CN110632230A - 一种血必净注射液中多个小分子化学成分的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种血必净注射液中多个小分子化学成分的检测方法，包括以下步骤：1)配制样品溶液；2)配制第一标准溶液；3)配制第二标准溶液；4)将样品溶液、第一标准溶液、第二标准溶液，采用高效液相色谱质谱联用法进行测定，通过标准曲线法对样品溶液中57种小分子化学成分进行定量，再半定量确定样品溶液中与定量确定的57种小分子化学成分结构相似的其它66种小分子化学成分的含量。本发明提供的一种血必净注射液中多个小分子化学成分的检测方法，可高通量、高灵敏度地定量或半定量检测123个中药小分子化合物，为进一步优化血必净的制备工艺、提高产品质量均一性提供关键的技术手段。

Description

一种血必净注射液中多个小分子化学成分的检测方法
技术领域
本发明属于药物成分的分析技术领域，涉及一种血必净注射液中多个小分子化学成分的检测方法，具体涉及一种同时对血必净注射液中123个小分子化学成分进行检测的方法。
背景技术
脓毒症是由感染引起的全身宿主反应所致器官功能障碍综合征，其特点是致死率高(25-50％)且预后不良。脓毒症(包括脓毒性休克)的常规治疗主要依靠及时合理的抗生素抗感染治疗和调控患者异常反应，但目前针对后者仍缺乏有效化药。中药注射液血必净是目前国内唯一批准用于脓毒症治疗的中药二类新药(2004年)，每年中国约60万脓毒症患者使用血必净。大量的临床和实验研究表明：血必净联合脓毒症常规治疗能有效降低患者28天病死率(判断脓毒症治疗有效的金标准)，血必净治疗脓毒症是通过抑制炎性因子过度释放、克服凝血功能障碍、调节免疫、保护内皮细胞等调节机体反应失调来发挥作用。血必净临床不良反应发生率低(0.03％)且多表现为过敏反应，停药后自行消失。
血必净由红花、赤芍、丹参、川芎和当归五味中药制备而成，化学成分组成复杂。文献调研结果提示血必净中四类中药成分可能与血必净抗脓毒症疗效相关，包括：红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、川芎和当归苯酞类成分。除此以外的血必净中其它小分子化学成分划归为第五类成分，这些成分也可能与血必净的疗效相关。血必净成品的质量一致性是其有效性和安全性可重复的保证，且与其生产过程各关键环节的质量一致性直接相关。
前人对血必净多个成分的检测方法进行了诸多探索，但目前尚未有对血必净中小分子化学成分含量进行比较全面的定量/半定量的检测方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种血必净注射液中多个小分子化学成分的检测方法，用于解决现有技术中缺乏全面地定量/半定量检测血必净注射液中123个小分子化学成分含量的方法的问题。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种血必净中多个小分子化学成分的检测方法，包括以下步骤：
1)将血必净注射液采用溶剂稀释后定容，配制样品溶液；
2)配制第一标准溶液，所述第一标准溶液为血必净注射液中红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、第五类成分中至少一种成分标准品用溶剂稀释后定容的溶液；
3)配制第二标准溶液，所述第二标准溶液为血必净注射液中川芎和当归苯酞类成分中至少一种成分标准品用溶剂稀释后定容的溶液；
4)将样品溶液、第一标准溶液、第二标准溶液，采用高效液相色谱质谱联用法进行测定，通过质谱对样品溶液中123种小分子化学成分进行定性，通过标准曲线法对样品溶液中57种小分子化学成分进行定量，再半定量确定样品溶液中与定量确定的57种小分子化学成分结构相似的其它66种小分子化学成分的含量。
优选地，步骤1)、2)或3)中，所述溶剂为10-75％(v/v)的甲醇水溶液。更优选地，所述溶剂为50％(v/v)的甲醇水溶液。
优选地，步骤1)中，所述血必净注射液与溶剂的体积比为1:1-1:5000。
优选地，步骤1)中，所述样品溶液中多种小分子化学成分为123种，包括有红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、川芎和当归苯酞类成分、第五类成分。
更优选地，所述红花黄酮类成分为36种，包括有以下小分子化学成分：
羟基红花黄色素A(Hydroxysafflor yellow A，CAS号为78281-02-4)、
山奈酚(Kaempferol，CAS号为520-18-3)、
6-羟基山奈酚(6-Hydroxykaempferol，CAS号为4324-55-4)、
山奈酚-3-O-葡萄糖苷(Kaempferol 3-O-glucoside，CAS号为480-10-4)、
山奈酚-3-O-芸香糖苷(Kaempferol 3-rha-(1-6)-glucoside，CAS号为17650-84-9)、
山奈酚-3-O-槐糖苷(Kaempferol 3-glc-(1-2)-glucoside，CAS号为19895-95-5)、
槲皮素(Quercetin，CAS号为117-39-5)、
槲皮素-3-O-葡萄糖苷(Quercetin 3-O-glucoside，CAS号为21637-25-2)、
槲皮素-3-O-芸香糖苷(Quercetin 3-rha-(1-6)-glucoside，CAS号为949926-49-2)、
圣草酚(Eriodictyol，CAS号为552-58-9)、
芹菜素(Apigenin，CAS号为520-36-5)、
木犀草素(Luteolin，CAS号为491-70-3)、
木犀草素-7-O-葡萄糖苷(Luteolin 7-O-glucoside，CAS号为5373-11-5)、
野黄芩苷(Scutellarin，CAS号为27740-01-8)、
红花黄色素A(Safflor yellow A，CAS号为85532-77-0)、
Saffloquinoside A
Figure BDA0002221136550000031
Saffloquinoside C/D
Figure BDA0002221136550000032
所述SaffloquinosideC/D选自Saffloquinoside C或Saffloquinoside D中的一种或两种混合、
Safflomin C(CAS号为126093-98-9)、
Saffloquinoside E
Figure BDA0002221136550000033
原红花苷(Precarthamin，CAS号为168216-23-7)、
脱水红花黄色素B(Anhydrosafflor yellow B、CAS号为184840-84-4)、
红花黄色素B(Safflor yellow B，CAS号为85532-77-0)、
山奈酚-3-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖醛酸苷/6-羟基芹菜素-6-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖醛酸苷(3-Glc-kaempferol 7-O-glucuronide/6-Glc-6-hydroxyapigenin 7-O-glucuronide，
Figure BDA0002221136550000034
Figure BDA0002221136550000035
)、所述山奈酚-3-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖醛酸苷/6-羟基芹菜素-6-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖醛酸苷选自山奈酚-3-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖醛酸苷或6-羟基芹菜素-6-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖醛酸苷中的一种或两种混合、
6-羟基山奈酚-7-O-葡萄糖苷(6-Hydroxykaempferol 7-O-glucoside，
Figure BDA0002221136550000036
)、
6-羟基山奈酚-3-O-葡萄糖苷(6-Hydroxykaempferol 3-O-glucoside，)、
6-羟基山奈酚-3-O-芸香糖苷(6-Hydroxykaempferol 3-rha-(1-6)-glucoside，
Figure BDA0002221136550000038
)、
6-羟基山奈酚-3,6-O-葡萄糖苷(6-Hydroxykaempferol 3,6-O-diglucoside，CAS号为142674-16-6)、
6-羟基山奈酚-6,7-O-葡萄糖苷(6-Hydroxykaempferol 6,7-O-diglucoside，
Figure BDA0002221136550000041
)、
6-羟基山奈酚-3-O-芸香糖-6-O-葡萄糖苷(6-Glc-6-hydroxykaempferol3-rha-(1-6)-glucoside，CAS号为145134-63-0)、
6-羟基山奈酚-3,6,7-O-葡萄糖苷(6-Hydroxykaempferol 7-(3,6-diglc)-glucoside，CAS号为145134-62-9)、
6-羟基山奈酚-3,6-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖醛酸苷(6-Hydroxykaempferol7-(3,6-diglc)-glucuronide，)、
槲皮素-3-O-鼠李糖苷-7-O-葡萄糖醛酸(3-Rha-quercetin 7-O-glucuronide，
Figure BDA0002221136550000043
)、
槲皮素-3,7-O-葡萄糖苷(Quercetin 3,7-O-diglucoside，)、
新红花苷(Neocarthamin，
Figure BDA0002221136550000045
)、
6-羟基芹菜素(6-Hydroxyapigenin，CAS号为529-53-3)、
Safflochalconeside
Figure BDA0002221136550000046
更优选地，所述赤芍单萜糖苷类成分为19种，包括有以下小分子化学成分：
芍药内酯苷(Albiflorin，CAS号为39011-90-0)、
芍药苷(Paeoniflorin，CAS号为23180-57-6)、
氧化芍药苷(Oxypaeoniflorin，CAS号为39011-91-1)、
6'-O-没食子酰去苯甲酰-芍药苷(6'-O-Galloyl desbenzoyl-paeoniflorin，
Figure BDA0002221136550000051
)、
苯甲酰芍药苷(Benzoylpaeoniflorin，CAS号为38642-49-8)、
牡丹皮苷C(Mudanpioside C，CAS号为172760-03-1)、
苯甲酰氧化芍药苷(Benzoyloxypaeoniflorin，CAS号为72896-40-3)、
牡丹皮苷J(Mudanpioside J，CAS号为262350-52-7)、
没食子酰芍药苷(Galloylpaeoniflorin，CAS号为122965-41-7)、
1-O-β-D-Glucopyranosyl-paeonisuffrone
Figure BDA0002221136550000052
去苯甲酰芍药苷(Desbenzoylpaeoniflorin，CAS号为23532-11-8)、
氧化芍药苷同分异构体1(Oxypaeoniflorin isomer 1，
Figure BDA0002221136550000053
)、
氧化芍药苷同分异构体2(Oxypaeoniflorin isomer 2，
Figure BDA0002221136550000054
)、
氧化芍药苷同分异构体3(Oxypaeoniflorin isomer 3，)、
牡丹皮苷D(Mudanpioside D，
Figure BDA0002221136550000056
)、
牡丹皮苷E(Mudanpioside E，
Figure BDA0002221136550000057
)、
牡丹皮苷B(Mudanpioside B，
Figure BDA0002221136550000061
)、
没食子酰芍药苷同分异构体(Galloylpaeoniflorin isomer，)、
没食子酰氧化芍药苷(Galloyloxypaeoniflorin，CAS号为145898-93-7)。
更优选地，所述丹参儿茶酚类成分为19种，包括有以下小分子化学成分：
原儿茶醛(Protocatechuic aldehyde，CAS号为139-85-5)、
原儿茶酸(Protocatechuic acid，CAS号为99-50-3)、
丹参素(Tanshinol，CAS号为76822-21-4)、
迷迭香酸(Rosmarinic acid，CAS号为20283-92-5)、
丹酚酸D(Salvianolic acid D，CAS号为142998-47-8)、
丹酚酸C(Salvianolic acid C，CAS号为115841-09-3)、
丹酚酸A(Salvianolic acid A，CAS号为96574-01-5)、
紫草酸(Lithospermic acid，CAS号为28831-65-4)、
丹酚酸B(Salvianolic acid B，CAS号为121521-90-2)、
丹酚酸F(Salvianolic acid F，CAS号为158732-59-3)、
丹酚酸G(Salvianolic acid G，
Figure BDA0002221136550000063
)、
原紫草酸(Prolithospermic acid，
Figure BDA0002221136550000064
)、
丹参酸C(Salvianic acid C，
Figure BDA0002221136550000065
)、
丹参酸C同分异构体(Salvianic acid C isomer，
Figure BDA0002221136550000066
)、
异丹酚酸C(Isosalvianolic acid C，
Figure BDA0002221136550000071
)、
异迷迭香酸苷(Salviaflaside，CAS号为178895-25-5)、
丹酚酸E(Salvianolic acid E，CAS号为142998-46-7)、
4-甲氧基丹酚酸B(4-Methoxyl salvianolic acid B，
Figure BDA0002221136550000072
)、
咖啡酸(Caffeic acid，CAS号为331-39-5)。
更优选地，所述川芎和当归苯酞类成分为21种，包括有以下小分子化学成分：
Z-丁烯基苯酞(Z-Butylidenephthalide，CAS号为72917-31-8)、
正丁基苯酞(3-n-Butylphthalide，CAS号为6066-49-5)、
Z-藁本内酯(Z-Ligustilide，CAS号为4431-01-0)、
洋川芎内酯A(Senkyunolide A，CAS号为63038-10-8)、
3-羟基-正丁基苯酞(3-Hydroxy-3-n-butylphthalide，
Figure BDA0002221136550000073
)、
洋川芎内酯G(Senkyunolide G，CAS号为94530-85-5)、
洋川芎内酯I(Senkyunolide I，CAS号为94596-28-8)、
洋川芎内酯H(Senkyunolide H，CAS号为94596-27-7)、
洋川芎内酯N(Senkyunolide N，
Figure BDA0002221136550000074
)、
开环洋川芎内酯I(ring-opened Senkyunolide I，)、
欧当归内酯A(Levistolide A，CAS号为88182-33-6)、
E-丁烯基苯酞(E-Butylidenephthalide，)、
E-藁本内酯(E-Ligustilide，)、
蛇床内酯(Cnidilide，CAS号为3674-03-1)、
Z-6,7-环氧藁本内酯(Z-6,7-Epoxyligustilide，
Figure BDA0002221136550000081
)、
4-羟基-3-丁基苯酞(4-Hydroxy-3-n-butylphthalide，CAS号为74459-23-7)、
6,7-双羟基藁本内酯(6,7-Dihydroxyligustilide，
Figure BDA0002221136550000082
)、
洋川芎内酯J(Senkyunolide J，CAS号为94530-86-6)、
欧当归内酯A同分异构体(Levistolide Aisomer，
Figure BDA0002221136550000083
)、
洋川芎内酯P同分异构体1(Senkyunolide P isomer 1，
Figure BDA0002221136550000084
)、
洋川芎内酯P同分异构体2(Senkyunolide P isomer 2，
Figure BDA0002221136550000085
)。
更优选地，所述第五类成分为28种，包括有以下小分子化学成分：
对香豆酸(p-Coumaric acid，CAS号为501-98-4)、
对羟基苯甲酸(p-Hydroxybenzoic acid，CAS号为99-96-7)、
阿魏酸(Ferulic acid，CAS号为1135-24-6)、
绿原酸(Chlorogenic acid，CAS号为327-97-9)、
苯甲酸(Benzoic acid，CAS号为65-85-0)、
没食子酸(Gallic acid，CAS号为149-91-7)、
没食子酰甲酯(Methyl gallate，CAS号为99-24-1)、
儿茶素(Catechin，CAS号为7295-85-4)、
香草酸(Vanillic acid，CAS号为121-34-6)、
新绿原酸(Neochlorogenic acid，CAS号为906-33-2)、
1,5-二咖啡酰奎宁酸(1,5-Dicaffeoylquinic acid，CAS号为1182-34-9)、
异绿原酸B(Isochlorogenic acid B，CAS号为14534-61-3)、
异绿原酸C(Isochlorogenic acid C，CAS号为57378-72-0)、
N-p-coumaroylserotonin-O-glucopyranoside
4-O-葡萄糖氧基苯甲酸(4-Glucosyloxybenzoic acid，
Figure BDA0002221136550000091
)、Safflospermidine A
Figure BDA0002221136550000092
Safflospermidine B
Figure BDA0002221136550000093
N1,N5,N10-(Z)-tri-p-coumaroylspermidine
Figure BDA0002221136550000094
N1,N5,N10-(E)-tri-p-coumaroylspermidine
Figure BDA0002221136550000095
1'-O-苯甲酰蔗糖(1'-O-Benzoylsucrose，
Figure BDA0002221136550000096
)、
1'-O-没食子酰蔗糖(1'-O-Galloylsucrose，)、
6-O-没食子酰蔗糖(6-O-Galloylsucrose，
Figure BDA0002221136550000098
)、
三没食子酰葡萄糖(Trigalloyl glucose，CAS号为94513-58-3)、
四没食子酰葡萄糖(Tetragalloyl glucose，CAS号为132023-50-8)、
四没食子酰葡萄糖同分异构体(Tetragalloyl glucose isomer，
Figure BDA0002221136550000099
)、
五没食子酰葡萄糖(Pentagalloylglucose，CAS号为14937-32-7)、
芍药二酮(Palbinone，CAS号为139954-00-0)、
30-降常春藤皂苷元(30-Norhederagenin，
Figure BDA00022211365500000910
)。
优选地，步骤2)中，所述第一标准溶液中有红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、第五类成分共46种，包括有以下小分子化学成分：
所述红花黄酮类成分为14种，包括有羟基红花黄色素A、山奈酚、6-羟基山奈酚、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、山奈酚-3-O-槐糖苷、槲皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷、圣草酚、芹菜素、木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、野黄芩苷；
所述赤芍单萜糖苷类成分为9种，包括有芍药内酯苷、芍药苷、氧化芍药苷、6'-O-没食子酰去苯甲酰芍药苷、苯甲酰芍药苷、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、牡丹皮苷J、没食子酰芍药苷；
所述丹参儿茶酚类成分为10种，包括有原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、丹参素、迷迭香酸、丹酚酸D、丹酚酸C、丹酚酸A、紫草酸、丹酚酸B；
所述第五类成分为13种，包括有对香豆酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、绿原酸、苯甲酸、没食子酸、没食子酰甲酯、儿茶素、香草酸、新绿原酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、异绿原酸C。
优选地，步骤3)中，所述第二标准溶液中有川芎和当归苯酞类成分，共11种，包括有Z-丁烯基苯酞、正丁基苯酞、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A、3-羟基-正丁基苯酞、洋川芎内酯G、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯N、开环洋川芎内酯I、欧当归内酯A。
优选地，步骤4)中，所述样品溶液及第一标准溶液采用的高效液相色谱质谱联用法中，所述高效液相色谱测定条件为：色谱柱：T3柱；柱温：40-50℃；流速：0.2-0.4ml/min；进样量：3-10μl；流动相：水-甲醇溶液(含甲酸)，其中，A相为水(含1-30mM甲酸)，B相为甲醇(含1-30mM甲酸)；分析时间：20min；梯度洗脱。
更优选地，所述高效液相色谱测定条件为：色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱(100×2.1mm，1.8μm)；柱温：45℃；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；流动相：水-甲醇溶液(含甲酸)，其中，A相为水(含25mM甲酸)，B相为甲醇(含25mM甲酸)；分析时间：20min；梯度洗脱。
更优选地，所述梯度洗脱程序的具体为(见表1)：
0-1min，A相：B相体积比为95：5-95：5；1-15min，A相：B相体积比为95：5-20：80；15-17min，A相：B相体积比为20：80-5：95；17-20min，A相：B相体积比为5：95-95：5。
表1
时间(min) 溶剂A相(v/v％) 溶剂B相(v/v％) Curve
0 95 5 —
1 95 5 6
15 20 80 6
17 5 95 1
20 95 5 1
优选地，步骤4)中，所述样品溶液及第二标准溶液采用的高效液相色谱质谱联用法中，所述高效液相色谱测定条件为：色谱柱：T3柱；柱温：40-50℃；流速：0.2-0.4ml/min；进样量：3-10μl；流动相：水-甲醇溶液(含甲酸)，其中，A相为水(含0.5-1.5mM甲酸)，B相为甲醇(含0.5-1.5mM甲酸)；分析时间：20min；梯度洗脱。
更优选地，所述高效液相色谱测定条件为：色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱(100×2.1mm，1.8μm)；柱温：45℃；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；流动相：水-甲醇溶液(含甲酸)，其中，A相为水(含1mM甲酸)，B相为甲醇(含1mM甲酸)；分析时间：20min；梯度洗脱。
进一步优选地，所述梯度洗脱程序的具体为(见表2)：
0-15min，A相：B相体积比为95：5-5：95；15-17min，A相：B相体积比为5：95-5：95；17-20min，A相：B相体积比为5：95-95：5。
表2
时间(min) 溶剂A相(v/v％) 溶剂B相(v/v％) Curve
0 95 5 —
15 5 95 6
17 5 95 6
20 95 5 1
表1、2的Curve一栏中数值含义如下(参见图3)：当溶剂B相洗脱比例从t1时的B1增加到t2时的B2时，若Curve设为1，表示t1时B1瞬间增加到B2，再维持至t2；若Curve设为11，B1将维持至t2再瞬间增加到B2；若Curve设为6，B1则匀速增加到B2。
优选地，步骤4)中，所述样品溶液、第一标准溶液、第二标准溶液采用的高效液相色谱质谱联用法中，所述质谱为电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱(high definitiontime-of-flight mass spectrometer)。
优选地，步骤4)中，所述样品溶液、第一标准溶液、第二标准溶液采用的高效液相色谱质谱联用法中，所述质谱测定条件为：离子源为ESI源；检测模式为负离子电喷雾电离模式(ESI-)和正离子电喷雾电离模式(ESI+)；扫描模式为Sensitivity模式；扫描范围为m/z50–1000，扫描时间为0.3s；数据采集模式为MSE；毛细管电压(Capillary Voltage)为-2.5kv(ESI-)或3.0kv(ESI+)；离子源温度(Source Temperature)为120℃；锥孔气体流量(Cone Gas Flow)为50L/hr；去溶剂化气体流量(Desolvation Gas Flow)为800L/hr；去溶剂化温度(Desolvation Temperature)为400℃；锥孔电压(Sampling Cone Voltage)为35V(ESI-：红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分和第五类成分)或40V(ESI+：川芎和当归苯酞类成分)；提取锥孔电压(Extraction Cone Voltage)为4V；质量数校正范围为m/z 50-1000；校正溶液为5mM甲酸钠溶液(流速10μL/min)；实时校正LockSpray为亮氨酸脑啡肽溶液【流速5μL/min；校正质量数m/z 554.2615(ESI-)和556.2771(ESI+)】；数据类型为centroid；打碎能量ramp为20-50eV(红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分和第五类成分)、20-40eV(川芎和当归苯酞类成分)。
优选地，步骤4)中，所述样品溶液中红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、第五类成分、川芎和当归苯酞类成分的定性信息：精确分子量、ESI电离模式特征峰情况、电离后m/z、保留时间TR见表3、4。
在ESI-模式下，红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分和第五类成分容易形成[M-H]－峰，部分赤芍单萜糖苷类成分还能形成[M+HCOO]－峰。在ESI+模式下，川芎当归苯酞类成分容易形成[M+H]+峰，部分苯酞类成分还能形成[M+Na]+峰。根据每个成分在正负两种模式下的精确分子质量、色谱保留时间、特征峰情况，对成分进行定性确认。
表3有标准品的血必净成分的定性检测信息
Figure BDA0002221136550000121
Figure BDA0002221136550000131
Figure BDA0002221136550000141
Figure BDA0002221136550000151
表4没有标准品的血必净成分检测信息和对应的用于半定量的参照标准品编号
Figure BDA0002221136550000161
优选地，步骤4)中，所述标准曲线法，包括以下步骤：
a)将一系列不同浓度的第一标准溶液和/或第二标准溶液，分别进行HPLC-MS获得各种血必净成分的色谱峰面积与相应血必净成分的浓度的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到多种血必净成分的标准工作曲线的回归方程；
b)将样品溶液进行HPLC-MS分析，将获得的多种血必净成分的色谱峰面积代入步骤a)中相应血必净成分的标准工作曲线的回归方程，计算得到样品溶液中相应血必净成分的含量。
更优选地，步骤a)或b)中，所述血必净成分为第一标准溶液和/或第二标准溶液中存在的化学成分。所述血必净成分为57个，具体成分见表3。
更优选地，步骤a)或b)中，所述标准工作曲线中，以各种血必净成分的色谱峰面积比为纵坐标(Y轴)，其相应血必净成分的浓度为横坐标(X轴)。
更优选地，步骤a)中，所述标准工作曲线中，各种血必净成分的浓度范围为7.8～4000nM。
更优选地，步骤a)或b)中，所述半定量确定样品溶液中与定量确定的57种小分子化学成分结构相似的其它66种小分子化学成分的含量是指，根据HPLC-MS分析获得的其它66种小分子化学成分的色谱峰面积，分别代入与其结构相似的定量确定的57种小分子化学成分相应的标准工作曲线中，计算得到其它66种小分子化学成分的含量。其它66种小分子化学成分相应的结构相似的定量确定的57种小分子化学成分见表4。
如上所述，本发明提供的一种血必净注射液中多个小分子化学成分的检测方法，是一种能够用于中药注射液血必净生产过程质控的多个小分子化学成分一同检测的分析方法，建立能够全面分析血必净中123种小分子化合物含量的检测方法。该分析方法灵敏可靠，可高通量、高灵敏度地定量或半定量检测更多的血必净成分。一共能够同时检测123个中药小分子化合物，其中包括：36个红花黄酮类化合物、19个赤芍单萜糖苷类化合物、19个丹参儿茶酚类化合物、21个川芎当归苯酞类化合物及28个其它小分子化合物。该方法比目前已有的血必净化合物分析方法有更强的分析能力，能够有效实现血必净成分的药材归属，提高血必净药材饮片及制剂加工中间体和成品的质控水平，为进一步优化血必净的制备工艺、提高产品质量均一性提供关键的技术手段，从而有利于研究和保证血必净制备过程中各环节中间体和最终制剂产品的质量，提高血必净质量的一致性、有效性、安全性。
附图说明
图1显示为本发明的血必净注射液成品样品中红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、第五类成分检测的总离子流图(ESI-模式)。
图2显示为本发明的血必净注射液成品样品中川芎和当归苯酞类成分检测的总离子流图(ESI+模式)。
图3显示为本发明的高效液相色谱中Curve数值设定曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下实施例使用的试剂和仪器如下：
1、试剂
血必净注射液(由天津红日药业股份有限公司提供)；甲醇(≥99.9％，美国Sigma-Aldrich公司)；水(纯水，由纯水机制备)；57种化学成分标准品(≥98％，分别购自上海同田生物技术股份有限公司、上海源叶生物科技有限公司、云南西力生物技术有限公司、成都普思生物科技有限公司、上海诗丹德生物技术有限公司)；甲酸(≥99.9％，美国Merck公司)。
2、仪器
AcQuityTM UPLC高效液相色谱仪(Waters公司)；SYNAPT G2 HDMS型电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱仪(Waters公司)；Waters Acquity
Figure BDA0002221136550000191
HSS T3色谱柱(100mm×2.1mm ID，1.8μm)。
在一个具体实施例中，对于一种血必净注射液中多个小分子化学成分的检测方法，包括以下的检测过程。
1、前处理
将血必净注射液采用10-75％(v/v)的甲醇水溶液稀释后定容，配制样品溶液。血必净注射液与溶剂的体积比为1:1-1:5000。
2、定性定量分析
将红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、第五类成分中至少一种成分标准品用溶剂稀释后定容，作为第一标准溶液。第一标准溶液中可包含的化学成分共46种，其中，红花黄酮类成分为14种，赤芍单萜糖苷类成分为9种，丹参儿茶酚类成分为10种，第五类成分为13种，具体见发明内容。
将川芎和当归苯酞类成分中至少一种成分标准品用溶剂稀释后定容，作为第二标准溶液。第二标准溶液中可包含的化学成分共11种，具体见发明内容。
将样品溶液、第一标准溶液、第二标准溶液，采用高效液相色谱质谱联用法进行测定，通过质谱对样品溶液中123种小分子化学成分进行定性，通过标准曲线法对样品溶液中57种小分子化学成分进行定量，再半定量确定样品溶液中与定量确定的57种小分子化学成分结构相似的其它66种小分子化学成分的含量。
其中，样品溶液及第一标准溶液采用的高效液相色谱质谱联用法中，高效液相色谱测定条件为：色谱柱：T3柱；柱温：40-50℃；流速：0.2-0.4ml/min；进样量：3-10μl；流动相：水-甲醇溶液(含甲酸)，其中，A相为水(含1-30mM甲酸)，B相为甲醇(含1-30mM甲酸)；分析时间：20min；梯度洗脱。梯度洗脱程序见表1。
其中，样品溶液及第二标准溶液采用的高效液相色谱质谱联用法中，高效液相色谱测定条件为：色谱柱：T3柱；柱温：40-50℃；流速：0.2-0.4ml/min；进样量：3-10μl；流动相：水-甲醇溶液(含甲酸)，其中，A相为水(含0.5-1.5mM甲酸)，B相为甲醇(含0.5-1.5mM甲酸)；分析时间：20min；梯度洗脱。梯度洗脱程序见表2。
上述采用的质谱为电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱(high definitiontime-of-flight mass spectrometer)。质谱测定条件为：离子源为ESI源；检测模式为负离子电喷雾电离模式(ESI-)和正离子电喷雾电离模式(ESI+)；扫描模式为Sensitivity模式；扫描范围为m/z50–1000，扫描时间为0.3s；数据采集模式为MSE；毛细管电压(CapillaryVoltage)为-2.5kv(ESI-)或3.0kv(ESI+)；离子源温度(Source Temperature)为120℃；锥孔气体流量(Cone Gas Flow)为50L/hr；去溶剂化气体流量(Desolvation Gas Flow)为800L/hr；去溶剂化温度(Desolvation Temperature)为400℃；锥孔电压(Sampling ConeVoltage)为35V(ESI-：红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分和第五类成分)或40V(ESI+：川芎和当归苯酞类成分)；提取锥孔电压(Extraction Cone Voltage)为4V；质量数校正范围为m/z 50-1000；校正溶液为5mM甲酸钠溶液(流速10μL/min)；实时校正Lock Spray为亮氨酸脑啡肽溶液【流速5μL/min；校正质量数m/z 554.2615(ESI-)和556.2771(ESI+)】；数据类型为centroid；打碎能量ramp为20-50eV(红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分和第五类成分)、20-40eV(川芎和当归苯酞类成分)。
上述样品溶液中红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、第五类成分、川芎和当归苯酞类成分的定性信息：精确分子量、ESI电离模式特征峰情况、电离后m/z、保留时间TR见表3、4。
上述标准曲线法是将一系列不同浓度的第一标准溶液和/或第二标准溶液，分别进行HPLC-MS获得各种血必净成分的色谱峰面积与相应血必净成分的浓度的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到多种血必净成分的标准工作曲线的回归方程。再将样品溶液进行HPLC-MS分析，将获得的多种血必净成分的色谱峰面积代入相应血必净成分的标准工作曲线的回归方程，计算得到样品溶液中相应血必净成分的含量。其中，血必净成分为第一标准溶液和/或第二标准溶液中存在的化学成分。所述血必净成分为57个，具体成分见表3。
上述半定量确定样品溶液中与定量确定的57种小分子化学成分结构相似的其它66种小分子化学成分的含量是指，根据HPLC-MS分析获得的其它66种小分子化学成分的色谱峰面积，分别代入与其结构相似的定量确定的57种小分子化学成分相应的标准工作曲线中，计算得到其它66种小分子化学成分的含量。其它66种小分子化学成分相应的结构相似的定量确定的57种小分子化学成分见表4。
实施例1
1、前处理
将血必净注射液采用50％(v/v)的甲醇水溶液稀释后定容，配制样品溶液。血必净注射液与溶剂的体积比为1:1-1:5000。
2、定性定量分析
将红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、第五类成分中至少一种成分标准品用溶剂稀释后定容，作为第一标准溶液。第一标准溶液中可包含的化学成分共46种，具体内容见上。
将川芎和当归苯酞类成分中一种或多种成分标准品用溶剂稀释后定容，作为第二标准溶液。第二标准溶液中可包含的化学成分共11种，具体内容见上。
将样品溶液、第一标准溶液、第二标准溶液，采用高效液相色谱质谱联用法进行测定，通过质谱对样品溶液中123种小分子化学成分进行定性，通过标准曲线法对样品溶液中57种小分子化学成分进行定量，再半定量确定样品溶液中与定量确定的57种小分子化学成分结构相似的其它66种小分子化学成分的含量。
其中，样品溶液及第一标准溶液采用的高效液相色谱质谱联用法中，高效液相色谱测定条件为：色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱(100×2.1mm，1.8μm)；柱温：45℃；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；流动相：水-甲醇溶液(含甲酸)，其中，A相为水(含25mM甲酸)，B相为甲醇(含25mM甲酸)；分析时间：20min；梯度洗脱。梯度洗脱程序见表1。
其中，样品溶液及第二标准溶液采用的高效液相色谱质谱联用法中，高效液相色谱测定条件为：色谱柱：Waters Acquity UPLC HSS T3色谱柱(100×2.1mm，1.8μm)；柱温：45℃；流速：0.3ml/min；进样量：5μl；流动相：水-甲醇溶液(含甲酸)，其中，A相为水(含1mM甲酸)，B相为甲醇(含1mM甲酸)；分析时间：20min；梯度洗脱。梯度洗脱程序见表2。
上述采用的质谱为电喷雾离子源高分辨串联飞行时间质谱(high definitiontime-of-flight mass spectrometer)。质谱测定条件为：离子源为ESI源；检测模式为负离子电喷雾电离模式(ESI-)和正离子电喷雾电离模式(ESI+)；扫描模式为Sensitivity模式；扫描范围为m/z50–1000，扫描时间为0.3s；数据采集模式为MSE；毛细管电压(CapillaryVoltage)为-2.5kv(ESI-)或3.0kv(ESI+)；离子源温度(Source Temperature)为120℃；锥孔气体流量(Cone Gas Flow)为50L/hr；去溶剂化气体流量(Desolvation Gas Flow)为800L/hr；去溶剂化温度(Desolvation Temperature)为400℃；锥孔电压(Sampling ConeVoltage)为35V(ESI-：红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分和第五类成分)或40V(ESI+：川芎和当归苯酞类成分)；提取锥孔电压(Extraction Cone Voltage)为4V；质量数校正范围为m/z 50-1000；校正溶液为5mM甲酸钠溶液(流速10μL/min)；实时校正Lock Spray为亮氨酸脑啡肽溶液【流速5μL/min；校正质量数m/z 554.2615(ESI-)和556.2771(ESI+)】；数据类型为centroid；打碎能量ramp为20-50eV(红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分和第五类成分)、20-40eV(川芎和当归苯酞类成分)。
上述样品溶液中红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、第五类成分、川芎和当归苯酞类成分的定性信息：精确分子量、ESI电离模式特征峰情况、电离后m/z、保留时间TR见表3、4。
上述标准曲线法是将一系列不同浓度的第一标准溶液和/或第二标准溶液，分别进行HPLC-MS获得各种血必净成分的色谱峰面积与相应血必净成分的浓度的线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到多种血必净成分的标准工作曲线的回归方程。再将样品溶液进行HPLC-MS分析，将获得的多种血必净成分的色谱峰面积代入相应血必净成分的标准工作曲线的回归方程，计算得到样品溶液中相应血必净成分的含量。其中，血必净成分为第一标准溶液和/或第二标准溶液中存在的化学成分。所述血必净成分为57个，具体成分见表3。
上述半定量确定样品溶液中与定量确定的57种小分子化学成分结构相似的其它66种小分子化学成分的含量是指，根据HPLC-MS分析获得的其它66种小分子化学成分的色谱峰面积，分别代入与其结构相似的定量确定的57种小分子化学成分相应的标准工作曲线中，计算得到其它66种小分子化学成分的含量。其它66种小分子化学成分相应的结构相似的定量确定的57种小分子化学成分见表4。
通过上述方法检测，结果见图1-2。由图1-2可知，可定性及定量测定血必净中小分子成分。该方法囊括了对36个红花黄酮类化合物、19个赤芍单萜糖苷类化合物、19个丹参儿茶酚类化合物、21个川芎当归苯酞类化合物及28个其它小分子化合物共123个成分。
实施例2
配制各成分的浓度范围为7.8～4000nM的第一标准溶液，分别进行HPLC/MS检测，以色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应第一标准溶液中红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、第五类成分的质量浓度为横坐标(X轴)，进行回归分析，得到回归方程及其相关系数，如表5所示。
由表5可知，上述回归方程的在相应浓度范围内进样时线性关系良好，相关系数r>0.99。对标准溶液中的目标物响应信号，采用最低浓度标样重复进样3次，进行HPLC/MS分析。
表5工作曲线和定量下限
Figure BDA0002221136550000231
Figure BDA0002221136550000241
实施例3
考察血必净注射液中代表性的红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、第五类成分测定方法的准确度和精密度。分析方法的加样回收率用注射液成分实测浓度与其标示浓度之比表示，分析方法的精密度用同浓度3份供试品分析结果的RSD值表示。
选取代表性的红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、第五类成分进行测定，具体结果见表6。由表6可知，选取的红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、第五类成分的加样平均回收率在88.5-114.4％之间，表明本方法加样回收率良好，精密度为1.2-13.1％，表明本方法重复性良好。
表6
实施例4
配制各成分的浓度范围为7.8～4000nM的第二标准溶液，分别进行HPLC/MS检测，以色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应第二标准溶液中川芎和当归苯酞类成分的质量浓度为横坐标(X轴)，进行回归分析，得到回归方程及其相关系数，如表7所示。
由表7可知，上述回归方程的在相应浓度范围内进样时线性关系良好，相关系数r>0.98。对标准溶液中的目标物响应信号，采用最低浓度标样重复进样3次，进行HPLC/MS分析。
表7工作曲线和定量下限
Figure BDA0002221136550000252
Figure BDA0002221136550000261
实施例5
考察血必净注射液中代表性川芎和当归苯酞类成分测定方法的准确度和精密度。分析方法的加样回收率用注射液成分实测浓度与其标示浓度之比表示，分析方法的精密度用同浓度3份供试品分析结果的RSD值表示。
选取代表性川芎和当归苯酞类成分进行测定，具体结果见表8。由表8可知，选取的川芎和当归苯酞类成分的加样平均回收率在91.2-111.2％之间，表明本方法加样回收率良好，精密度为2.4-7.0％，表明本方法重复性良好。
表8
实施例6
通过实施例1制备的第一标准溶液存在的化学成分的标准曲线，半定量确定样品溶液中结构相似的红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、第五类成分的其它化学成分的含量。
通过实施例1制备的第二标准溶液存在的化学成分的标准曲线，半定量确定样品溶液中结构相似的川芎和当归苯酞类成分的其它化学成分的含量。
半定量可以较为准确地实现没有标准品的化合物的定量，有助于对血必净中各成分含量高低有一个全面的认知，对于寻找质控标识物(Quality Markers)起辅助作用。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (10)

1.一种血必净中多个小分子化学成分的检测方法，包括以下步骤：
1)将血必净注射液采用溶剂稀释后定容，配制样品溶液；
2)配制第一标准溶液，所述第一标准溶液为血必净注射液中红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、第五类成分中至少一种成分标准品用溶剂稀释后定容的溶液；
3)配制第二标准溶液，所述第二标准溶液为血必净注射液中川芎和当归苯酞类成分中至少一种成分标准品用溶剂稀释后定容的溶液；
4)将样品溶液、第一标准溶液、第二标准溶液，采用高效液相色谱质谱联用法进行测定，通过质谱对样品溶液中123种小分子化学成分进行定性，通过标准曲线法对样品溶液中57种小分子化学成分进行定量，再半定量确定样品溶液中与定量确定的57种小分子化学成分结构相似的其它66种小分子化学成分的含量；
所述红花黄酮类成分为36种，包括有羟基红花黄色素A、山奈酚、6-羟基山奈酚、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、山奈酚-3-O-槐糖苷、槲皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷、圣草酚、芹菜素、木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、野黄芩苷、红花黄色素A、Saffloquinoside A、Saffloquinoside C/D、Safflomin C、SaffloquinosideE、原红花苷、脱水红花黄色素B、红花黄色素B、山奈酚-3-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖醛酸苷/6-羟基芹菜素-6-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖醛酸苷、6-羟基山奈酚-7-O-葡萄糖苷、6-羟基山奈酚-3-O-葡萄糖苷、6-羟基山奈酚-3-O-芸香糖苷、6-羟基山奈酚-3,6-O-葡萄糖苷、6-羟基山奈酚-6,7-O-葡萄糖苷、6-羟基山奈酚-3-O-芸香糖-6-O-葡萄糖苷、6-羟基山奈酚-3,6,7-O-葡萄糖苷、6-羟基山奈酚-3,6-O-葡萄糖-7-O-葡萄糖醛酸苷、槲皮素-3-O-鼠李糖苷-7-O-葡萄糖醛酸、槲皮素-3,7-O-葡萄糖苷、新红花苷、6-羟基芹菜素、Safflochalconeside；
所述赤芍单萜糖苷类成分为19种，包括有芍药内酯苷、芍药苷、氧化芍药苷、6'-O-没食子酰去苯甲酰-芍药苷、苯甲酰芍药苷、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、牡丹皮苷J、没食子酰芍药苷、1-O-β-D-Glucopyranosyl-paeonisuffrone、去苯甲酰芍药苷、氧化芍药苷同分异构体1、氧化芍药苷同分异构体2、氧化芍药苷同分异构体3、牡丹皮苷D、牡丹皮苷E、牡丹皮苷B、没食子酰芍药苷同分异构体、没食子酰氧化芍药苷；
所述丹参儿茶酚类成分为19种，包括有原儿茶醛、原儿茶酸、丹参素、迷迭香酸、丹酚酸D、丹酚酸C、丹酚酸A、紫草酸、丹酚酸B、丹酚酸F、丹酚酸G、原紫草酸、丹参酸C、丹参酸C同分异构体、异丹酚酸C、异迷迭香酸苷、丹酚酸E、4-甲氧基丹酚酸B、咖啡酸；
所述川芎和当归苯酞类成分为21种，包括有Z-丁烯基苯酞、正丁基苯酞、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A、3-羟基-正丁基苯酞、洋川芎内酯G、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯N、开环洋川芎内酯I、欧当归内酯A、E-丁烯基苯酞、E-藁本内酯、蛇床内酯、Z-6,7-环氧藁本内酯、4-羟基-3-丁基苯酞、6,7-双羟基藁本内酯、洋川芎内酯J、欧当归内酯A同分异构体、洋川芎内酯P同分异构体1、洋川芎内酯P同分异构体2；
所述第五类成分为28种，包括有对香豆酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、绿原酸、苯甲酸、没食子酸、没食子酰甲酯、儿茶素、香草酸、新绿原酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、异绿原酸C、N-p-coumaroylserotonin-O-glucopyranoside、4-O-葡萄糖氧基苯甲酸、Safflospermidine A、Safflospermidine B、N1,N5,N10-(Z)-tri-p-coumaroylspermidine、N1,N5,N10-(E)-tri-p-coumaroylspermidine、1'-O-苯甲酰蔗糖、1'-O-没食子酰蔗糖、6-O-没食子酰蔗糖、三没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖、四没食子酰葡萄糖同分异构体、五没食子酰葡萄糖、芍药二酮、30-降常春藤皂苷元。
2.根据权利要求1所述的一种血必净中多个小分子化学成分的检测方法，其特征在于，步骤1)、2)或3)中，所述溶剂为10-75v/v％的甲醇水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种血必净中多个小分子化学成分的检测方法，其特征在于，步骤1)中，所述血必净注射液与溶剂的体积比为1:1-1:5000。
4.根据权利要求1所述的一种血必净中多个小分子化学成分的检测方法，其特征在于，步骤2)中，所述第一标准溶液中有红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分、第五类成分共46种，包括有以下小分子化学成分：
所述红花黄酮类成分为14种，包括有羟基红花黄色素A、山奈酚、6-羟基山奈酚、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-芸香糖苷、山奈酚-3-O-槐糖苷、槲皮素、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香糖苷、圣草酚、芹菜素、木犀草素、木犀草素-7-O-葡萄糖苷、野黄芩苷；
所述赤芍单萜糖苷类成分为9种，包括有芍药内酯苷、芍药苷、氧化芍药苷、6'-O-没食子酰去苯甲酰芍药苷、苯甲酰芍药苷、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍药苷、牡丹皮苷J、没食子酰芍药苷；
所述丹参儿茶酚类成分为10种，包括有原儿茶醛、原儿茶酸、咖啡酸、丹参素、迷迭香酸、丹酚酸D、丹酚酸C、丹酚酸A、紫草酸、丹酚酸B；
所述第五类成分为13种，包括有对香豆酸、对羟基苯甲酸、阿魏酸、绿原酸、苯甲酸、没食子酸、没食子酰甲酯、儿茶素、香草酸、新绿原酸、1,5-二咖啡酰奎宁酸、异绿原酸B、异绿原酸C。
5.根据权利要求1所述的一种血必净中多个小分子化学成分的检测方法，其特征在于，步骤3)中，所述第二标准溶液中有川芎和当归苯酞类成分，共11种，包括有Z-丁烯基苯酞、正丁基苯酞、Z-藁本内酯、洋川芎内酯A、3-羟基-正丁基苯酞、洋川芎内酯G、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、洋川芎内酯N、开环洋川芎内酯I、欧当归内酯A。
6.根据权利要求1所述的一种血必净中多个小分子化学成分的检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述样品溶液及第一标准溶液采用的高效液相色谱质谱联用法中，所述高效液相色谱测定条件为：色谱柱：T3柱；柱温：40-50℃；流速：0.2-0.4ml/min；进样量：3-10μl；流动相：水-甲醇溶液，含甲酸；其中，A相为水，含1-30mM甲酸；B相为甲醇，含1-30mM甲酸；分析时间：20min；梯度洗脱。
7.根据权利要求6所述的一种血必净中多个小分子化学成分的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序的具体为：0-1min，A相：B相体积比为95：5-95：5；1-15min，A相：B相体积比为95：5-20：80；15-17min，A相：B相体积比为20：80-5：95；17-20min，A相：B相体积比为5：95-95：5。
8.根据权利要求1所述的一种血必净中多个小分子化学成分的检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述样品溶液及第二标准溶液采用的高效液相色谱质谱联用法中，所述高效液相色谱测定条件为：色谱柱：T3柱；柱温：40-50℃；流速：0.2-0.4ml/min；进样量：3-10μl；流动相：水-甲醇溶液，含甲酸；其中，A相为水，含0.5-1.5mM甲酸；B相为甲醇，含0.5-1.5mM甲酸；分析时间：20min；梯度洗脱。
9.根据权利要求8所述的一种血必净中多个小分子化学成分的检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱程序的具体为：0-15min，A相：B相体积比为95：5-5：95；15-17min，A相：B相体积比为5：95-5：95；17-20min，A相：B相体积比为5：95-95：5。
10.根据权利要求1所述的一种血必净中多个小分子化学成分的检测方法，其特征在于，步骤4)中，所述样品溶液、第一标准溶液、第二标准溶液采用的高效液相色谱质谱联用法中，所述质谱测定条件为：离子源为ESI源；检测模式为负离子电喷雾电离模式ESI-和正离子电喷雾电离模式ESI+；扫描模式为Sensitivity模式；扫描范围为m/z 50–1000，扫描时间为0.3s；数据采集模式为MSE；毛细管电压为在ESI-模式-2.5kv或在ESI+模式3.0kv；离子源温度为120℃；锥孔气体流量为50L/hr；去溶剂化气体流量为800L/hr；去溶剂化温度为400℃；ESI-：红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分和第五类成分，锥孔电压为35V；ESI+：川芎和当归苯酞类成分，锥孔电压为40V；提取锥孔电压为4V；质量数校正范围为m/z 50-1000；校正溶液为5mM甲酸钠溶液，流速10μL/min；实时校正Lock Spray为亮氨酸脑啡肽溶液，流速5μL/min，ESI-模式校正质量数m/z 554.2615和ESI+模式校正质量数m/z 556.2771；数据类型为centroid；打碎能量ramp为20-50eV，红花黄酮类成分、赤芍单萜糖苷类成分、丹参儿茶酚类成分和第五类成分；打碎能量ramp为20-40eV，川芎和当归苯酞类成分。
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