CN103884569B - 水牛卵泡液多肽组的制备和质谱分析方法 - Google Patents

水牛卵泡液多肽组的制备和质谱分析方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103884569B
CN103884569B CN201310595339.6A CN201310595339A CN103884569B CN 103884569 B CN103884569 B CN 103884569B CN 201310595339 A CN201310595339 A CN 201310595339A CN 103884569 B CN103884569 B CN 103884569B
Authority
CN
China
Prior art keywords
follicular fluid
polypeptide group
preparation
mass spectrometry
babalus bubalis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201310595339.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103884569A (zh
Inventor
张明
付强
黄愉淋
黄德伦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi University
Original Assignee
Guangxi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi University filed Critical Guangxi University
Priority to CN201310595339.6A priority Critical patent/CN103884569B/zh
Publication of CN103884569A publication Critical patent/CN103884569A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103884569B publication Critical patent/CN103884569B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)

Abstract

本发明公开了一种水牛卵泡液多肽组的制备和质谱分析方法，先通过合理浓度的乙腈沉淀水牛卵泡液中的高丰度蛋白质，可有效去除高丰度蛋白质对检测的干扰，再通过不同孔径的超滤管多次过滤、截留不同分子量的多肽，能有效富集多肽组样品；脱盐处理后，用飞行时间质谱仪分析多肽组指纹图谱，在质谱检测时，通过合适的质谱分析条件，能高通量鉴定卵泡液多肽组信息。本发明精确、高效、费用低，实现了对水牛卵泡液中多肽组的高效制备和质谱检测，其检测结果可用于分析成熟卵泡液和未成熟卵泡液中多肽组组分鉴定和差异分析，发明人据此发现了一批与卵母细胞成熟微环境卵泡液的生物标志物。

Description

水牛卵泡液多肽组的制备和质谱分析方法
技术领域
本发明属于多肽组学技术领域，尤其涉及一种水牛卵泡液多肽组的制备和质谱分析方法。
背景技术
目前，随着生物学领域中蛋白质组学研究的深入，研究者们发现一类由氨基酸组成但又与蛋白质不同的物质，这类物质具有蛋白质特性，被称为多肽。在分类上，10个氨基酸以下组成的肽链称为寡肽，10个氨基酸以上称为多肽，在科研领域中，分子量小于10KDa的蛋白质被划分为多肽范畴。多肽是生命信息的体现者，各种生理变化和生化反应都有多肽参与。体内存在有上万种多肽，几乎所有的细胞生命周期都受多肽调节，涉及激素、神经递质、生殖生理等各个生命研究领域。多肽组学是研究体液（血液、脑脊液、卵泡液、尿液等）内全部多肽的一门学科，通过多肽分离和质谱鉴定技术精确地识别所有多肽信息，对于明确其前体蛋白质和生物来源具有重要的意义，多肽指纹图谱也逐渐被称为医疗领域内病理诊断指标。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种水牛卵泡液多肽组的制备和质谱分析方法。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：水牛卵泡液多肽组的制备方法，包括以下步骤：
（1）水牛卵泡液离心去除细胞碎片其他杂质，取上清液400μL，按体积比1:4向上清液中添加无水乙腈，沉淀并离心去除高丰度蛋白质；
（2）将步骤（1）所得沉淀并去除高丰度蛋白质后的样品转移至30000道尔顿超滤管上层，低温离心，取超滤管下层溶液；
（3）将步骤（2）所得下层溶液转移至10000道尔顿超滤管，低温离心，取超滤管下层溶液。
步骤（1）中水牛卵泡液离心采用3000×g离心15min。
步骤（1）中添加无水乙腈后室温25℃静置30min，离心去除采用8000×g离心15min。
步骤（2）和（3）中低温离心采用4℃、8000×g离心30min。
上述水牛卵泡液多肽组的质谱分析方法，其特征在于包括以下步骤：
（4）将步骤（3）所得下层溶液真空冷冻浓缩至20微升，用微量碳18反相色谱吸附柱脱盐处理；
（5）将步骤（4）得到的脱盐样品点在基质辅助激光解离串联飞行时间质谱仪的384样品孔靶上，待点靶样品干燥后，覆盖0.5微升芥子酸饱和溶液，氮气吹干；
（6）在质谱中设置合适的参数采集多肽组指纹图谱。
步骤（6）中质谱参数为加速电压2kV，使用标准品校正仪器质量轴和质量精确度小于0.3道尔顿；一级质谱激光强度为4200，完成一级数据采集后，动态选取20个最强的母离子进行二级质谱分析，二级质谱激光强度为4500，碰撞方式为源内诱导裂解。
发明人针对水牛卵泡液成分复杂难分析的问题，建立了一种水牛卵泡液多肽组的制备和质谱分析方法，先通过合理浓度的乙腈沉淀水牛卵泡液中的高丰度蛋白质，可有效去除高丰度蛋白质对检测的干扰，再通过不同孔径的超滤管多次过滤、截留不同分子量的多肽，能有效富集多肽组样品；脱盐处理后，用飞行时间质谱仪分析多肽组指纹图谱，在质谱检测时，通过合适的质谱分析条件，能高通量鉴定卵泡液多肽组信息。本发明精确、高效、费用低，实现了对水牛卵泡液中多肽组的高效制备和质谱检测，其检测结果可用于分析成熟卵泡液和未成熟卵泡液中多肽组组分鉴定和差异分析，发明人据此发现了一批与卵母细胞成熟微环境卵泡液的生物标志物。
附图说明
图1是应用本发明获得的成熟卵泡液和未成熟卵泡液中多肽组表达模式图，图中IMFF：未成熟卵泡液；MFF：成熟卵泡液。
具体实施方式
以下所用的试剂乙腈、芥子酸、水都是色谱纯，购自Sigma-Aldrich或Fisher试剂公司；30kDa、10kDa超滤管购自Millipore公司；质谱仪中离子化方式是基质辅助激光解吸附串联飞行时间质谱仪（Matrix-assisted Laser desorption ionization，MALDI），质谱为应用生物系统公司4800型飞行时间质谱仪。
实施例1
从屠宰场获取的水牛卵巢，将卵巢上卵泡按直径分为2个组：1）未成熟卵泡（直径<8mm）；2）成熟卵泡（直径>8mm）。使用注射器抽取水牛卵巢表面卵泡内的卵泡液分别收集，并将不同个体的卵巢内相同组别的样品混合，用于消除个体误差。按以下方法分别进行检测。
（1）水牛卵泡液离心（3000×g，15min）去除细胞碎片其他杂质，取上清液400μL，弃掉下层细胞碎片，按体积比1:4向上清液中添加无水乙腈，室温25℃静置30min，使大分子量的蛋白质沉淀，沉淀并离心（8000×g，15min）去除高丰度蛋白质；
（2）取30kDa超滤管，用500μL Milli-Q H2O润洗超滤管2次，将步骤（1）所得沉淀并去除高丰度蛋白质后的样品转移至30kDa超滤管上层，低温离心（4℃，8000×g，30min），使大于30kDa的蛋白质和多肽被截留在上层，超滤至下层的卵泡液分子量均低于30kDa，取超滤管下层溶液；
（3）取10kDa超滤管，用500μL Milli-Q H2O润洗超滤管2次，将步骤（2）所得下层溶液转移至10kDa超滤管，低温离心（4℃，8000×g，30min），使大于10kDa的蛋白质和多肽被截留在上层，超滤至下层的卵泡液分子量均低于10kDa，取超滤管下层溶液，得分子量低于10kDa的水牛卵泡液的全部多肽。
（4）将步骤（3）所得下层溶液真空冷冻浓缩至20微升，用微量碳18反相色谱吸附柱（C18ZipTip，Millipore公司）脱盐处理，去除多肽混合液的小分子无机盐；
（5）将步骤（4）得到的脱盐样品0.5μL点在基质辅助激光解离串联飞行时间质谱仪（MALDI-TOF）的384样品孔靶上，待点靶样品干燥后，覆盖0.5微升芥子酸饱和溶液，氮气吹干；
（6）在质谱中设置合适的参数采集多肽组指纹图谱：加速电压2kV，使用标准品校正仪器质量轴和质量精确度小于0.3道尔顿；一级质谱激光强度为4200，完成一级数据采集后，动态选取20个最强的母离子进行二级质谱分析，二级质谱激光强度为4500，碰撞方式为源内诱导裂解（CID）。
最后，使用MASCOT算法将质谱采集得到的原始数据用于搜库分析，使用数据库为NCBInr蛋白质数据库。设置酶切参数为无酶切，修饰类型为氧化修饰和烷基化修饰。
对测得的卵泡液多肽谱图进行数据检测和比较分析，共鉴定249个多肽，对应68个蛋白质（表1），其中在成熟卵泡液中特异表达的28个，在未成熟卵泡液中特异表达的18种，在两类卵泡液中共同表达的22种（图1）。
表1成熟卵泡液和未成熟卵泡液鉴定蛋白质种类表

Claims (6)

1.一种水牛卵泡液多肽组的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)水牛卵泡液离心去除细胞碎片其他杂质，取上清液400μL，按体积比1:4向上清液中添加无水乙腈，沉淀并离心去除高丰度蛋白质；
(2)将步骤(1)所得沉淀并去除高丰度蛋白质后的样品转移至30000道尔顿超滤管上层，低温离心，取超滤管下层溶液；
(3)将步骤(2)所得下层溶液转移至10000道尔顿超滤管，低温离心，取超滤管下层溶液。
2.根据权利要求1所述的水牛卵泡液多肽组的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述水牛卵泡液离心采用3000×g离心15min。
3.根据权利要求1所述的水牛卵泡液多肽组的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述添加无水乙腈后室温25℃静置30min，所述离心去除采用8000×g离心15min。
4.根据权利要求1所述的水牛卵泡液多肽组的制备方法，其特征在于：步骤(2)和(3)中低温离心采用4℃、8000×g离心30min。
5.一种水牛卵泡液多肽组的质谱分析方法，其特征在于包括以下步骤：
(4)将权利要求1所述步骤(3)所得下层溶液真空冷冻浓缩至20微升，用微量碳18反相色谱吸附柱脱盐处理；
(5)将步骤(4)得到的脱盐样品点在基质辅助激光解离串联飞行时间质谱仪的384样品孔靶上，待点靶样品干燥后，覆盖0.5微升芥子酸饱和溶液，氮气吹干；
(6)在质谱仪中设置合适的参数采集多肽组指纹图谱。
6.根据权利要求5所述水牛卵泡液多肽组的质谱分析方法，其特征在于：步骤(6)中质谱参数为加速电压2kV，使用标准品校正仪器质量轴和质量精确度小于0.3道尔顿；一级质谱激光强度为4200，完成一级数据采集后，动态选取20个最强的母离子进行二级质谱分析，二级质谱激光强度为4500，碰撞方式为源内诱导裂解。
CN201310595339.6A 2013-11-21 2013-11-21 水牛卵泡液多肽组的制备和质谱分析方法 Active CN103884569B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310595339.6A CN103884569B (zh) 2013-11-21 2013-11-21 水牛卵泡液多肽组的制备和质谱分析方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310595339.6A CN103884569B (zh) 2013-11-21 2013-11-21 水牛卵泡液多肽组的制备和质谱分析方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103884569A CN103884569A (zh) 2014-06-25
CN103884569B true CN103884569B (zh) 2017-03-22

Family

ID=50953588

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310595339.6A Active CN103884569B (zh) 2013-11-21 2013-11-21 水牛卵泡液多肽组的制备和质谱分析方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103884569B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108191953B (zh) * 2018-03-09 2022-04-05 广西大学 一种高效富集水牛细胞蛋白质的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Growing trend of CE at the omics level: The frontier of systems biology;Eulsik Oh et. al.;《Electrophoresis》;20101231;第31卷;74-92 *
Proteome analysis of human follicular fluid;Stefania Angelucciet. al.;《Proteome analysis of human follicular fluid》;20060914;第1764卷;1775-1785 *
Specific peptide patterns of follicular fluids at different growth stages analyzed by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry;Ai-Xia Liu et. al.;《Biochimica et Biophysica Acta》;20060721;第1770卷;29-38 *
不同品种牛卵泡液对水牛卵母细胞体外受精效果的影响;庞春英 等;《中国畜牧兽医》;20101231;第37卷(第4期);162-166 *
利用MALDI-TOF质谱比较水牛卵泡液多肽变化的研究;付强等;《中国畜牧兽医》;20121231;第39卷(第1期);132-136 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103884569A (zh) 2014-06-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6528320B2 (en) Method and apparatus for desorption and ionization of analytes
CA2467144A1 (en) System of analyzing complex mixtures of biological and other fluids to identify biological state information
Magni et al. Biomarkers discovery by peptide and protein profiling in biological fluids based on functionalized magnetic beads purification and mass spectrometry
Horgan et al. An overview of proteomic and metabolomic technologies and their application to pregnancy research
US20220028676A1 (en) Multiplexed inductive ionization systems and methods
Nickerson et al. Recent advances in top‐down proteome sample processing ahead of MS analysis
CN105699476A (zh) 一种多肽化衍生方法及其在maldi-tof-ms检测小分子化合物中的应用
CN100439918C (zh) 对微量蛋白质或多肽同步富集、脱盐并直接进行分析的方法
EP3270152A1 (en) Kit for preparing sample for detecting monoclonal antibody
CN103776891A (zh) 一种检测差异表达蛋白质的方法
CN106324115B (zh) 一种基于二级质谱的全离子监测定量方法
Tang et al. In-depth analysis of a plasma or serum proteome using a 4D protein profiling method
Helena et al. Current applications of capillary electrophoresis‐mass spectrometry for the analysis of biologically important analytes in urine (2017 to mid‐2021): A review
CN102788833B (zh) 一种检测低丰度低分子量蛋白谱的试剂盒
CN103884569B (zh) 水牛卵泡液多肽组的制备和质谱分析方法
US20050196789A1 (en) Preparation of biologically derived fluids for biomarker determination by mass spectrometry
CN103134852A (zh) 一种核酸适配体靶上富集和激光酶解检测蛋白质的方法
CN111635921A (zh) 用于蛋白质组学分析的样本制备方法
CN110045053A (zh) 一种适用于血液中苯丙胺类药物分析的QuEChERS前处理方法
JP2013076629A (ja) α２，６−シアロ糖鎖とα２，３−シアロ糖鎖とを識別する方法
CN113406183B (zh) 基于离子淌度质谱仪高效识别青霉胺手性对映体的方法
CN114839253A (zh) 血清或血浆中低分子量蛋白定量分析方法及应用
CN114593979A (zh) 一种基于质谱检测体液样本里中低丰度蛋白的方法
RU2216021C2 (ru) Способы ретентатной хроматографии для разделения аналитов в образце
Ek et al. Electrospray ionization mass spectrometry from discrete nanoliter‐sized sample volumes

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant