体的抗原抗体反应的方法、利用质谱分析法的方法。
(a)使用标记的测定对象和识别测定对象的抗体，利用标记的测定对象和待检体中包含的测定对象与前述抗体竞争性结合的竞争法。
(b)使用了使待检体与固定化有识别测定对象的抗体的芯片接触、并且检测依赖于该抗体与测定对象的结合的信号的表面等离子共振的方法。
(c)利用了使用识别荧光标记的测定对象的抗体、由于该抗体与测定对象结合而荧光偏光度上升的荧光偏光免疫测定法。
(d)使用抗原决定簇不同的2种识别测定对象的抗体(其中1种为进行了标记的抗体)，形成该2个抗体与测定对象这3者的复合体的夹心法。
(e)作为前处理通过识别测定对象的抗体将待检体中的测定对象浓缩后，通过质谱分析装置等检测该结合蛋白的多肽的方法。
(d)、(e)的方法简便且通用性高，从在处理多待检体方面已充分确立了有关试剂和装置的技术方面考虑，更优选(d)的方法。
利用抗原抗体反应来测定NT-TFPI2量和/或完整TFPI2量的方法具体可列举出以下方法。
(A)使用识别NT-TFPI2和完整TFPI2这两者的抗体，测定NT-TFPI2和完整TFPI2的总计量的方法(NT+I-TFPI2测定系统)。需要说明的是，识别前述NT-TFPI2和完整TFPI2这两者的抗体优选为：与序列号1所示的TFPI2氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合的抗体，进一步优选在TFPI2的Kunitz结构域1中具有抗原决定簇的抗体。另外，在该方法中使用前述夹心法的情况，通常使用抗原决定簇不同的2种前述抗体。
(B)使用不识别NT-TFPI2而识别完整TFPI2的抗体，测定完整TFPI2单独的量的方法(I-TFPI2测定系统)。需要说明的是，不识别前述NT-TFPI2而识别完整TFPI2的抗体优选为在TFPI2的Kunitz结构域3中具有抗原决定簇的抗体。另外，在该方法中使用前述夹心法的情况，通常前述抗体使用抗原决定簇不同的2种抗体，其中至少1种使用不识别NT-TFPI2而识别完整TFPI2的抗体、另1种可以是不识别NT-TFPI2而识别完整TFPI2的抗体，或者可以是识别NT-TFPI2和完整TFPI2这两者的抗体。
(C)通过从利用(A)的NT+I-TFPI2测定系统测定的NT-TFPI2和完整TFPI2的总计量中减去利用(B)的I-TFPI2测定系统测定的完整TFPI2单独量，从而计算出NT-TFPI2单独的量的方法。
(D)使用不识别完整TFPI2而识别NT-TFPI2的抗体，测定NT-TFPI2单独的量的方法。需要说明的是，前述不识别完整TFPI2而识别NT-TFPI2的抗体例如可列举出特异性识别NT-TFPI2的C末端部分的肽序列的抗体。使用前述夹心法的情况，例如，将该抗体作为固相抗体，将在Kunitz结构域1中具有抗原决定簇的抗体作为检测抗体。
本发明的检测胰腺癌的方法中，可以将利用前述的(C)、(D)的方法测定的NT-TFPI2单独的量用作判定基准，但将利用(A)的方法测定的NT-TFPI2和完整TFPI2的总计量用作判定的基准也可以得到充分的灵敏度和特异性，而且从抗体的获得容易度、测定为一个阶段而简便方面考虑，更优选后者。
识别NT-TFPI2和/或完整TFPI2的抗体可以通过将NT-TFPI2多肽或蛋白质、完整TFPI2多肽或由TFPI2蛋白质的部分区域组成的寡肽、编码NT-TFPI2多肽或TFPI2蛋白质的完整区域或部分区域的多核苷酸等作为免疫原并对动物进行免疫而获得。前述蛋白质或前述寡肽、多肽未反映出生物体内的TFPI2的立体结构或者在制备过程中其结构可能发生变化。因此，得到的抗体可能不具有所期望的对生物体内的TFPI2的高特异性、结合力，即使使用本抗体来构建测定系统，结果也有可能无法准确地对待检体中包含的TFPI2浓度进行定量。
另一方面，通过使用包含编码TFPI2多肽或完整TFPI2蛋白质的完整区域或部分区域的多核苷酸的表达载体作为免疫原，从而在免疫动物的体内表达TFPI2多肽或完整TFPI2蛋白质的完整区域或部分区域而引发免疫应答，因此可以得到对待检体中的TFPI2具有高特异性和结合力(即，高亲和性)的抗体，故而更优选。
免疫中使用的动物只要是具有抗体产生能力的动物就没有特别限定，可以是小鼠、大鼠、兔子等免疫中通常使用的哺乳动物，还可以使用鸡等禽类。
进而，血液中还存在作为TFPI2的同源物已知的TFPI1。因此，期望使用仅特异性识别TFPI2而不与TFPI1交叉的抗体。
本发明的另一方面，为测定TFPI2量的试剂在制造用于检测胰腺癌的试剂中的应用。此处，测定前述TFPI2量的试剂优选为测定TFPI2加工多肽量和完整TFPI2量的总计的试剂。另外，测定前述TFPI2量的试剂优选为与序列号1的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合的抗体、更优选为识别TFPI2的Kunitz结构域1的抗体。
因此，本发明也可以称为与序列号1所示的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合的抗体在制造用于检测胰腺癌的试剂中的应用。
另外，本发明也可以称为与序列号1所示的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合的抗体在检测胰腺癌中的应用。
识别TFPI2的抗体可以为单克隆抗体，也可以为多克隆抗体，但优选为单克隆抗体。
产生识别TFPI2的抗体的杂交瘤细胞的建立可以从建立了技术的方法中适宜选择来进行。作为一例，从利用前述方法进行了免疫的动物中采集B细胞，使前述B细胞与骨髓瘤细胞进行电融合或在聚乙二醇存在下融合，通过HAT培养基进行产生期望的抗体的杂交瘤细胞的选择，利用有限稀释法对选择的杂交瘤细胞进行单克隆化，由此能够建立产生识别TFPI2的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
本发明中使用的识别TFPI2的单克隆抗体的选择例如可以基于针对源自宿主表达系统的、GPI(glycosylphosphatidylinositol，糖基化磷酯酰肌醇)锚定型TFPI2或分泌型TFPI2的亲和性来进行。
需要说明的是，作为前述宿主，没有特别限定，可以从本领域技术人员通常用于表达蛋白质的大肠杆菌、酵母等微生物细胞、昆虫细胞、动物细胞中适宜选择，但优选将哺乳细胞用作宿主，原因在于，其通过二硫键或者糖链添加之类的翻译后修饰能够表达具有与天然型的TFPI2近似的结构的蛋白质。作为哺乳细胞的一例，可列举出一直以来使用的、人胚胎肾脏来源细胞(HEK)293T细胞株、猴肾脏细胞COS7株、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或从人分离出的癌细胞等。
本发明中使用的抗体的纯化可以从建立了技术的方法中适宜选择来进行。作为一例，培养利用前述的方法建立的产生抗体的杂交瘤细胞后，回收其培养上清液，根据需要利用硫酸铵沉淀而浓缩抗体后，通过使用固定化有蛋白A、蛋白G、或蛋白L等的载体的亲和色谱和/或离子交换色谱，从而能够进行抗体的纯化。
需要说明的是，对于利用前述的夹心法进行抗原抗体反应时使用的经标记的抗体，用过氧化物酶、碱性磷酸酶等酶标记利用前述的方法纯化的抗体即可，该标记也可以利用已经充分确立了技术的方法来进行。
以下对于本发明的方法中利用质谱分析法测定TFPI2量的方法进行具体说明。
待检体为血液的情况，作为预处理工序，优选：用Agilent Human 14等去除血液中富含的白蛋白、免疫球蛋白、运铁蛋白等主要蛋白质后，利用离子交换、凝胶过滤或反相HPLC等进行进一步分级。或者，利用使用了抗TFPI2抗体的免疫方法也能够特异性地仅回收TFPI2。
测定可以通过串联质谱分析(MS/MS)、液相色谱·串联质谱分析(LC/MS/MS)、基质辅助激光解吸电离化飞行时间型质谱分析(matrix assisted laser desorptionionization time-of-flight mass spectrometry、MALDI-TOF/MS)、表面增强激光解吸电离质谱分析(surface enhanced laser desorption ionization mass spectrometry、SELDI-MS)等进行。
<2>本发明的用于检测胰腺癌的试剂
将本发明的试剂用于前述的夹心法的情况，作为前述抗体，优选包含抗原决定簇不同的2种抗体。
本发明的试剂中包含的抗体可以为抗体本身，也可以进行了标记，也可以被固定化于固相上。
本发明的试剂中，以下对用于作为前述夹心法的一方式的2步夹心法的情况进行具体说明。但是，本发明不限定于此。
首先，本发明的试剂可以利用以下的(I)至(III)所示的方法制作。
(I)首先，使夹心法中使用的、识别TFPI2且抗原决定簇不同的2种抗体(以下称为“抗体1”和“抗体2”)中的抗体1与免疫板、磁性颗粒等能进行B/F(结合/游离)分离的载体结合。结合方法可以是利用了疏水键的物理性结合，还可以是利用了能使2种物质间交联的连接试剂等的化学性结合。
(II)使前述抗体1与载体结合后，为了避免非特异性结合，用牛血清白蛋白、脱脂乳、市售的免疫分析用封闭剂、用于抑制蛋白吸附的化学合成聚合物等对载体表面进行封闭处理而制成1次试剂。
(III)标记另一抗体2，准备包含得到的标记抗体的溶液作为2次试剂。作为对抗体2进行标记的物质，优选过氧化物酶、碱性磷酸酶这样的酶、荧光物质、化学发光物质、放射性同位素等能通过检测装置进行检测的物质、或针对生物素的亲和素等存在特异性结合的对象的物质等。另外，作为2次试剂的溶液，优选可良好地进行抗原抗体反应的缓冲液、例如磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。以此方式制作的本发明的试剂还可以根据需要进行冷冻干燥。
需要说明的是，1步夹心法的情况，与前述(I)～(II)同样地制作使抗体1与载体结合并进行了封闭处理的试剂，在前述抗体固定化载体中进一步添加包含标记的抗体2的缓冲液而制作试剂即可。
接着，在使用利用前述方法得到的试剂利用2步夹心法检测、测定TFPI2时，利用以下的(IV)至(VI)所示的方法进行即可。
(IV)使(II)中制作的1次试剂和待检体在一定温度下接触一定时间。反应条件在温度4℃至40℃的范围内进行5分钟至180分钟反应即可。
(V)通过B/F分离去除未反应物质，接着在一定温度下与(III)中制作的2次试剂接触一定时间，形成夹心复合体。反应条件在温度4℃至40℃的范围内进行5分钟至180分钟反应即可。
(VI)通过B/F分离去除未反应物质，对标记抗体的标记物质进行定量，通过将已知浓度的TFPI2溶液作为标准而制作的标准曲线，对待检体中的人TFPI2进行定量。
本发明的试剂中包含的抗体等试剂成分的量可以根据待检体量、待检体的种类、试剂的种类、测定的方法等各种条件进行适宜设定。具体而言，例如，在如后所述使用血清、血浆20μL作为待检体并利用夹心法进行TFPI2量的测定时，相对于使该待检体20μL与抗体反应的反应体系，与载体结合的抗体量可以为100ng至1000μg，标记抗体量可以为2ng至20μg。
本发明的试剂可以用于利用手动方法的测定，还可以用于使用自动免疫诊断装置的测定。特别是使用了自动免疫诊断装置的测定能够在不受到待检体中包含的内源性测定干扰因素、竞争酶的影响的情况下进行测定，且能够在短时间内对待检体中的TFPI2进行定量，故而优选。
本发明的检测胰腺癌的方法能够用于治疗胰腺癌的方法。即，根据本发明，提供一种治疗待检体中的胰腺癌的方法，所述方法包括如下工序：
(i)以TFPI2量的测定值超过预先设定的基准值的形式对待检体进行鉴定的工序；和
(ii)对鉴定为TFPI2量的测定值超过预先设定的基准值的前述待检体相实施治疗的工序。
前述治疗胰腺癌的方法的优选方式中，前述TFPI2量为TFPI2加工多肽量和完整TFPI2量的总计。
另外，前述工序(i)的鉴定中，TFPI2量的测定优选通过使用了抗体的抗原抗体反应来进行，所述抗体与序列号1的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合。更优选前述抗体是识别TFPI2的Kunitz结构域1的抗体。
另外，前述工序(i)的鉴定中，TFPI2量的测定可以使用质谱分析法进行。
作为前述工序(ii)的治疗，可列举出外科切除、药物疗法、放射线疗法等，作为前述药物，可列举出酪氨酸激酶抑制剂、mToR抑制剂、免疫检查点抑制剂等，没有特别限定。
实施例
以下为了对本发明进行具体地说明而示出实施例，这些实施例示出本发明的一例，本发明不限定于实施例。
<实施例1>TFPI2测定试剂的制备
依据专利文献3的方法，使用利用DNA免疫法得到的TFPI2抗体如下制备了TFPI2测定试剂。
(1)使抗TFPI2单克隆抗体(TS-TF04)以成为100ng/载体的方式在室温下一昼夜物理地吸附于水不溶性的含有铁氧体的载体上，然后用包含1％BSA的100mM Tris缓冲液(pH8.0)进行53℃·4小时封闭，由此制备了抗TFPI2抗体固定化载体。
(2)对于抗TFPI2单克隆抗体(TS-TF01)，利用碱性磷酸酶标记试剂盒(同仁化学公司制)制备了碱性磷酸酶标记抗TFPI2抗体。
(3)在透磁性的容器(容量1.2mL)中放入(1)中制备的12个抗体固定化载体后，添加(2)中制备的包含碱性磷酸酶标记抗体1μg/mL的缓冲液(包含3％BSA的Tris缓冲液、pH8.0)100μL，实施冷冻干燥，由此制作了TFPI2测定试剂。需要说明的是，制作的TFPI2测定试剂在充氮下施加气密密封，在4℃下保管直至测量。
<实施例2>临床待检体的评价
表1示出本实施例中使用的临床待检体的详细情况。健康的人血清241例(男性102例、女性139例)和胰腺囊性肿瘤(良性胰腺肿瘤)患者血清1例(男性)、胰腺癌患者血清23例(男性17例、女性6例)中，除男性健康的人外的病例是横浜市立大学按照相同方案收集的待检体，在获得知情同意和横滨市立大学伦理委员会的批准的情况下提供。男性健康的人使用获得了知情同意和东曹公司内部伦理委员会的批准的内部志愿者待检体。
[表1]
表1
Figure BDA0003966490400000151
评价用装置使用全自动酶免疫测定装置AIA-2000(东曹公司制：制造销售通知编号13B3X90002000009)。通过全自动酶免疫测定装置AIA-2000进行的TFPI2测定按以下的步骤进行。
(1)将包含样品20μL和表面活性剂的稀释液100μL自动分注于收纳有实施例1中制作的TFPI2测定试剂的容器中，
(2)在37℃恒温下进行10分钟的抗原抗体反应，
(3)B/F分离后，用包含表面活性剂的缓冲液进行8次清洗，
(4)添加4-甲基伞形酮磷酸盐，将单位时间的碱性磷酸酶产生的4-甲基伞形酮生成浓度作为测定值(TFPI2 intensity、nmol/(L·s))。
将市售TFPI2重组蛋白(R&D公司)作为标准品制作校准曲线，计算出待检体中的TFPI2浓度。良性胰腺肿瘤和胰腺癌患者的血液中CA19-9值采用最接近采血日期的电子病历中记载的测定值。
将健康的人、胰腺癌患者、良性胰腺肿瘤患者中的血液中TFPI2值的箱形图示于图1，将健康的人和胰腺癌患者的ROC解析结果示于图2。证实了：与健康的人相比，TFPI2在胰腺癌患者中具有统计学显著差异而显示出高值(曼-惠特尼U检验、p<0.0001)，在良性胰腺肿瘤患者中与健康的人同样地显示出低值。由TFPI2的ROC曲线计算出的曲线下面积(AUC)为0.9230。由本结果示出：TFPI2具有良好的胰腺癌检测性能。
<实施例3>TFPI2在胰腺癌发病部位和性别差异中的比较
对于实施例2的临床待检体，将胰腺癌患者按胰头部、胰体部和胰尾部的胰腺癌发病部位区分的血液中TFPI2值的箱形图示于图3，将胰腺癌患者按性别差异区分的血液中TFPI2值的箱形图示于图4。在胰腺癌发病部位以及性别差异方面，血液中TFPI2值在组间未观察到差异。
<实施例4>TFPI2和CA19-9在胰腺癌检测中的互补性
表2示出：对于实施例2的临床待检体，根据实施例2的ROC解析结果将Youdenindex(特异性+灵敏度-1)为最大值的200pg/mL设定为截止值时的TFPI2的阳性率、将临床现场使用的37U/mL设定为截止值时的CA19-9的阳性率。示出：与CA19-9相比，TFPI2单独的阳性率虽差，但通过将CA19-9和TFPI2组合而阳性率上升。CA19-9在Lewis血型抗原阴性的患者中存在假阴性的课题，但通过与TFPI2同时(并行)测定而可期待改善胰腺癌患者的阳性率。
[表2]
表2
Figure BDA0003966490400000161
<实施例5>胰腺癌患者血清中的TFPI2和CA19-9的相关性
对于实施例2的临床待检体，将胰腺癌患者血清中的TFPI2和CA19-9的相关性和相关系数示于图5。启示出：TFPI2和CA19-9没有显著相关性(相关系数＝0.22)，各自是独立的指标。
<实施例6>早期胰腺癌病例的待检体评价
将本实施例中使用的临床待检体的详细情况示于表3。对于分期相对而言未发展的胰腺癌患者血清12例，均为横浜市立大学按照相同方案收集的待检体，在获得知情同意和横滨市立大学伦理委员会的批准的情况下提供。
[表3]
表3
病例数 分期1 分期2，3
非进行性胰腺癌 12 8 4
利用与实施例2同样的评价用装置和评价方法，计算出待检体中的TFPI2浓度。胰腺癌患者的血液中CA19-9、CEA、SPan-1、DUPAN-2值采用最接近采血日期的电子病历中记载的测定值。
<实施例7>早期胰腺癌检测中的各胰腺癌标记物的阳性率
对于实施例6的临床待检体，表4示出非进行性的胰腺癌患者中的各胰腺癌标记物的阳性率。TFPI2的截止值与实施例4同样地设为200pg/mL，其它胰腺癌标记物使用在临床现场所使用的截止值。基于TFPI2的非进行性胰腺癌病例的阳性率为75％(9/12例)，与其它胰腺癌标记物相比，显示出具有优异的检测性能。另外，即使仅限于早期(分期1)，基于TFPI2的阳性率也为75％(6/8例)，与其它胰腺癌标记物相比，显示出具有优异的检测性能。
[表4]
表4
Figure BDA0003966490400000171
<实施例8>早期胰腺癌检测中的TFPI2与其它胰腺癌标记物的互补性
对于实施例6的临床待检体，将非进行性的胰腺癌患者血清中的TFPI2与其它胰腺癌标记物的相关性示于图6～9(图中的黑色圆圈标记(·)表示分期1的病例，黑色三角标记(▲)表示分期2、3的病例)。另外，将胰腺癌标记物间的相关系数(r)示于表5。TFPI2与其它胰腺癌标记物之间未观察到显著相关性(r＝-0.689～0.068)，启示出是彼此独立的指标。虽然除TFPI2以外的标记物之间普遍未观察到相关性，但CA19-9和SPan-1显示出相关系数接近1的值，确认了具有较高的相关性。
[表5]
表5
CA19-9 CEA Span-1 DUPAN-2
TFPI2 -0.689 -0.040 -0.680 0.068
CA19-9 ---- 0.090 0.968 -0.203
CEA ---- ---- 0.022 -0.153
Span-1 ---- ---- ---- -0.231
将其它单独检测胰腺癌标记物时的阳性率、及将TFPI2和其它胰腺癌标记物组合进行检测时的阳性率示于表6。确认了：通过将TFPI2与其它胰腺癌标记物组合而提高阳性率，特别是通过将TFPI2与CA19-9或SPan-1组合而显示出高检测性能。
另外，CA19-9和SPan-1表现出相似的行为，图6～9的各相关图中用箭头所示的1例仅在DUPAN-2的情况下显示出阳性。基于这些结果，在早期胰腺癌患者的检测中，通过测定在TFPI2和DUPAN-2的基础上增加CA19-9或SPan-1这3个项目的胰腺癌标记物，从而可期待能够检测更多的病例。
[表6]
表6
Figure BDA0003966490400000191
产业上的可利用性
根据本发明，提供通过简便且患者负担相对较少的血液检测来检测胰腺癌患者的方法。其可期待有助于依赖于图像诊断而不存在有效的肿瘤标记物的胰腺癌诊疗，在产业上是非常有用的。
序列表
<110> 公立大学法人横滨市立大学（Public University Corporation YokohamaCity University）
东曹株式会社（TOSOH corporation）
<120> 胰腺癌的检测方法和检测试剂
<130> 2200023-0861
<150> JP2020-096966
<151> 2020-06-03
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 235
<212> PRT
<213> 智人（Homo Sapiens）
<400> 1
Met Asp Pro Ala Arg Pro Leu Gly Leu Ser Ile Leu Leu Leu Phe Leu
1 5 10 15
Thr Glu Ala Ala Leu Gly Asp Ala Ala Gln Glu Pro Thr Gly Asn Asn
20 25 30
Ala Glu Ile Cys Leu Leu Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu
35 40 45
Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr Asp Arg Tyr Thr Gln Ser Cys Arg Gln Phe
50 55 60
Leu Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu
65 70 75 80
Ala Cys Asp Asp Ala Cys Trp Arg Ile Glu Lys Val Pro Lys Val Cys
85 90 95
Arg Leu Gln Val Ser Val Asp Asp Gln Cys Glu Gly Ser Thr Glu Lys
100 105 110
Tyr Phe Phe Asn Leu Ser Ser Met Thr Cys Glu Lys Phe Phe Ser Gly
115 120 125
Gly Cys His Arg Asn Arg Ile Glu Asn Arg Phe Pro Asp Glu Ala Thr
130 135 140
Cys Met Gly Phe Cys Ala Pro Lys Lys Ile Pro Ser Phe Cys Tyr Ser
145 150 155 160
Pro Lys Asp Glu Gly Leu Cys Ser Ala Asn Val Thr Arg Tyr Tyr Phe
165 170 175
Asn Pro Arg Tyr Arg Thr Cys Asp Ala Phe Thr Tyr Thr Gly Cys Gly
180 185 190
Gly Asn Asp Asn Asn Phe Val Ser Arg Glu Asp Cys Lys Arg Ala Cys
195 200 205
Ala Lys Ala Leu Lys Lys Lys Lys Lys Met Pro Lys Leu Arg Phe Ala
210 215 220
Ser Arg Ile Arg Lys Ile Arg Lys Lys Gln Phe
225 230 235

Claims (8)

1.一种检测胰腺癌的方法，其包括测定采集的体液中的TFPI2量的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述TFPI2量的测定值超过预先设定的基准值的情况下，作为检测到胰腺癌。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述TFPI2量为TFPI2加工多肽量和完整TFPI2量的总计。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述TFPI2量的测定通过使用了抗体的抗原抗体反应来进行，所述抗体与序列号1的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述抗体是识别TFPI2的Kunitz结构域1的抗体。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其使用质谱分析法进行测定。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的方法，其还包括测定所述体液中除TFPI2以外的胰腺癌标记物和/或胰酶的量的步骤。
8.一种用于检测胰腺癌的试剂，其包含：与序列号1所示的氨基酸序列的从第23位残基的天冬氨酸到第131位残基的组氨酸或第130位残基的半胱氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合的抗体。
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