CN105675582A - 利用拉曼光谱检测水果中β-胡萝卜素含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种利用拉曼光谱检测水果中β-胡萝卜素含量的方法,利用拉曼光谱对水果样品进行无损检测,同时使用高效液相色谱进行化学检测,将两者检测结果相比较,而后进行科学的数学推演,以得出两者间的映射关系,通过该映射关系,利用拉曼光谱检测数据,即可得出适用于该种水果的β-胡萝卜素含量。本发明具有检测速度快、样品无损、灵敏度高等优点。
Description
技术领域
本发明涉及光谱学、果蔬品质无损检测领域,尤其涉及一种利用拉曼光谱检测水果中β-胡萝卜素含量的方法。
背景技术
类胡萝卜素是一类天然的脂溶性色素分子,大约有750种类胡萝卜素是可以直接从自然界中分离提取的,其主要分布于高等植物,藻类和光合细菌中。类胡萝卜素的存在使得植物和动物呈现出各种颜色,它也常被用作色剂添加到食品和饮料中。虽然动物和人类都无法自身合成类胡萝卜素,但是却可以从植物中摄取,并转化成所需要的成分,例如β-胡萝卜素可以在人体内被转化成为视黄醇(维生素A)。
类胡萝卜素根据其分子中是否含有氧原子可分为两类:叶黄素类(例如叶黄素C40H56O2、虾青素C40H52O2、玉米黄质C40H52O2)和胡萝卜素类(番茄红素C40H56、β-胡萝卜素C40H56)。其共同点就是都为高度不饱和化合物(多烯),含有一系列共轭双键和甲基支链。双键的存在也使得其成为较好的单线氧猝灭剂。而共轭双键的多少决定了色素的颜色分布,也为之后拉曼散射光谱提供了分辨的可能。而在植物光合作用中,类胡萝卜素主要吸收蓝紫光,承担吸收和传递光能的作用,保护叶绿素。
而β-胡萝卜素(C40H56)是类胡萝卜素之一,是橘黄色脂溶性化合物,它是自然界中最普遍存在也是最稳定的天然色素。许多天然食物中例如:绿色蔬菜、甘薯、胡萝卜、菠菜、木瓜、芒果等,皆存有丰富的β-胡萝卜素。β-胡萝卜素是一种抗氧化剂,具有解毒作用,是维护人体健康不可缺少的营养素,在抗癌、预防心血管疾病、白内障及抗氧化上有显著的功能,进而防止老化和衰老引起的多种退化性疾病。
传统检测植物内类胡萝卜素的方法主要是薄层层析法和高效液相色谱法(HPLC)。这些方法已成为化学、医学、工业、农学、商检和法检等学科领域中重要的分离分析技术。不论是薄层层析法还是高效液相色谱法,都需要长时间的样品准备过程,色素的萃取提纯对操作者的操作要求比较高,分离效果也会因此打折扣。因此,需要寻求一种更为简单、快速的方法对植物体内的类胡萝卜素进行测量。
发明内容
本发明的目的是为了弥补现有水果品质检测方法所存在的对样品有所损坏、效率偏低、精度不高等缺点,提供了一种利用拉曼光谱检测水果中β-胡萝卜素含量的方法。
本发明中,拉曼光谱是以拉曼效应为基础建立起来的分子结构表征技术,其信号来源于分子的振动和转动,因此可以很便捷的找到特定物质的频移波段,相比于其他光谱学繁杂的特征波段提取有巨大的优势。其分析方法也不需要对样品进行前处理,也没有样品的制备过程,避免了一些误差的产生,并且具有在分析过程中操作简便,测定时间短,灵敏度高等优点。
本发明的具体技术方案如下:
一种利用拉曼光谱检测水果中β-胡萝卜素含量的方法,包括步骤:
1)采集纯度≥95%的β-胡萝卜素粉末样品的拉曼图谱,并确定β-胡萝卜素的拉曼光谱特征峰;
2)选取水果样品,并采集水果样品的拉曼图谱,处理得到β-胡萝卜素特征峰的拉曼光谱;
3)利用高效液相色谱法(HPLC),对梯度浓度为别为0.02μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL的β-胡萝卜素标准溶液进行分析,以得到β-胡萝卜素浓度标准曲线;
4)利用所述的高效液相色谱法(HPLC),对所述水果样品的提取液进行处理,并与所述的β-胡萝卜素浓度标准曲线进行比对,得到所述水果样品中β-胡萝卜素含量的参考值;
5)利用多个样品的β-胡萝卜素特征峰的拉曼光谱以及其所对应放入β-胡萝卜素含量的参考值,建立数学预测模型;
6)利用所述的数学预测模型,以β-胡萝卜素含量未知的样品的拉曼光谱作为输入,即可输出该样品中β-胡萝卜素的含量。
本发明中,由于β-胡萝卜素是9共轭胡萝卜素,标准β-胡萝卜素的拉曼信号包含三个波峰,1003cm-1左右(甲基平面内摆动),1154cm-1左右(C—C全对称伸缩振动模式)和1520cm-1左右(C=C对称伸缩振动模式);其拉曼信号的一致性并不会因为其是在水果内还是溶液中而产生变化,并且拉曼光谱所包含的信息在经过一系列数学映射之后,还可以定量的表征所测物质的含量,因此可以采用拉曼光谱的手段对水果内β-胡萝卜素的含量进行测定。
进一步的,在建立所述的数学预测模型时,输入量为不同成熟阶段水果样品的β-胡萝卜素特征峰的拉曼光谱,包括未成熟阶段、成熟初期阶段和完全成熟阶段,以表现模型在检测不同β-胡萝卜素含量的稳定性。
为确保数学预测模型的准确性,进一步的,在建立所述的数学预测模型时,输入的β-胡萝卜素的拉曼光谱数据应涵盖有效频移范围内以拉曼光谱仪最小分辨率为单位的所有数据,所述的有效频移范围为800.31-2001.92cm-1,共257组数据(n=257)。
本发明中,所述的数学预测模型包括公式(1)和公式(2):
公式(1):
其中,
通过公式(1)推导出B为映射关系矩阵,带入公式(2):
其中,
就可以得到Ypre,未知样品果实内β胡萝卜素的含量;
式中,Acali为拉曼光谱数据矩阵,B为映射关系矩阵,Ycali为HPLC检测β-胡萝卜素含量数据矩阵,Apre为未知样品的拉曼光谱数据矩阵,Ypre为未知样品果实内β胡萝卜素的含量数据矩阵;x为拉曼光谱数据光强值,p为样品序号,q为未知样品序号,n为有效频移段内拉曼数据点序号,b为序号拉曼数据点对应映射关系,y为序号样品HPLC检测β-胡萝卜素参考值。
本发明中,利用拉曼光谱对β-胡萝卜素标准粉末进行检测,以确定β-胡萝卜素拉曼特征峰,可以对比样品β-胡萝卜素提取液的拉曼光谱,以其特征峰的高低,粗略判断不同样品β-胡萝卜素含量的高低。
进一步的,对于所有检测样品,将激光发射器置于暗箱内,待拉曼光谱稳定后,开始采集数据;测光谱仪暗场光谱并保存,扣除暗场背景后,取枇杷果实样品中心位置附近2-3个受测点作为采样点,以两个采样点均值表征该样本的拉曼光谱,并对所有光谱数据均进行高斯平滑预处理,以减少随机误差。
进一步的,在样品接受拉曼光谱检测之后,立即进行化学提取其β-胡萝卜素的提取液,低温保存,并立即送样进行高效液相色谱法(HPLC)检测,以减少期间β-胡萝卜素因其自身的不稳定所造成的损失。
本发明通过拉曼光谱对枇杷果实进行分析,结合高效液相色谱数据,建立枇杷果实中的β-胡萝卜素的数学预测模型,实现β-胡萝卜素的定量检测。这种方法不仅具有易于携带、操作简单、分析快速以及预测精度高等优点,也对未来研制果蔬类胡萝卜素快速、无损、现场检测设备提供了一定的参考,为拉曼光谱检测技术在农产品品质以及安全检测领域的发展奠定了一定的基础。
附图说明
图1为依照HPLC检测图谱特征峰峰面积与β-胡萝卜素梯度浓度标准溶液制得的标准曲线;
图2为激光波长为785nm的激光光源照射β-胡萝卜素标准粉末的拉曼图谱;
图3为激光波长为785nm的激光光源照射47号枇杷果实所得的原始拉曼图谱;
图4为47号枇杷果实原始拉曼图谱经多项式拟合扣除背景后所得的拉曼图谱;
图5为三个不同成熟阶段枇杷果实平均拉曼图谱(背景扣除后);
图6为最小二乘支持向量机(LS-SVM)预测模型对预测集(22个样品)的线性拟合图。
具体实施方式
下面结合附图说明对本发明的检测方法作进行进一步的解释说明。
本实施例中,选取枇杷果实作为检测样本。
枇杷果实样品为杭州塘栖“红毛丫头”,样本采集时间分别为2014年的4月28日、5月8日和5月16日三个时间段,相对应为枇杷果实未成熟阶段、成熟初期阶段以及完全成熟阶段。共获取67个有效样品,各阶段分别为22、22、23个,其中45个为校正集,其余22个为预测集(p=45,q=22)。获取样本之后将样本置于4℃冰箱内保存,在检测前2小时取出置于室温条件下。
本实施例采用的拉曼光谱仪为OceanOptics公司的QE65pro采集枇杷果实的拉曼光谱,该仪器的基础参数包括:
激光波长:785nm;
像素总数:1044×64;
检测波长:779.3-1148.1nm;
光栅常数:H14;
狭缝大小:50μm。
采用高效液相色谱仪获得枇杷果实的β-胡萝卜素含量参考值,型号为岛津公司的LC-20AD型液相色谱仪。其中用到的化学试剂:石油醚(沸程30℃-60℃)、甲醇(色谱纯,分析纯)、丙酮(分析纯)、乙腈(色谱纯)、三氯甲烷。所有提取液均置于-18℃冷冻避光保存。
β-胡萝卜素标准样品来源于Sigma-aldrich公司,纯度大于95%。用于提取拉曼光谱特征频移,并为HPLC提供标准曲线取样点,如图1和图2所示。
针对上述的样本,本实施例的具体步骤如下:
(1)拉曼光谱数据获取;
以785nm激光波长照射β-胡萝卜素标准粉末(纯度≥95%),获得标准β-胡萝卜素粉末样品的拉曼图谱,并以此确定β-胡萝卜素的拉曼光谱特征峰;其中所述β-胡萝卜素的拉曼光谱特征峰位于800-2000cm-1的拉曼频移区间内,具体共有3个成尖峰状的特征峰,分别位于1003.34cm-1左右、1154.19cm-1左右以及1512.44cm-1左右,且光强依次升高。
以785nm激光波长照射枇杷样品,镜头靠紧果实表面,以获得样品的拉曼图谱;其中所述β-胡萝卜素的拉曼光谱特征峰位于800.31-2001.92cm-1的拉曼频移区间内,利用化学计量方法将背景荧光扣除,以获得较为清晰的β-胡萝卜素特征峰的拉曼光谱。
采集时,设置拉曼光谱激发波长为785nm,TEC温度为-20℃,积分时间为5s,平均次数2次,平滑度为3。将激光发射器置于暗箱内,待拉曼光谱稳定后,开始采集数据。首先测光谱仪暗场光谱并保存,扣除暗场背景后,为了减少随机误差,取枇杷果实样本中心位置附近两个受测点作为采样点。以两个采样点均值表征该样本的拉曼光谱,所有光谱数据均进行了高斯平滑预处理,滤波器宽度为3,如图3和图4所示。
对三个成熟阶段的样本分别进行拉曼光谱的采集。每个样本经过表面干燥、去柄、编号、称量、测直径等预处理后,进行拉曼光谱的测量。如图5所示,获取完拉曼光谱之后,用高效液相色谱仪对样本进行β-胡萝卜素的含量进行测定。
(2)高效液相色谱数据获取;
用高效液相色谱(HPLC)法,对不同梯度浓度为0.02μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL的β-胡萝卜素标准溶液进行分析,以得到β-胡萝卜素浓度标准曲线;通过HPLC对水果(枇杷)样品提取液进行处理,并比对β-胡萝卜素浓度标准曲线,以获得对应样品中β-胡萝卜素含量的参考值。
精确称取β-胡萝卜素标准品12.5mg于烧杯中,先用少量三氯甲烷溶解,再用石油醚溶解并洗涤烧杯数次,溶液转入50mL容量瓶中,用石油醚定容,浓度为250μg/mL,置于-18℃储存备用。根据所需浓度取一定量的β-胡萝卜素标准液用甲醇稀释成100μg/mL。β-胡萝卜素在开始着色期间,含量都较低,因此稀释标准溶液浓度至0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL。
枇杷果实中β-胡萝卜素提取液的制备过程参考国标GBT5009.832003。将所获提取液置于-18℃保存,次日样本进行高效液相分析。
所采用高效液相分析参数如下:
色谱柱:SpherisorbC18柱4.6mm×150mm;
流动相:甲醇+乙腈(90+10);
流速:1.2mL/min;波长:448nm;
进样量:10μL。
(3)数学模型优选
本实施例采用了多元线性回归(MLR)、偏最小二乘法回归(PLSR)和最小二乘支持向量机(LS-SVM)对样本的拉曼光谱数据进行分析,建立定量模型。采用校正集相关系数(Rc)、交叉验证均方根误差(RMSECV)、预测集相关系数(Rp)和预测均方根误差(RMSEP)作为比对分析与评价模型的评判标准。
MLR建模输入自变量为三个特征频移对应光强,而PLSR与LS-SVM建模的输入自变量均为拉曼光谱所检测到的有效频移波段对应光强,三种建模方法的输出值均为HPLC所测得的样本内β-胡萝卜素含量。拟在三种化学计量方法中取一种预测精度更高的方法来建立较为可靠的数学预测模型,如图6所示。建模校正集预测集均一致,校正集含45个样品数据,预测集含22个样品数据。
使用的数据处理软件包括Unscrambler10.1(CAMOAS,Oslo,Norway)、MatlabR2013a(TheMathWorks,Natick,MA,USA),Spectrasuite(OceanOptics,USA)。
综合对比MLR模型,PLSR模型和LS-SVM模型的预测精度可知(见表1),不论是从校正集相关系数Rc2还是从预测集相关系数Rp2来看,三种模型中MLR模型预测效果最差,PLSR模型效果次之,LS-SVM效果最佳。试验表明以高效液相色谱(HPLC)检测值作为因变量的LS-SVM模型预测活体枇杷果实内β-胡萝卜素含量精度最高,其Rc2为0.91,证明拉曼光谱能有效的实现对活体枇杷果实内β-胡萝卜素含量的准确、无损、快速的预测。
表1β-胡萝卜素三种模型校正集与预测集结果
以上所述仅为本发明的较佳实施举例,并不用于限制本发明,凡在本发明精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种利用拉曼光谱检测水果中β-胡萝卜素含量的方法,其特征在于,包括步骤:
1)采集纯度≥95%的β-胡萝卜素粉末样品的拉曼图谱,并确定β-胡萝卜素的拉曼光谱特征峰;
2)选取水果样品,并采集水果样品的拉曼图谱,处理得到β-胡萝卜素特征峰的拉曼光谱;
3)利用高效液相色谱法,对梯度浓度为别为0.02μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL的β-胡萝卜素标准溶液进行分析,以得到β-胡萝卜素浓度标准曲线;
4)利用所述的高效液相色谱法,对所述水果样品的提取液进行处理,并与所述的β-胡萝卜素浓度标准曲线进行比对,得到所述水果样品中β-胡萝卜素含量的参考值;
5)利用多个样品的β-胡萝卜素特征峰的拉曼光谱以及其所对应放入β-胡萝卜素含量的参考值,建立数学预测模型;
6)利用所述的数学预测模型,以β-胡萝卜素含量未知的样品的拉曼光谱作为输入,即可输出该样品中β-胡萝卜素的含量。
2.如权利要求1所述的利用拉曼光谱检测水果中β-胡萝卜素含量的方法,其特征在于,在建立所述的数学预测模型时,输入量为不同成熟阶段水果样品的β-胡萝卜素特征峰的拉曼光谱,包括未成熟阶段、成熟初期阶段和完全成熟阶段。
3.如权利要求2所述的利用拉曼光谱检测水果中β-胡萝卜素含量的方法,其特征在于,在建立所述的数学预测模型时,输入的β-胡萝卜素的拉曼光谱数据应涵盖有效频移范围内以拉曼光谱仪最小分辨率为单位的所有数据,所述的有效频移范围为800.31-2001.92cm-1,共257组数据。
4.如权利要求3所述的利用拉曼光谱检测水果中β-胡萝卜素含量的方法,其特征在于,所述的数学预测模型包括公式(1)和公式(2):
公式(1):
其中,
通过公式(1)推导出B为映射关系矩阵,带入公式(2):
其中,
就可以得到Ypre,未知样品果实内β胡萝卜素的含量;
式中,Acali为拉曼光谱数据矩阵,B为映射关系矩阵,Ycali为HPLC检测β-胡萝卜素含量数据矩阵,Apre为未知样品的拉曼光谱数据矩阵,Ypre为未知样品果实内β胡萝卜素的含量数据矩阵;x为拉曼光谱数据光强值,p为样品序号,q为未知样品序号,n为有效频移段内拉曼数据点序号,b为序号拉曼数据点对应映射关系,y为序号样品HPLC检测β-胡萝卜素参考值。
5.如权利要求1所述的利用拉曼光谱检测水果中β-胡萝卜素含量的方法,其特征在于,对于所有检测样品,将激光发射器置于暗箱内,待拉曼光谱稳定后,开始采集数据;测光谱仪暗场光谱并保存,扣除暗场背景后,取枇杷果实样品中心位置附近两个受测点作为采样点,以两个采样点均值表征该样本的拉曼光谱,并对所有光谱数据均进行高斯平滑预处理。
6.如权利要求1所述的利用拉曼光谱检测水果中β-胡萝卜素含量的方法,其特征在于,在样品接受拉曼光谱检测之后,立即进行化学提取其β-胡萝卜素的提取液,低温保存,并立即送样进行高效液相色谱法检测。
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