CN111051889A

CN111051889A - 检测癌症的方法和检测试剂

Info

Publication number: CN111051889A
Application number: CN201880054905.3A
Authority: CN
Inventors: 明庭昇平; 大竹则久
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 2017-08-30
Filing date: 2018-08-22
Publication date: 2020-04-21
Anticipated expiration: 2038-08-22
Also published as: CA3073923A1; US11913955B2; US20200256872A1; EP3677913A1; JP7127422B2; JP2019045486A; AU2018323281A2; CN111051889B; EP3677913A4; WO2019044602A1; BR112020003937A2; AU2018323281A1

Abstract

本发明提供简便且以高精度检测癌症的方法及能用于前述方法的试剂。在待检体中，通过测定完整的生长分化因子(GDF15)前肽量、GDF15前肽片段量或完整的GDF15前肽量与GDF15前肽片段量的总计量，从而检测癌(其中，去势抵抗性前列腺癌除外)。作为上述的检测癌症的方法，包括检测胃癌、胰腺癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌或食道癌或者鉴别并检测非小细胞肺癌与小细胞肺癌的方法。进而，特异性识别GDF15前肽的抗体包含在癌症的检测试剂中。

Description

检测癌症的方法和检测试剂

技术领域

本发明涉及血液中的生长分化因子15(Growth and Differentiation Factor15、以下也记为“GDF15”)蛋白质的前肽及其分解产物、以及将它们作为测定对象的癌症的检测方法和检测试剂。

背景技术

作为用于检测癌症的肿瘤标记物，通常可列举出表1所示那样的肿瘤标记物。然而，所有标记物在癌症早期的阳性率均低，且存在许多在良性肿瘤、炎症中的假阳性、恶性度高癌症无法检测等的课题。因此，期望发现能以高精度检测这些癌症的肿瘤标记物和开发出检测法。

[表1]

生长分化因子15(GDF15)是与巨噬细胞抑制因子1(Macropharge InhibitoryCytokine 1：MIC-1)、非甾体系抗炎药活激活基因1(Nonsteroidal anti-inflammatorydrug-Activated Gene 1：NAG-1)相同的蛋白质，属于TGF-β家族。GDF15表达为包含分泌信号和前肽的前GDF15后，分泌信号被切断并作为pro-GDF15分泌至细胞外。pro-GDF15经由前肽储存在细胞外基质中，在通过弗林样蛋白酶由前肽形成了二聚体的状态下GDF15被切断而释放至血液中(非专利文献1)。报道了：pro-GDF15全长上在分子量40000附近被分级，GDF15成熟体在分子量15000附近被分级(非专利文献2)。

GDF15被报道在胰腺癌、大肠癌等各种癌症中，血液中的成熟体量增加，并且发现GDF15在心脏病等除了癌症以外的疾病中、在血液中的量增加(专利文献1～6、非专利文献3～8)，此外尝试了在调节食欲、妊娠中的胎儿检测中的应用(专利文献7～8)。

然而，这些见解均与GDF15成熟体有关，GDF15前肽被认为局部存在于细胞外基质中(非专利文献2)。另外，以该蛋白质作为测定对象来检测疾病的效果也不清楚。

需要说明的是，GDF15前肽(以下也记为“GDPP”)是位于pro-GDF15的N末端侧的165残基的多肽。更具体而言，本说明书中的GDF15前肽在基于序列号1所示的人GDF15的cDNA(GenBank Accession No.：NM_004864)的氨基酸序列中，继从开始蛋氨酸至第29残基的丙氨酸为止的信号肽之后、至少包含第30残基的亮氨酸至第194残基的精氨酸为止的序列或者包含与前述序列具有80％以上的同一性的氨基酸序列。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2011-102461号公报

专利文献2：日本特开2009-545735号公报

专利文献3：日本特开2010-528275号公报

专利文献4：日本特开2011-523051号公报

专利文献5：日本特开2012-515335号公报

专利文献6：日本特开2015-108077号公报

专利文献7：日本特开2011-190262号公报

专利文献8：日本特开2003-532079号公报

非专利文献

非专利文献1：Prostate Cancer Prostatic Dis.2012；15(4)：320-328

非专利文献2：Cancer Res.2005；65(6)：2330-2336

非专利文献3：Biochemical Pharmacology.2013；85：597-606

非专利文献4：Clin Cancer Res.2009；15(21)：6658-6664

非专利文献5：Clin Cancer Res.2011；17：4825-4833

非专利文献6：Clin Cancer Res.2003；9：2642-2650

非专利文献7：Clin Cancer Res.2006；12：442-446

非专利文献8：BMC Cancer.2014；14：578-588

发明内容

发明要解决的问题

本发明的目的在于提供简便且以高精度检测癌症的方法及能用于前述方法的试剂。

用于解决问题的方案

本发明人等为了解决上述课题而进行了深入研究，结果得到如下见解：在胰腺癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌、食道癌和胃癌中，通过使用了识别GDF15前肽的抗体的免疫分析，血液中的GDF15前肽与健康待检体相比，在这些癌症待检体中显示出增加；以及肺癌中与非小细胞肺癌相比，在小细胞肺癌中上升，发现GDF15前肽可以成为检测癌症、特别是胰腺癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌、食道癌或胃癌、或者在肺癌中鉴别并检测非小细胞肺癌与小细胞肺癌的标记物，完成了本发明。

即，本发明如下。

[1]一种检测癌症的方法，其中，去势抵抗性前列腺癌除外，所述方法包括：在待检体中，测定完整的生长分化因子(GDF15)前肽量。

[2]一种检测癌症的方法，其中，去势抵抗性前列腺癌除外，所述方法包括：在待检体中，测定GDF15前肽片段量，。

[3]一种检测癌症的方法，其中，去势抵抗性前列腺癌除外，所述方法包括：在待检体中，测定完整的GDF15前肽量与GDF15前肽片段量的总计量。

[4]根据上述的[1]～[3]中任一项所述的检测癌症的方法，其为检测胃癌、胰腺癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌或食道癌或者鉴别并检测非小细胞肺癌与小细胞肺癌的方法。

[5]根据[2]或[3]所述的方法，其中，前述GDF15前肽片段包含以下的(A)和/或(B)所述的GDF15前肽片段：

(A)具有以下的特征的GDF15前肽片段，

包含序列号2所示的GDF15氨基酸序列的从第58残基的赖氨酸至至少第167残基的天冬氨酸为止的氨基酸序列或与其具有80％以上的同一性的序列；

(B)具有以下的特征的GDF15前肽片段，

包含序列号2所示的GDF15氨基酸序列的从第74残基的谷氨酸至至少第167残基的天冬氨酸为止的氨基酸序列或与其具有80％以上的同一性的序列。

[6]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，利用抗原抗体反应来进行所述测定，所述抗原抗体反应使用了识别GDF15前肽的抗体。

[7]根据[1]～[5]中任一项所述的方法，其中，利用质谱分析法进行所述测定。

[8]一种用于检测癌症的试剂，其中，去势抵抗性前列腺癌除外，所述试剂包含识别GDF15前肽的抗体。

发明的效果

根据本发明，提供简便且以高精度检测癌症的方法及能用于前述方法的试剂。

另外，本发明的试剂用于检测GDF15前肽，GDF15表达控制位于p53下游，因此推测出反映现有的癌症治疗药、特别是紫杉烷系抗癌剂的治疗效果。因此，本发明的试剂也能作为癌症的治疗中的伴随诊断药。

附图说明

图1是示出制作的各种重组GDPP的结构的图。

图2是示出ELISA解析的结果的图。

图3是示出蛋白质印迹结果的图。

图4是示出各种测定值的箱形图(Box Plot)的图。

图5是示出受试者工作特征(ROC)曲线解析的结果的图。

图6是示出实施例6中测定、解析的结果的图。

图7是示出健康的人、食道癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌中的iGDPP和tGDPP测定值的箱形图(Box Plot)的图。

图8是示出食道癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌中的CEA测定值的箱形图(BoxPlot)的图。

图9是对非小细胞肺癌与小细胞肺癌中的iGDPP、tGDPP、CEA测定值进行比较的图。

图10是示出非小细胞肺癌与小细胞肺癌中的iGDPP、tGDPP、CEA的ROC曲线解析的结果的图。

具体实施方式

＜1＞本发明的检测癌症的方法

本发明的第一方式是检测癌症的方法(其中，去势抵抗性前列腺癌(以下也记为“CRPC))除外)，包括在待检体中测定GDF15前肽量。该方法是基于与健康的待检体相比癌症的血液等生物体试样中特征性存在GDF15前肽的方法。通过该方法，如后述的实施例所示，与测定现有已知的肿瘤标记物(CA19-9、CEA)的情况相比，在检测癌症(其中，CRPC除外)例如胰腺癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌、食道癌或胃癌或者鉴别并检测非小细胞肺癌与小细胞肺癌时，能够以高灵敏度和特异性进行检测。

作为本方式中测定对象的GDF15前肽包含：由序列号2所示的GDF15氨基酸序列的从第30残基的亮氨酸至第194残基的精氨酸为止的氨基酸序列构成的完整的GDF15前肽(以下也记为“iGDPP”)和/或GDF15前肽片段，GDF15前肽片段包含dNT57-GDPP(相当于序列号2的氨基酸序列的从第58残基至第167残基)、dNT73-GDPP(相当于序列号2的氨基酸序列的从第74残基至第167残基)及其它肽片段。需要说明的是，完整的GDF15前肽是指未被分解的GDF15前肽。本发明的检测方法中，测定GDF15前肽量的方法没有特别限定。例如可以示例出利用了使用识别GDF15前肽的抗体的抗原抗体反应的方法、利用了质谱分析法的方法。

作为利用了使用识别GDF15前肽的抗体的抗原抗体反应的测定方法的具体例子，可列举出以下的方法。

(a)竞争法，其使用标记的测定对象和识别测定对象的抗体，利用标记的测定对象和在待检体中包含的测定对象与前述抗体竞争性结合。

(b)利用了表面等离子体共振的方法，其使待检体与固定化有识别测定对象的抗体的芯片接触，检测取决于该抗体与测定对象结合的信号。

(c)荧光偏振免疫测定法，使用识别荧光标记的测定对象的抗体，利用通过使该抗体与测定对象结合而使荧光偏振度上升。

(d)夹心法，其使用表位不同的2种识别测定对象的抗体(其中1种为标记的抗体)，形成该2种抗体与测定对象这3者的复合体。

(e)作为前处理通过识别测定对象的抗体将在待检体中的测定对象浓缩后，通过质谱分析装置等检测其结合蛋白的多肽的方法。

(d)、(e)的方法简便且通用性高，在处理多个待检体方面，(d)的方法在充分确立了与试剂和装置相关的技术上更优选。

作为识别GDF15前肽的抗体，识别GDF15前肽的N末端区域的、例如与序列号2的从第30残基的亮氨酸至第57残基的精氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合的抗体可以适宜地用于测定iGDPP量。另外，识别GDF前肽的C末端区域的、例如与序列号2的从第74残基的谷氨酸至第196残基的精氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合的抗体可以适宜地用于测定iGDPP量与GDPP片段量的总计量(总GDPP、以下也记为“tGDPP”)。

识别GDF15前肽的抗体可以通过将GDF15前肽本身、由GDF15前肽的部分区域构成的寡肽、编码pro-GDF15蛋白质的完整或部分区域的多聚核苷酸等作为免疫原，使动物免疫而获得。

用于免疫的动物只要具有产生抗体的能力，就没有特别限定，可以是小鼠、大鼠、兔子等通常用于免疫的哺乳动物，还可以使用鸡等鸟类。

需要说明的是，作为免疫原，若使用GDF15前肽本身或由GDF15前肽的部分区域构成的寡肽，则在制备前述蛋白质或前述寡肽的过程中其结构可能发生变化。因此，得到的抗体与期望的抗原不具有高的特异性、结合力，作为结果有可能无法准确地定量在待检体中包含的GDF15前肽量。另一方面，作为免疫原，若使用包含编码pro-GDF15蛋白质的完整或部分区域的多聚核苷酸的表达载体，则由于GDF15前肽蛋白质的完整或部分区域在导入时被表达而未在已免疫的动物体内发生结构变化，因此可以得到对待检体中的GDF15前肽具有高特异性和结合力(即高亲和性)的抗体，故而优选。

识别GDF15前肽的抗体可以是单克隆抗体，还可以是多克隆抗体，但优选为单克隆抗体。

产生识别GDF15前肽的抗体的杂交瘤细胞的树立从已确立了技术的方法中适宜选择来进行即可。作为一个例子，可以通过如下方式树立产生识别GDF15前肽的单克隆抗体的杂交瘤细胞，即，从利用前述的方法免疫的动物采集B细胞，使前述B细胞与骨髓瘤细胞电融合或在聚乙二醇的存在下使其融合，通过HAT培养基进行产生期望的抗体的杂交瘤细胞的选择，利用极限稀释法对已选择的杂交瘤细胞进行单克隆化。

本发明的检测癌症的方法中使用的、识别GDF15前肽的抗体、例如识别GDF15前肽的单克隆抗体的选定可以基于针对源自宿主表达系统的、糖基磷脂酰肌醇(GPI：glycosylphosphatidyl inositol)锚定型GDF15前肽或分泌型GDF15前肽的亲和性进行。

需要说明的是，作为前述宿主没有特别限定，可以适宜地选自本领域技术人员通常用于蛋白质表达的、大肠杆菌、酵母等微生物细胞、昆虫细胞、动物细胞，但优选使用哺乳细胞作为宿主，所述哺乳细胞通过二硫键或糖链添加之类的翻译后修饰而能够表达具有与天然型的GDF15前肽的结构接近的蛋白质。作为哺乳细胞的一个例子，可列举出一直以来使用的人胎儿肾脏来源细胞(HEK)293T细胞株、猴子肾脏细胞COS7株、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或从人分离出的癌细胞等。

本发明的癌症检测方法中使用的抗体的纯化从已确立了技术的方法中适宜选择来进行即可。作为一个例子，可以通过如下方式进行抗体的纯化，即，培养利用前述的方法树立的产生抗体的杂交瘤细胞后，回收其培养上清液，根据需要进行基于硫酸铵沉淀的抗体浓缩后，通过使用了固定化有蛋白A、蛋白G或蛋白L等的载体的亲和色谱和/或离子交换色谱而进行。

需要说明的是，对于利用前述的夹心法进行抗原抗体反应时使用的经标记的抗体，只要通过过氧化酶、碱性磷酸酶等酶等标记利用前述方法纯化的抗体即可，该标记也可以使用充分确立了技术的方法来进行。

本发明的检测方法中，以下对利用质谱分析法来检测GDF15前肽的方法进行具体地说明。

待检体为血液的情况，作为前处理工序优选：通过Agilent Human 14等去除血液中富含的白蛋白、免疫球蛋白、运铁蛋白等蛋白质后，通过离子交换、凝胶过滤或反相HPLC等进一步进行分级。

测定可以通过串联质谱分析(MS/MS)、液相色谱/串联质谱分析(LC/MS/MS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间型质谱分析(matrix assisted laser desorption ionizat-ion time-of-flight mass spectrometry、MALDI-TOF/MS)、表面增强激光离子化质谱分析(surface enhanced laser desorption ionization mass spectrometry、SELDI-MS)等进行。

本发明的检测方法中，优选：通过测定而得到的GDF15前肽量在超过基于对照计算出的基准值(临界值)的情况下，判定为检测出胰腺癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌、胃癌或食道癌。另外，作为本发明的鉴别并检测非小细胞肺癌与小细胞肺癌的方法，优选：在超过基于非小细胞肺癌计算出的基准值(临界值)的情况下，判定为检测出小细胞肺癌。

用于判定的GDF15前肽量可以是测定值或换算浓度值中的任一者。需要说明的是，换算浓度值是指基于以GDF15前肽作为标准试样而制作的校正曲线由测定值换算而得到的值。标准试样的浓度还可以基于使用了质谱分析的标准肽的校正曲线由测定值换算而得到的值来确定。

基准值(临界值)可以通过分别测定健康的人与胰腺癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌、食道癌或胃癌；或者非小细胞肺癌与小细胞肺癌，利用受试者工作特征(ROC)曲线解析适宜设定为显示出最佳的灵敏度和特异性的测定值。

＜2＞本发明的用于检测癌症的试剂

本发明的第二方式为用于检测胰腺癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌、食道癌或胃癌或者用于鉴别并检测非小细胞肺癌与小细胞肺癌的试剂，所述试剂包含识别GDF15前肽的抗体。前述抗体通常是与序列号2所示的pro-GDF15的第30残基的亮氨酸至第196残基的精氨酸为止的区域内的抗原决定簇结合的抗体。

本方式中作为检测对象的GDF15前肽包含完整的GDF15前肽和/或GDF15前肽片段，GDF15前肽片段包含dNT57-GDPP、dNT73-GDPP及其它肽片段。

将本发明的试剂用于前述的夹心法的情况，作为前述抗体需要包含表位不同的2种抗体。

本发明的检测试剂还可以进一步包括癌症的肿瘤标记物的检测试剂，其包含识别癌症的肿瘤标记物的抗体。作为癌症的肿瘤标记物，例如可列举出表1所示的肿瘤标记物。

本发明的试剂中包含的抗体可以是抗体本身，还可以进行了标记，还可以固定化在固相上。

本发明的试剂中，以下对用于作为前述的夹心法的一个方式的2步夹心法的情况进行具体地说明。其中，本发明不限定于此。

首先，本发明的试剂可以利用以下的(I)～(III)所示的方法来制作。

(I)首先，使夹心法中所使用的识别GDF15前肽的表位不同的2种抗体(以下作为“抗体1”和“抗体2”)中的、抗体1与免疫板、磁性颗粒等能分离B/F(结合/游离)的载体结合。结合方法可以是利用了疏水键的物理性结合，还可以是使用了能使两物质间交联的连接体试剂等的化学性结合。

(II)使前述抗体1与载体结合后，为了避免非特异性结合，通过牛血清白蛋白、脱脂乳、市售的免疫分析用封闭剂等对载体表面进行封闭处理，制成1次试剂。

(III)标记另一抗体2，准备包含得到的标记抗体的溶液作为2次试剂。作为标记抗体2的物质，优选：过氧化酶、碱性磷酸酶之类的酶、荧光物质、化学发光物质、放射性同位素等能用检测装置检测的物质、或存在抗生物素等与生物素特异性结合的对象的物质等。另外，作为2次试剂的溶液，优选抗原抗体反应得以良好进行的缓冲液、例如磷酸缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。

由此制作的本发明的试剂还可以根据需要进行冷冻干燥。

需要说明的是，1步夹心法的情况，可以与前述的(I)～(II)同样地使抗体1与载体结合制作进行了封闭处理的物质，向前述抗体固定化载体中进一步添加包含标记的抗体2的缓冲液来制作试剂。

接着，使用前述的方法中得到的试剂，利用2步夹心法检测、测定GDF15前肽时，利用以下的(IV)～(VI)所示的方法进行即可。

(IV)使(II)中制作的1次试剂与待检体在一定时间、一定温度下接触。反应条件在温度4℃至40℃的范围内进行5分钟至180分钟的反应即可。

(V)通过B/F分离去除未反应物质，接着与(III)中制作的2次试剂在一定时间、一定温度下接触，形成夹心复合体。反应条件在温度4℃至40℃的范围内进行5分钟至180分钟的反应即可。

(VI)通过B/F分离去除未反应物质，对标记抗体的标记物质进行定量，以已知浓度的GDF15前肽溶液作为标准，利用制作的校正曲线对在待检体中的人GDF15前肽浓度进行定量。

检测试剂中包含的抗体等试剂成分的量根据待检体量、待检体的种类、试剂的种类、检测的方法等各条件进行适宜设定即可。具体而言，例如，如后所述，作为待检体使用2.5倍稀释的血清、血浆50μL，利用夹心法测定GDF15前肽量时，对于使该待检体50μL与抗体反应的每一反应体系，与载体结合的抗体量可以是100ng至1000μg，标记抗体量可以是2ng至20μg。

本发明的癌症检测试剂可以用于通过手动方法的检测，还可以用于使用了自动免疫诊断装置的检测。特别是使用了自动免疫诊断装置的检测能够在不受在待检体中包含的内源性的测定干扰因素、竞争酶的影响的情况下进行检测，且能够在短时间内定量在待检体中的GDF15前肽以及癌症的肿瘤标记物的浓度，故而优选。

成为本发明的检测癌症的方法和本发明的检测试剂的对象的待检体(被检试样)可列举出全血、血球、血清、血浆等血液成分、细胞或组织的提取液、尿、脑脊髓液等。使用血液成分、尿等体液作为待检体时，能够简便且非侵入式地检测癌症，故而优选，考虑到待检体采集的容易性、与其它检测项目的通用性，特别优选使用血液成分作为待检体。待检体的稀释倍率根据所使用的待检体的种类、状态从无稀释至100倍稀释中适宜选择即可，例如，血清、血浆的情况，使用2.5倍稀释的待检体50μL即可。

实施例

以下为了具体地说明本发明而示出实施例，这些实施例是示出本发明的一个例子，本发明不限定于实施例。

＜实施例1＞单克隆抗体制作

利用已知的方法(DNA免疫：日本特开2013-061321号公报)，制作了5种识别GDF15前肽的单克隆抗体。

＜实施例2＞各种单克隆抗体的表位解析

通过完整的GDF15前肽(iGDPP)和N末端缺失型GDF15前肽片段(dNT-GDPP)的变体表达细胞培养上清液鉴定了实施例1中制作的各抗体的抗原识别位点。

为了进行各种重组GDPP的表达评价和纯化工序，制备了在5’末端进一步插入FLAG标签和StrepII-标签、在3’末端插入编码由BNP(脑利钠肽)的C末端侧7个氨基酸构成的BNC肽(日本特开2009-240300号公报)的寡聚核苷酸的、能表达分泌型iGDPP和4种dNT-GDPP的质粒。将制作的各种重组GDPP的结构示于图1，以下示出具体的制备方法。

需要说明的是，如图1所示，在序列号2的氨基酸序列中，分别地，iGDPP相当于第30残基～第196残基，dNT37-GDPP相当于第38残基～第196残基，dNT59-GDPP相当于第60残基～第196残基，dNT77-GDPP相当于第78残基～第196残基，dNT94-GDPP相当于第95残基～第196残基。

(1)以表2所示的组合使用由人GDF15的cDNA(GenBank Accessesion No.：NM_004864)设计的引物，依据常规方法并利用RT-PCR法使相当于iGDPP、dNT37-GDPP、dNT59-GDPP、dNT-77GDPP和dNT94-GDPP的各多聚核苷酸扩增。

[表2]

(2)根据方案，使用In-fusion(Clonetech公司制)将(1)的RT-PCR扩增产物插入至包含胎盘碱性磷酸酶(Placental Alkaline phosphatase)的GPI锚定区域的质粒pFLAG1(SIGMA公司制)的HindIII-EcoRI位点，构建了各种分泌型GDPP表达质粒。

(3)在通过插入至质粒pFLAG1中的多聚核苷酸表达的各种分泌型GDPP中，为了确认在N末端侧添加了FLAG标签、在C末端侧添加了BNC标签，使用作为一过性表达细胞的293T细胞株，利用下述的方法进行验证。

(4)依据常规方法，向293T细胞株中导入(2)中构建的各种分泌型GDPP表达质粒来一过性表达各种分泌型GDPP，将培养72小时后的培养液离心分离，回收上清液作为各种分泌型GDPP溶液。

(5)使用各种分泌型GDPP溶液作为试样，如下所示实施了酶联免疫测定法(ELISA法)。

(5-1)以成为100ng/孔的方式用碳酸盐缓冲液(pH9.8)稀释兔子抗FLAG多克隆抗体(ROCKLAND公司制)，固相化在MaxiSorp96孔板(NUNC公司制)中。

(5-2)在4℃下反应一夜后，用TBS(Tris-Buffered Saline)清洗3次，以250μL/孔将包含3％牛血清白蛋白(BSA；Bovine Serum Albumin)的TBS溶液添加至各孔中，在室温下放置2小时。

(5-3)用TBS进行3次清洗，以50μL/孔添加各种分泌型GDPP溶液及作为阴性对照的未导入表达质粒的293T细胞株的培养上清液，在室温下放置1小时。

(5-4)通过包含0.5％Tween 20的TBS(TBS-T)进行3次清洗后，以50μL/孔添加用包含1％BSA的TBS-T(1％BSA/TBS-T)稀释至1μg/mL的小鼠抗BNC单克隆抗体溶液或者各单克隆抗体，在室温下放置1小时。

(5-5)通过TBS-T进行3次清洗后，以50μL/孔添加用1％BSA/TBS-T稀释10000倍的辣根过氧化酶(HRP)标记抗小鼠免疫球蛋白G-Fc抗体(SIGMA公司制)溶液，在室温下放置1小时。

(5-6)通过TBS-T进行4次清洗，添加TMB Microwell Peroxidase Substrate(KPL公司制)后，用1mol/L磷酸溶液停止反应，通过吸光测定板读取器测定450nm的吸光值。

(5-7)将ELISA解析的结果示于图2，将各抗体的抗原识别位点示于表3。

[表3]

＜实施例3＞GDF15前肽测定试剂的制备

使用实施例1中制作的抗GDPP单克隆抗体，改变抗体的组合制作了2种GDPP测定试剂。1种是识别GDPP的N末端区域的抗体(TS-GDPP02)与识别C末端区域的抗体(TS-GDPP04)的组合，检测完整的GDPP(iGDPP)。另一种通过识别C末端区域的抗体之间的组合(TS-GDPP04与TS-GDPP08)检测iGDPP与dNT-GDPP这两者。将后者检测得到的值作为总GDPP(tGDPP)。以下记载具体的制备方法。

(1)使抗GDF15前肽单克隆抗体(TS-GDPP02和08)以100ng/载体的方式在室温下一昼夜物理性吸附于水不溶性铁素体载体上，然后通过包含1％BSA的100mM Tris缓冲液(pH8.0)进行40℃·4小时的封闭，制备了抗GDF15前肽抗体固定化载体。

(2)对于抗GDF15前肽单克隆抗体(TS-GDPP04)通过碱性磷酸酶标记试剂盒(同仁化学株式会社制)，制备了抗GDF15前肽标记抗体。

(3)在磁力透过性的容器(容量1.2mL)中放入(1)中制备的12个抗体固定化载体后，添加包含0.5μg/mL的(2)中制备的标记抗体的缓冲液(包含3％BSA的Tris缓冲液、pH8.0)50μL，实施冷冻干燥，由此制作了GDF15前肽测定试剂。需要说明的是，制作的GDF15前肽测定试剂在氮气填充下实施密闭封印密封，直至测定保管在4℃下。

＜实施例4＞GDF15前肽标准品的制备

由于在实施例3中制备的分泌型iGDPP培养上清液中混有分解产物，因此利用位于重组iGDPP的N末端侧的Strep-II标签(IBA公司制)，通过市售的纯化试剂盒(IBA公司制)仅对全长GDF15前肽进行纯化。利用蛋白质印迹法评价了纯化后的分泌型iGDPP。依据常规方法用SDS-PAGE展开各种纯化样品，转印于PVDF膜(Bio-Rad Company制)。通过Blocking One溶液(Nakaraitesque,INC.制)进行封闭后，添加至该封闭溶液中以1μg/片添加碱性磷酸酶标记抗BNC抗体，在4℃下反应一夜。用TBS-T清洗后，使用ECL Select试剂(GE HealthcareCo.,Ltd.制)，通过LAS 4000图像解析装置(GE Healthcare Co.,Ltd.制)检测了得到的化学发光。

将GDPP纯化品的蛋白质印迹结果示于图3。尽管因标签肽而使分子量增大，但即使使用N末端和C末端中任意的标签抗体，也仅检测出一条全长GDF15前肽的条带。

＜实施例5＞GDF15前肽测定试剂的性能评价

作为包含GDF15前肽的样品用FBS分别将实施例4中制作的重组GDPP上清液及前列腺癌细胞株LnCap的培养上清液稀释10倍，作为不包含GDF15前肽的样品，分别制备仅有FBS的共计3种疑似待检体样品。使用全自动辅酶免疫分析装置AIA-2000(Tosoh Corporation制：制造贩卖申报型号13B3X90002000009)实施了实施例4中制作的2种GDF15前肽测定试剂的性能评价。进行基于全自动辅酶免疫分析装置AIA-2000的如下测定：

(1)将稀释样品20μL和包含表面活性剂的稀释液80μL自动分注在收纳有实施例3中制作的GDF15前肽测定试剂的容器中，

(2)在37℃恒温下进行10分钟的抗原抗体反应，

(3)用包含表面活性剂的缓冲液进行8次清洗，

(4)添加4-甲基伞形酮磷酸盐，

由此将每单位时间的由碱性磷酸酶产生的4-甲基伞形酮的浓度作为测定值(nmol/(L·s))。AIA测定的结果是：FBS除外的任意的疑似待检体样品均显示出5处测定的变动系数为3％以下，证实了通过实施例3中制作的GDF15前肽测定试剂得到的结果是值得信赖的结果。

＜实施例6＞临床待检体的测定

本实施例中使用的血清待检体面板(总计123病例)的明细示于表4。健康的人血清待检体由Bioreclamation IVT公司购买，各种癌症血清待检体由PROMEDDX公司购买，各公司的制品随附资料明确记载了经伦理委员会批准的方案中所收集的内容。

[表4]

将全自动辅酶免疫分析装置AIA-2000(Tosoh Corporation制)作为评价用装置，使用实施例3中制作的iGDPP和tGDPP测定试剂来测定临床待检体。将各种测定值的箱形图(Box Plot)示于图4，将各待检体组的iGDPP、tGDPP测定值的最小值、25百分比、中央值、75％百分比、最大值和95％置信区间内的测定值范围示于表5。

与健康组相比，在任意的癌症种类的组中iGDPP和tGDPP测定值均明显显示出高值，特别是在作为消化系统的主要癌症种类的胰腺癌和大肠癌中观察到测定值高的倾向。

[表5]

接着，将iGDPP和tGDPP的健康的人组与各种癌症待检体组之间的受试者工作特征(ROC)曲线解析的结果示于图5，将AUC(Area Under the Curve、ROC曲线下面积)和显著差异检验中的P值示于表6。iGDPP和tGDPP在任意的癌症种类中观察到与健康的人存在统计学上的显著差异，证实具有优异的癌症检测性能。特别是，在肺癌、胰腺癌和大肠癌中，AUC为0.9以上，说明对于健康与癌症的鉴别是极其有用的。

[表6]

＜实施例7＞与CA19-9的性能比较

对作为消化系统癌症的代表性的标记物的CA19-9与iGDPP和tGDPP的消化系统癌症检测性能进行了比较。通过CA19-9(Tosoh Corporation制：制造贩卖申报型号20400AMZ00913000)测定试剂，将实施例6中测定的对健康、胰腺癌和大肠癌血清待检体进行解析的结果示于图6，将基于健康与胰腺癌或大肠癌的ROC解析求出的AUC和显著差异检验中的P值示于表7。与健康组相比，CA19-9在胰腺癌组或大肠癌组中显示出高值倾向，基于ROC解析也显示出为优异的消化系统系肿瘤标记物。另一方面，与CA19-9相比，iGDPP或tGDPP显示出胰腺癌和大肠癌检测性能优异。

[表7]

＜实施例8＞iGDPP、tGDPP和CA19-9的灵敏度和特异性的计算

使用实施例6和7所示的iGDPP、tGDPP和CA19-9的ROC解析结果，计算出各种标记物的灵敏度和特异性。将由Youden Index(灵敏度-(100-特异性))的最大值导出的灵敏度和特异性、以及截止值示于表8。iGDPP以及tGDPP在肺癌、胰腺癌和大肠癌中灵敏度和特异性均为85％以上，证实具有优异的癌症检测性能。另外，iGDPP以及tGDPP显示出与CA19-9相比胰腺癌以及大肠癌的检测性能优异。进而，证实了iGDPP以及tGDPP在CA19-9阴性胰腺癌待检体3例中有3例、在CA19-9阴性大肠癌待检体8例中有6例检测为阳性。

[表8]

＜实施例9＞临床待检体的测定(食道癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌)

将本实施例中使用的血清待检体面板(总计120病例)的明细示于表9。健康的人血清待检体由BioreclamationIVT公司购买，各种癌症血清待检体由PROMEDDX公司或BioreclamationIVT公司购买，各公司的制品随附资料明确记载了经伦理委员会批准的方案中所收集的内容。

[表9]

将全自动辅酶免疫分析装置AIA-2000(Tosoh Corporation制)作为评价用装置，使用实施例3中制作的iGDPP和tGDPP测定试剂来测定上述临床待检体。将各种测定值的箱形图(Box Plot)示于图7，将各待检体组的iGDPP、tGDPP测定值的最小值、25百分比、中央值、75％百分比、最大值和95％置信区间内的测定值范围示于表10。

与健康组相比，iGDPP和tGDPP测定值在食道癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌的任意癌症种类组中均明显显示出高值。

[表10]

接着，将基于iGDPP和tGDPP的健康的人组与食道癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌组之间的ROC曲线解析计算出的AUC和显著差异检验中的P值示于表11。iGDPP和tGDPP在任意的癌症种类中AUC均为0.9以上，观察到统计学上的显著差异，因此证实了具有优异的癌症检测性能。

[表11]

＜实施例10＞食道癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌中的iGDPP、tGDPP的灵敏度和特异性的计算

使用实施例9所示的iGDPP和tGDPP的ROC曲线解析结果，计算出各种标记物的灵敏度和特异性。将由Youden Index(灵敏度-(100-特异性))的最大值导出的灵敏度和特异性、以及截止值示于表12。iGDPP以及tGDPP在食道癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌组中灵敏度和特异性均为85％以上(iGDPP对胃癌的灵敏度除外)，证实具有优异的癌症检测性能。

[表12]

＜实施例11＞食道癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌中的iGDPP、tGDPP和CEA的阳性率的比较

对作为全部癌症的代表性的标记物的CEA与iGDPP和tGDPP的食道癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌中的阳性率进行比较。通过CEA测定试剂(Tosoh Corporation制：制造贩卖申报型号20100EZZ00112000)，对实施例9记载的食道癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌症待检体进行了解析。计算出CEA为截止值5ng/mL以上，iGDPP和tGDPP通过实施例10记载的截止值计算出阳性率。将CEA测定值的箱形图示于图8，将阳性率一览表示于表13。虽然观察到CEA在各种癌症种类有上升倾向，但与CEA相比iGDPP以及tGDPP在食道癌、胃癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌组中阳性率高2倍左右，证实具有优异的癌症检测性能。

[表13]

＜实施例12＞肺癌中的iGDPP、tGDPP和CEA的组织型鉴别性能的比较

肺癌的组织型主要分为非小细胞(约85％)和小细胞(约15％)，根据组织型而治疗方针不同，因此认为组织型的鉴别是重要的。因此，对iGDPP、tGDPP和CEA的非小细胞肺癌与小细胞肺癌的组织型鉴别性能进行了比较。将CEA、iGDPP和tGDPP的非小细胞肺癌或小细胞肺癌待检体组的比较解析结果示于图9，将ROC曲线解析结果示于图10。虽然CEA在非小细胞肺癌中显示出高值倾向，但未观察到显著差异(曼-惠特尼U检验、p＝0.9747)。另一方面，iGDPP和tGDPP在小细胞肺癌中显示出高值倾向，iGDPP观察到显著差异(曼-惠特尼U检验、p＝0.0452)。在ROC曲线解析中，CEA的AUC为0.5，显示出不具有鉴别性能，而iGDPP和tGDPP的AUC为0.7左右，显示出具有良好的鉴别性能。

参照特定的实施方式对本发明进行了详细地说明，但对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以进行各种变更和修改。

需要说明的是，将2017年8月30日申请的日本专利申请2017-165409号的说明书、序列表、权利要求书、附图和说明书摘要的全部内容引用至此，作为本发明的说明书的公开内容而引入。

产业上的可利用性

根据本发明，提供能够检测肺癌、胰腺癌、大肠癌、乳腺癌、食道癌或胃癌；或者鉴别并检测非小细胞肺癌与小细胞肺癌的、GDF15前肽检测的方法和试剂。由此，能够通过血液诊断等简便且高精度高地检测现有的标记物中难以判别的各种癌症。其结果，由于能使癌症的检测变得简便，能够进行治疗法的选择以及治疗效果判定，因此在工业上非常有用。

序列表（SEQUENCE LISTING）

<110> 东曹株式会社（TOSOH corporation）

<120> 检测癌症的方法和检测试剂

<130> 217-0091WO

<150> JP2017-165409

<151> 2017-08-30

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1220

<212> DNA

<213> 智人(Homo Sapiens)

<220>

<221> CDS

<222> (33)..(956)

<400> 1

agtcccagct cagagccgca acctgcacag cc atg ccc ggg caa gaa ctc agg 53

Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg

1 5

acg gtg aat ggc tct cag atg ctc ctg gtg ttg ctg gtg ctc tcg tgg 101

Thr Val Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu Val Leu Leu Val Leu Ser Trp

10 15 20

ctg ccg cat ggg ggc gcc ctg tct ctg gcc gag gcg agc cgc gca agt 149

Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser

25 30 35

ttc ccg gga ccc tca gag ttg cac tcc gaa gac tcc aga ttc cga gag 197

Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Ser Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu

40 45 50 55

ttg cgg aaa cgc tac gag gac ctg cta acc agg ctg cgg gcc aac cag 245

Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln

60 65 70

agc tgg gaa gat tcg aac acc gac ctc gtc ccg gcc cct gca gtc cgg 293

Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu Val Pro Ala Pro Ala Val Arg

75 80 85

ata ctc acg cca gaa gtg cgg ctg gga tcc ggc ggc cac ctg cac ctg 341

Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly Ser Gly Gly His Leu His Leu

90 95 100

cgt atc tct cgg gcc gcc ctt ccc gag ggg ctc ccc gag gcc tcc cgc 389

Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg

105 110 115

ctt cac cgg gct ctg ttc cgg ctg tcc ccg acg gcg tca agg tcg tgg 437

Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp

120 125 130 135

gac gtg aca cga ccg ctg cgg cgt cag ctc agc ctt gca aga ccc cag 485

Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln

140 145 150

gcg ccc gcg ctg cac ctg cga ctg tcg ccg ccg ccg tcg cag tcg gac 533

Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp

155 160 165

caa ctg ctg gca gaa tct tcg tcc gca cgg ccc cag ctg gag ttg cac 581

Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala Arg Pro Gln Leu Glu Leu His

170 175 180

ttg cgg ccg caa gcc gcc agg ggg cgc cgc aga gcg cgt gcg cgc aac 629

Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn

185 190 195

ggg gac cac tgt ccg ctc ggg ccc ggg cgt tgc tgc cgt ctg cac acg 677

Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly Arg Cys Cys Arg Leu His Thr

200 205 210 215

gtc cgc gcg tcg ctg gaa gac ctg ggc tgg gcc gat tgg gtg ctg tcg 725

Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser

220 225 230

cca cgg gag gtg caa gtg acc atg tgc atc ggc gcg tgc ccg agc cag 773

Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln

235 240 245

ttc cgg gcg gca aac atg cac gcg cag atc aag acg agc ctg cac cgc 821

Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln Ile Lys Thr Ser Leu His Arg

250 255 260

ctg aag ccc gac acg gtg cca gcg ccc tgc tgc gtg ccc gcc agc tac 869

Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr

265 270 275

aat ccc atg gtg ctc att caa aag acc gac acc ggg gtg tcg ctc cag 917

Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln

280 285 290 295

acc tat gat gac ttg tta gcc aaa gac tgc cac tgc ata tgagcagtcc 966

Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp Cys His Cys Ile

300 305

tggtccttcc actgtgcacc tgcgcggagg acgcgacctc agttgtcctg ccctgtggaa 1026

tgggctcaag gttcctgaga cacccgattc ctgcccaaac agctgtattt atataagtct 1086

gttatttatt attaatttat tggggtgacc ttcttgggga ctcgggggct ggtctgatgg 1146

aactgtgtat ttatttaaaa ctctggtgat aaaaataaag ctgtctgaac tgttaaaaaa 1206

aaaaaaaaaa aaaa 1220

<210> 2

<211> 308

<212> PRT

<213> 智人(Homo Sapiens)

<400> 2

Met Pro Gly Gln Glu Leu Arg Thr Val Asn Gly Ser Gln Met Leu Leu

1 5 10 15

Val Leu Leu Val Leu Ser Trp Leu Pro His Gly Gly Ala Leu Ser Leu

20 25 30

Ala Glu Ala Ser Arg Ala Ser Phe Pro Gly Pro Ser Glu Leu His Ser

35 40 45

Glu Asp Ser Arg Phe Arg Glu Leu Arg Lys Arg Tyr Glu Asp Leu Leu

50 55 60

Thr Arg Leu Arg Ala Asn Gln Ser Trp Glu Asp Ser Asn Thr Asp Leu

65 70 75 80

Val Pro Ala Pro Ala Val Arg Ile Leu Thr Pro Glu Val Arg Leu Gly

85 90 95

Ser Gly Gly His Leu His Leu Arg Ile Ser Arg Ala Ala Leu Pro Glu

100 105 110

Gly Leu Pro Glu Ala Ser Arg Leu His Arg Ala Leu Phe Arg Leu Ser

115 120 125

Pro Thr Ala Ser Arg Ser Trp Asp Val Thr Arg Pro Leu Arg Arg Gln

130 135 140

Leu Ser Leu Ala Arg Pro Gln Ala Pro Ala Leu His Leu Arg Leu Ser

145 150 155 160

Pro Pro Pro Ser Gln Ser Asp Gln Leu Leu Ala Glu Ser Ser Ser Ala

165 170 175

Arg Pro Gln Leu Glu Leu His Leu Arg Pro Gln Ala Ala Arg Gly Arg

180 185 190

Arg Arg Ala Arg Ala Arg Asn Gly Asp His Cys Pro Leu Gly Pro Gly

195 200 205

Arg Cys Cys Arg Leu His Thr Val Arg Ala Ser Leu Glu Asp Leu Gly

210 215 220

Trp Ala Asp Trp Val Leu Ser Pro Arg Glu Val Gln Val Thr Met Cys

225 230 235 240

Ile Gly Ala Cys Pro Ser Gln Phe Arg Ala Ala Asn Met His Ala Gln

245 250 255

Ile Lys Thr Ser Leu His Arg Leu Lys Pro Asp Thr Val Pro Ala Pro

260 265 270

Cys Cys Val Pro Ala Ser Tyr Asn Pro Met Val Leu Ile Gln Lys Thr

275 280 285

Asp Thr Gly Val Ser Leu Gln Thr Tyr Asp Asp Leu Leu Ala Lys Asp

290 295 300

Cys His Cys Ile

305

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 分泌的iGDPP正向引物

<400> 3

cgatgacgac aagcttctgt ctctggccga g 31

<210> 4

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 分泌的iGDPP反向引物

<400> 4

cagaactttg cagatatcgg cggcttgcgg ccg 33

<210> 5

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 分泌的dNT37-GDPP正向引物

<400> 5

cgatgacgac aagcttgcaa gtttcccggg acc 33

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 分泌的dNT59-GDPP正向引物

<400> 6

cgatgacgac aagcttcgct acgaggacct g 31

<210> 7

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 分泌的dNT77-GDPP正向引物

<400> 7

cgatgacgac aagcttaaca ccgacctcgt cc 32

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 分泌的dNT94-GDPP正向引物

<400> 8

cgatgacgac aagcttctgg gatccggcgg c 31

Claims

1.一种检测癌症的方法，其中，去势抵抗性前列腺癌除外，所述方法包括：在待检体中，测定完整的生长分化因子即GDF15前肽量。

2.一种检测癌症的方法，其中，去势抵抗性前列腺癌除外，所述方法包括：在待检体中，测定GDF15前肽片段量。

3.一种检测癌症的方法，其中，去势抵抗性前列腺癌除外，所述方法包括：在待检体中，测定完整的GDF15前肽量与GDF15前肽片段量的总计量。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的检测癌症的方法，其为检测胃癌、胰腺癌、大肠癌、肺癌、乳腺癌或食道癌或者鉴别并检测非小细胞肺癌与小细胞肺癌的方法。

5.根据权利要求2或3所述的方法，其中，前述GDF15前肽片段包含以下的(A)和/或(B)所述的GDF15前肽片段：

(A)具有以下的特征的GDF15前肽片段，

(B)具有以下的特征的GDF15前肽片段，

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，利用抗原抗体反应进行所述测定，所述抗原抗体反应使用了识别GDF15前肽的抗体。

7.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，利用质谱分析法进行所述测定。

8.一种用于检测癌症的试剂，其中，去势抵抗性前列腺癌除外，所述试剂包含识别GDF15前肽的抗体。