CN110095549A - 一种谷物及其制品中黄曲霉毒素的检测装置及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种谷物及其制品中黄曲霉毒素的检测装置及方法，包括操作台、左泵、右泵、六通阀、进样器、净化富集柱、定量环、色谱分析柱和黄曲霉检测器，检测方法包括以下步骤：样品的制备、样品的提取、净化富集、平衡色谱分析柱并连接检测器、分析检测等。本发明的装置为衍生荧光检测一体机，与传统检测装置相比，体积小、操作更加便捷，而且灵敏度未降低。本发明回收率及检出限灵敏度高，可使用性强。经提取的样液可以直接进行上机检测，所有的其他处理都在机器上自动完成，大大节约了时间，对操作人员能力要求相对降低，提高了工作效率。

Description

一种谷物及其制品中黄曲霉毒素的检测装置及方法

技术领域

本发明涉及一种检测装置及方法，特别涉及一种谷物及其制品中黄曲霉毒素的检测装置及方法。

背景技术

黄曲霉毒素是黄曲霉和寄生曲霉的代谢产物，具有极强的毒性和致癌性，特别容易污染花生、玉米、大米、大豆、小麦等粮油产品，并且在烹调过程中不易分解，是严重影响食品质量安全的一类真菌毒素。现有食品中黄曲霉毒素的经典检测方法为免疫亲和-高效液相色谱法，该方法的检测过程包括：毒素的提取过程；净化过程，主要是采用免疫亲和柱净化，进一步降低提取溶液中的干扰；仪器柱后衍生过程；液相色谱荧光检测器检测过程。整个过程历时长、自动化程度低、劳动强度大、检验成本高，且需要配置衍生设备等缺点，黄曲霉毒素检测前处理过程对检测人员技术及能力要求也较高。因此，开发一种快速、低成本且易操作的检测装置及方法迫在眉睫，同时也是检测行业急需攻克的技术难题。

发明内容

本发明为解决上述技术问题，提供一种谷物及其制品中黄曲霉毒素的检测装置及方法，其装置包括操作台、左泵、右泵、六通阀、进样器、净化富集柱、定量环、色谱分析柱和黄曲霉检测器，其中左泵、右泵、六通阀、进样器、净化富集柱、定量环、色谱分析柱和黄曲霉检测器均设置在操作台上；左泵通过管路与六通阀的一个阀孔相连，右泵、进样器、净化富集柱和六通阀的一个阀孔通过管路顺次相连；定量环的两端分别通过管路与六通阀的两个阀孔相连；色谱分析柱的一端与六通阀的一个阀孔通过管路相连，另一端与黄曲霉检测器相连；六通阀的一个阀孔与废液桶相连。

所述的黄曲霉检测器包括四氟管，四氟管上设有衍生光源，四氟管的入口与色谱分析柱出口相连，四氟管的出口与荧光检测池连通，荧光检测池上设置有二色镜，二色镜的反射光路方向上设有激发光源，二色镜的透射光路方向上设有荧光探测器，所述的荧光探测器通过处理器与色谱工作站相连，所述的衍生光源为254nm的紫外灯，所述的激发光源为365nm的发光二极管，所述荧光检测池的出口端与废液桶相连。

所述的净化富集柱的规格为2.1mm×20mm，填料为苯乙烯二乙烯基聚合填料，粒径1.8μm；所述的色谱分析柱为C18色谱柱，规格为4.6mm×150mm，粒径为5μm。

所述的检测方法包括以下步骤：

(1)样品的制备：

取待测谷物不少于1kg,用高速粉碎机将其粉碎,过粒径2mm的试验筛后,进行低温超微粉碎，混合至100g,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用；

(2)样品的提取：

准确称取上述步骤制备的样品20g，精确至0.01g，装入34mL加速溶剂萃取仪的萃取池中提取，接收得萃取液装入150mL棕色旋蒸瓶中，45℃旋转蒸发至近干，减压取下旋蒸瓶，马上用1mL流动相溶解，再用0.5mL流动相复溶，最后合并溶解液于2mL棕色容量瓶中，准确定容，过0.45μm有机相滤膜，收集滤液于进样瓶中，待进样。加速溶剂萃取条件为：萃取压力：1700psi；萃取温度：80-85℃；静态萃取时间：5min；循环次数：1-2次；萃取池冲洗溶剂：60％的乙腈；氮气吹扫时间：100-120秒。

(3)检测步骤：

a)净化富集：将待测样液置于进样器，调节六通阀使净化富集柱与定量环连通，启动右泵，样液随流动相由进样器进入净化富集柱净化吸附后，经六通阀进入定量环中保留待检，余液经六通阀排入废液桶；

b)平衡色谱分析柱并连接检测器：调节六通阀使左泵与色谱分析柱连通，启动左泵，流动相经过六通阀后依次经过色谱分析柱和黄曲霉检测器，最终排入废液桶；

c)分析检测：调节六通阀使定量环分别与左泵和色谱分析柱连通，启动左泵，定量环中的目标物被流动相反冲于色谱分析柱中，再次解脱吸附分离纯化目标物，并进入黄曲霉检测器进行检测，余液排入废液桶；

d)冲洗平衡净化富集柱：调节六通阀使净化富集柱与废液桶连通，启动右泵，流动相依次经过进样器、净化富集柱和六通阀最终排入废液桶。

所述的流动相为乙腈-水溶液，体积比为80：20。

检测步骤中左泵的流速为1.0mL/min，右泵的流速为0.4mL/min。

本发明的有益效果：

本发明的净化富集柱的填料采用了对黄曲霉毒具有良好富集净化作用的聚乙烯二乙烯苯基聚合物，该柱对目标物富集性能优良，同时可以去除提取液中的杂质，实现净化富集双功能，对样品检测具有较好的净化富集效果，经净化富集柱处理后的样品杂质干扰进一步降低，信号响应值更高；

本发明提供了一种新型的衍生检测一体化检测器，将衍生和检测两项功能进行有效整合，从检测装置上看，传统的检测装置为单独的柱后衍生装置和配有荧光检测器的液相色谱仪。本发明的装置为衍生荧光检测一体机，与传统检测装置相比，体积小、操作更加便捷，而且灵敏度未降低。本发明回收率及检出限灵敏度高，可使用性强；

本发明装置通过六通阀的切换，可以灵活的实现二维净化富集，有效减小溶剂死体积及杂质峰干扰，利于样品分析定量；

传统的实验前处理过程长，需要手动操作的步骤多，对操作人员的熟练程度和技能要求较高；同时必须要过免疫亲和柱，该柱的价格高昂。而本发明中，经提取的样液可以直接进行上机检测，所有的其他处理都在机器上自动完成，大大节约了时间，对操作人员能力要求相对降低，提高了工作效率；

本发明提取步骤采用了低温超微粉碎技术，该技术在低温下进行，对样品粉碎的更彻底，使目标物更容易游离出以便后续提取，更有利于保护目标物的完整性。

附图说明

图1为本发明装置整体结构示意图；

图2为本发明黄曲霉检测器结构示意图；

图3为本发明未经净化富集柱样品色谱图。

图4为本发明经净化富集柱样品色谱图。

1、操作台 2、左泵 3、右泵 4、六通阀 5、进样器

6、净化富集柱 7、定量环 8、色谱分析柱 9、黄曲霉检测器

10、四氟管 11、衍生光源 12、荧光检测池 13、二色镜

14、激发光源 15、荧光探测器 16、处理器。

具体实施方式

请参阅图1-4所示：

本发明提供一种谷物及其制品中黄曲霉毒素的检测装置包括操作台1、左泵2、右泵3、六通阀4、进样器5、净化富集柱6、定量环7、色谱分析柱8和黄曲霉检测器9，其中左泵2、右泵3、六通阀4、进样器5、净化富集柱6、定量环7、色谱分析柱8和黄曲霉检测器9均设置在操作台1上；左泵2通过管路与六通阀4的阀一相连，右泵3、进样器5、净化富集柱6和六通阀4的阀四通过管路顺次相连；定量环7的两端分别通过管路与六通阀4的阀五和阀二相连；色谱分析柱8的一端与六通阀4的阀六通过管路相连，另一端与黄曲霉检测器9相连；六通阀4的阀三与废液桶相连。

所述的黄曲霉检测器9包括四氟管10，四氟管10上设有衍生光源11，四氟管10的入口与色谱分析柱8出口相连，四氟管10的出口与荧光检测池12连通，荧光检测池12上设置有二色镜13，二色镜13的反射光路方向上设有激发光源14，二色镜13的透射光路方向上设有荧光探测器15，所述的荧光探测器15通过处理器16与色谱工作站相连，所述的衍生光源11为254nm的紫外灯，所述的激发光源14为365nm的发光二极管，所述荧光检测池12的出口端与废液桶相连。

所述的净化富集柱6的规格为2.1mm×20mm，填料为苯乙烯二乙烯基聚合填料，粒径1.8μm；所述的色谱分析柱8为C18色谱柱，规格为4.6mm×150mm，粒径为5μm。

所述的检测方法包括以下步骤：

(1)样品的制备：

取待测谷物不少于1kg,用高速粉碎机将其粉碎,过粒径2mm的试验筛后,进行低温超微粉碎，混合至100g,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用；

(2)样品的提取：

准确称取上述步骤制备的样品20g，精确至0.01g，装入34mL加速溶剂萃取仪的萃取池中提取，接收得萃取液装入150mL棕色旋蒸瓶中，45℃旋转蒸发至近干，减压取下旋蒸瓶，马上用1mL流动相溶解，再用0.5mL流动相复溶，最后合并溶解液于2mL棕色容量瓶中，准确定容，过0.45μm有机相滤膜，收集滤液于进样瓶中，待进样。加速溶剂萃取条件为：萃取压力：1700psi；萃取温度：85℃；静态萃取时间：5min；循环次数：2次；萃取池冲洗溶剂：60％的乙腈；氮气吹扫时间：120秒。

如果样品为半固体或液体样品：准确称取10g试样(精确至0.01g)，加入适量硅藻土混合均匀，后同上述操作步骤进行。

(3)检测步骤：

a)净化富集：将待测样液置于进样器5，调节六通阀4使阀四和阀五连通，阀二和阀三连通，阀二和阀五连通，启动右泵3，样液随流动相由进样器5进入净化富集柱6净化吸附后，经六通阀4进入定量环7中保留待检，余液经六通阀4阀三排入废液桶；

b)平衡色谱分析柱并连接检测器：调节六通阀4阀一和阀六连通，启动左泵2，流动相经过六通阀4后依次经过色谱分析柱8和黄曲霉检测器9，最终排入废液桶；

c)分析检测：调节六通阀4使阀一和阀二连通，阀五和阀六连通，启动左泵2，定量环7中的目标物被流动相反冲于色谱分析柱8中，再次解脱吸附分离纯化目标物，并进入黄曲霉检测器9进行检测，余液排入废液桶；

d)冲洗平衡净化富集柱：调节六通阀4使阀四和阀三连通，启动右泵3，流动相依次经过进样器5、净化富集柱6和六通阀4最终排入废液桶。

所述的流动相为乙腈-水溶液，体积比为80：20。

检测步骤中左泵2的流速为1.0mL/min，右泵3的流速为0.4mL/min。

黄曲霉检测器的工作过程：

黄曲霉毒素样品经过色谱分析柱分离后，进入四氟管10，并在衍生光源11(254nm紫外光)的照射下被衍生，以提高B1的荧光强度，之后经过光化学衍生后的样品直接进入荧光检测池12，激发光源14(365nm的发光二级管)产生的光经过二色镜13的反射后，对荧光检测池12中的样品进行激发，产生430nm波长的荧光，这部分荧光透过二色镜13后进入荧光探测器15，荧光探测器15将荧光信号转变为电信号，最后经过处理器16处理后将色谱信号传给色谱工作站进行分析、检测，而通过荧光检测池12激发后的样品则直接排入废液桶。

方法的验证：

(1)标准液及标准工作液的配制

标准储备液(10μg/mL)：准确称取AFT B1标准品1mg于100mL烧杯种，加乙腈80mL，搅拌至完全溶解(若出现不溶现象则40℃超声10min，使标准品完全溶解)，将溶解液于100mL棕色容量瓶中，用乙腈准确定容到刻度，-20℃避光保存，备用。

标准中间液(100ng/mL)：准确移取标准储备液100μL于10mL棕色容量瓶中，并用乙腈准确定容。

标准工作液：准确移取10μL、50μL、100μL、500μL、1000μL标准中间液分别于10mL棕色容量瓶中，用初始流动相定容至刻度，得到浓度为0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL AFT B1系列标准液。

(2)方法线性、定量限及检出限测定

根据标准工作液配制得0.1ng/mL、0.5ng/mL、1.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL五个水平AFT B1浓度，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标建立基质标准曲线，得出标准曲线方程及相关系数，根据信噪比(S/N)＝3:1计算方法的检出限(LOD)，根据信噪比(S/N)＝10:1计算方法的定量限(LOQ)，结果见表1。结果表明，本方法在线性范围内具有较好的线性关系。

表1黄曲霉毒素B1线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

Table 1 Linear ranges、linear equations、corelation coefficients、LODand LOQ of the AFT B1

(3)方法稳定性

准确称取20.00g不含AFT B1的大米为空白基质，添加浓度为25.0μg/mL标准液1.00mL混匀，得0.5μg/kg加标样品，分别于样品制备后0h、3h、6h、9h、12h、15h进行测定。得6次测定值相对标准偏差为2.39％，结果表明本方法稳定性较好。

(4)加标回收率和精密度

分别选取不含AFT B1的大米、小麦粉及玉米粉为空白基质，制定0.1μg/kg、1.0μg/kg、5.0μg/kg低中高三个加标水平加标样品，分别对三个水平进行6次平行测定，分析方法的回收情况，并根据样品的相对标准偏差(RSD)进行精密度的分析，详见表2。结果表明回收率和精密度数据均满足国际食品法典委员会对痕量物质分析的方法学要求。

表2三种不同基质样品回收率及相对标准偏差(n＝6)

Table 2 Recovery and relative standard deviation of three differentmatrix sample(n＝6)

(5)实际样品的检测与分析

采用本方法对市售大米样品30个、编号为DAFT01～30，市售玉米粉样品30个、编号为YAFT01～30，市售小麦粉样品30个、编号为XAFT01～30进行AFT B1含量的测定。测定结果：30个大米结果全部为未检出；30个玉米粉结果为28个样品未检出，YAFT13及YAFT29号样品检出含有AFT B1，含量为0.54μg/kg及2.35μg/kg；30个小麦粉结果为29个样品未检出，MAFT07号样品检出含有AFT B1，含量为1.01μg/kg。结果表明，市售90个样品中AFT B1检出率为96.7％，合格率为100％，结果较好，同时也证明本方法对于谷物极其制品中黄曲霉毒素B1检测方法可靠。

仪器及设备：

U3000高效液相色谱仪、ASE350加速溶剂萃取机、六通阀、400μL定量环，美国赛默飞公司；Milli-Q纯水器，美国Millipore公司；1210BS旋转蒸发仪，日本EYELA公司；HMB701低温超微粉碎机，北京环亚天元机械技术有限公司；

材料及试剂：

玉米粉、大米、小麦粉，市售；黄曲霉毒素B1标准品(AFT B1)，ROMER公司；超纯水，美国Millipore公司；乙腈(色谱纯)，美国sigma公司；硅藻土：Celite 545 coarse，Fluka公司。

本实施方式与传统方法效果对比见表3：

表3：

Claims (7)

1.一种谷物及其制品中黄曲霉毒素的检测装置，其特征在于：包括操作台、左泵、右泵、六通阀、进样器、净化富集柱、定量环、色谱分析柱和黄曲霉检测器，其中左泵、右泵、六通阀、进样器、净化富集柱、定量环、色谱分析柱和黄曲霉检测器均设置在操作台上；左泵通过管路与六通阀的一个阀孔相连，右泵、进样器、净化富集柱和六通阀的一个阀孔通过管路顺次相连；定量环的两端分别通过管路与六通阀的两个阀孔相连；色谱分析柱的一端与六通阀的一个阀孔通过管路相连，另一端与黄曲霉检测器相连；六通阀的一个阀孔与废液桶相连。

2.根据权利要求1所述的一种谷物及其制品中黄曲霉毒素的检测装置，其特征在于：所述的黄曲霉检测器包括四氟管，四氟管上设有衍生光源，四氟管的入口与色谱分析柱出口相连，四氟管的出口与荧光检测池连通，荧光检测池上设置有二色镜，二色镜的反射光路方向上设有激发光源，二色镜的透射光路方向上设有荧光探测器，所述的荧光探测器通过处理器与色谱工作站相连，所述的衍生光源为254nm的紫外灯，所述的激发光源为365nm的发光二极管，所述荧光检测池的出口端与废液桶相连。

3.根据权利要求1所述的一种谷物及其制品中黄曲霉毒素的检测装置，其特征在于：所述的净化富集柱的规格为2.1mm×20mm，填料为苯乙烯二乙烯基聚合填料，粒径1.8μm；所述的色谱分析柱为C18色谱柱，规格为4.6mm×150mm，粒径为5μm，柱温：35℃；。

4.一种谷物及其制品中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)样品的制备：

取待测谷物不少于1kg,用高速粉碎机将其粉碎,过粒径2mm的试验筛后,进行低温超微粉碎，混合至100g,储存于样品瓶中,密封保存,供检测用；

(2)样品的提取：

准确称取上述步骤制备的样品20g，精确至0.01g，装入加速溶剂萃取仪的萃取池中提取，接收得萃取液装入旋蒸瓶中，45℃旋转蒸发至近干，减压取下旋蒸瓶，马上用1mL流动相溶解，再用0.5mL流动相复溶，最后合并溶解液于2mL棕色容量瓶中，准确定容，过0.45μm有机相滤膜，收集滤液于进样瓶中，待进样；

(3)检测步骤：

a)净化富集：将待测样液置于进样器，调节六通阀使净化富集柱与定量环连通，启动右泵，样液随流动相由进样器进入净化富集柱净化吸附后，经六通阀进入定量环中保留待检，余液经六通阀排入废液桶；

b)平衡色谱分析柱并连接检测器：调节六通阀使左泵与色谱分析柱连通，启动左泵，流动相经过六通阀后依次经过色谱分析柱和黄曲霉检测器，最终排入废液桶；

c)分析检测：调节六通阀使定量环分别与左泵和色谱分析柱连通，启动左泵，定量环中的目标物被流动相反冲于色谱分析柱中，再次解脱吸附分离纯化目标物，并进入黄曲霉检测器进行检测，余液排入废液桶；

d)冲洗平衡净化富集柱：调节六通阀使净化富集柱与废液桶连通，启动右泵，流动相依次经过进样器、净化富集柱和六通阀最终排入废液桶。

5.根据权利要求4所述的一种谷物及其制品中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于：所述的流动相为乙腈-水溶液，体积比为80：20。

6.根据权利要求4所述的一种谷物及其制品中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于：样品的提取步骤中加速溶剂萃取条件为：萃取压力：1700psi；萃取温度：80-85℃；静态萃取时间：5min；循环次数：1-2次；萃取池冲洗溶剂：60％的乙腈；氮气吹扫时间：100-120秒。

7.根据权利要求4所述的一种谷物及其制品中黄曲霉毒素的检测方法，其特征在于：检测步骤中左泵的流速为1.0mL/min，右泵的流速为0.4mL/min。