CN104407082A - 一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法 - Google Patents
一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法，采用高效液相色谱（HPLC）分离、电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱（ESI-Q-TOF-MS）同时测定银杏叶中多种烷基酚类化合物的含量。本发明建立的一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法，能够同时检测银杏叶、银杏叶提取物及银杏制剂中31种致敏的烷基酚类化合物，其中包括：22种银杏酸类化合物、3种雷锁酸类化合物及6种漆酚类化合物，比目前已有的银杏烷基酚类化合物分析方法有更强的分析能力，能够有效提高对银杏叶原料及制剂加工半成品和成品的质控水平，这对于保证临床用药安全具有积极的意义。
Description
技术领域
本发明属于药物成分的分析技术领域，具体涉及一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法。
背景技术
银杏叶作为银杏树的树叶，具有很高的药用价值，对改善脑功能障碍、动脉硬化、高血压、眩晕、耳鸣、头痛、老年痴呆、记忆力减退等有明显效果，其防病、治病、健身的价值在明代李时珍的《本草纲目》中早有记载，是目前世界公认的治、防心脑血管疾病最理想的药物成份。
中医学上使用银杏叶提取物制成制剂，作为临床实际使用的药物，用于防治缺血性心脑血管疾病效果确切，市场需求大。然而，银杏叶提取物制剂在临床应用中出现了多起过敏反应，Jaggy H等(Chemistry and biology of alkylphenols from Ginkgo biloba L.Pharmazie,52:735-738，1997)、Hausen B.M等(The Sensitizing Capacity of Ginkgolic Acids in Guinea Pigs.Am.J.Contact.Dermat.,9:146-148，1998)、Koch E等(Evidence for immunotoxic effects of crudeGinkgo biloba L.leaf extracts using the popliteal lymph node assay in the mouse.Int.J.Immunopharmacol.,22:229-236，2000)通过实验研究发现引起上述过敏反应的物质为银杏叶中的烷基酚类化合物，包括银杏酸(Ginkgolic acids)、雷锁酸(Resorcylic acids)、漆酚(Urushiols)类化合物等。因此，有必要对这些化合物成分的含量进行有效检测，以便于在银杏叶提取物制剂制备过程中进行去除。
目前，中国药典中仅围绕银杏酸类中的银杏酸C13:0、C15:0、C15:1、C17:1及C17:2化合物，制定银杏叶提取物中总银杏酸浓度检测方法，并规定该浓度应<10ppm，并未提及如何检测银杏叶提取物中其它烷基酚类化合物的含量。因此建立一种能够全面分析银杏叶原料药、提取物中间体及其制剂中银杏烷基酚类化合物含量的方法，对于提高制剂加工生产中的质控水平、临床合理用药均具有积极意义，非常值得深入探讨。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法，用于解决现有技术中缺乏全面分析银杏叶原料药、提取物中间体及其制剂中致敏的烷基酚类化合物(银杏酸类、雷锁酸类、漆酚类)含量的方法的问题。
为实现上述目的，本发明提供一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法，采用高效液相色谱(HPLC)分离、电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)同时测定银杏叶中多种烷基酚类化合物的含量。其中，高效液相色谱以甲醇-水溶液为流动相，电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱采用外标法(标准曲线法)同时对多种烷基酚类化合物进行定量及半定量分析。
较佳的，所述银杏叶选自银杏叶原料粉末、银杏叶提取物中间体粉末、银杏叶提取物制剂粉末中的一种。
较佳的，所述银杏叶中的烷基酚类化合物包括有银杏酸类化合物、雷锁酸类化合物、漆酚类化合物。
进一步的，所述银杏酸类化合物、雷锁酸类化合物、漆酚类化合物的母核结构式为：
具体的，所述银杏叶中的烷基酚类化合物为：31种烷基酚类化合物，其中，银杏酸类化合物为22种(银杏酸C13:0、银杏酸C13:1、银杏酸C14:0、银杏酸C14:1、银杏酸C15:0、银杏酸C15:1、银杏酸C15:2、银杏酸C15:3、银杏酸C16:0、银杏酸C16:1、银杏酸C16:2、银杏酸C17:0、银杏酸C17:1、银杏酸C17:2、银杏酸C17:3、银杏酸C18:0、银杏酸C18:1、银杏酸C19:0、银杏酸C19:1、银杏酸C19:2、银杏酸C19:3、银杏酸C19:4)；雷锁酸类化合物为3种(雷锁酸C15:0、雷锁酸C15:1、雷锁酸C17:1)；漆酚类化合物为6种(漆酚C13:0、漆酚C14:0、漆酚C14:1、漆酚C15:1、漆酚C15:2、漆酚C17:1)。
所述一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法，包括以下步骤：
1)在银杏叶粉末中加入正己烷，震荡、超声萃取后，离心，取上清液；
进一步的，所述银杏叶粉末的用量为0.1-0.2g。
进一步的，所述正己烷溶剂的用量为1-2ml。
进一步的，所述震荡、超声萃取条件为：先震荡3±0.5min，再超声萃取15±0.5min，然后再震荡3±0.5min；震荡频率：3000±500rpm/min；超声功率：58±2KHz。
优选的，所述震荡、超声萃取条件为：先震荡3min，再超声萃取15min，然后再震荡3min；震荡频率：3000rpm/min；超声功率：58KHz。
进一步的，所述离心条件为：离心时间：10±0.5min；转速：3000±500rpm/min。
优选的，所述离心条件为：离心时间：10min；转速：3000rpm/min。
2)重复步骤1)，将收集的上清液震荡混合后，取一定量上清液用N2气吹干，再用乙腈复溶，震荡离心后，取上清液，待测；
进一步的，所述重复步骤1)是指，在银杏叶粉末中重复加入正己烷，震荡、超声萃取后，离心，取上清液的过程。
进一步的，所述重复步骤1)的次数为2-3次。
进一步的，所述震荡混合条件为：震荡时间：3±0.5min；震荡频率：3000±500rpm/min。
优选的，所述震荡混合条件为：震荡时间：3min；震荡频率：3000rpm/min。
进一步的，所述上清液的用量为1-2ml。
进一步的，所述乙腈的用量为200-300μl。
进一步的，所述震荡离心条件为：震荡时间：5±0.5min；震荡频率：1600±200rpm/min；离心时间：10±0.5min；转速：14000±3000rpm/min。
优选的，所述震荡离心条件为：震荡时间：5min；震荡频率：1600rpm/min；离心时间：10min；转速：14000rpm/min。
3)配制混合标准溶液；
A、分别移取银杏酸C13:0、银杏酸C15:1、银杏酸C17:1标准品，用乙腈溶解并定容，配制混合标准储备溶液；
优选的，所述银杏酸C13:0、银杏酸C15:1、银杏酸C17:1标准品的浓度分别为3mM。所述mM为mmol/L。
优选的，所述混合标准储备溶液中银杏酸C13:0、银杏酸C15:1、银杏酸C17:1的浓度分别为300μM。所述μM为μmol/L。
B、分别移取不同体积的步骤A中的混合标准储备溶液，用乙腈溶解并定容，配制为一系列不同浓度的混合标准溶液。
进一步的，所述混合标准溶液中各成分的浓度范围为：银杏酸C13:0：4.1-3000nM；银杏酸C15:1：4.1-3000nM；银杏酸C17:1：37-3000nM。所述nM为nmol/L。
4)定性检测：采用HPLC-ESI-Q-TOF-MS测定步骤2)中的待测液，根据精确分子质量、相对保留时间，确定待测液中的31种烷基酚类化合物成分；
进一步的，所述精确分子质量是指，烷基酚类化合物成分的精确分子质量及该成分形成的[M－H]－峰的精确分子质量。由于烷基酚类化合物成分的烷基侧链通常含有13～19个碳原子以及0～3个双键，双键构型为Z型，可对烷基酚类化合物中银杏酸类、雷锁酸类及漆酚类成分构成进行预测，并根据在ESI负检测模式下，烷基酚类成分容易形成[M－H]－峰，其中银杏酸还能形成[M－H－CO2]－峰，从而确定31种烷基酚类化合物成分。
5)定量检测：采用HPLC-ESI-Q-TOF-MS分别测定步骤2)中的待测液和步骤3)中的混合标准溶液，采用外标法对待测液中的31种烷基酚类化合物成分含量进行定量及半定量检测。
进一步的，所述高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱：BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)色谱柱；柱温：40-50℃，优选45℃；流速：0.3-0.5ml/min，优选0.4ml/min；进样量：5μl；流动相：甲醇-水溶液(含甲酸)，分析时间：10min；梯度洗脱。
优选的，所述流动相中，A相为甲醇-水溶液(体积比v/v：1:99；含0.2‰甲酸)，B相为甲醇-水溶液(体积比v/v：99:1；含0.2‰甲酸)。
优选的，所述0.2‰甲酸为体积百分比为0.2‰甲酸水溶液。
优选的，所述梯度洗脱程序的具体为：
0-6min，A相：B相体积比为30：70-2：98；
6-8min，A相：B相体积比为2：98-2：98；
8-10min，A相：B相体积比为2：98-30：70。
进一步的，所述电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱的检测条件为：离子源：ESI源；检测模式：负离子电喷雾电离模式(ESI-)；扫描模式：Sensitivity模式；数据采集模式：MSE；扫描范围：m/z 50-1000amu；扫描时间：0.3s。
所述电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱的检测原理为：TOF-MS的质量分析器是一个离子漂移管。样品在离子源中离子化后即被电场加速，由离子源产生的离子加速后进入无场漂移管，并以恒定速度飞向离子接收器。离子以此速度穿过负极板上的栅条，飞向检测器。离子从负极板到达检测器的飞行时间t，就是TOF-MS进行质量分析的判据。因此，所述电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱在ESI负检测模式下，烷基酚类成分容易形成[M－H]－峰，其中银杏酸还能形成[M－H－CO2]－峰。根据每个成分在正负两种模式下的精确分子质量、色谱保留时间、特征峰情况，对成分归属进行确认。
进一步的，所述采用外标法对待测液中的31种烷基酚类化合物成分含量进行定量及半定量检测是指，利用检测到的有标准品的烷基酚类化合物浓度与其色谱峰面积的线性关系，得到相应线性回归方程，从而由已知浓度的标样计算样品中被测物的浓度，进行定量检测；再根据成分结构的相似程度，将检测到的无标准品的烷基酚类化合物的色谱峰面积代入到与其结构相似的有标准品被测成分的线性回归方程中，获取无标准品的被测成分的浓度信息，进行半定量检测。
具体的，所述外标法是指：分别将步骤3)所述一系列不同浓度的混合标准溶液，采用HPLC-ESI-Q-TOF-MS进样分析，获得混合标准溶液中银杏酸C13:0、银杏酸C15:1、银杏酸C17:1浓度与峰面积的线性关系，以每一种活性成分色谱峰面积对应其相应的含量，绘制相应的标准工作曲线，计算得到上述各标准工作曲线的回归方程。再将待测溶液采用HPLC-ESI-Q-TOF-MS检测，将获得的供待测溶液中3种烷基酚类化合物成分的色谱峰面积，分别代入所述各标准工作曲线的回归方程中，可得到相应烷基酚类化合物成分的含量。然后，根据成分结构的相似程度，我们将银杏酸C13:0的标准曲线用于半定量银杏酸C13:0-C13:1、银杏酸C14:0-C14:1、漆酚C13:0、漆酚C14:0-C14:1的浓度；将银杏酸C15:1的标准曲线用于定量银杏酸C15:0-C15:3、银杏酸C16:0-C16:2、雷锁酸C15:0-C15:1、漆酚C15:1-C15:2的浓度；将银杏酸C17:1的标准曲线用于定量银杏酸C17:0-C17:3、银杏酸C18:0-C18:1、银杏酸C19:0-C19:4、雷锁酸C17:1、漆酚C17:1的浓度。
如上所述，本发明建立的一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法，能够同时检测银杏叶、银杏叶提取物及银杏制剂中31种致敏的烷基酚类化合物，其中包括：22种银杏酸类化合物、3种雷锁酸类化合物及6种漆酚类化合物，从而更全面地反映银杏叶、银杏叶提取物及银杏叶提取物制剂的质量，有利于研究和保证银杏叶原料及制剂的质量。该检测方法灵敏可靠，比目前已有的银杏烷基酚类化合物分析方法有更强的分析能力，能够有效提高对银杏叶原料及制剂加工半成品和成品的质控水平，这对于保证临床用药安全具有积极的意义。
附图说明
图1显示为本发明中银杏叶原料及制剂中31种烷基酚类化合物的色谱图
图2显示为银杏叶中多种烷基酚类化合物测定结果示意图2A、2B、2C、2D、2E
图3显示为实际样品中多种烷基酚类化合物测定结果示意图3A、3B、3C、3D、3E、3F、3G、3H、3I；其中，图中柱标记表示烷基酚类化合物成分的实际含量，叉标记表示烷基酚类化合物成分的含量低于检测下限
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
实施例1
1试剂与仪器
1.1试剂
银杏叶原料、银杏叶提取物中间体购自上海杏灵科技药业股份有限公司提供；广西金嗓子药业银杏叶提取物制剂、山西瑞福莱药业银杏叶提取物制剂、广西半宙大康药业银杏叶提取物制剂、株洲市金泰制药银杏叶提取物制剂、海口奇力制药银杏叶提取物制剂、广西亿康药业银杏叶提取物制剂、桂林兴达制药银杏叶提取物制剂、湖南麗山天然植物制药杏叶提取物制剂、湖南华纳大药厂银杏叶提取物制剂均由上海药物所中药药代动力学实验室自市场购买；银杏酸C13:0、银杏酸C15:1、银杏酸C17:1标准品(纯度≥98％，中国食品药品检定研究院)；正己烷、甲醇、甲酸、乙腈(分析纯，Sigma公司)；N2气(纯度≥99％，上海成功气体工业有限公司)。
1.2仪器
USC-802型超声仪(上海波龙电子设备有限公司)；7500型离心机(德国SORVALL公司)；DB-3D型吹氮仪(英国TECHNE公司)；Acquity型高效液相色谱仪(美国Waters公司)、Synapt G2型电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱仪(美国Waters公司)；1.7μm BEH C18色谱柱(50mm×2.1mm，美国Waters公司)；
2测定方法
2.1样品前处理
精密称取0.1-0.2g银杏叶粉末置于1根10ml试管中，加入1-2ml的正己烷，先震荡3±0.5min，然后超声萃取15±0.5min，再震荡3±0.5min后，进行离心，离心时间为10±0.5min，转速为3000±500rpm/min，收集上清液至另1根10ml试管中。
再对该银杏叶粉末按上述方法重复提取2-3次后，收集、合并上清液至10ml容量瓶中。将收集的上清液震荡混合后，取1-2ml上清液置于N2气吹干，随后用200-300μl乙腈复溶，震荡离心后取上清液，待测。所述震荡混合条件为：震荡时间：3±0.5min；震荡频率：3000±500rpm/min。所述震荡离心条件为：震荡时间：5±0.5min；震荡频率：1600±200rpm/min；离心时间：10±0.5min；转速：14000±3000rpm/min。
2.2配制混合标准溶液
分别移取浓度为3mM的银杏酸C13:0、银杏酸C15:1、银杏酸C17:1标准品，用乙腈溶解并定容，配制银杏酸C13:0、银杏酸C15:1、银杏酸C17:1的浓度分别为300μM的混合标准储备溶液。
分别移取不同体积的混合标准储备溶液，用乙腈溶解并定容，配制为一系列不同浓度的混合标准溶液。其中，混合标准溶液中各成分的浓度范围为：银杏酸C13:0：4.1-3000nM；银杏酸C15:1：4.1-3000nM；银杏酸C17:1：37-3000nM。
2.3样品的测定
分别将2.1制备的待测溶液、2.2中混合标准溶液进行HPLC-ESI-Q-TOF-MS检测，如表1所示，根据精确分子质量、相对保留时间，确定待测液中的31种烷基酚类化合物成分；采用外标法进行定量和半定量分析，获得样待测溶液中31种烷基酚类化合物成分的含量。
表1.银杏叶中31个烷基酚类成分的鉴定
| 序号 | 银杏酸类成分 | 分子式 | 精确分子质量 | [M－H]－(m/z) | 保留时间(min) |
| 1 | 银杏酸C13:0 | C20H32O3 | 320.2352 | 319.2274 | 4.90 |
| 2 | 银杏酸C13:1 | C20H30O3 | 318.2195 | 317.2117 | 4.27 |
| 3 | 银杏酸C14:0 | C21H34O3 | 334.2508 | 333.2430 | 5.15 |
| 4 | 银杏酸C14:1 | C21H32O3 | 332.2352 | 331.2274 | 4.67 |
| 5 | 银杏酸C15:0 | C22H36O3 | 348.2665 | 347.2587 | 5.59 |
| 6 | 银杏酸C15:1 | C22H34O3 | 346.2508 | 345.2430 | 5.04 |
| 7 | 银杏酸C15:2 | C22H32O3 | 344.2352 | 343.2274 | 4.57 |
| 8 | 银杏酸C15:3 | C22H30O3 | 342.2196 | 341.2118 | 4.16 |
| 9 | 银杏酸C16:0 | C23H38O3 | 362.2822 | 361.2744 | 5.80 |
| 10 | 银杏酸C16:1 | C23H36O3 | 360.2666 | 359.2588 | 5.39 |
| 11 | 银杏酸C16:2 | C23H34O3 | 358.2510 | 357.2432 | 4.94 |
| 12 | 银杏酸C17:0 | C24H40O3 | 376.2978 | 375.2900 | 6.18 |
| 13 | 银杏酸C17:1 | C24H38O3 | 374.2821 | 373.2743 | 5.70 |
| 14 | 银杏酸C17:2 | C24H36O3 | 372.2665 | 371.2587 | 5.27 |
| 15 | 银杏酸C17:3 | C24H34O3 | 370.2509 | 369.2431 | 4.85 |
| 16 | 银杏酸C18:0 | C25H37O3 | 390.3134 | 389.3056 | 6.35 |
| 17 | 银杏酸C18:1 | C25H35O3 | 388.2978 | 387.2900 | 5.99 |
| 18 | 银杏酸C19:0 | C26H44O3 | 404.3290 | 403.3212 | 6.68 |
| 19 | 银杏酸C19:1 | C26H42O3 | 402.3134 | 401.3056 | 6.25 |
| 20 | 银杏酸C19:2 | C26H40O3 | 400.2978 | 399.2900 | 5.88 |
| 21 | 银杏酸C19:3 | C26H38O3 | 398.2822 | 397.2744 | 5.49 |
| 22 | 银杏酸C19:4 | C26H36O3 | 397.2744 | 395.2588 | 5.11 |
| 23 | 雷锁酸C15:0 | C22H36O4 | 365.2692 | 363.2536 | 3.35 |
| 24 | 雷锁酸C15:1 | C22H34O4 | 363.2536 | 361.2379 | 2.96 |
| 25 | 雷锁酸C17:1 | C24H38O4 | 391.2849 | 389.2692 | 3.77 |
| 26 | 漆酚C13:0 | C19H32O2 | 293.2481 | 291.2325 | 4.53 |
| 27 | 漆酚C14:0 | C20H34O2 | 307.2637 | 305.2481 | 4.50 |
| 28 | 漆酚C14:1 | C20H32O2 | 305.2481 | 303.2325 | 4.04 |
| 29 | 漆酚C15:1 | C21H34O2 | 319.2638 | 317.2481 | 4.70 |
| 30 | 漆酚C15:2 | C21H32O2 | 317.2481 | 315.2325 | 4.05 |
| 31 | 漆酚C17:1 | C23H38O2 | 347.2951 | 345.2794 | 5.39 |
其中，所述高效液相色谱(HPLC)的色谱条件为：色谱柱：BEH C18(50mm×2.1mm，1.7μm)色谱柱；柱温：40-50℃，优选45℃；流速：0.3-0.5ml/min，优选0.4ml/min；进样量：5μl；流动相：甲醇-水溶液(含甲酸)，分析时间：10min；梯度洗脱。
所述流动相中，A相为甲醇-水溶液(体积比v/v：1:99；含0.2‰甲酸)，B相为甲醇-水溶液(体积比v/v：99:1；含0.2‰甲酸)。如表2所示，所述梯度洗脱程序的具体为：
0-6min，A相：B相体积比为30：70-2：98；
6-8min，A相：B相体积比为2：98-2：98；
8-10min，A相：B相体积比为2：98-30：70。
表2.梯度洗脱程序
| 时间 | 流速(ml/min) | 溶剂A％ | 溶剂B％ | Curve |
| 0 | 0.4 | 30 | 70 | Initial |
| 6 | 0.4 | 2 | 98 | 6 |
| 8 | 0.4 | 2 | 98 | 6 |
| 10 | 0.4 | 30 | 70 | 1 |
其中，所述电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱(ESI-Q-TOF-MS)的检测条件为：离子源：ESI源；检测模式：负离子电喷雾电离模式(ESI-)；扫描模式：Sensitivity模式；数据采集模式：MSE；扫描范围：m/z 50-1000amu；扫描时间：0.3s。
3结果与讨论
3.1测定方法的线性关系、检出限和定量限
分别移取不同体积的混合标准储备溶液，用乙腈溶解并定容，配制为一系列不同浓度的混合标准溶液。其中，混合标准溶液中各成分的浓度范围为：银杏酸C13:0：4.1-3000nM；银杏酸C15:1：4.1-3000nM；银杏酸C17:1：37-3000nM。
将上述配制好的一系列不同浓度的混合标准溶液分别进行HPLC-ESI-Q-TOF-MS检测，以色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应银杏酸化合物的质量浓度为横坐标(X轴)，进行回归分析，得到回归方程及其相关系数，如表3所示。
由表3可知，上述回归方程的在相应浓度范围内进样时线性关系良好，相关系数r>0.99。对标准溶液中的目标物响应信号，采用最低浓度标样重复进样5次，进行HPLC-ESI-Q-TOF-MS分析。换算为样品含量后得出目标物检出限为0.78μg/g(银杏酸C13:0)、0.86μg/g(银杏酸C15:1)及8.30μg/g(银杏酸C17:1)，具有较高的灵敏度。
表3.工作曲线和检出限
再根据成分结构的相似程度，我们将银杏酸C13:0的标准曲线用于半定量银杏酸C13:0-C13:1、银杏酸C14:0-C14:1、漆酚C13:0、漆酚C14:0-C14:1的浓度；将银杏酸C15:1的标准曲线用于定量银杏酸C15:0-C15:3、银杏酸C16:0-C16:2、雷锁酸C15:0-C15:1、漆酚C15:1-C15:2的浓度；将银杏酸C17:1的标准曲线用于定量银杏酸C17:0-C17:3、银杏酸C18:0-C18:1、银杏酸C19:0-C19:4、雷锁酸C17:1、漆酚C17:1的浓度。通过将无标准品的化合物成分峰面积作为Y值代入有标准品的结构相似化合物成分的标准曲线方程中，求得相应浓度X值。
3.2回收率和精密度
采用银杏树平茬后采集的银杏叶样品，按前述2.1中方法提取，提取完后收集1ml上清液，用N2气吹干后复溶，用于HPLC-ESI-Q-TOF-MS分析。该样品反复提取5次，每次均收集1ml上清液，并分别用于HPLC-ESI-Q-TOF-MS分析。将5次提取的样品浓度累加起来，基本可以获得样品中总的烷基酚类化合物成分含量，再与本发明中采用提取三次后获得烷基酚类化合物成分含量进行比较，可以得到31个化合物三次提取回收率，所述三次提取回收率＝三次提取浓度/五次提取浓度×100％，具体结果见表4。同时，对该样品平行测定5次(n＝5)，得到样品中烷基酚类化合物C13:0、C15:1、C17:1的精密度测定数据，结果见表5。由表4、5可以看出，样品中烷基酚类化合物成分的三次提取回收率在84.3-100％之间，C13:0、C15:1、C17:1的相对标准偏差(RSD)小于15％，所以本发明准确性和重复性较好，可以满足定量及半定量分析的需要。
表4.提取回收率
表5.精密度(n＝5)
| 序号 | 银杏酸类成分 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 平均值 | RSD(％) |
| 1 | 银杏酸C13:0 | 333 | 365 | 357 | 371 | 362 | 358 | 4.1 |
| 6 | 银杏酸C15:1 | 368 | 383 | 375 | 379 | 308 | 363 | 8.6 |
| 13 | 银杏酸C17:1 | 290 | 290 | 264 | 321 | 386 | 310 | 15 |
4实际样品的测定
采用本方法测定实际样品中31种烷基酚类化合物成分的含量，具体见表6。由表6可知，针对不同的样品，该方法均能有效测定其实际样品中31种烷基酚类化合物成分的含量，方法操作简便、适用性好，结果准确、可靠。
表6.实际样品中31种烷基酚类化合物成分的含量
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (10)
1.一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法，采用高效液相色谱分离、电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱同时测定银杏叶中多种烷基酚类化合物的含量，其中，所述银杏叶中的烷基酚类化合物包括有银杏酸类化合物、雷锁酸类化合物、漆酚类化合物。
2.根据权利要求1所述的一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法，其特征在于，所述银杏叶中的烷基酚类化合物为：31种烷基酚类化合物，其中，银杏酸类化合物为22种：银杏酸C13:0、银杏酸C13:1、银杏酸C14:0、银杏酸C14:1、银杏酸C15:0、银杏酸C15:1、银杏酸C15:2、银杏酸C15:3、银杏酸C16:0、银杏酸C16:1、银杏酸C16:2、银杏酸C17:0、银杏酸C17:1、银杏酸C17:2、银杏酸C17:3、银杏酸C18:0、银杏酸C18:1、银杏酸C19:0、银杏酸C19:1、银杏酸C19:2、银杏酸C19:3、银杏酸C19:4；雷锁酸类化合物为3种：雷锁酸C15:0、雷锁酸C15:1、雷锁酸C17:1；漆酚类化合物为6种：漆酚C13:0、漆酚C14:0、漆酚C14:1、漆酚C15:1、漆酚C15:2、漆酚C17:1。
3.根据权利要求1所述的一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)在银杏叶粉末中加入正己烷溶剂，震荡、超声萃取后，离心，取上清液；
2)重复步骤1)，将收集的上清液震荡混合后，取一定量上清液用N2气吹干，再用乙腈复溶，震荡离心后，取上清液，待测；
3)配制混合标准溶液；
4)定性检测：采用HPLC-ESI-Q-TOF-MS测定步骤2)中的待测液，根据精确分子质量、相对保留时间，确定待测液中的31种烷基酚类化合物成分；
5)定量检测：采用HPLC-ESI-Q-TOF-MS分别测定步骤2)中的待测液和步骤3)中的混合标准溶液，采用外标法对待测液中的31种烷基酚类化合物成分含量进行定量及半定量检测。
4.根据权利要求3所述的一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述震荡、超声萃取条件为：先震荡2.5-3.5min，再超声萃取14.5-15.5min，然后再震荡2.5-3.5min；震荡频率：2500-3500rpm/min；超声功率：56-60KHz；所述离心条件为：离心时间：9.5-10.5min；转速：2500-3500rpm/min。
5.根据权利要求3所述的一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述重复步骤1)的次数为2-3次；所述震荡混合条件为：震荡时间2.5-3.5min；震荡频率：2500-3500rpm/min。
6.根据权利要求3所述的一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述震荡离心条件为：震荡时间：4.5-5.5min；震荡频率：1400-1800rpm/min；离心时间：9.5-10.5min；转速：11000-17000rpm/min。
7.根据权利要求4所述的一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述精确分子质量是指，烷基酚类化合物成分的精确分子质量及该成分形成的[M－H]－峰的精确分子质量。
8.根据权利要求4所述的一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法，其特征在于，步骤4)或5)中，所述高效液相色谱的色谱条件为：色谱柱：BEH C18色谱柱；柱温：40-50℃；流速：0.3-0.5ml/min；进样量：5μl；流动相：含甲酸的甲醇-水溶液，分析时间：10min；梯度洗脱。
9.根据权利要求8所述的一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法，其特征在于，所述流动相中，A相为含0.2‰甲酸、体积比为1:99的甲醇-水溶液，B相为含0.2‰甲酸、体积比为99:1的甲醇-水溶液；所述梯度洗脱程序的具体为：0-6min，A相：B相体积比为30：70-2：98；6-8min，A相：B相体积比为2：98-2：98；8-10min，A相：B相体积比为2：98-30：70。
10.根据权利要求4所述的一种银杏叶原料及制剂中烷基酚类化合物的检测方法，其特征在于，步骤4)或5)中，所述电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱的检测条件为：离子源：ESI源；检测模式：负离子电喷雾电离模式；扫描模式：Sensitivity模式；数据采集模式：MSE；扫描范围：m/z 50-1000amu；扫描时间：0.3s。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108254466A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-07-06 | 华侨大学 | 芍药属油用植物油脂中酚类化合物的分析方法 |
| CN110632230A (zh) * | 2019-09-29 | 2019-12-31 | 中国科学院上海药物研究所 | 一种血必净注射液中多个小分子化学成分的检测方法 |
| CN110672750A (zh) * | 2019-10-25 | 2020-01-10 | 皖西学院 | 一种采用uplc-ms测定盐肤木果油中漆酚的方法 |
| CN112213410A (zh) * | 2020-06-12 | 2021-01-12 | 江苏康缘药业股份有限公司 | 一种银杏叶的检测方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1070483A (zh) * | 1991-09-12 | 1993-03-31 | 中国石油化工总公司兰州炼油化工总厂 | 高压液相色谱法测定长链烷基酚组成的方法 |
| US20030152654A1 (en) * | 1998-03-19 | 2003-08-14 | Xie De Long | Ginkgo biloba composition, method to prepare the same and uses thereof |
| CN101757050A (zh) * | 2010-02-23 | 2010-06-30 | 广州汉方现代中药研究开发有限公司 | 一种测定银杏提取物中总银杏酸的方法 |
| CN102841161A (zh) * | 2012-09-27 | 2012-12-26 | 浙江省海洋水产研究所 | 一种水产品中辛基酚和壬基酚的气相色谱-质谱检测方法 |
| CN103110671A (zh) * | 2013-01-29 | 2013-05-22 | 华中科技大学 | 一种利用纳米材料脱除银杏叶提取物中银杏酸和重金属的方法 |
-
2014
- 2014-11-27 CN CN201410705090.4A patent/CN104407082B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1070483A (zh) * | 1991-09-12 | 1993-03-31 | 中国石油化工总公司兰州炼油化工总厂 | 高压液相色谱法测定长链烷基酚组成的方法 |
| US20030152654A1 (en) * | 1998-03-19 | 2003-08-14 | Xie De Long | Ginkgo biloba composition, method to prepare the same and uses thereof |
| CN101757050A (zh) * | 2010-02-23 | 2010-06-30 | 广州汉方现代中药研究开发有限公司 | 一种测定银杏提取物中总银杏酸的方法 |
| CN102841161A (zh) * | 2012-09-27 | 2012-12-26 | 浙江省海洋水产研究所 | 一种水产品中辛基酚和壬基酚的气相色谱-质谱检测方法 |
| CN103110671A (zh) * | 2013-01-29 | 2013-05-22 | 华中科技大学 | 一种利用纳米材料脱除银杏叶提取物中银杏酸和重金属的方法 |
Non-Patent Citations (7)
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108254466A (zh) * | 2018-01-18 | 2018-07-06 | 华侨大学 | 芍药属油用植物油脂中酚类化合物的分析方法 |
| CN110632230A (zh) * | 2019-09-29 | 2019-12-31 | 中国科学院上海药物研究所 | 一种血必净注射液中多个小分子化学成分的检测方法 |
| CN110672750A (zh) * | 2019-10-25 | 2020-01-10 | 皖西学院 | 一种采用uplc-ms测定盐肤木果油中漆酚的方法 |
| CN112213410A (zh) * | 2020-06-12 | 2021-01-12 | 江苏康缘药业股份有限公司 | 一种银杏叶的检测方法 |
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