JP2000506520A - 前立腺特異抗原ペプチド及びその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、例えば遊離及び複合体化前立腺特異抗原の検出に、よって前立腺ガンの診断に使用され得るペプチドに関する。

Description

【発明の詳細な説明】 前立腺特異抗原ペプチド及びその使用 発明の背景 技術分野 本発明は、例えば遊離及び複合体化（ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ）前立腺特異的抗原 （ＰＳＡ）の検出に、よって前立腺ガンの診断に使用され得るペプチドに関する 。従来技術 前立腺特異抗原（ＰＳＡ）は、主に前立腺の上皮細胞より産生される約３０キ ロダルトン（ｋＤ）の低分子量糖タンパク質である。ＰＳＡはヒト組織カリクレ イン遺伝子ファミリーの一員であり、３つの遺伝子、即ちｈＫＬＫ１、ｈＫＬＫ ２及びｈＫＬＫ３からなる。３つの遺伝子のタンパク質産物は、膵−腎臓カリク レイン（ｈＫ１）、ヒト腺性カリクレイン（ｈＫ２）（従来はｈＧＫ−１として 知られていた）及びＰＳＡ（ｈＫ３）である。ＰＳＡはセリンプロテアーゼであ り、疎水性残基で切断するキモトリプシン様特異性を示す（Ｃｈｕら、Ｊ．Ｕｒ ｏｌ． １４１：１５２−５６（１９８９））。他の２つのカリクレイ ンはトリプシン様特異性を有する。上記３つの遺伝子は染色体１９に位置してい る。ＰＳＡ及びｈＫ２はアンドロケン制御下で発現する。ｈＫ２に対するタンパ ク質は単離されておらず、その可能性ある臨床有用性は明らかになっていない（ ＭｃＣｏｒｍａｃｋら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ４５：７２９−４４（１９９５）、係 属中の米国特許出願第０８／３９４，０３３号明細書も参照されたい）。 ＰＳＡは前立腺で産生され、前立腺及び精液中に高濃度で存在する。ＰＳＡは 尿及び血清中にも存在する。正常男性の血清ＰＳＡの濃度は年齢と共に増加する 。良性前立腺肥大（ＢＰＨ）、前立腺症及び前立腺ガンの場合、血清ＰＳＡレベ ルは高い。多くの女性ではＰＳＡは全くまたは殆ど発現しない。精液または前立 腺組織から単離されるＰＳＡは主として３０ｋＤ形態のＰＳＡとして存在するが 、血清中のＰＳＡは種々の形態で存在する。少量の血清ＰＳＡは低分子量もしく は遊離ＰＳＡとして存在する。免疫検出性ＰＳＡの大部分は、ＰＳＡとα−１− 抗キモトリプシン（ＡＣＴ）の１００ｋＤ複合体（複合体化ＰＳＡとしても知ら れている）（ＰＳＡ−ＡＣＴ）として存在する。α−２−マクログロブリンと形 成される他のＰＳＡ複合体は、 現在のイムノアッセイでは検出され得ない。ＰＳＡは、上記プロテアーゼ抑制物 質とそのプロテアーゼ活性サイトを介して複合体を形成する。血清は過剰のプロ テアーゼ抑制物質を含んでいるので（ＭｃＣｏｒｍａｃｋら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ４５：７２９−４４（１９９５）、Ｐａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５２：１ ３５８−６８（１９９４）、Ｌｉｌｊａら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１６１ ８（１９９１）、Ｓｔｅｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２２２（１ ９９１）及びＷＯ９２／０９１３６）、血清中の遊離ＰＳＡは恐らく不活性ＰＳ Ａである。 血清ＰＳＡは前立腺疾患における臨床的に最も有用な腫瘍マーカーとなった。 ＰＳＡは、治療に対する応答性をモニターするために、また前立腺ガンに対する 早期再発を検出するために使用されている。前立腺ガンを放射線、手術またはア ンドロゲン喪失により治療すると、ＰＳＡの血清レベルは低下する。治療後に低 下したレベルは予後及び生存に相関している。根治的前立腺摘除後に使用したと き、治療が成功した後のＰＳＡレベルはゼロまで低下していなければならない。 なぜならば、前立腺がＰＳＡの唯一の主要ソースであるからである。このため、 ＰＳＡは術後の腫瘍再発に対する非常に敏感なマーカーであり得る。ＰＳＡは患 者の段階付けを助けるためにも使用されている。ＰＳＡレベルは腫瘍の大きさと 相関するが、病気を独立して段階付けするには余り正確でないことが判明した。 しかしながら、ＰＳＡレベルは他の臨床及び病理学的パラメーターと組み合わせ ると有用である（Ｐａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５２：１３５８−６８（１ ９９４））。 ＰＳＡの用途が大きく発展し、ＰＳＡを臨床症状が現れる前に前立腺ガンの早 期発見に使用されるようになった。ＰＳＡが使用される以前は、直腸指診（ＤＲ Ｅ）が使用されていた。この方法の感度及び特異性は低かった。加えて、ＤＲＥ により発見された多くの腫瘍は治すにはあまりに大きすぎた。早期発見方法とし てＤＲＥと一緒にＰＳＡを使用することは、幾つかの臨床研究で有効であると確 認されている。典型的には、正常人のＰＳＡの上限値は４．０ｎｇ／ｍｌとされ てきた。このレベルを越えると生検の約３３％は陽性であり、１０ｎｇ／ｍｌを 越えると約６７％が陽性であった。前立腺症または良性前立腺肥大（ＢＰＨ）の 場合、ＰＳＡレベルは４．０ｎｇ／ｍｌを越えることがあり得る。５０歳を過ぎ た多くの男性は幾つかの ＢＰＨの兆候を有している。ＰＳＡの老化特異的参照範囲（ａｇｅ−ｓｐｅｃｉ ｆｉｃ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｒａｎｇｅｓ）が早期発見におけるＰＳＡの使用 を改善するための方法として示唆された（Ｐａｒｋｉｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５ ２：１３５８−６８（１９９４））。 ＤＲＥが正常でＰＳＡが４．０ｎｇ／ｍｌ以下の患者は正常であると見做され 、１０ｎｇ／ｍｌを越える患者は恐らく前立腺ガンを患っているであろうと見做 される。従って、境界領域は４〜１０ｎｇ／ｍｌである。早期発見におけるＰＳ Ａの特異性を向上させるために幾つかの方法が案出された。これらの方法には、 １）老化特異的参照範囲の使用、２）ＰＳＡの経時的変化の使用、３）ＰＳＡ密 度の使用、及び４）ＰＳＡ形態の比率の使用が含まれる。遊離ＰＳＡレベル／総 ＰＳＡレベル比またはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体レベル／総ＰＳＡレベル比を使用す るとガンに対するＰＳＡの特異性を向上し得ることが判明している。これは、前 立腺ガンを患っている患者の血清は、ＢＰＨを患っている男性の血清よりも遊離 ＰＳＡレベルが低い傾向にあるからである（ＭｃＣｏｒｍａｃｋら、Ｕｒｏｌｏ ｇｙ ４５：７２９−４４（１９９５）、Ｐａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ． １５２：１３５８−６８（１９９４）、Ｌｉｌｊａら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３ ７：１６１８（１９９１）、Ｓｔｅｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１： ２２２（１９９１）、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｓｏｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０：１ ００−１０５（１９９３）及びＷＯ ９２／０１９３６）。 本発明のペプチドにより、サンプル中に存在する総ＰＳＡ、遊離ＰＳＡおよび ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体の量を測定するために、よって臨床医の、例えば患者のＢ ＰＨと前立腺ガンを区別し得る能力を向上させるために必要な抗血清を作製する ことができる。その後、的確な治療コースを始めることができる。本発明のペプ チドの上記使用及び他の使用について、更に詳細に以下説明する。 本明細書に記載した米国特許及び刊行物の開示内容はすべて参照により本明細 書に援用されるものとする。 発明の要旨 本発明は、ＰＳＡの領域のアミノ酸配列と同一であり、ｈＫ２のアミノ酸配列 と非同一のアミノ酸を１個以上含むことを特徴とする約１０〜２０個の残基を有 するアミノ酸配列からなる精製ペプチドに関する。或いは、ペプチドの配列はＰ ＳＡ及び ｈＫ２の領域のアミノ酸配列の配列と同一であり得る。これらのペプチドは、例 えば、ＡＢＴ１（配列番号１）、ＡＢＴ２（配列番号２）、ＡＢＴ３（配列番号 ３）、ＡＢＴ４（配列番号４）、ＡＢＴ５（配列番号５）、ＡＢＴ６（配列番号 ６）、ＡＢＴ７（配列番号７）、ＡＢＴ８（配列番号８）、ＡＢＴ９（配列番号 9)、ＡＢＴ１０（配列番号１０）、ＡＢＴ１１（配列番号１１）、ＡＢＴ１２（ 配列番号１２）、ＡＢＴ１３（配列番号１３）、ＡＢＴ１５（配列番号１５）及 びＡＢＴ１６（配列番号１６）からなる群から選択され得る。 また、本発明には、本発明のペプチドによる免疫感作に応答して産生される遊 離ＰＳＡに対して特異的な抗体が含まれる。前記ペプチドの例はＡＢＴ６及びＡ ＢＴ１である。これらのペプチドに対する抗体は、モノクローナルでもポリクロ ーナルでもよい。 更に、本発明は、ＡＢＴ４、ＡＢＴ１４及びＡＢＴ１６からなる群から選択さ れるペプチドによる免疫感作に応答して産生される総ＰＳＡに対して特異的に抗 体に関する。同様に、この抗体はモノクローナルでもポリクローナルでもよい。 更に、本発明は、ＰＳＡを含んでいると疑われる試験サンプ ル中のＰＳＡを検出する方法も包含する。この方法は、 ａ）前記試験サンプルを、抗原／抗体複合体を形成し得るのに十分な時間及び条 件下でペプチドつまり抗原上の少なくとも１つのサイトに特異的に結合する抗体 またはその断片と接触させるステップ、 ｂ）前記ステップａ）で形成した抗原／抗体複合体に、プローブが前記ペプチド つまり抗原上の第２サイトに結合するプローブ抗体を該プローブが結合抗原に結 合し得るのに十分な時間及び条件下で添加するステップ ｃ）結合プローブの量、よって前記試験サンプル中のＰＳＡの量を測定するステ ップ、 を含む。前記ＰＳＡペプチドつまり抗原は、ＰＳＡの領域のアミノ酸配列と同一 であり、ｈＫ２のアミノ酸配列と非同一のアミノ酸を１個以上含む、約１０〜２ ０個の残基を有するアミノ酸配列からなる。例えば、前記ペプチドつまり抗原は ＡＢＴ２、ＡＢＴ４、ＡＢＴ６、ＡＢＴ１、ＡＢＴ７及びＡＢＴ１６からなる群 から選択され得る。ステップａ）の前記抗体を固相に結合させても、ステップｃ ）の前記抗体を放射性同位元素で標識させてもよい。また、１つの抗体が遊離Ｐ ＳＡに対して特異的 であり且つ他の抗体が総ＰＳＡに対して特異的であるか、または両方の抗体が総 ＰＳＡに対して特異的であってもよい。 本発明は、ＰＳＡを含んでいると疑われる試験サンプル中のＰＳＡを検出する 別の方法も包含する。この方法は、 ａ）前記試験サンプルを、抗原／抗体複合体を形成し得るのに十分な時間及び条 件下で少なくとも１つのＰＳＡ由来のペプチドつまり抗原と特異的に結合する抗 体またはその断片と接触させるステップ、 ｂ）前記ステップａ）で形成した試験サンプル−抗体混合物に標識遊離ＰＳＡを 添加するステップ、 ｃ）前記試練サンプル中のＰＳＡと標識遊離ＰＳＡとの競合量を測定することに より、前記試験サンプル中のＰＳＡの量を測定するステップ、 を含む。遊離ＰＳＡを検出する場合にはステップａ）の前記抗体は遊離ＰＳＡに 特異的に結合し、総ＰＳＡを検出する場合にはステップａ）の前記抗体は総ＰＳ Ａに結合する。前記ペプチドつまり抗原はＰＳＡの領域のアミノ酸配列と同一で あり、ｈＫ２のアミノ酸配列と非同一のアミノ酸を１個以上含む、約１０〜２０ 個の残基を有するアミノ酸配列からなる。例えば、 前記ペプチドつまり抗原はＡＢＴ２、ＡＢＴ４、ＡＢＴ６、ＡＢＴ１、ＡＢＴ７ 及びＡＢＴ１６からなる群から選択される。 本発明は、ペプチドによる免疫感作に応答して産生された抗体を収容した容器 を含む試験サンプル中のＰＳＡの存在を調べるためのキットをも包含する。前記 ペプチドは、ＰＳＡの領域のアミノ酸配列と同一であり、ｈＫ２のアミノ酸配列 と非同一のアミノ酸を１個以上含む、約１０〜２０個の残基を有するアミノ酸配 列からなる。抗体を作製するために使用される前記ペプチドは、例えば、ＡＢＴ ２、ＡＢＴ４、ＡＢＴ６、ＡＢＴ１、ＡＢＴ７及びＡＢＴ１６からなる群から選 択され得る。 試験サンプル中のＰＳＡの存在を測定するために使用され得る本発明の別のキ ットは、ａ）ＰＳＡ上の少なくとも１つのサイトに特異的に結合する抗体または その断片、及びｂ）プローブが前記ＰＳＡ上の第２サイトに結合するプローブ抗 体を含む。前記抗体を産生するために使用されるペプチドは、ＰＳＡの領域のア ミノ酸配列と同一であり、ｈＫ２のアミノ酸配列と非同一のアミノ酸を１個以上 含む、約１０〜２０個の残基を有するアミノ酸配列からなる。例えば、前記ペプ チドは、ＡＢＴ２、ＡＢＴ４、ＡＢＴ６、ＡＢＴ１、ＡＢＴ７及びＡＢＴ１６か ら なる群から選択され得る。 本発明は、ａ）ＰＳＡの領域のアミノ酸配列と同一であり、ｈＫ２のアミノ酸 配列と非同一のアミノ酸を１個以上含む、約１０〜２０個の残基を有するアミノ 酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体またはその断片、及びｂ）標識 遊離ＰＳＡを含む試験サンプル中の遊離ＰＳＡの存在を調べるためのキットも包 含する。抗体を作製するために使用される前記ペプチドはＡＢＴ６又はＡＢＴ１ であり得る。 更に、本発明は、ＰＳＡの領域のアミノ配列と同一であり、ｈＫ２のいずれの 領域のアミノ酸配列とも同一である、約１０〜２０個の残基を有するアミノ酸配 列からなるＰＳＡ由来の精製ペプチドが包含される。前記ペプチドの例はＡＢＴ １４（配列番号１４）である。 図面の簡単な説明 図１は設計したＰＳＡペプチドを示す。（Ａ）ＰＳＡの３Ｄモデルでの設計ペ プチドの位置。ペプチドセグメントをＡＢＴ−番号で表示した。（Ｂ）ＰＳＡ及 びｈＫ２（それぞれ、配列番号１７及び１８）の配列及び構造アラインメント。 設計したＰＳＡペプチド配列を、ＡＢＴ−番号で表示した。非相同もし くは非同一残基を、ｈＫ２においてはボールドで、ＰＳＡにおいて影付きで示し た。更に、ｈＫ２配列に由来する２つのｈＫ２ペプチドをｈＫ２ａおよびｈＫ２ ｂと表示した。 図２は、（Ａ）遊離ＰＳＡ特異的モノクローナル抗体及び遊離ＰＳＡを優先的 に検出するモノクローナル抗体の抑制、並びに（Ｂ）遊離ＰＳＡを優先的に検出 する抗体であるｍＡｂ ２Ｅ９の、ＡＢＴ６ペプチド及びＰＳＡに結合するがｈ Ｋ２ｂペプチドには結合しない結合特異性を示す定量曲線を示す。 図３は、（Ａ）ＰＳＡに対する総ＰＳＡ特異的ｍＡｂ結合の、ＡＢＴ４ペプチ ドによる抑制、（Ｂ）ＰＳＡに対する総ＰＳＡ特異的ｍＡｂ結合の、ＡＢＴ１４ 及びＡＢＴ１６ペプチドによる抑制、並びに（Ｃ）ｍＡｂ Ｈ１６４の、ＡＢＴ ４ペプチド及びＰＳＡに結合するがｈＫ２ａペプチドには結合しない結合特異性 を示す定量曲線を示す。 図４は、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗−ＰＳＡ抗血清の合成ＰＳＡペプ チドに対する特異的結合を示す。 図５は、家兎抗−ＡＢＴ６抗血清の、ＡＢＴ６ペプチド及びＰＳＡに結合する がｈＫ２ｂペプチドに結合しない結合特異性を示す定量曲線を示す。 図６は、家兎抗−ＡＢＴ４抗血清の、ＡＢＴ４ペプチド、ＰＳＡ及びｈＫ２ａ ペプチドへの結合アフィニティーを比較する定量曲線を示す。アフィニティーは ＡＢＴ４＞ＰＳＡ＞ｈＫ２ａの順である。 発明の詳細な説明 本発明は、ＰＳＡの領域のアミノ酸配列と同一であり、ｈＫ２のアミノ酸配列 と非同一のアミノ酸を１個以上含む、約１０〜２０個の残基を有するアミノ酸配 列またはその断片からなる精製ペプチドに関する。或いは、ペプチドのアミノ酸 配列は、ＰＳＡの領域及びｈＫ２の領域の配列と同一であり得る。これらのペプ チドは、各種診断及び治療目的で使用することができる。（末端システィン基を 「同一」ペプチドに付加して環化を実施することができることに注目されたい。 「同一」ペプチドをシスティン基を介して担体分子に結合させることもできる。 ） 用語「同一」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の相関度 を表すために使用される。アミノ酸配列の「同一性」を調べるための方法は当業 界で公知であり、例えば当該ペプチドのアミノ酸配列を直接調べ、例えばそれを 本明細書に 記載の配列と比較する方法が含まれる。特に、「同一性」は、２つの物質、例え ば本発明のペプチドとＰＳＡ及び／またはｈＫ２のアミノ酸配列が正確に一致す ることを指す。「非同一」は、当該アミノ酸配列が正確に一致しないことを指す 。ウィスコンシン配列分析パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ）のバージョン８において利用可能なプロ グラム（ウィスコンシン州マディソン、５３７１１に所在のＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐから入手可能）、例えばＧＡＰプログラムを用い て、２つのポリヌタレオチドまたは２つのポリペプチド配列の同一性（及び類似 性）を計算することができる。２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の同一性 を計算するための他のプログラムは当業界で公知である。 本発明のペプチドは、ＰＳＡ及びｈＫ２の３次元モデルを構築し（Ｂｒｉｄｏ ｎら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ４５：８０１−８０６（１９９５）及びＶｉｈｉｎｅｎ ，Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｖｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：１ ２５１−１２５６（１９９５））、次いで前記モデル中の露出（ｅｘｐｏｓｅｄ ）領域のいずれが特定の特徴を有しているかを決定 することにより選択された。 より詳しくは、標準的な比較方法を使用して結晶学的同等物及びセリンプロテ アーゼファミリー中の同族物のアミノ酸配列から推定することにより、ＰＳＡモ デルをまず作製した。 続いて、直接視覚化して分子の表面近くにあると思われるペプチドを選択した 。すなわち、露出表面ペプチドに対する抗体は前記ペプチドに容易に結合し得る 。タンパク質中に隠れている残基は選択しなかった。 更に、本明細書に記載されているペプチドを選択する際の基準として第２構造 物を使用した。より詳しくは、好ましくはβターン及び突出ループを有している ペプチドを選択した。なぜならば、前記した構造特徴は免疫学的応答の発生と相 関しているからである（例えば、Ｋｒｃｈｎａｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎＥｎ ｚｙｍｏｌｏｇｙ １７８：５８６−６１１（１９８９）参照）。 高フレキシブル性及び高親水性も考慮した。前記特徴は免疫原性と関連し、従 って抗体の産生を引き出す能力に関連している。特に、Ｋａｒｐｌｕｓ及びＳｈ ｕｌｔｚの方法を用いて高フレキシブル性を予測した（Ｋａｒｐｌｕｓら、Ｎａ ｔｕｒｗ ｉｓｓｅｎｓｃｈａｆｔｅｎ ７２：２１２−１３（１９８５）参照）。Ｈｏｐ ｐ及びＷｏｏｄｓの方法を用いて高親水性を予測した（Ｈｏｐｐら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：３８２４−２８（１９９１）参照 ）。 選択過程で考慮した他の因子には、ペプチド中に元々存在するジスルフィド橋 の存在及び／またはペプチド内にジスルフイド橋を付加してもβコイルまたはタ ーンが正しいコンフォメーションで保持され得る可能性が含まれる。前記特性に より、環化ペプチドはＰＳＡタンパク質の３次元立体配置により近似し、従って 前記特徴は選択過程で有用であった。 ペプチドを上記基準に基づいて３次元モデルから選択したら、選択した１６個 の配列を線状コンフォメーションで合成した。数個の配列は環状コンフォメーシ ョンでも作製した。前記した環状形態は線状のものよりもより良好な免疫原とし て作用し得る。 ペプチドの表示、そのアミノ酸配列及び分子量を下記表１に示す。表１ 合成ＰＳＡペプチド ＭＳ＝マススペクトル分析法 上記したペプチドのすべてがＰＳＡと反応性のモノクローナルまたはポリクロ ーナル抗体を作製するために使用され得るが、７個のペプチド、即ちＡＢＴ４、 ＡＢＴ１４、ＡＢＴ６、ＡＢＴ１、ＡＢＴ２、ＡＢＴ１６及びＡＢＴ７が幾つか の公知の抗−ＰＳＡモノクローナル抗体に対する特異的結合を示し、よって、例 えばエピトープ特異的ポリクローナル及びモノクローナ ル抗体を引き出すための免疫原として使用され得る。エピトープ特異的ポリクロ ーナル抗体は、免疫原性（免疫応答を引き出すことができる性質）を有する親タ ンパク質由来のアミノ酸残基の小セグメントに相当する免疫原で産生される抗体 である。小セグメント、即ちペプチドはエピトープであると見做される。 上記した７個のペプチドの構造及び特性は以下の通りである。 ＡＢＴ６はＰＳＡの３次元モデルにおいてＰＳＡの活性サイトの触媒三つ組（ ｃａｔａｌｙｔｉｃ ｔｒｉａｄ）近くに突出ループとして存在する（図１Ａ参 照）。ＡＢＴ６はＰＳＡ−ＡＣＴ複合体中のＡＣＴによりブロックされるＰＳＡ 特異的エピトープを含み、そのアミノ酸配列はｈＫ２と同一でない。また、ＡＢ Ｔ６は免疫原性でもあり、よって抗体を産生する能力を有している（図５参照） 。 ＡＢＴ１はＡＢＴ６の短型である。ＡＢＴ１はＡＢＴ６と同じ配列を有するが 、ＡＢＴ６のＮ−末端の５個のアミノ酸（ＭＳＬＬＫ）及びＣ−末端のセリンア ミノ酸が含まれていない（図１Ｂ参照）。抑制試験で、ＡＢＴ１は、９Ｂ１０抗 体（抑制率４０％）、６：３抗体（抑制率２３％）及び３０：５抗体（抑制率５ ０％）の３つのモノクローナル抗体を抑制した。ＡＢＴ ６と同様に、ＡＢＴ１はｈＫ２と非同一の４個のアミノ酸を含む。従って、ＡＢ Ｔ１はＰＳＡ−ＡＣＴ複合体中のＡＣＴによりブロックされるＰＳＡ特異的エピ トープである。 ＡＢＴ４はＰＳＡの３次元モデルにおいて触媒３つ組から離れてループ及びβ シート構造として存在する。ＡＢＴ４はＰＳＡ−ＡＣＴ複合体中のＡＣＴにより ブロックされないＰＳＡ特異的エピトープであり、ｈＫ２と非同一のアミノ酸配 列を有する。ＡＢＴ４は免疫原性でもある（図６参照）。 ＡＢＴ１４はＰＳＡのＮ−末端に存在する。ＡＢＴ１４はＰＳＡのエピトープ を含み、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体中のＡＣＴによりブロックされない。そのアミノ 酸配列はＰＳＡ及びｈＫ２と同一である（図１Ｂ参照）。 ＡＢＴ１６はＰＳＡの３次元モデルにおいてαヘリックス構造として存在する 。ＡＢＴ１６はＰＳＡ−ＡＣＴ複合体中のＡＣＴによりブロックされないエピト ープを含み、ｈＫ２のアミノ酸配列との同一性を欠くためにＰＳＡ特異的であり 得る（図１Ｂ参照）。 ＡＢＴ２はＰＳＡの３次元モデルにおいてループ構造として存在する。ＡＢＴ ２はＰＳＡ−ＡＣＴ複合体中のＡＣＴにより ブロックされないエピトープである。このエピトープはｈＫ２のアミノ酸配列と の同一性を欠くためにＰＳＡ特異的であり得る（図１Ｂ参照）。 ＡＢＴ７はＰＳＡの３次元モデルにおいて触媒３つ組から離れた所にループ構 造として存在する。ＡＢＴ７はＰＳＡ−ＡＣＴ複合体中のＡＣＴによりブロック されないエピトープであり、ｈＫ２のアミノ酸配列との同一性を欠くためにＰＳ Ａ特異的であり得る（図１Ｂ参照）。 特に、遊離ＰＳＡに対して特異的な抗体と反応性の本発明のペプチド（すなわ ち、「遊離ＰＳＡ関連エピトープ」）は、ペプチド−担体タンパク質または他の 免疫原性形態での注入によるポリクローナル及びモノクローナル系の抗体（すな わち、遊離特異的抗体）を作製するために使用され得る。前記した遊離ＰＳＡ関 連エピトープとしてはＡＢＴ６及びＡＢＴ１が例示される。適当なペプチド担体 タンパク質には、例えば免疫原性であるように十分な分子量を有するタンパク質 が含まれる。その非限定例として、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペット ヘモシアニン、オボアルブミン、及びペプチドが複数結合し得る合成担体（例え ば、ポリ−Ｌ−リシンまたはポリ−Ｌ−グル タミン）が挙げられる。（ペプチドの担体への結合による抗血清作製についての 概説は、Ｊ．Ｗａｌｋｅｒ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂ ｉｏｌｏｇｙ、３２巻、３８９−４００頁（１９９４）を参照されたい。） また、総ＰＳＡに対して特異的な抗体と反応性の本発明のペプチド（すなわち 、「総ＰＳＡ関連エピトープ」）は、ペプチド−担体タンパク質または他の免疫 原性形態での注入によるポリクローナル及びモノクローナル系の「総ＰＳＡ抗体 」を作製するために使用され得る。前記した総ＰＳＡ関連エピトープとしてはＡ ＢＴ４，ＡＢＴ１４及びＡＢＴ１６が例示される。 「遊離関連」抗体またはエピトープは、ＰＳＡ−抑制物質複合体に比較して、 遊離ＰＳＡに対して部分的なもしくは実質的に全体的な特異性を示す抗体及び該 抗体に関連するエピトープであることに留意すべきである。前記したＰＳＡ−抑 制物質複合体の最も一般的なものはＰＳＡ−α−１−抗キモトリプシン（ＰＳＡ −ＡＣＴ）及びＰＳＡ−α−２−マクログロブリン（ＰＳＡ−Ａ２Ｍ）である。 一方、「総」ＰＳＡ抗体またはエピトープは、ＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴ複合 体の両方に対して有意に同等に結合する能力 を示す抗体及び該抗体に関連するエピトープである。 遊離及び総ＰＳＡのレベルを測定し得ることは非常に重要な利点である。上記 したように、前立腺患者の場合、遊離ＰＳＡ／総ＰＳＡ比はＢＰＨ患者に比して 低い。直腸指診の結果に加えて遊離／総ＰＳＡ比を測定することは、前立腺ガン の早期発見を助け、必要な生検数を減らす（ＭｃＣｏｒｍａｃｋら、Ｕｒｏｌｏ ｇｙ ４５：７２９−４４（１９５５）、Ｐａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５ ２：１３５８−６８（１９９４）、Ｌｉｌｊａら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７： １６１８（１９９１）、Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅｓｓｏｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５０ ：１００−１０５（１９９３））。 本発明は、本発明のペプチドに応答して産生される抗体または本発明のペプチ ドに対する抗体を含むキットを包含する。前記抗体は、例えば１個以上の前記ペ プチドによる免疫感作に応答して産生され得る。 「総ＰＳＡ」は、イムノアッセイの、免疫学的に検出可能な形態のＰＳＡ、特 に遊離ＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴ複合体（この２つが血清中の最も一般的な形態 である）を認識する能力を示すために使用される。遊離ＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣ Ｔ複合体 の割合はヒトにより異なるので、両方の形態を検出するためには総ＰＳＡアッセ イは必要である（ＭｃＣｏｒｍａｃｋら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ４５：７２９−４４ （１９９５）及びＰａｒｔｉｎら、Ｊ．Ｕｒｏｌ．１５２：１３５８−６８（１ ９９４））。 また、ｈＫ２と非同一の本発明の遊離ＰＳＡ関連及び総ＰＳＡ関連ペプチドは 、ペプチド−担体タンパク質または他の免疫原性形態での注入によるポリクロー ナル及びモノクローナル系の、遊離ＰＳＡまたは総ＰＳＡに対するＰＳＡ特異性 ，非−ｈＫ２交差反応性抗体を産生するために使用され得る。（ＰＳＡ及びｈＫ ２はアミノ酸及び構造の点でかなり同一であるので交差反応性でない抗体を産生 することは難しい。） 加えて、遊離ＰＳＡ特異的イムノアッセイは、上記した遊離ＰＳＡ特異的抗体 及び総ＰＳＡ抗体の組合せを使用することにより構成され得る。（本発明の総Ｐ ＳＡ抗体の代りに現在入手可能な総ＰＳＡ抗体を使用することができる。） 特に、サンドイッチアッセイでは、１つの遊離特異的抗体及び１つの本発明の 適当なペプチドを用いて産生される総ＰＳＡ抗体が使用され得る。ＰＳＡに対す る典型的な２ステップサンドイッチアッセイは、担体（例えば、微量定量プレー ト、ポリ スチレンビーズ及びラテックス微粒子）に固定化されたＰＳＡに第１抗体を添加 し、そこにＰＳＡを含む標本、コントロールまたは検量物質を添加することから なる。サンプル中のＰＳＡはインキュベーション中に担体結合ＰＳＡ抗体に結合 する。非結合物質を、例えば緩衝液による洗浄により除去する。次いで、ＰＳＡ に対するプローブ抗体を添加すると、インキュベーション中に該抗体はＰＳＡ上 の第２サイトに結合する。過剰のプローブ抗体を緩衝液による洗浄により除去す る。前記プローブ抗体を放射性同位元素、例えばＩ¹²⁵または酵素、例えば西洋 ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはグルコースオキシダー ゼで標識してもよい。ＰＳＡにより結合されるプローブの量を、放射能レベルを 測定することにより、または酵素基質を添加し、形成された生成物を検出するこ とにより測定することができる。次いで、既知のＰＳＡレベルを有する標準物質 を用いて検量曲線からＰＳＡの量を決定する。 本発明は、上記サンドイッチアッセイを実施するために使用され得るキットを 包含する。前記キットは、例えば、ＰＳＡ上の少なくとも１つのサイトに特異的 に結合する抗体またはその断片とＰＳＡ上の第２サイトに結合するプローブ抗体 を含み得 る。前記した抗体は本発明のペプチドを用いて作製され得る。 １ステップアッセイでは、捕捉抗体、プローブ抗体及びＰＳＡ含有サンプルを １回のインキュベーションステップで結合させ、洗浄ステップ及び読取りステッ プがそれに続く。遊離ＰＳＡ特異的アッセイの場合には、プローブまたは担体抗 体のいずれかが遊離特異的でなければならない（Ｃｈａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅ ｍ． ３３：１９１６−１９２０（１９８７）、Ａｍｂｒｕｓｔｅｒ、Ｃｌｉｎ． Ｃｈｅｍ． ３９：１８１−１９５（１９９３）、Ｌｉｌｊａら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈ ｅｍ． ３７：１６１８（１９９１）及びＣｈｒｉｓｔｅｎｅｓｓｏｎら、Ｊ．Ｕ ｒｏｌ． １５８：１００−１０５（１９９３））。 更に、本発明のペプチドは、遊離ＰＳＡに対する競合アッセイのための抗体を 作製するために使用され得る。より詳しくは、前記アッセイは、１つの遊離特異 的抗体及び標識遊離ＰＳＡを使用することを含む。（より好都合ならば、標識遊 離ＰＳＡの代わりに標識遊離ペプチドを使用することができる。） 遊離ＰＳＡに対する競合アッセイでは、サンプル、コントロールまたは検定物 質を遊離ＰＳＡに対する抗体とインキュベートする。このステップ後またはこの ステップと同時に、放射性 標識した精製遊離ＰＳＡを添加する。（放射性標識を使用することに加えて、Ｐ ＳＡを、酵素、または化学発光または蛍光を発する化学物質のような他のリポー ター分子で標識してもよい（例えば、Ｃｈａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３３： １９１６−２０（１９８７）参照））。遊離ＰＳＡ抗体に対する第２抗体（例え ば遊離ＰＳＡ抗体がマウスモノクローナルならばヤギ抗−マウスＩｇＧである） を添加して、遊離ＰＳＡ抗体及び結合しているＰＳＡを沈殿させる。或いは、第 ２抗体を固相、例えばラテックス微粒子またはポリスチレンビーズに結合させて もよい。混合物を緩衝液で洗浄し、放射能の量を測定する。サンプル中のＰＳＡ の量を、標識ＰＳＡの結合に対するサンプル中のＰＳＡの競合量を比較すること により測定する。ＰＳＡ濃度は、既知レベルのＰＳＡを含む標準物質からなる検 定曲線を用いて決定される（Ｃｈａｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３３：１９１６ −１９２０（１９８７））。 本発明は、上記した競合アッセイ成分を利用するキットも包含する。より詳し くは、前記キットは本発明のペプチドの少なくとも１つに結合する抗体またはそ の断片を含有し得る。前記キットは、例えば標識遊離ＰＳＡを含み得る。 総ＰＳＡ特異的イムノアッセイは、２つの本発明のペプチドに対する総ＰＳＡ関 連抗体を組み合わせて使用することにより構成され得る。前記抗体の１方もしく は両方が非−ｈＫ２交差反応性抗体であってもよい。或いは、前記した抗体のう ちの１つを現在入手可能な総ＰＳＡ抗体と組み合わせて使用してもよい。（非− ｈＫ２交差反応性抗体を使用することによりＰＳＡの非−ｈＫ２交差反応アッセ イを構成し得る。）総ＰＳＡ特異的アッセイは遊離ＰＳＡサンドイッチアッセイ に関して上記したように実施されるが、ただし両方の抗体は総ＰＳＡと反応性で なければならない。両抗体が総ＰＳＡ及びｈＫ２と反応性である場合には、構成 したアッセイでＰＳＡ及びｈＫ２を検出する。プローブまたは捕捉抗体のいずれ かがＰＳＡに対して特異的（非−ｈＫ２反応性）であるときには、アッセイは総 ＰＳＡのみを検出する。第１フォーマットの利点は、前立腺により産生される両 方のカリクレイン（即ち、ＰＳＡ及びｈＫ２）か検出されることである。第２フ ォーマットの利点は、アッセイがＰＳＡ分子に対してのみ特異的であることであ る。 また、総ＰＳＡに対する競合アッセイは、１つの本発明のペプチドに対する総 ＰＳＡ抗体または１つの本発明のペプチドに 対するＰＳＡ特異性，非ｈＫ２交差反応性抗体と標識遊離または複合体化ＰＳＡ を使用して構成され得る。前記アッセイでは標識遊離ＰＳＡの代わりに標識遊離 ペプチドを使用することができる。（非ｈＫ２交差反応性抗体を使用することに よりＰＳＡ，非−ｈＫ２交差反応アッセイが構成される。）アッセイの諸ステッ プは競合遊離ＰＳＡアッセイの場合と同一であるが、遊離ＰＳＡに対する抗体の 代わりに総ＰＳＡ抗体または総ＰＳＡ，非−ｈＫ２反応性抗体を使用する。 更に、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体に対するイムノアッセイは、総ＰＳＡ抗体（恐ら く非−ｈＫ２交差反応性抗体であり得る）を使用して構成され、現在入手可能な ＡＣＴに対する抗体を用いてサンドイッチを形成し得る。上記したように、ＰＳ Ａ−ＡＣＴ複合体は、血清中の主要なＰＳＡ形態である。ＰＳＡ−ＡＣＴに対す るアッセイは、１つの型の分子が検出される点で総ＰＳＡアッセイよりもより特 異的である。従って、遊離ＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣＴに対するアッセイを使用し て、２つの主要なＰＳＡ形態を別個に検出することが可能である。 前立腺ガンを患っている患者の場合、ＰＳＡ−ＡＣＴレベルがＢＰＨ患者より も高いので、ＰＳＡ−ＡＣＴ／総ＰＳＡ比を 使用すると前立腺ガンの早期発見においてＰＳＡの特異性が向上することが判明 している（Ｓｔｅｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：２２２−２６（１ ９９１）及びＳｔｅｎｍａｎら、Ｌａｎｃｅｔ ３３４：１５９４−１５９８（ １９９４))。 加えて、本発明のペプチドは単独で、またはタンパク質（例えば、ウシ血清ア ルブミン、キーホールリンペットヘモシアニンまたはオボアルブミン）のような 担体または化学骨格（例えば、ポリ−Ｌ−リシンまたはポリ−Ｌ−グルタミン） に結合させて使用され得る。競合アッセイでは、アッセイに対するコントロール として（または検量物質として）ペプチドまたはペプチド担体をＰＳＡの代わり に使用して、抗−ＰＳＡペプチドを抑制することができる。サンドイッチアッセ イでは、共通の担体骨格に結合させた２つのペプチドを使用して、該２つのペプ チドに対する抗体を使用するアッセイにおいてサンドイッチし得る２つのペプチ ドを含む二価分子（二価ペプチドコントロールまたは検量物質）を作製し得る。 前記した人工コントロールを使用するとき、二価ペプチドコントロールをサンプ ルとして含め、そのレベルをアッセイの正当性をみるためにモニターする。更に 、二価ペプチドの検量物質としての使用に関して、各 種濃度の二価ペプチドを使用してアッセイのための検量曲線を作製し得る。潜在 的な利点は、安定性、製造コスト及び明確に規定されたコントロールまたは検量 物質の使用である。 また、ｈＫ２の領域の配列を有するペプチドを使用して、ペプチド−担体タンパ ク質または他の免疫原性形態での注入によるポリクローナル及びモノクローナル 系の、ｈＫ２特異的抗体を作製することができる。更に、ｈＫ２に対して特異的 なイムノアッセイは、上記したｈＫ２特異的抗体の組合せを用いて、または上記 抗体の１つと総ＰＳＡ抗体（この抗体がｈＫ２交差反応性であるならば）の組合 せを用いて構成され得る。より特定的には、１つまたは２つのｈＫ２特異的抗体 を使用するサンドイッチアッセイフォーマットまたは１つのｈＫ２特異的抗体ア ッセイは、１つのｈＫ２特異的抗体及び標識ｈＫ２またはｈＫ２ペプチドを用い て構成される（ＷＯ ９５／０３３３４参照）。従って、上記アッセイはすべて 、本発明のペプチドが選択されたＰＳＡ分子の領域に相当するｈＫ２ペプチドを 用いて実施され得る。 更には、上記したｈＫ２ペプチドは単独で、またはタンパク質（例えば、ウシ 血清アルブミン、キーホールリンペットヘモ シアニンまたはオボアルブミン）または化学骨格（例えば、ポリ−Ｌ−リシンま たはポリ−Ｌ−グルタミン）に結合させた組合せとして使用され得ることに留意 すべきである。競合アッセイでは、ペフチドまたはペプチド担体をアッセイのた めのコントロールとして（または検量物質として）使用して、抗−ｈＫ２ペプチ ド抗体を抑制することができる。ｈＫ２に対するサンドイッチアッセイでは、共 通の担体骨格に結合させた２つのｈＫ２ペプチドを使用して、該ペプチドに対す る抗体を使用するアッセイにおいてサンドイッチし得る二価ペプチドコントロー ルまたは検量物質を作製することができる。二価ペプチドを人工コントロールと して使用するときには、二価ペプチドコントロールをサンプルとして含ませ、そ のレベルをアッセイの正当性をみるためにモニターする。二価ペプチドを検量物 質として使用するときには、各種濃度の二価ペプチドを使用してアッセイのため の検量曲線を作製することができる。潜在的な利点は、安定性、製造コスト及び 明確に規定されたコントロールまたは検量物質の使用である。 ＰＳＡに対して産生されるポリクローナル抗体は、遊離及び総ＰＳＡの両方に 対して反応性の抗体を含むことに留意すべき である。ポリクローナル抗−ＰＳＡ抗体中の遊離特異的抗体は、固相（例えば、 臭化シアノゲン活性化セファロースＣＬ４Ｂ）に結合させた本発明の遊離特異的 ペプチド（例えば、ＡＢＴ６またはＡＢＴ１）を含有するカラムに結合され得る 。（ペプチドカラムを使用する抗血清の精製についての概説は、Ｍ．Ｍａｎｓｏ ｎ編、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１０巻、 ３９−４１頁（１９９２）を参照されたい。）非−遊離ペプチド特異的抗体を、 緩衝液を用いてカラムから洗い出す。次いで、遊離特異的抗体を高もしくは低− ｐＨまたはカオトロピック物質を用いて溶離して、遊離ＰＳＡに対するアッセイ で使用され得る遊離特異的ポリクローナル抗体を生じさせる。 或いは、総ＰＳＡに対するエピトープ特異的抗体は、ポリクローナル抗血清か ら精製され得る。例えば、ペプチドＡＢＴ４、ＡＢＴ１４またはＡＢＴ１６は、 固相担体に結合され得、カラムを作製するために使用され得る。ペプチドに反応 性のポリクローナル抗体はカラム上のペプチドに結合し、非反応性ペプチドは緩 衝液を用いてカラムから洗い出される。次いで、結合ポリクローナル抗体を高も しくは低ｐＨまたはカオトロピック物 質を用いて溶離して、ペプチドエピトープに特異的なポリクローナル抗体を生じ させる。上記抗体は、遊離ＰＳＡに対して偏っている現在のサンドイッチアッセ イポリクローナルアッセイ（係属中の米国特許出願第０８／１７４，９６４号明 細書参照）とは対照的に、イムノアッセイに使用して遊離ＰＳＡ及びＰＳＡ−Ａ ＣＴに対して同等に反応し得るアッセイを構成することができる。遊離ＰＳＡ及 びＰＳＡ−ＡＣＴの割合はヒトにより異なるので、遊離ＰＳＡ及びＰＳＡ−ＡＣ Ｔを同等に測定することに理論的利点がある（ＭｃＣｏｒｍａｃｋら、Ｕｒｏｌ ｏｇｙ ４５：７２９−４４（１９９５）、Ｓｔａｍｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ ７ ４：１６６２−６６（１９９４）及びＳｔａｍｅｙ、Ｕｒｏｌｏｇｙ ４５：１ ７３−８４（１９９５））。 本発明のペプチドを用いて作製した抗−ＰＳＡ抗体は、免疫組織化学的方法に より正常、良性またはガン組織の凍結またはパラフィン切片または細胞系中のＰ ＳＡを検出するために使用することができる。例えば、標識抗血清を当該サンプ ルに添加後、インキュベーション及び洗浄ステップを行い得る。（適当な標識の 非限定例には、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼまたはペルオ キシダーゼのような酵素、Ｉ¹²⁵の ような放射性標識、またはフルオレセインイソチオシアネートのような蛍光色素 が含まれる。）次いで、ＰＳＡの存在を、酵素標識抗体の場合には発色団由来の 吸光度、放射性標識抗体の場合には放射線減衰、または蛍光色素標識抗体の場合 には蛍光を検出することにより評価する。他の標識及び検出方法も使用すること ができる。 更に、本発明のペプチドは抗体を産生するので、前記ペプチドは哺乳動物用ワ クチンにも使用され得る。 以下の非限定的実施例を使用して、本発明を例示する。 実施例Ｉ ペプチドの設計、合成及びエピトープマッピング Ａ．ペプチド設計法： 仮想ペプチドエピトープを、ＰＳＡの分子モデル及びアミノ酸配列アラインメ ント（Ｂｒｉｄｏｎら、Ｕｒｏｌｏｇｙ ４５：８０１（１９９５）及びＶｉｈ ｉｎｅｎ，Ｍ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２ ０４：１２５１−１２５６（１９９４））に基づいて設計した。ＰＳＡの３次元 モデルから設計した１６個のペプチドの位置を図１Ａに示す。ＰＳＡ及びｈＫ２ のオリジナルのタンパク質配列アラインメン トは、ウィスコンシン配列分析パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｓｅｑｕｅｎ ｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｐａｃｋａｇｅ、ウィスコンシン州マディソン，Ｓｕ ｉｔｅ Ｂ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒ ｅｓｅａｒｃｈ Ｐａｒｋに所在のＧｅｎｅｔｉｃ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏ ｕｐ）のＰｉｌｅｕｐから得た。次いで、上記アラインメントを更にＧｒｅｅｒ （Ｊ．Ｇｒｅｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ７：３１７（１９９０））に記載されてい る比較モデリングのより正確な方法に従って編集した。ｈＫ２及びＰＳＡの最終 タンパク質配列アラインメントを図１Ｂに示す。 上記したように、１６個のＰＳＡペプチドを、ＰＳＡの一次アミノ酸配列及び これらのペプチドの３Ｄモデルにおける位置に基づいて作製した。一般的に、こ れらのペプチド配列は、ＰＳＡ分子に対して表面接近性であり、突出ループ、α ヘリックスまたはβターンのような或る種の２次的構造特徴を示した。更に、設 計されたペプチドの多く（即ち、１５／１６）は、ヒトカリクレイン−１（ｈＫ ２）とは異なるアミノ酸残基を１個以上含んでいた。 Ｂ．ペプチド合成： 設計したペプチドを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ４３１Ａ合成装置 （カリフォルニア州フォースターシティー）で標準Ｆｍｏｃ（９−フルオレニル メトキシカルボニル）化学を用いてＭｅｒｒ−ｉｆｉｅｌｄ（Ｍｅｒｒｉｆｉｅ ｌｄ，Ｒ．Ｂ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９−２１５４（１ ９６３））の段階的固相法により合成した。ペプチドを切断し、８２％ＴＦＡ、 ５％フェノール、５％Ｈ₂Ｏ、５％チオアニソール及び２．５％エタンジチオー ルの混合物を用いて２５℃で２〜４時間脱保護し、冷エーテルを添加して沈殿さ せた。粗ペプチドを、０．１％ＴＦＡを含有する５〜５０％アセトニトリル勾配 を用いる逆相ＨＰＬＣにより精製した。精製したペプチドの等質性及び同一性を 、電気−スプレーマススペクトル分析により確認した。すべてのペプチドが少な くとも９５％の純度を有していることが判明した。ペプチドを環化させるために 、カルボキシル末端及びアミノ末端に１個のシスティン残基を有するペプチドを 作製した。分子内ジスルフィド橋により形成される環状ペプチドを、既知の空気 酸化法（Ｔａｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３： ８０８２−８０８６（１９８６））を用いて合成した。要するに、精製した線状 ペプチドを０．１ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．４）中に０．５ｍｇ／ｍ ｌの濃度で溶解し、空気に曝しながら２５℃で可変時間撹拌した。ＨＰＬＣを酸 化の完了をモニターするために使用した。環状ペプチドを上記のように精製し、 分子内ジスルフィド結合の形成を電気−スプレーマススペクトルにより確認した 。 Ｃ．エピトープマッピング： Ｉ．間接ＥＬＩＳＡ 間接ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、抗−ＰＳＡ ｍＡｂ及びｐＡｂの反応性 及び特異性を調べた。アッセイのために、９６ウェルマイクロタイタープレート （マサチューセッツ州ケンブリッジに所在のＣｏｓｔａｒ）を、０．１Ｍ炭酸− 重炭酸緩衝液（ｐＨ９．０）中のＰＳＡ（０．５μｇ／ウェル、精液から精製し たＡｂｏｔｔｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの社内製品、コード＃９１９６９） またはペプチド（０．１ｍｇ／ウェル）で４℃で一晩コートした。プレートをＰ ＢＳ緩衝液（０．００８Ｍリン酸ナトリウム、０．００２Ｍリン酸カリウム、０ ．１４Ｍ塩化ナトリウム及び０．０１Ｍ塩化カリウム、ｐＨ７．４） 中１％ ＢＳＡで１時間ブロックしてから、希釈度の異なる抗４−ＰＳＡ ｍＡ ｂまたはｐＡｂ（１００μ１／ウェル）を添加した。２５℃で１時間インキュベ ート後、ウェルを０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ緩衝液で洗浄し、次 いで５０００倍希釈のアルカリホスファターゼ結合抗体（ヤギ抗−マウスＩｇＧ またはヤギ抗−家兎ＩｇＧ、イリノイ州ロックフォードに所在のＰｉｅｒｃｅか ら入手）１００μｌ／ウェルを添加し、インキュベーションを２５℃で１〜２時 間継続した。洗浄後、１００μｌ／ウェルのリン酸ｐ−ニトロフェニル基質（イ リノイ州ロックフォードに所在のＰｉｅｒｃｅ）を添加し、４０５ｎｍの吸光度 を自動化マイクロタイタープレートリーダー（カリフォルニア州メンローオーク スに所在のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐ．）を用いて測定し た。 ＩＩ．競合イムノアッセイ （Ａ） 捕捉抗体及びユーロピウムキレート（Ｅｕ）標識抗体の２サイト組合せ を使用して、ＰＳＡに対するｍＡｂ結合のＰＳＡ由来の合成ペプチドによる抑制 を調べた。要するに、０．１００ｍｌのＤｅｌｆｉａ（登録商標）緩衝液（フィ ンランド国トゥルクのＯＹに所在のＷａｌｌａｃ）（即ち、５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．７５）、０．９％ＮａＣｌ、０．０５％Ｎａ−アジド 、０．０１％Ｔｗｅｅｎ４０、０．０５％ウシγグロブリン、２０μＭ ＤＰＴ Ａ、０．５％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌ天然マウスＩｇＧ、５μｇ／ｍｌ変性マウ スＩｇＧ及び２０μｇ／ｍｌチェリーレッド含有ブロック緩衝液）中の遊離ＰＳ Ａ（０．０５ｐｍｏｌ／ウェル、ＯＹのＷａｌｌａｃ）を、捕捉のために使用さ れる各種抗−ＰＳＡ抗体をコートしたマイクロタイターウェル（１〜２μｇ／ウ ェルの抗体）に添加し、２５℃で１時間インキュベートした。（遊離または総抗 体を使用することができる。）Ｄｅｌｆｉａ（登録商標）洗浄溶液で洗浄後、２ ５ｍｌのＤｅｌｆｉａ（登録商標）緩衝液中のペプチド（ＰＳＡに対して６２， ５００〜１，０００，０００モル過剰）をユーロピウムキレート標識抗−ＰＳＡ 抗体（０．０５ｐｍｏｌ）と一緒に添加し、２５℃で１時間インキュベーション を継続した。別に４回洗浄後、結合したＥｕ標識抗体の量を既知の時間分解蛍光 定量法（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４１：１４８０−８８ （１９９５）及びＨｅｍｍｉｌｉａら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７：３ ３５−４３（１９８４））で測定した。 （Ｂ） 捕捉抗体及びアルカリホスファターゼ結合抗体の２サイト組合せを使用 して、ＰＳＡに対するｍＡｂ結合の合成ペプチドによる抑制をアルカリホスファ ターゼ標識抗体を用いて調べた。遊離ＰＳＡまたは総ＰＳＡに対して特異性を有 する抗体を含むプローブ及び捕捉抗体の組合せを、該組合せが結合してサンドイ ッチを形成するように選択した。上記したように、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４） １００ｍｌ中の各種抗−ＰＳＡ捕捉ｍＡｂ（即ち、遊離または総）（０．４ｐｍ ｏｌ／ウェル）をコートしたマイクロタイターウェル（１μｇ／ウェル）を添加 し、２５℃で１時間インキュベートした。０．５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰ ＢＳ緩衝液で洗浄後、ＰＢＳ緩衝液５０μｌ中のペプチド（ＰＳＡに対して５０ ，０００〜５００，０００モル過剰）をアルカリホスファターゼ結合抗体（２０ ｎｇ／ウェル、Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と一緒に添加し、２ ５℃で１〜２時間インキュベートした。別に４回洗浄後、１００μｌ／ウェルの リン酸ｐ−ニトロフェニル基質（イリノイ州ロックフォードに所在のＰｉｅｒｃ ｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を添加し、４０５ｎｍの吸光度を自動化マイク ロタイタープレートリーダーを用いて測定した。 Ｄ．結果： Ｉ．遊離ＰＳＡに優先的に結合するｍＡｂのエピトープ １６個の合成ペプチド（表１）のすべてを、一連のモノクローナル抗−ＰＳＡ 抗体を使用してセクションＣ−１１−Ａに記載の競合イムノアッセイによりスク リーニングした。ＡＢＴ６ペプチドは、遊離ＰＳＡに対して特異的であるｍＡｂ ９Ｂ１０及び５Ａ１０（Ｌｉｌｊａら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：１６１８ −２５（１９９１）、Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ． ４１： １４８０−８８（１９９５）及びＬｏｖｇｒｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｈ ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ２１３：８８８−９５（１９９５））に対する特異 的結合を示した。また、ＡＢＴ６ペプチドは、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体中のＡＣＴ によりカバーされる領域に近い領域に結合するＨ６８（Ａｂｂｏｔｔ ＬａｂＳ ．から入手）及びｍＡＢ ２Ｅ９（Ｌｏｖｇｒｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ ｐｈｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ２１３：８８８−９５（１９９５））に選択 的に結合した。ＰＳＡに結合するｍＡｂのＡＢＴ６ペプチドによる抑制率（％） を図２Ａに示す。これらのデーターから、ＡＢＴ６は遊離ＰＳＡに対して特異的 なｍＡｂ により認識されるＰＳＡ上エピトープを含んでいるかまたは遊離ＰＳＡに対する 優先的な結合を示すことが分かる。 図１Ｂに示すように、ＡＢＴ６ペプチドは、ｈＫ２配列とは異なる幾つかのア ミノ酸を含む。ＡＢＴ６ペプチドがＰＳＡ特異的エピトープに相当することを示 すために、対応するｈＫ２ｂペプチド（図１Ｂ参照）を合成した。ＡＢＴ６ペプ チド、ｈＫ２ペプチド及びＰＳＡのｍＡｂ ２Ｅ９に対する特異的結合をセクシ ョンＣ−Ｉに記載した間接ＥＬＩＳＡを用いて比較した。図２ＢにＥＬＩＳＡの 結果を示す。２Ｅ９はＰＳＡおよびＡＢＴ６ペプチドに対して結合するが、ｈＫ ２ペプチドに対しては結合しない結合特異性を示すことが明らかである。これら のデーターに基づいて、ＰＳＡの３次元モデルで突出ループであるＡＢＴ６ペプ チドは、ＰＳＡ−ＡＣＴ複合体中のＰＳＡに対するＡＣＴの結合によりブロック されるかまたは立体的に干渉されるＰＳＡ特異的エピトープに相当するとの結論 が得られる。更に、このエピトープは、ＡＢＴ６及びｈＫ２ｂの比較に基づいて ＰＳＡに対して幾分特異性を有する。 II．総ＰＳＡに対して特異的なｍＡｂのエピトープ ３つの合成ペプチド、即ちＡＢＴ４、ＡＢＴ１４及びＡＢＴ １６は、セクションＣ−II−Ａ及びＢに記載の競合イムノアッセイにおいて総Ｐ ＳＡに対して特異的であった数種のｍＡｂのエピトープを含んでいることが同定 された。ＡＢＴ４ペプチドは、ｍＡｂ ２Ｃｌ（Ｌｏｖｇｒｅｎら、Ｂｉｏｃｈ ｅｍ．Ｂｉｏｈｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ． ２０４：１２５１−５６（１９９４ ））及びＨ１６４（イリノイ州アボットパークに所在のＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ ．で標準ハイブリドーマ技術により産生した）に対するＰＳＡ結合をそれぞれ８ ０〜９０％抑制した（図３Ａ）。ＡＢＴ１４は、ｍＡｂ ４Ｈ５（Ｌｏｖｇｒｅ ｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｖｓ．Ｒｅｓ，Ｃｏｍｍｕｎ． ２０４：１ ２５１−５６（１９９４））に対するＰＳＡ結合を選択的に抑制し、ＡＢＴ１６ はｍＡｂ Ｐ１０（スウェーデン国イエーデポリに所在のＣａｎＡｇ Ｄｉａｇ ｎｏｓｔｉｃｓ Ｉｎｃ．）及びＨ５０（イリノイ州アボットパークに所在のＡ ｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ．で標準ハイブリドーマ技術により産生した）に対するＰ ＳＡ結合を抑制する。しかしながら、両ペプチドの抑制率は、ＡＢＴ４ペプチド に比して比較的弱い。従って、ＡＢＴ１４及びＡＢＴ１６は、ｍＡｂ ４Ｈ５、 Ｐ１０及びＨ５０の部分的エピトープに相当し得る。 配列アラインメント（図１Ｂ）から、有力なＡＢＴ４ペプチドはｈＫ２配列とは 異なる幾つかのアミノ酸を含んでいた。ＡＢＴ４のエピトープ特異性を評価する ために、対応するｈＫ２ａペプチドを合成した。ｍＡｂ Ｈ１６４のＡＢＴ４， ｈＫ２ａペプチド（図１Ｂ参照）及びＰＳＡの特異的結合をセクションＣ−Ｉに 記載の間接ＥＬＩＳＡを用いて調べ、結果を図３Ｃに示す。これらのデータ（図 ３Ｃ）から、ＭＡｂ Ｈ１６４はＰＳＡおよびＰＳＡペプチドＡＢＴ４に特異的 に結合するが、ｈＫ２ａペプチドには結合しないことが明らかであった。従って 、ＰＳＡの３Ｄモデルでループ及びβ鎖構造を示したＡＢＴ４はＰＳＡ特異的エ ピトーブに相当し、このエピトープはＰＳＡ−ＡＣＴ複合体中のＡＣＴによりブ ロックされないであろう。 III．合成ペプチドに対する抗−ＰＳＡ ｐＡｂ反応性 合成ペプチドを、アルカリホスファターゼに結合させたヤギ抗−ＰＳＡ抗血清 を使用する直接ＥＬＩＳＡアッセイフォーマットによりスクリーニングした。特 に、ペプチドをマイクロタイタープレートにコートし、酵素標識抗−ＰＳＡポリ クローナル抗体により検出した。ヤギ抗−ＰＳＡ抗血清を遊離ＰＳＡで免疫感作 することにより産生した。ポリクローナル抗血清とし て、このヤギ抗−ＰＳＡは複数の遊離及び総ＰＳＡ関連エピトープに対する抗体 を示すと予想され得る。ＥＬＩＳＡ結果を図４に示す。上記したようにｍＡｂで 同定された上記エピトープに加えて、２個の新しいエピトープのＡＢＴ２及びＡ ＢＴ７が抗−ＰＳＡ抗血清により同定された。 実施例ＩＩ ＡＢＴ６ペプチド（遊離ＰＳＡエピトープ）の免疫原性 Ａ．ＡＢＴ６ペプチドでの免疫感作 抗血清を、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（テキサス州ルイスビル） において標準的な市販の方法を用いて、家兎を担体タンパク質ＫＬＨ（キーホー ルリンペットヘモシアニン）に結合させたＰＳＡペプチドＡＢＴ６で免疫感作す ることにより作製した。 Ｂ．抗−ＡＢＴ６抗血清の反応性及び特異性 抗血清抗−ＡＢＴ６の反応性及び特異性を、実施例Ｉに記載されているように ＰＳＡ、ＰＳＡペプチドＡＢＴ６及びｈＫ２ペプチドｈＫ２ｂに対する相対的結 合アティニティー（Ｗａｎｇら、Ｕｒｏｌｏｙ ３９：１−５（１９８２））を 推定することにより評価した。これらの研究のために実施例Ｉのセクシ ョンＣ−Ｉに記載されている間接ＥＬＩＳＡフォーマットを使用し、データを図 ５に示す。これらのデータから、抗−ＡＢＴ６抗血清はＡＢＴ６ペプチド及びＰ ＳＡに対してのみ高アフィニティーで特異的に結合することが明らかとなった。 ｈＫ２ｂペプチドに対しては殆ど結合しなかった。 実施例ＩＩＩ ＡＢＴ４ペプチド（総ＰＳＡエピトープ）の免疫原性 Ａ．ＡＢＴ４ペプチドでの免疫感作 抗−ＡＢＴ４抗血清を、Ｂｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．（テキサス州 ルイスビル）において２匹の家兎を担体タンパク質ＫＬＨに結合させたＰＳＡペ プチドＡＢＴ４で免疫感作することにより作製した。 Ｂ．抗−ＡＢＴ４抗血清の反応性及び特異性 抗−ＡＢＴ４抗血清の反応性及び特異性を、実施例Ｉに記載されているように ＰＳＡ、ＰＳＡペプチドＡＢＴ４及びｈＫ２ペプチドｈＫ２ａに対する相対的結 合アフィニティーを推定することにより評価した。これらの研究のために実施例 ＩのセクションＣ−Ｉに記載されている間接ＥＬＩＳＡフォーマットを使用し、 データを図６に示す。これらのデータから、抗−ＡＢ Ｔ４抗血清はＡＢＴ４ペプチド及びＰＳＡに対して結合するが、ｈＫ２Ａペプチ ドに対して若干の交差反応性を有することが明らかとなった。相対的アフィニテ ィーはＡＢＴ４＞ＰＳＡ＞ｈＫ２ａであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/574 Ｇ０１Ｎ 33/574 Ａ 33/577 33/577 Ｂ (72)発明者 ブライドン，ドミニク・ピー アメリカ合衆国、カリフオルニア・94123、 サン・フランシスコ、ベイ・ストリート・ 2167 (72)発明者 チユー，シアオシン アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガー ニー、シエラ・プレイス・752 (72)発明者 リルヤ，ハンス スウエーデン国、エス―236 00・ホール ビケン、ホレンダーレベーゲン・28 (72)発明者 ピーロネン，テイモ・ペツテリ フインランド国、フイン―20380・トウル ク、フランツインカツ・４・ベー・８ (72)発明者 ビヒネン，マウノ・アンテロ フインランド国、フイン―00660・ヘルシ ンキ、アルクテイエ・27・セ (72)発明者 ペツテルソン，インマヌエル・キム・スベ ルケル フインランド国、フイン―20810・トウル ク、テイーレンテキヤンカツ・14・エー・ 20

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 約１０〜２０個の残基のアミノ酸配列からなる精製ペプチドであって、前 記配列は前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の領域のアミノ酸配列と同一であり、ヒト腺 性カリクレイン（ｈＫ２）のアミノ酸配列と非同一のアミノ酸を１個以上含むこ とを特徴とする前記精製ペプチド。 ２． 前記ペプチドが、ＡＢＴ１（配列番号１）、ＡＢＴ２（配列番号２）、Ａ ＢＴ３（配列番号３）、ＡＢＴ４（配列番号４）、ＡＢＴ５（配列番号５）、Ａ ＢＴ６（配列番号６）、ＡＢＴ７（配列番号７）、ＡＢＴ８（配列番号８）、Ａ ＢＴ９（配列番号９）、ＡＢＴ１０（配列番号１０）、ＡＢＴ１１（配列番号１ １）、ＡＢＴ１２（配列番号１２）、ＡＢＴ１３（配列番号１４）、ＡＢＴ１５ （配列番号１５）及びＡＢＴ１６（配列番号１６）からなる群から選択されるこ とを特徴とする請求項１に記載の精製ペプチド。 ３． 前記ペプチドがＡＢＴ２、ＡＢＴ４、ＡＢＴ６、ＡＢＴ１、ＡＢＴ７及び ＡＢＴ１６からなる群から選択されることを特徴とする請求項２に記載の精製ペ プチド。 ４． ＡＢＴ６及びＡＢＴ１からなる群から選択されるペプチドによる免疫感作 に応答して産生されることを特徴とする遊離ＰＳＡに対して特異的な抗体。 ５． 前記抗体がモノクローナルであることを特徴とする請求項４に記載の抗体 。 ６． 前記抗体がポリクローナルであることを特徴とする請求項４に記載の抗体 。 ７． ＡＢＴ４、ＡＢＴ１４及びＡＢＴ１６からなる群から選択されるペプチド による免疫感作に応答して産生される総ＰＳＡに対して特異的な抗体。 ８． 前記抗体がモノタローナルであることを特徴とする請求項７に記載の抗体 。 ９． 前記抗体がポリクローナルであることを特徴とする請求項７に記載の抗体 。 １０． ＰＳＡを含んでいると疑われる試験サンプル中のＰＳＡを検出する方法 であって、 ａ）前記試験サンプルを、抗原／抗体複合体を形成し得るのに十分な時間及び条 件下でペプチドつまり抗原上の少なくとも１つのサイトに特異的に結合する抗体 またはその断片と接触させ るステップ、 ｂ）前記ステップａ）で形成された抗原／抗体複合体に、プローブが前記ペプチ ドつまり抗原上の第２サイトに結合するプローブ抗体を該プローブが結合抗原に 結合するのに十分な時間及び条件下で添加するステップ ｃ）結合プローブの量、よって前記試験サンプル中のＰＳＡの量を測定するステ ップ、 を含み、前記ステップａ）のペプチドつまり抗原が、ＰＳＡの領域のアミノ酸配 列と同一であり、ｈＫ２のアミノ酸配列と非同一のアミノ酸を１個以上含む、約 １０〜２０個の残基のアミノ酸配列からなることを特徴とする前記方法。 １１． ステップａ）の前記抗体が固相に結合していることを特徴とする請求項 １０に記載の方法。 １２． ステップｂ）の前記抗体が放射性同位元素で標識されていることを特徴 とする請求項１０に記載の方法。 １３． １つの抗体が遊離ＰＳＡに対して特異的であり且つ他の抗体が総ＰＳＡ に対して特異的であるか、または両方の抗体が総ＰＳＡに対して特異的であるこ とを特徴とする請求項１０に記載の方法。 １４． 前記ペプチドつまり抗原がＡＢＴ２、ＡＢＴ４、ＡＢＴ６、ＡＢＴ１、 ＡＢＴ７及びＡＢＴ１６からなる群から選択されることを特徴とする請求項１０ に記載の方法。 １５． ＰＳＡを含んでいると疑われる試験サンプル中のＰＳＡを検出する方法 であって、 ａ）前記試験サンプルを、抗原／抗体複合体を形成し得るのに十分な時間及び条 件下で少なくとも１つのＰＳＡ由来のペプチドつまり抗原と特異的に結合する抗 体またはその断片と接触させるステップ、 ｂ）前記ステップａ）で形成した試験サンプルー抗体混合物に標識遊離ＰＳＡを 添加するステップ ｃ）前記試練サンプル中のＰＳＡと標識遊離ＰＳＡとの競合量を測定することに より、前記試験サンプル中のＰＳＡの量を測定するステップ、 を含み、前記ステップａ）のペプチドつまり抗原が、ＰＳＡの領域のアミノ酸配 列と同一であり、ｈＫ２のアミノ酸配列と非同一のアミノ酸を１個以上含む、約 １０〜２０個の残基のアミノ酸配列からなることを特徴とする前記方法。 １６． 遊離ＰＳＡを検出する場合にはステップａ）の前記抗 体は遊離ＰＳＡに特異的に結合し、総ＰＳＡを検出する場合にはステップａ）の 前記抗体は総ＰＳＡに結合することを特徴とする請求項１５に記載の方法。 １７． 前記ペプチドつまり抗原がＡＢＴ２、ＡＢＴ４、ＡＢＴ６、ＡＢＴ１、 ＡＢＴ７及びＡＢＴ１６からなる群から選択されることを特徴とする請求項１５ に記載の方法。 １８． 試験サンプル中のＰＳＡの存在を調べるためのキットであって、ＰＳＡ の領域のアミノ酸配列と同一であり、ｈＫ２のアミノ酸配列と非同一のアミノ酸 を１個以上含む、約１０〜２０個の残基のアミノ酸配列からなるペプチドによる 免疫感作に応答して産生された抗体を収容した容器を含むことを特徴とする前記 キット。 １９． 前記ペプチドがＡＢＴ２、ＡＢＴ４、ＡＢＴ６、ＡＢＴ１、ＡＢＴ７及 びＡＢＴ１６からなる群から選択されることを特徴とする請求項１７に記載のキ ット。 ２０． 試験サンプル中のＰＳＡの存在を調べるためのキットであって、ａ）Ｐ ＳＡ上の少なくとも１つのサイトに特異的に結合する抗体またはその断片、及び ｂ）プローブが前記ＰＳＡ上の第２サイトに結合するプローブ抗体を含み、前記 抗体また はその断片が、ＰＳＡの領域のアミノ酸配列と同一であり、ｈＫ２のアミノ酸配 列と非同一のアミノ酸を１個以上含む、約１０〜２０個の残基のアミノ酸配列か らなるペプチドによる免疫感作に応答して産生されることを特徴とする前記キッ ト。 ２１． 前記ペプチドがＡＢＴ２、ＡＢＴ４、ＡＢＴ６、ＡＢＴ１、ＡＢＴ７及 びＡＢＴ１６からなる群から選択されることを特徴とする請求項２０に記載のキ ット。 ２２． 試験サンプル中のＰＳＡの存在を調べるためのキットであって、ａ）Ｐ ＳＡの領域のアミノ酸配列と同一であり、ｈＫ２のアミノ酸配列と非同一のアミ ノ酸を１個以上含む、約１０〜２０個の残基のアミノ酸配列からなるペプチドに 特異的に結合する抗体またはその断片、及びｂ）標識遊離ＰＳＡを含むことを特 徴とする前記キット。 ２３． 前記ペプチドがＡＢＴ６であることを特徴とする請求項２２に記載のキ ット。 ２４． 約１０〜２０個の残基のアミノ酸配列からなる精製ペプチドであって、 前記配列はＰＳＡの領域のアミノ酸配列と同一であり、ｈＫ２の領域のアミノ酸 配列と同一であることを特徴とする前記精製ペプチド。 ２５ 前記ペプチドがＡＢＴ１４であることを特徴とする請求項２４に記載のペ プチド。