CN113376286A - 一种评估提取纯化方法亲疏水偏好性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种评估提取纯化方法亲疏水偏好性的方法，设置至少两组外源肽段标品，每组外源肽段标品至少包含三种不同亲疏水偏好性的肽段，并且每一组中每种肽段在另一组中均有序列一致，但是同位素标记不同的对应肽段；样品提取纯化处理中任一步骤可以加入外源肽段标品作为检测标品；最后一组外源肽段标品作为标定标品在样本提取完毕后加入，通过液相质谱检测；计算不同亲疏水偏好性肽段的得率比值，将其进行比对，比值减少明显的，即为某步骤处理后或者整体方法对该性质肽段的选择性较弱。本方法能够直观、定量评估样本提取纯化过程中的不同性质样本的损失情况，以及不同提取纯化实验方法对样本中不同极性物质分布比例的改变影响。

Description

一种评估提取纯化方法亲疏水偏好性的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体地，涉及一种评估分子提取纯化方法亲疏水偏好性的方法。
背景技术
随着检测技术的高速发展，各种组学技术，包括蛋白组、肽组、代谢组等都在快速发展。对于各种组学技术来说，合适的提取纯化方法，可以有效地减少其他物质的影响，充分的保留目标物质丰富性和分布状态。由于组学样本中存在一系列不同物质，且存在不同极性性质，如果提取方法存在亲疏水偏好性，则将造成非偏好性的物质大量丢失，而偏好性的物质高度富集，则目标样本的丰富性将减少，比例真实性也将失真。
目前，对于组学样本提取纯化的亲疏水性的评估大多基于经验来判断结果，没有一个合适的方法可以直观、定量进行评估。
发明内容
发明目的：为解决上述技术问题，本发明提供了一种评估提取纯化方法亲疏水偏好性的方法。
技术方案：一种评估提取纯化方法亲疏水偏好性的方法，包括以下步骤：
(1)设置至少两组外源肽段标品，每组外源肽段标品至少包含三种不同亲疏水偏好性的肽段，并且每一组中每种肽段在另一组中均有序列一致，但是同位素标记不同的对应肽段；
(2)样本提取纯化完毕后，加入一组外源肽段标品作为标定标品，通过液相质谱进行检测；其他组外源肽段标品作为检测标品，可在样品提取纯化处理中任一步骤加入；
(3)定量检测标品与标定标品，将检测标品的肽段丰度除以标定标品的肽段丰度，可以得到不同亲疏水偏好性肽段的得率比值，将其进行比对，比值减少明显的，即为某步骤处理后或者整体方法对该性质肽段的选择性较弱。
作为优选或具体的实施方式：
步骤(1)中，所述每组外源肽段标品至少包含三种不同亲疏水偏好性的肽段，其中所述三种不同亲疏水偏好性的肽段的比例在每组中均相同。
步骤(1)中，所述每组外源肽段检测标品至少包含三种不同亲疏水偏好性的肽段，其中所述不同亲疏水偏好性的肽段包括单独存在的肽段或者是肽段串联起来的以酶切位点为间隔的长肽段或蛋白，但是标定标品中必须包含不同亲疏水偏好性的单独存在的肽段。
步骤(1)中，所述每一组中每种肽段在另一组中均有序列一致，但是同位素标记不同的对应肽段，其中所述同位素标记不同包括：一组中肽段没有同位素标记，其他组中有同位素标记，但各组用以标记的同位素也不相同；或者各组中肽段都有同位素标记，但各组用以标记的同位素不相同。
步骤(2)中，所述标定标品加入量与样本的比例浓度和检测标品加入量与样本的比例浓度相同。
步骤(2)中，所述提取纯化处理涉及方法可以包括：萃取，沉淀，过滤或吸附等。
步骤(2)中，所述样本包括肽组、代谢组及能够被酶切为各种亲疏水肽段的蛋白质或蛋白质组。
本发明方法中，样本处理中加入的检测标品组与上机前加入的标定标品组中每种肽段的比例一致。因此，通过检测标品中肽段与其相对应的标定标品中肽段的质谱定量信号，对比不同性质肽段的得率(检测标品中的肽段丰度除以标定标品中对应的肽段丰度)，可以判断样本处理过程中亲、疏水肽段损失量。该方法不仅能够实现分步监测，评估提取纯化操作过程中的不同性质样品的损失情况；而且还能够评估不同提取纯化方法对样本中不同极性物质分布比例的改变影响。所述样品包括肽组、代谢组及能够被酶切为各种亲疏水肽段的蛋白质或蛋白质组等。
有益效果：与现有方法相比，本方法可以直观、定量评估提取纯化方法的亲疏水偏好性对样本造成的影响，从而评估样本操作过程中的不同性质物质的损失情况(并排除样本本身差异性造成的比例不一)，进一步可以指导提取纯化方法的改良，也可以用于评估不同提取纯化实验方法对样本中不同极性物质分布比例的改变影响。
附图说明
图1为本发明评估方法的流程示意图。
图2为实施例1的实验流程示意图。
具体实施方式
以下对本发明方案进行全面的描述，所述的实施案例是本发明中最优选实施方式，但本发明并不限于以下实施例。
实施例
(1)设置一组肽段包括3个肽段：LGQVGNETR，TPGGPYVISEYR，LFGAQLQPFLFGSR，分别对应亲水、中性、疏水肽段；
(2)将3个肽段及其相应的同位素标记肽段(R用C14标记)，按照浓度1:1:1进行配比，检测标品肽段组和标定标品肽段组分别稀释到浓度为1000fmol/uL，100fmol/uL；
(3)在蛋白质组样品提取完成后，取100ug蛋白质组样品2组，分别加入2uL胰蛋白酶，用50mM NH4HCO3溶液补齐至20uL体系，37℃酶解过夜；
(4)向样品中分别加入1uL1000 fmol/uL检测标品肽段组，加入900uL 0.1％甲酸水溶液，混匀；
(5)取SPE C18 1mL除盐柱，按如下顺序加入：甲醇1mL，0.1％甲酸1mL*2次，上样*2遍，0.1％甲酸1mL*3次，分别使用70％乙腈和80％乙腈1mL洗脱样品，获得样品1和样品2；
(6)将洗脱样品进行离心真空冷冻干燥；
(7)向样品管中分别加入50uL 2％乙腈，充分震荡混匀；
(8)分别取10uL样品，加入2uL 100fmol/uL同位素标记的标定标品肽段组，再加入8uL 2％乙腈补齐体系至20uL；
(9)分别进样5uL至液相质谱进行150min DIA数据采集；流动相A为2％乙腈、0.1％甲酸水溶液，流动相B为80％乙腈和0.1％甲酸水溶液；设置梯度为0-5min，3％B，5-140min，3％-90％B，140-150min，90％-3％B；
(10)使用Spectronaut软件对采集数据进行分析：
表1.样品1抽提3个肽段标品的定量信息
肽段 检测标品肽段 标定标品肽段 比例 保留时间
1 LGQVGNETR 20,453,352 23,509,600 0.87 8.6min
2 TPGGPYVISEYR 20,885,710 23,467,090 0.89 72.2min
3 LFGAQLQPFLFGSR 17,634,520 26,320,180 0.67 137.7min
表2.样品2抽提3个肽段标品的定量信息
肽段 检测标品肽段 标定标品肽段 比例 保留时间
1 LGQVGNETR 21,066,953 24,144,359 0.87 8.4min
2 TPGGPYVISEYR 21,554,053 23,983,366 0.90 72min
3 LFGAQLQPFLFGSR 22,086,053 26,609,702 0.83 137.6min
表3.样品1、2中抽提部分样品肽段定量信息
肽段 样品1 样品2 比例1vs2 保留时间
VSGSPSSGFR 16,062,870 16,559,660 0.97 19.1
LEEEGQSLKDEMAR 26,175,648 26,189,950 0.99 43.4
FSGSGSGTDFTLK 20,102,905 21,386,070 0.94 65.3
LLSAEFLEQHYDR 15,538,409 15,855,520 0.98 88.4
DSHSLTTNIMEILR 14,820,577 17,233,230 0.86 128.4
LEVAPISDIIAIK 11,320,605 15,094,140 0.75 137.6
通过分析比例数据，发现样品1和样品2中肽段1、2定量比例都接近，而样品中肽段3定量比例明显偏小，而样品2中肽段3定量比例接近于肽段1、2，说明在使用SPE C18 1mL柱纯化时，使用低比例乙腈洗脱，会造成肽段3损失偏大；表3中，样品1、2中相同肽段定量比例大部分接近1，而保留时间靠后的肽段，相对应的疏水性肽段比例较低，表明疏水性肽段会损失较多；说明70％乙腈未能充分洗脱吸附于SPE C18柱上的疏水性肽段，而提高乙腈比例以达到优化洗脱效率。

Claims (7)

1.一种评估提取纯化方法亲疏水偏好性的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)设置至少两组外源肽段标品，每组外源肽段标品至少包含三种不同亲疏水偏好性的肽段，并且每一组中每种肽段在另一组中均有序列一致，但是同位素标记不同的对应肽段；
(2)样本提取纯化完毕后，加入一组外源肽段标品作为标定标品，通过液相质谱进行检测；其他组外源肽段标品作为检测标品，可在样品提取纯化处理中任一步骤加入；
(3)定量检测标品与标定标品，将检测标品的肽段丰度除以标定标品的肽段丰度，可以得到不同亲疏水偏好性肽段的得率比值，将其进行比对，比值减少明显的，即为某步骤处理后或者整体方法对该性质肽段的选择性较弱。
2.根据权利要求1所述的评估提取纯化方法亲疏水偏好性的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述每组外源肽段标品至少包含三种不同亲疏水偏好性的肽段，其中所述三种不同亲疏水偏好性的肽段的摩尔比例在每组中均相同。
3.根据权利要求1所述的评估提取纯化方法亲疏水偏好性的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述每组外源肽段标品至少包含三种不同亲疏水偏好性的肽段，其中所述不同亲疏水偏好性的肽段包括单独存在的肽段或者是肽段串联起来的以酶切位点为间隔的长肽段或蛋白，但是标定标品中必须包含不同亲疏水偏好性的单独存在的肽段。
4.根据权利要求1所述的评估提取纯化方法亲疏水偏好性的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述每一组中每种肽段在另一组中均有序列一致，但是同位素标记不同的对应肽段，其中所述同位素标记不同包括：一组中肽段没有同位素标记，其他组中有同位素标记，但各组用以标记的同位素也不相同；或者各组中肽段都有同位素标记，但各组用以标记的同位素不相同。
5.根据权利要求1所述的评估提取纯化方法亲疏水偏好性的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述标定标品加入量与样本的比例浓度和检测标品加入量与样本的比例浓度相同。
6.根据权利要求1所述的评估提取纯化方法亲疏水偏好性的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述提取纯化处理涉及方法可以包括：萃取，沉淀，过滤或吸附等。
7.根据权利要求1所述的评估提取纯化方法亲疏水偏好性的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述样本包括肽组、代谢组及能够被酶切为各种亲疏水肽段的蛋白质或蛋白质组。
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