CN106290295B - 一种利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中叶绿素a含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中叶绿素a含量的方法，包括以下步骤：1)将茶叶样品放在样品台上，采用拉曼光谱仪，获取茶叶样本的拉曼光谱信息，并进行全波段积分校正；2)利用15个特征波数处的拉曼光谱强度建立线性模型；3)采集待测茶叶样本在15个特征波数处的校正光谱强度，利用线性模型，预测茶叶中的叶绿素a含量，实现茶叶叶绿素a含量的无损、快速检测。本发明可快速有效地实现茶叶中叶绿素a含量的快速、无损、低成本、环保地检测，无需对茶叶样本进行复杂的前处理以及化学分析，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，快速获取茶叶中叶绿素a成分的信息，提高了测量的准确率。
Description
技术领域
本发明涉及叶绿素a含量检测技术领域，具体涉及一种利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中叶绿素a含量的方法。
背景技术
植物叶片的功能形状直接反映了植物的生理生长情况及遗传特性，其变化趋势影响着植物与周围环境的物质和能量交换以及植物适应环境变化所形成的生存对策。叶片是植物进行光合作用的主要场所，而光合作用是光能转变为化学能的能量转化过程，是作物产量和品质形成的基础。
【茶树不同叶位叶片功能性状与光合特性研究】中指出叶片是植物光合作用的重要器官，太阳能首先被叶片的色素吸收，绿色植物中含有大量的叶绿素a、b(chlorophyll)。它们不溶于水，但溶于酒精、丙酮和石油醚等。叶绿素a呈蓝绿色而叶绿素b呈黄绿色。叶绿素是植物叶片将光能转化为化学能的物质，直接影响植物对光能的利用及吸收，因此叶绿素的含量是植物被环境胁迫、光合作用高能力和植被发育阶段的指示器。
“宁可一日不食，不可一日无茶。”茶是世界三大饮料之一，茶叶因其清甜的口感，及其利于人体健康的功效，被世界各地的人们所喜爱。我国是茶叶的故乡，也是世界茶叶生产、消费和出口的大国。茶树是一种以收获新梢芽叶为主的多年生经济作物，新梢叶片的功能性状和光合能力直接决定着茶树生长和品质成分的形成。在茶叶的消费和生产中，茶叶的色泽起着举足轻重的作用。茶叶的色泽影响着茶汤的颜色、香气及口味等品质，是茶叶品级优劣评判的最直观的因素。
传统的叶绿素a检测方法包括分光光度计法、高效液相色谱法、原子吸收法等。传统的检测方法具有破坏性、检测步骤繁琐，且无法实现在线检测。同时，茶叶中的叶绿素的性质不是很稳定，在实验过程中容易受光、氧、热的作用而发生改变，传统的化学方法测定茶叶中的叶绿素精确度易受实验条件和实验操作的影响而降低。因此需要一种快速无损检测茶叶中的叶绿素a含量的方法。
发明内容
本发明提供了一种利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中叶绿素a含量的方法，实现了茶叶中叶绿素a含量的快速、无损、低成本检测。
一种利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中叶绿素a含量的方法，包括：
步骤1，采集待测茶叶样本在激发波长532nm时的拉曼光谱，在特征波数处，利用下式计算矫正系数：
K＝(W7-W2)/(W7+W2)
式中，W2为1131cm-1处的拉曼光谱的强度；W7为1510cm-1处的拉曼光谱的强度；
所述特征波数分别为：945cm-1、1131cm-1、1152cm-1、1341cm-1、 1414cm-1、1500cm-1、1510cm-1、1528cm-1、1531cm-1、1828cm-1、2314cm-1、 2701cm-1、2888cm-1、2995cm-1、3058cm-1；
步骤2，在特征波数处，拉曼光谱强度与矫正系数的乘积作为矫正后的拉曼光谱强度；
步骤3，依据下式计算叶绿素a含量：
Y叶绿素a＝7.5426+10-3×(4.446A1+2.000A2-3.494A3-1.347A4
+1.440A5-1.971A6-0.193A7+1.913A8+1.810A9
-2.716A10-2.630A11+2.851A12
-0.977A13-3.444A14+2.315A15)
式中：A1为945cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A2为1131cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A3为1152cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A4为1341cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A5为1414cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A6为1500cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A7为1510cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A8为1528cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A9为1531cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A10为1828cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A11为2314cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A12为2701cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A13为2888cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A14为2995cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A15为3058cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度。
其中，叶绿素a的主要特征峰为1500cm-1、1510cm-1、1528cm-1、1531cm-1附近与v2(C＝C)平面内伸缩振动有关；945cm-1附近与ν4(C-H)平面外摆动相关；1131cm-1、1152cm-1附近与v1(C-C)伸缩振动相关，其余的几个峰中，2314cm-1附近与C-C伸缩振动基频的二级倍频。
拉曼光谱是一种散射光谱，是研究分子振动的一种光谱方法。拉曼光谱具有以下特点：1、可直接测定完整果蔬、果汁、果肉匀浆等；2、激光束聚焦直径小，样品可以是毫克甚至微克的数量级；3、灵活，无需样品预处理，可对果蔬样品进行非接触的无损伤检测；4.快速，可同时对果蔬样品多个组分或指标进行分析；5、拉曼光谱具有指纹光谱特性，选择性强；水是很弱的拉曼散射物质，无需考虑水分子振动的影响。
本发明采用拉曼光谱测量新鲜茶叶中叶绿素a含量，保证测量结果不受茶叶中其他物质的干扰。
多元线性回归分析用来研究一个因变量与一组自变量之间的依存关系，本发明以15个拉曼特征峰的校正强度(即特征波数处矫正后的拉曼光谱强度)作为自变量，以茶叶中叶绿素a含量作为因变量，根据所建立的线性回归模型，实现茶叶中叶绿素a含量的无损、快速检测。
作为优选，每个茶叶样本上选取3个点采集拉曼光谱，依据3条拉曼光谱的平均光谱计算叶绿素a含量。
作为优选，将茶叶样本置于样品台上进行检测，所述样品台包括：
载玻片，用于承载茶叶样本，载玻片的侧缘设有弹簧销；
盖玻片，与载玻片铰接，用于压平茶叶样本；
载物台，顶面设有与载玻片相配合的滑动槽，滑动槽的侧壁上设有与弹簧销相配合以定位载玻片位置的若干插孔。
进行拉曼光谱采集时，将茶叶样本放置在载玻片上，翻转盖玻片，使盖玻片压紧茶叶样本，移动载玻片，使载玻片侧缘的弹簧销与不同位置的插孔相配合，每个插孔对应为茶叶样本的一个检测位点。
盖玻片能够保证茶叶叶片表面的平整，同时保证检测茶叶样本上不同点时，物距尽可能保持一致，保证拉曼检测镜头能够准确定位在茶叶样本表面。
载玻片和盖玻片均采用石英材质。进行拉曼检测时，激发光通过盖玻片照射到茶叶样本表面。
载玻片为矩形，载玻片的两长边分别固定一条滑块，所述弹簧销固定设置在滑块上。盖玻片为矩形，盖玻片的长边与其中一条滑块铰接。
为了方便拉曼光谱的初始矫正，优选地，载玻片上嵌装一块用于光谱的初始矫正的硅片。本发明中的硅片采用单晶硅片。
进行拉曼光谱检测时，首先在532nm激发波长处，采集硅片的拉曼光谱，利用532cm-1处的硅片光谱对拉曼光谱进行初始矫正。
插孔为沿直线排布的四个，其中一个插孔对应硅片的检测位点，其余插孔分别对应茶叶样本的不同检测位点。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)不需要对茶叶样本进行复杂的前处理以及化学分析，大大简化了操作步骤，缩短了检测时间，建立的线性模型准确度高，仅用了15个特征波数，即实现了精确度和稳定性的检测。
2)样品台结构简单，易于实现，成本低，结构和原理比较简单，体积较小，维护的成本低，且检测精度高。
3)具有良好的经济效益，茶叶中叶绿素a含量与茶叶的品质色泽、生理生长以及营养价值等都密切相关，传统的测量手段在提取、检测等方面需要耗费大量的试剂与人力，采用本发明方法能够避免由于操作人员操作不熟练，或者实验过程中温度、光照等造成茶叶色素含量变化等主观因素与客观因素带来的测量结果不准确等后果。
4)本发明方法可以快速、准确的检测茶叶中的叶绿素a含量，可以为茶树栽培和采摘加工中开发快速原位检测的仪器提供有效的手段。
5)环保，不会像传统检测那样消耗大量化学试剂，因此不会对环境造成不利影响。
附图说明
图1为315片茶叶样本的原始拉曼光谱谱线；
图2为建模集与预测集样本的叶绿素a含量的预测值与测量值的散点分布图；
图3为实施例1中样品台的结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐释本发明。
实施例1
本发明提供的样品台结构如图3所示，包括：载玻片2、盖玻片1和载物台3。载玻片2和盖玻片1均采用石英材质。
载玻片2的表面用于放置茶叶样本，载玻片2为矩形，载玻片2的两长边分别固定一条滑块7，每条滑块7上固定有弹簧销，两条滑块7上的弹簧销位置对应。载玻片2上嵌装一块硅片5。
盖玻片1为矩形，盖玻片1的长边与其中一条滑块7铰接，盖玻片1翻转后压紧茶叶样本。盖玻片1用于保持茶叶叶片表面的平整，检测茶叶样本上不同点时，尽量减少物距变化，保证拉曼检测镜头能够准确定位在茶叶样本表面。
载物台3，顶面设有滑动槽4，载玻片2通过滑块7与滑动槽4配合，滑动槽4的侧壁上设有与弹簧销相配合的插孔6。插孔6为沿直线排布的四个，其中插孔6与硅片5的检测位点对应，其余三个插孔6分别对应茶叶样本的一个检测位点。
实施例2
取315片龙井43叶片，针对每个龙井43叶片，分别随机剪取叶脉两侧的叶片，得到两份茶叶样本，每份茶叶样本的质量约为0.1g，剪取完毕后，实际测量并记录湿重。其中一份直接置于袋中，并标号，作为拉曼光谱材料A，另一份剪碎置于离心管中，并标号，加入10mL质量分数为95％的酒精溶液，置于暗室保存约24h，作为紫外分光光度材料B。针对同一茶叶叶片，拉曼光谱材料A与紫外分光光度材料B的标号相同。
将拉曼光谱材料A固定于实施例1所述的拉曼载物台上，采用雷尼绍共聚焦激光显微拉曼仪(Renishaw in Via-Reflex 532/XYZ)，激发波长 532nm；激光强度50mW；积分时间1s；拉曼光谱检测波长范围为 579.175～3061.95cm-1；分辨率0.2nm；选用放大倍数为5x的物镜。
针对每个拉曼光谱材料A检测3个不同位置的点，每个点得到一条拉曼光谱，利用三条拉曼光谱的平均光谱，建立数学模型。具体操作为：将茶叶样本至于载玻片上，盖玻片压平茶叶样本，通过移动滑块带动载玻片移动，滑块上的弹簧销插入不同插孔时，对应茶叶样本上的不同测量位点，分别采集对应的拉曼光谱，然后对拉曼光谱进行平均。整个实验都在恒温 25℃条件下进行。
图1是茶叶样本的原始拉曼光谱，各光谱曲线中，在1155cm-1与1528 cm-1处，都有比较明显的叶绿素a等色素谱峰，另外在1006cm-1和1192cm-1处还有一些小峰，均为茶叶样本内色素对应的特征峰。
在得到的315个茶叶样本中，对315个样本以约3：1的比例进行建模集和预测集的划分。将各茶叶样本按其叶绿素a的化学浓度从小到大的顺序排列，对前312个样本依据次序每八个为一组，从每组中选择第2个、第7个样本归于预测集，余下的样本归于建模集。剩下的3个样本，第313、 315号样本归于建模集，314号样本归于预测集，茶叶样本划分的具体信息如表1所示。
表1
对测得的茶叶样本的拉曼光谱进行校正，首先，获取1131cm-1和 1510cm-1处的拉曼强度，然后依据K＝(W7-W2)/(W7+W2)计算矫正系数K，式中，W2为1131cm-1处的拉曼强度，W7为1510cm-1处的拉曼强度。
通过对拉曼光谱强度进行校正，能够减少拉曼光谱受激光强度、积分强度和不同仪器测定时不同基线漂移的影响，大大提高了测试的准确性。
通过某一个测试样本的Raman光谱很难准确的确定叶绿素a的特征指纹峰，本发明通过对大样本进行统计学分析，能够准确的找出叶绿素a卜素振动相关的特征指纹峰(即特征波数)，选取15个特征波数分别为： 945cm-1、1131cm-1、1152cm-1、1341cm-1、1414cm-1、1500cm-1、1510cm-1、 1528cm-1、1531cm-1、1828cm-1、2314cm-1、2701cm-1、2888cm-1、2995cm-1、3058cm-1，计算每个特征波数处的拉曼光谱的强度与矫正系数的乘积，得到矫正后的拉曼强度。
针对建模集样品，采用紫外分光光度计测量得到各茶叶样品中的叶绿素a含量作为叶绿素a含量的测量值，依据叶绿素a含量的测量值，以及 15个特征波数处矫正后的拉曼强度，建立线性回归模型，线性回归模型如下：
Y叶绿素a＝7.5426+10-3×(4.446A1+2.000A2-3.494A3-1.347A4
+1.440A5-1.971A6-0.193A7+1.913A8+1.810A9
-2.716A10-2.630A11+2.851A12
-0.977A13-3.444A14+2.315A15)
式中：A1为945cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A2为1131cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A3为1152cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A4为1341cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A5为1414cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A6为1500cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A7为1510cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A8为1528cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A9为1531cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A10为1828cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A11为2314cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A12为2701cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A13为2888cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A14为2995cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A15为3058cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度。
针对建模集样品，将15个特征波数处矫正后的拉曼强度代入线性回归模型中，计算得到叶绿素a含量的预测值。
针对预测集样品，采用紫外分光光度计测量得到各茶叶样品中的叶绿素a含量作为叶绿素a含量的测量值，将15个特征波数处矫正后的拉曼强度代入建模集样品建立的线性回归模型中，计算得到叶绿素a含量的预测值。
图2为建模集与预测集中各个茶叶样本的叶绿素a卜素含量的预测值与测量值的散点分布图，其中圆代表建模集中的茶叶样本，三角形代表预测集中的茶叶样本，横坐标代表茶叶样本的叶绿素a含量的真实值(即测量值)，纵坐标代表叶绿素a含量的预测值。
从图2可以看出，采用上述方法得到的建模集和预测集样本的叶绿素 a含量预测值与真实值呈明显的线性关系，且建模集和预测集的相关系数见表2，相关系数在0.80以上。相关系数为在因变量的总平方和中，由自变量引起的平方和所占的比例的平方根，其值越大，自变量对因变量的解释程度越高，均方根误差为预测值与测量值偏差的平方和与观测次数间比值的平方根，能够很好地反映出预测的精确度，值越小精度越高，由表2 可以看出本实施例提供的能够获得可靠的叶绿素a含量。
表2
| 相关系数 | 均方根误差 | |
| 建模集 | 0.8647 | 0.6630 |
| 预测集 | 0.8389 | 0.7178 |
针对待检测的茶叶样本，获取茶叶样本在设定波数范围内以硅片为衬底时的拉曼光谱，计算该拉曼光谱在15个特征波数处的强度与矫正系数的乘积，代入建立的线性模型中计算待检测茶叶样本中叶绿素a的含量。
以上所述的具体实施方式对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的最优选实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中叶绿素a含量的方法，其特征在于，包括：
步骤1，采集待测茶叶样本在激发波长532nm时的拉曼光谱，在特征波数处，利用下式计算矫正系数：
K＝(W7-W2)/(W7+W2)
式中，W2为1131cm-1处的拉曼光谱的强度；W7为1510cm-1处的拉曼光谱的强度；
所述特征波数分别为：945cm-1、1131cm-1、1152cm-1、1341cm-1、1414cm-1、1500cm-1、1510cm-1、1528cm-1、1531cm-1、1828cm-1、2314cm-1、2701cm-1、2888cm-1、2995cm-1、3058cm-1；
步骤2，在特征波数处，拉曼光谱强度与矫正系数的乘积作为矫正后的拉曼光谱强度；
步骤3，依据下式计算叶绿素a含量：
Y叶绿素a＝7.5426+10-3×(4.446A1+2.000A2-3.494A3-1.347A4+1.440A5-1.971A6-0.193A7+1.913A8+1.810A9-2.716A10-2.630A11+2.851A12-0.977A13-3.444A14+2.315A15)
式中：A1为945cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A2为1131cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A3为1152cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A4为1341cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A5为1414cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A6为1500cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A7为1510cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A8为1528cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A9为1531cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A10为1828cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A11为2314cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A12为2701cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A13为2888cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A14为2995cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
A15为3058cm-1处的矫正后的拉曼光谱强度；
将茶叶样本置于样品台上进行检测，所述样品台包括：
载玻片，用于承载茶叶样本，载玻片的侧缘设有弹簧销；
盖玻片，与载玻片铰接，用于压平茶叶样本；
载物台，顶面设有与载玻片相配合的滑动槽，滑动槽的侧壁上设有与弹簧销相配合以定位载玻片位置的若干插孔。
2.如权利要求1所述的利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中叶绿素a含量的方法，其特征在于，每个茶叶样本上选取3个点采集拉曼光谱，依据3条拉曼光谱的平均光谱计算叶绿素a含量。
3.如权利要求1所述的利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中叶绿素a含量的方法，其特征在于，载玻片和盖玻片均采用石英材质。
4.如权利要求1所述的利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中叶绿素a含量的方法，其特征在于，载玻片为矩形，载玻片的两长边分别固定一条滑块，所述弹簧销固定设置在滑块上。
5.如权利要求4所述的利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中叶绿素a含量的方法，其特征在于，盖玻片为矩形，盖玻片的长边与其中一条滑块铰接。
6.如权利要求1所述的利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中叶绿素a含量的方法，其特征在于，载玻片上嵌装一块用于光谱的初始矫正的硅片。
7.如权利要求1所述的利用共聚焦显微拉曼检测茶叶中叶绿素a含量的方法，其特征在于，插孔为沿直线排布的四个，其中一个插孔对应硅片的检测位点，其余插孔分别对应茶叶样本的不同检测位点。
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Non-Patent Citations (2)
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|---|
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN106290295A (zh) | 2017-01-04 |
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