CN112129861B - 一种金芩花颗粒中绿原酸、芍药苷和黄芩苷的检测方法 - Google Patents
一种金芩花颗粒中绿原酸、芍药苷和黄芩苷的检测方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种金芩花颗粒中绿原酸、芍药苷和黄芩苷的检测方法。该检测方法包括下述步骤：将待测液采用液相色谱法经梯度洗脱分离，即可；其中：所述液相色谱法中，色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，流动相A为0.1%磷酸溶液，流动相B为甲醇，通过控制梯度洗脱分离的程序检测绿原酸、芍药苷和黄芩苷，所述待测液为金芩花颗粒的提取液。本发明所提供的检测方法能够同时定量检测金芩花颗粒中的绿原酸、黄芩苷和芍药苷，可降低检验成本、提高检测效率，且具有精密度佳、准确度高等优点，适用于金芩花颗粒（儿童剂型）的质量控制。
Description
技术领域
本发明涉及一种金芩花颗粒中绿原酸、芍药苷和黄芩苷的检测方法。
背景技术
目前，一般通过检测金芩花颗粒中黄芩苷和芍药苷的含量来评价金芩花颗粒的质量，黄芩苷可按如下色谱条件进行检测：色谱柱：Lichrospher ODS色谱柱(4.6×250 mm)：流动相：甲醇-水-磷酸(48:52:0.2)；流速：1.0mL/min；检测波长：280 nm；进样量：10μL；理论板数按黄芩苷峰计算不低于2500。芍药苷可按如下色谱条件进行检测：色谱柱：Lichrospher ODS色谱柱（4.6×250mm）；流动相：甲醇-水-冰醋酸（25:75:0.2）作为流动相；流速：1.0 mL/min；检测波长：232 nm；进样量：10μL；理论板数按芍药苷峰计算不低于2500。（参见：俞婷, 王观军. 金芩花颗粒质量标准研究[C]. 江苏省药学大会暨江苏省药师周.2010.）。
然而，上述方法所针对的对象一般为金芩花颗粒成人制剂，对于儿童剂型，质量控制标准更高，该方法存在质量控制指标单一、操作繁琐的缺陷。为更好地控制产品质量，需增加君药金银花的含量测定，上述方法均不能实现绿原酸、芍药苷和黄芩苷三种有效成分的同时定量。
因此，如何同步检测金芩花颗粒中绿原酸、芍药苷和黄芩苷的含量，以准确反应产品质量并提高检测效率是亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中金芩花颗粒的检测方法要么质量控制指标单一、难以准确反应产品质量，要么需要不同的检测方法结合、检测成本高的缺陷，而提供了一种金芩花颗粒中绿原酸、芍药苷和黄芩苷的检测方法。本发明所提供的检测方法能够同时定量检测金芩花颗粒中的绿原酸、黄芩苷和芍药苷，简化了操作步骤、降低了检验成本，且具有精密度佳、准确度高等优点，适用于金芩花颗粒（儿童剂型）的质量控制。
本发明提供了一种绿原酸、芍药苷和黄芩苷的检测方法，其包括下述步骤：
将待测液采用液相色谱法经梯度洗脱分离，即可；其中：
所述液相色谱法中，色谱条件如下：
色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相A为0.1%磷酸溶液，流动相B为甲醇；以所述流动相A、所述流动相B的总体积为100%计，所述梯度洗脱分离的程序为：
在0-12min，所述流动相A的体积为72-82%；
在12-25min，所述流动相A的体积由72-82%递减至55-65%；
在25-40min，所述流动相A的体积由55-65%递减至45-55%；
在40-45min，所述流动相A的体积由45-55%递减至0%；
所述待测液为金芩花颗粒的提取液。
本发明中，所述待测液可经乙醇稀释。所述乙醇可为体积分数为50%的乙醇。
本发明中，所述填料的粒径可为3-4 μm，例如3.5 μm。
本发明中，所述色谱柱的柱长可为150mm。
本发明中，所述色谱柱的内径可为4.6mm。
本发明中，所述色谱柱可为Kromasil C18色谱柱或Agilent C18色谱柱。
本发明中，所述色谱柱的柱温可为23-27℃，例如23℃、25℃或27℃。
本发明中，所述液相色谱法中，进样体积可为5μL。
本发明中，所述液相色谱法中，流动相的流速可为0.7-0.9 mL/min，例如0.7mL/min、0.8mL/min或0.9mL/min。
本发明中，优选地，以所述流动相A、所述流动相B的总体积为100%计，所述的梯度洗脱分离的程序为：
在0-12min，所述流动相A的体积为77%；
在12-25min，所述流动相A的体积由77%递减至60%；
在25-40min，所述流动相A的体积由60%递减至50%；
在40-45min，所述流动相A的体积由50%递减至0%；
更优选地：
在0-12min，所述流动相A的体积为77%；
在12-25min，所述流动相A的体积由77%递减至60%；
在25-40min，所述流动相A的体积由60%递减至50%；
在40-45min，所述流动相A的体积由50%递减至0%；
在45-55min，所述流动相A的体积为0%。
本发明中，所述液相色谱法中的色谱仪可为本领域常规的色谱仪，例如Thermo生产的U3000型液相色谱仪或者岛津生产的LC-20AD XR型液相色谱仪。
本发明中，所述金芩花颗粒的提取液可采用下述方法制得，将所述金芩花颗粒经乙醇提取，即可。
其中，所述金芩花颗粒的质量g和所述乙醇的体积mL之比可为1:100。
其中，所述提取的方式可为回流提取。
其中，所述提取的时间可为60min。
其中，所述提取之后，还可经离心。所述离心的转速可为10kr/min。
本发明中，所述金芩花颗粒可为本领域常规的金芩花颗粒，例如金芩花颗粒成人颗粒或金芩花小儿颗粒。所述金芩花颗粒的原料可包括下述组分：金芩花清膏、包合物和辅料；其中：
所述包合物按下述方法制得，将挥发油加入β-环糊精的水溶液中，经包合，获得包合物，即可；所述挥发油的提取原料为连翘和野菊花；
所述金芩花清膏的原料为提取液A和提取液B，所述的提取液A的提取原料为金银花、蒲公英、紫花地丁、黄芩、赤芍、当归、大青叶、柴胡、大黄、所述的包合物的制备方法中提取挥发油后的连翘和提取挥发油后的野菊花，所述的提取液B为所述连翘和所述野菊花提取挥发油后所获得的药液
其中，所述连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa （Thunb.）Vahl的干燥果实。
其中，所述野菊花为菊科植物野菊Chrysanthemum indicum L.的干燥头状花序。
其中，所述连翘和所述野菊花的原料用量之比可为本领域制备金芩花颗粒中金芩花清膏的常规用量之比，例如所述连翘和所述野菊花的质量之比为（0.75-1.3）:1，再例如1:1。
其中，所述挥发油可按本领域常规的工艺提取得到，例如采用水蒸气蒸馏法提取得到。所述水蒸气蒸馏法可按本领域常规操作进行，例如将所述连翘、所述野菊花和水混合，浸泡后经蒸馏提取，收集挥发油，即可。所述水的用量ml：（连翘、野菊花质量之和g）可为（5-10）:1，例如8:1。所述浸泡的时间可为3-5小时，例如4小时。所述蒸馏的时间可为3-5小时，例如4小时。
其中，所述β-环糊精的水溶液中的水和所述挥发油的体积比可为≥25:1，例如40:1。
其中，所述β-环糊精的水溶液中β-环糊精的质量g和所述挥发油的体积ml之比可为本领域常规的包合比例，例如（6-16）:1，再例如8:1。
其中，所述包合的温度可为本领域常规的包合温度，例如60-75℃，再例如75℃。
其中，所述包合的时间可根据所述挥发油的量进行确定，例如，所述挥发油的量为1-25 mL（例如1-2mL，再例如1mL或2mL），所述包合的时间优选为30-90min。更优选地，所述包合的时间为60-90min，例如90min。
其中，优选地，所述β-环糊精的水溶液中β-环糊精的质量g和所述挥发油的体积mL之比为8:1，所述包合的温度为75℃。当所述挥发油的量为1-25 mL（例如1-2mL，再例如1mL或2mL）时，所述包合的时间优选为30-90min（例如90min）。
其中，所述包合后一般还经冷藏、抽滤和干燥等后处理过程。所述冷藏可为2-8℃冷藏24h。所述干燥可为低温干燥。所述干燥后，还可经粉碎制得细粉，过12目筛。
其中，所述金银花为忍冬科忍冬属植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花。所述金芩花颗粒中，所述金银花的原料用量可为本领域制备所述金芩花清膏的常规用量，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述金银花的原料用量可为150-200份，例如177.5份。
其中，所述蒲公英为菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.、碱地蒲公英Taraxacum borealisinense Kitam.或同属数种植物的干燥全草。所述金芩花颗粒中，所述蒲公英的原料用量可为本领域制备所述金芩花清膏的常规用量，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述蒲公英的原料用量可为150-200份，例如177.5份。
其中，所述紫花地丁为堇菜科植物紫花地丁Viola yedoensis Makino的干燥全草。所述金芩花颗粒中，所述紫花地丁的原料用量可为本领域制备所述金芩花清膏的常规用量，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述紫花地丁的原料用量可为150-200份，例如177.5份。
其中，所述黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根。所述金芩花颗粒中，所述黄芩的原料用量可为本领域制备所述金芩花清膏的常规用量，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述黄芩的原料用量可为120-160份，例如141.6份。
其中，所述赤芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.或川赤芍Paeonia veitchii Lynch的干燥根。所述金芩花颗粒中，所述赤芍的原料用量可为本领域制备所述金芩花清膏的常规用量，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述赤芍的原料用量可为120-160份，例如141.6份。
其中，所述当归为伞形科植物当归Angelica sinensis (Oliv.)Diels的干燥根。所述金芩花颗粒中，所述当归的原料用量可为本领域制备所述金芩花清膏的常规用量，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述当归的原料用量可为100-150份，例如118份。
其中，所述大青叶为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort.的干燥叶。所述金芩花颗粒中，所述大青叶的原料用量可为本领域制备所述金芩花清膏的常规用量，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述大青叶的原料用量可为100-150份，例如118份。
其中，所述柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根。所述金芩花颗粒中，所述柴胡的原料用量可为本领域制备所述金芩花清膏的常规用量，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述柴胡的原料用量可为100-150份，例如118份。
其中，所述大黄为蓼科植物掌叶大黄Rheum palmatum L.、唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim. ex Balf.或药用大黄Rheum officinale Baill.的干燥根及根茎。所述金芩花颗粒中，所述大黄的原料用量可为本领域制备所述金芩花清膏的常规用量，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述大黄的原料用量可为30-60份，例如47.2份。
其中，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述连翘的原料用量可为120-160重量份，例如141.6份。
其中，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述野菊花的原料用量可为120-160重量份，例如141.6份。
其中，所述金芩花颗粒的原料中：优选地，所述金银花150-200份、所述蒲公英150-200份、所述紫花地丁150-200份、所述连翘120-160份、所述黄芩120-160份、所述赤芍120-160份、所述野菊花120-160份、所述当归100-150份、所述大青叶100-150份、所述柴胡100-150份和所述大黄30-60份；
更优选地：所述金银花177.5份、所述蒲公英177.5份、所述紫花地丁177.5份、所述连翘141.6份、所述黄芩141.6份、所述赤芍141.6份、所述野菊花141.6份、所述当归118份、所述大青叶118份、所述柴胡118份和所述大黄47.2份。
其中，所述提取液A可按本领域常规的工艺提取得到，例如将金银花、蒲公英、紫花地丁、黄芩、赤芍、当归、大青叶、柴胡、大黄、提取挥发油后的连翘、提取挥发油后的野菊花和水混合，加热煎煮，获得药液，将所述药液经浓缩即可。所述水的用量ml：提取原料质量之和g可为（8-12）:1，例如8:1或10:1。所述加热的温度可为55-65℃，例如60℃。所述煎煮的时间可为1-2小时，例如2小时。所述黄芩可经粗粉碎之后再进行煎煮。所述煎煮可分多次进行，例如按水的用量ml：提取原料质量之和g为10:1煎煮1小时，过滤，再按水的用量ml：提取原料质量之和g为8:1煎煮1小时。
本领域技术人员知晓，若煎煮分多次进行，需合并药液。一般将所述提取挥发油后所获得的药液和所述煎煮后获得的药液合并。
一般将所述提取液A和所述提取液B浓缩即可获得所述金芩花清膏。所述金芩花清膏的药液相对密度一般为1.2（60℃）。
其中，所述金芩花清膏的原料用量可为本领域常规的制备所述金芩花颗粒的原料用量，优选地，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述金芩花清膏为450-480份，例如466.7份。
其中，所述辅料可为本领域常规的在生产药品和调配处方时所使用的赋形剂和附加剂，优选地，所述辅料为糊精、乳糖和甘露醇中的一种或多种，例如糊精。所述糊精可购自安徽山河药用辅料有限公司。以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述辅料的用量一般为余量。
其中，优选地，所述金芩花颗粒的原料中还包括阿司帕坦、三氯蔗糖和安赛蜜中的一种或多种。
其中，当所述金芩花颗粒中的原料还包括阿司帕坦时，优选地，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述阿司帕坦为8-15份，例如10份。
当所述金芩花颗粒的原料中还包括三氯蔗糖时，优选地，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述三氯蔗糖为4-20份，例如5份。
当所述金芩花颗粒的原料中还包括安赛蜜时，优选地，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述安赛蜜为8-15份，例如10份。
优选地，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述金芩花颗粒的原料中还包括下述组分：阿司帕坦 8-15份，三氯蔗糖 4-10份，安赛蜜 8-15份；或者，阿司帕坦 10份，三氯蔗糖 5份，安赛蜜 10份。
其中，所述金芩花颗粒的原料中还可包括苦味阻滞剂和/或香精。
所述苦味阻滞剂可为氯化钠、谷氨酸钠和呈味核苷酸二钠中的一种或多种，例如谷氨酸钠。以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述苦味阻滞剂的用量可为1-10份，例如2.5份。当所述苦味阻滞剂为谷氨酸钠时，所述苦味阻滞剂的用量优选为1-3份，例如2.5份。
所述香精可为草莓香精、甜橙香精、西柚香精和黑加仑香精中的一种或多种，优选为黑加仑香精。所述黑加仑香精可购自南京天力食品配料有限公司。所述草莓香精可购自南京天力食品配料有限公司。所述金芩花颗粒以1000份重量份计，所述香精的用量可为10-40份，例如10份。
当所述香精为黑加仑香精时，所述香精的用量优选为10-20份，例如10份。
以所述金芩花颗粒1000份重量份计，优选地，所述金芩花颗粒的原料中还包括：阿司帕坦8-15份，三氯蔗糖4-20份，安赛蜜8-15份，谷氨酸钠1-10份，黑加仑香精10-20份；例如：阿司帕坦10份，三氯蔗糖5份，安赛蜜10份，谷氨酸钠2.5份，黑加仑香精10份。
以所述金芩花颗粒1000份重量份计，优选地，所述金芩花颗粒的原料由下述组分组成：所述金芩花清膏，所述包合物，所述糊精，阿司帕坦8-15份，三氯蔗糖4-20份，安赛蜜8-15份，谷氨酸钠1-10份，黑加仑香精10-20份；更优选地，所述金芩花颗粒的原料由下述组分组成：所述金芩花清膏，所述包合物，所述糊精，阿司帕坦10-15份，三氯蔗糖5-10份，安赛蜜10-15份，谷氨酸钠2.5-10份，黑加仑香精10份；例如：所述金芩花清膏，所述包合物，所述糊精，阿司帕坦10份，三氯蔗糖5份，安赛蜜10份，谷氨酸钠2.5份，黑加仑香精10份。
优选地，所述金芩花颗粒的原料组分如下表1所示。
其中，所述金芩花颗粒可采用本领域常规方法制得，例如采用下述步骤制得：
（1）将所述金芩花清膏和所述辅料经混合制粒，制得颗粒；
（2）将所述包合物和步骤（1）中所述颗粒混合均匀，即可；
当所述金芩花颗粒的原料中还包括所述阿司帕坦、所述三氯蔗糖和所述安赛蜜中的一种或多种时，将所述金芩花清膏、所述阿司帕坦、所述三氯蔗糖、所述安赛蜜和所述辅料经混合制粒，制得颗粒；
当所述金芩花颗粒的原料中还包括所述苦味阻滞剂和/或所述香精时，将所述苦味阻滞剂、所述香精、所述包合物和步骤（1）中所述颗粒混合均匀，即可。
步骤（1）中，所述制粒的方法可为本领域常规的方法，例如湿法制粒或流化床制粒。所述流化床制粒可按照下述工艺进行，例如：先将所述辅料加入制粒机中，再将所述金芩花清膏喷入所述制粒机中，经制粒，即可；再例如：将所述金芩花清膏、所述阿司帕坦、所述三氯蔗糖和所述安赛蜜混合溶解得混合溶液，将所述辅料加入制粒机中，再将所述混合溶液喷入所述制粒机中，经制粒，即可。
所述辅料加入制粒机中后，可将物料加热至60-70℃。
所述混合溶解的温度可为60-70℃。
所述制粒机中，进风温度可为90 + 15℃。
所述制粒机中，出风温度可为60 + 10℃。
所述金芩花清膏喷入所述制粒机中时，物料的温度可为65-80℃。
所述混合溶液喷入所述制粒机中时，物料的温度可为65-80℃。
当所述金芩花颗粒为金芩花颗粒成人颗粒时，优选地，所述黄芩苷的含量≥13mg/g，所述芍药苷的含量≥4.5mg/g。
当所述金芩花颗粒为金芩花颗粒小儿颗粒时，优选地，所述绿原酸的含量≥1.0mg/g，所述黄芩苷的含量≥4.6mg/g，所述芍药苷的含量≥1.6mg/g。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明所提供的方法能够同时定量检测金芩花颗粒中的绿原酸、黄芩苷和芍药苷，适用于金芩花颗粒（儿童剂型）的质量控制，降低了检验成本。
附图说明
图1为实施例1金芩花小儿颗粒中绿原酸、芍药苷和黄芩苷的分离色谱图。
图2为实施例5中绿原酸、芍药苷和黄芩苷标准曲线。
图3为对比例1金芩花小儿颗粒中绿原酸、芍药苷和黄芩苷的分离色谱图。
图4为对比例2金芩花小儿颗粒中绿原酸、芍药苷和黄芩苷的分离色谱图。
图5为对比例3金芩花小儿颗粒中绿原酸、芍药苷和黄芩苷的分离色谱图。
图6为对比例4金芩花小儿颗粒中绿原酸、芍药苷和黄芩苷的分离色谱图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
金芩花小儿颗粒的原料中：
糊精购自安徽山河药用辅料有限公司，β-环糊精购自山东新大生物科技，阿司帕坦（也称阿斯巴甜，CAS号:22839-47-0），三氯蔗糖（CAS号:56038-13-2），安赛蜜（CAS号:33665-90-6），谷氨酸钠（CAS号:142-47-2），黑加仑香精购自南京天力食品配料有限公司。
下述实施例及对比例中：
（1）缩写和简称见下表2。
（2）材料和仪器
金芩花小儿颗粒按下述方法制得：
1）配料
按照下表4准备原料，每批投料量（300料，一料为一个处方量）。
2）粗粉碎工序
将黄芩粉碎成粗粉，置于容器内备用。
3）蒸馏、提取工序
取连翘、野菊花放入蒸馏器中，加约8倍量水，温浸4小时后，提取挥发油，连续蒸馏约4小时，收集挥发油。药液备用，药渣置清洁、干燥容器内备用。
4）煎煮工序
将3）中蒸馏后的连翘、野菊花的药渣与金银花、蒲公英、当归、紫花地丁、大青叶、柴胡、大黄、赤芍一起投入多能提取罐中，加约10倍量水，升温至60℃，加入步骤2）中黄芩粗粉，继续加热煎煮1小时，过滤，药渣加8倍量水加热再煎煮1小时，合并药液。
5）过滤工序
将步骤3）中蒸馏后药液与步骤4）中煎煮药液合并，经管道过滤器过滤，滤液置沉淀罐中。
6）沉淀、离心、过滤工序
7）浓缩工序
将离心过滤后药液浓缩至相对密度为1.2（60℃）的清膏，中间产品检验合格后。
8）包合工序：
9）流化床一步制粒工序
10）整粒工序
11）混合工序
缺黄芩阴性样品为在表4的基础上不添加黄芩，其余同金芩花小儿颗粒。
缺赤芍阴性样品为在表4的基础上不添加赤芍，其余同金芩花小儿颗粒。
缺金银花阴性样品为在表4的基础上不添加金银花，其余同金芩花小儿颗粒。
缺金银花、野菊花、柴胡阴性样品为在表4的基础上不添加金银花、野菊花、柴胡，其余同金芩花小儿颗粒。
（3）色谱条件
（4）溶液配制
流动相：0.1%磷酸溶液：取超纯水1L，加磷酸1ml，混匀，即得。
稀释剂（空白溶剂）：稀乙醇溶液（50%乙醇）：量取无水乙醇50ml，加水至100ml，混匀，即得。
对照品溶液：取黄芩苷对照品、芍药苷对照品、绿原酸对照品适量，精密称定，加稀乙醇溶液分别制成每1ml含黄芩苷60μg，芍药苷30μg，绿原酸25μg的溶液，混匀，即得。
供试品溶液：取金芩花小儿颗粒粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇溶液50ml，密塞，摇匀，称定重量，回流提取（沸水浴）60分钟，取出，放至室温，再称定重量，用稀乙醇溶液补足减失重量，摇匀，高速离心（10kr/min），取上清液，即得。
阴性供试品溶液：
NSMP-1: 取缺黄芩的阴性样品，同供试品溶液制备方法，制成缺黄芩的阴性供试品溶液。
NSMP-2: 取缺赤芍的阴性样品，同供试品溶液制备方法，制成缺芍药的阴性供试品溶液。
NSMP-3: 取缺金银花的阴性样品，同供试品溶液制备方法，制成缺金银花的阴性供试品溶液。
NSMP-4: 取同时缺金银花、野菊花、柴胡的阴性样品，同供试品溶液制备方法，制成缺绿原酸的阴性供试品溶液。
（5）系统适用性试验
精密吸取混合对照品溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，连续6针对照品溶液中，色谱峰保留时间的RSD应不大于1.0%，峰面积的RSD应不大于1.5%。
精密吸取供试品溶液5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。
（6）测定与计算
精密量取混合对照品溶液和供试品溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。计算公式如下：
式中：
WSTD：对照品的称样量，mg；
PSTD：对照品的含量；
VSTD：对照品的稀释倍数；
ASTD：对照品溶液色谱图中待测成分的峰面积；
AIMP：供试品溶液色谱图中待测成分的峰面积；
WSAM：供试品的称样量，g；
VSAM：供试品的稀释倍数；
f：待测成分的平均校正因子。
（7）限度
根据处方工艺及待测成分转移率，金芩花小儿颗粒中绿原酸含量不得少于1.0mg/g；黄芩苷含量不得少于4.6mg/g；芍药苷含量不得少于1.6mg/g。
实施例1 系统适用性试验
（1）验证过程
参照前述方法配制空白溶剂、对照品溶液（平行制备2份，下称STD-1、STD-2）、供试品溶液（SMP）。
测定：精密吸取上述空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，对照品溶液1连续进6针，空白溶液、对照品溶液2、供试品溶液进样2针，记录色谱图。
（2）可接受标准
1）空白溶剂在主成分保留时间处应无干扰，若有，干扰峰面积应不超过对照品溶液主成分峰面积的0.5%；
2）连续6针对照品溶液1主成分峰面积的RSD≤1.5%，主成分保留时间的RSD≤1.0%，第一针对照品溶液中主成分，拖尾因子0.7~1.3，理论板数≥5000；
3）两份对照品溶液的响应因子RSD应≤2.0%；
4）供试品溶液中绿原酸、芍药苷、黄芩苷与相邻色谱峰分离度应≥1.5。
（3）验证结果
结论：空白溶剂在对照品溶液各目标成分保留时间处无干扰。系统适用性试验中，对照品溶液1连续6针绿原酸、芍药苷、黄芩苷峰面积的RSD在0.35%~1.24%之间，保留时间的RSD在0.02%~0.07%之间，第一针对照品溶液中的目标成分，对称因子在0.97~1.04之间，理论板数在5876~197904之间；两份对照品溶液的响应因子RSD在0.25%~1.36%之间。供试品溶液中绿原酸、芍药苷、黄芩苷与相邻色谱峰分离度在2.14~3.64之间。均符合接受标准，系统适用性良好。
供试品溶液中绿原酸、芍药苷、黄芩苷与相邻色谱峰图谱如图1所示。在实施例1的洗脱条件下，3个成分分离完全，色谱峰分布均匀，分析时间适宜，可作为金芩花多成分含量测定的洗脱程序。
实施例2 专属性试验
（1）验证过程
参照前述方法配制空白溶剂、对照品溶液（STD）、供试品溶液（SMP）和阴性供试品溶液（NSMP）。
测定：精密吸取上述溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
（2）可接受标准
1）供试品溶液中待测成分峰纯度应满足要求（光谱匹配度≥990或峰纯度≥980或纯度角小于纯度阈值）；
2）赤芍阴性样品对芍药苷无干扰，黄芩阴性样品对黄芩苷无干扰，金银花、野菊花、柴胡的阴性对绿原酸无干扰，若有，干扰峰面积应不超过供试品溶液对应待测成分峰面积的5%。
（3）验证结果
结论：供试品溶液中待测成分光谱匹配度≥995。缺赤芍阴性供试品对芍药苷含量测定无干扰；缺黄芩阴性供试品对黄芩苷含量测定有干扰，干扰峰面积占供试品溶液黄芩苷峰面积的1.05%，缺金银花、野菊花、柴胡的阴性供试品对绿原酸含量测定有干扰，干扰峰面积占供试品溶液绿原酸峰面积的1.73%，符合要求。表明方法专属性良好。结果见表17-表18。
实施例3 溶液稳定性
（1）验证过程
参照前述方法配制对照品溶液（STD）和供试品溶液（SMP）。
测定：供试品溶液、对照品溶液室温下保存，分别于0h、6h、12h、18h、24h（1天）、48h（2天）分别进样5μl（单针），其中24h、48h溶液为新取用溶液。
（2）可接受标准
1）与0 hr相比，对照品溶液室温放置2天，对照品溶液与0hr对照品溶液主成分峰面积的比值应在97.0%~103.0%之间，表明对照品溶液室温放置2天溶液保持稳定；
2）与0 hr相比，供试品溶液室温放置2天，供试品溶液与0hr供试品待测成分峰面积的比值应在97.0%~103.0%之间，表明供试品溶液室温放置2天溶液保持稳定。
（3）验证结果
结论：对照品溶液、供试品溶液在室温放置2天内，对照品溶液主成分含量相对0h的百分比在99.2%~102.2%范围内，供试品溶液待测成分含量相对0h的百分比在98.7%~101.5%范围内，符合接受标准，表明室温条件下，对照品溶液和供试品溶液放置2天均保持稳定。
实施例4 定量限
（1）验证过程
参照前述方法配制空白溶剂和对照品溶液。
定量限溶液：取对照品溶液，精密量取1ml，至50ml量瓶中，加稀乙醇稀释并定容至刻度，摇匀，即得。
测定：精密吸取定量限溶液5μl，连续进6针，记录色谱图。
（2）可接受标准
1）定量限溶液中，待测成分峰S/N应≥10；
2）所测6份溶液主成分峰峰面积的RSD应不大于10.0%。
（3）验证结果
结论：定量限溶液中，待测成分峰S/N在33.0~127.3之间，6针定量限溶液的峰面积RSD在0.54%~1.78%之间，符合接受标准，这表明本方法的检测灵敏度良好，可以满足要求。
实施例5 线性与范围
（1）验证过程
按以下表格分别称取绿原酸、芍药苷、黄芩苷对照品于对应容量瓶中，加稀释液适量，超声振摇使完全溶解，冷却至室温后，再用稀释液（参照前述方法配制）稀释至刻度，摇匀。
测定：精密吸取上述各线性对照品溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
（2）可接受标准
1）报告线性方程及线性范围；
2）相关系数（r）应≥0.9998；
3）Y轴截距的绝对值应在100%响应值的2%以内。
（3）验证结果
结论：绿原酸线性相关系数r为1.000，Y轴截距为-0.0306，其绝对值小于100%限度水平峰面积的2.0%（0.0622），符合接受标准；芍药苷线性相关系数r为1.000，Y轴截距为0.0321，小于100%限度水平峰面积的2.0%（0.0445），符合接受标准；黄芩苷线性相关系数r为1.000，Y轴截距为-0.046，其绝对值小于100%限度水平峰面积的2.0%（0.333），符合接受标准；表明绿原酸、芍药苷、黄芩苷分别在5.050μg/ml ~50.50μg/ml、6.128μg/ml ~61.28μg/ml、12.06μg/ml ~120.6μg/ml范围线性良好（如图2所示）。
实施例6 精密度
（1）验证过程
1）重复性—实验人员A，时间A，仪器A
对照品溶液：参照前述方法配制。
供试品溶液：参照前述方法配制，平行制备6份。
测定：精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
2）中间精密度—实验人员B，时间B，仪器B
对照品溶液：参照前述方法配制。
供试品溶液：参照前述方法配制，平行制备6份。
（2）可接受标准
重复性
1）系统适用性应符合要求；
2）同一实验人员（A）制备的6份供试品溶液以仪器（A）测定成分含量的RSD应≤2.0%。
中间精密度
1）系统适用性应符合要求；
2）另一实验人员（B）制备的6份供试品溶液测定成分含量的RSD应≤2.0%；
3）实验人员（A）制备的6份供试品溶液以仪器（B）测定成分含量的RSD应≤2.0%；
4）实验人员A、B制备的18份供试品溶液以仪器A、B测定成分含量的RSD应≤3.0%。
（3）验证结果
结论：不同分析人员、不同分析时间以及不同的液相系统分析结果，系统适用性结果均符合要求；分析人员A在时间A以仪器A测定6份供试品溶液RSD在0.81%~1.35%之间，分析人员B在时间B以仪器C测定6份供试品溶液RSD在0.55%~0.77%之间，分析人员A在时间B以仪器B测定6份供试品溶液RSD在0.53%~0.59%之间，均符合重复性接受标准；18份数据汇总，3个成分含量的RSD在0.75%~2.33%之间，符合中间精密度接受标准。表明方法精密度良好。
实施例7 准确度
（1）验证过程
对照品溶液：参照前述方法进行配制。
供试品溶液：取金芩花小儿颗粒粉末约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别加入供试品成分含量50%、100%、150%的对照品，每个浓度平行3份，具体加入量详见下表，参照前述方法配制供试品溶液制备准确度溶液。
测定：精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
（2）可接受标准
1）各浓度水平的3份准确度溶液回收率均应在90.0%~108.0%之间，RSD应≤5.0%；
2）9份准确度溶液回收率的RSD应≤6.0%。
（3）验证结果
结论：各浓度水平的平均回收率在93.0%~107.8%范围内，符合要求；每个浓度水平3份溶液回收率RSD在0.17%~3.38%之间，3个浓度水平9份溶液回收率RSD在1.2%~5.4%之间，符合要求。表明该方法准确度良好。
实施例8 耐用性
（1）验证过程
空白溶剂：参照前述方法进行配制。
对照品溶液：参照前述方法进行配制。
供试品溶液：参照前述方法进行配制。
测定：更换色谱柱（同规格同品牌不同批次与不同品牌同规格），在拟定色谱条件下，精密量取上述对照品溶液、供试品溶液各5μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。
（2）可接受标准
1）不同色谱柱分析，系统适应性符合要求，与初始条件相比，相对平均偏差应≤3.0%；
2）其他各色谱参数耐用性条件，理论板数按芍药苷计算，均应≥10000，分离度均应≥1.5。
（3）验证结果
结论：以不同色谱柱分析，系统适用性符合要求，3个成分含量相对平均偏差绝对值在0.16%~1.68%之间，符合接受标准，表明方法对色谱柱耐用性良好。
结果显示，流速在0.7ml/min~0.9ml/min范围内，3个目标成分分离度（≥1.5）、理论板数（≥10000）均符合接受标准，表明方法对流速耐用性良好。
结果显示，柱温在23℃~27℃范围内，3个目标成分分离度（≥1.5）、理论板数（≥10000）均符合接受标准，表明方法对柱温耐用性良好。
结果显示，洗脱比例在设定比例±5%范围内，3个目标成分分离度（≥1.5）、理论板数（≥10000）均符合接受标准，表明方法对洗脱梯度耐用性良好。
对比例1
取供试品溶液按下表所示梯度洗脱条件进行检测，其余同实施例1。
结果显示：在该洗脱条件下，绿原酸和黄芩苷等目标成分均未达到基线分离（如图3所示）。
对比例2
取供试品溶液按下表所示梯度洗脱条件进行检测，其余同实施例1。
结果显示：在该色谱条件下，绿原酸色谱峰刚达到基线分离，存在方法耐用性差的风险（如图4所示）。
对比例3
取供试品溶液按下表所示梯度洗脱条件进行检测，其余同实施例1。
结果显示：通过条件优化，绿原酸、芍药苷分离度符合要求，但是芍药苷出峰在洗脱梯度急剧变化阶段，存在保留时间不稳定风险（如图5所示）。
对比例4
取供试品溶液按下表所示梯度洗脱条件进行检测，其余同实施例1。
结果显示：该色谱条件下，绿原酸、芍药苷、黄芩苷分离度均符合要求，但是绿原酸峰形不对称（如图6所示）。
实施例1、对比例1、对比例2、对比例3和对比例4的图谱分析数据见下表。
Claims (10)
1.一种绿原酸、芍药苷和黄芩苷的检测方法，其特征在于，其包括下述步骤：
将待测液采用液相色谱法经梯度洗脱分离，即可；其中：
所述液相色谱法中，色谱条件如下：
色谱柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶；
流动相A为0.1%磷酸溶液，流动相B为甲醇；以所述流动相A、所述流动相B的总体积为100%计，所述梯度洗脱分离的程序为：
在0-12min，所述流动相A的体积为72-82%；
在12-25min，所述流动相A的体积由72-82%递减至55-65%；
在25-40min，所述流动相A的体积由55-65%递减至45-55%；
在40-45min，所述流动相A的体积由45-55%递减至0%；
所述待测液为金芩花颗粒的提取液，所述金芩花颗粒的提取液采用下述方法制得：将金芩花颗粒经乙醇提取。
2.如权利要求1所述的绿原酸、芍药苷和黄芩苷的检测方法，其特征在于，所述待测液经乙醇稀释；
和/或，所述填料的粒径为3-4 μm；
和/或，所述色谱柱的柱长为150mm；
和/或，所述色谱柱的内径为4.6mm；
和/或，所述色谱柱为Kromasil C18色谱柱或Agilent C18色谱柱；
和/或，所述色谱柱的柱温为23-27℃；
和/或，所述液相色谱法中，进样体积为5μL；
和/或，所述液相色谱法中，流动相的流速为0.7-0.9 mL/min。
3.如权利要求1或2所述的绿原酸、芍药苷和黄芩苷的检测方法，其特征在于，以所述流动相A、所述流动相B的总体积为100%计，所述的梯度洗脱分离的程序为：
在0-12min，所述流动相A的体积为77%；
在12-25min，所述流动相A的体积由77%递减至60%；
在25-40min，所述流动相A的体积由60%递减至50%；
在40-45min，所述流动相A的体积由50%递减至0%。
4.如权利要求1所述的绿原酸、芍药苷和黄芩苷的检测方法，其特征在于，
所述金芩花颗粒的原料包括下述组分：金芩花清膏、包合物和辅料；其中：
所述包合物按下述方法制得，将挥发油加入β-环糊精的水溶液中，经包合，获得包合物，即可；所述挥发油的提取原料为连翘和野菊花；
所述金芩花清膏的原料为提取液A和提取液B，所述的提取液A的提取原料为金银花、蒲公英、紫花地丁、黄芩、赤芍、当归、大青叶、柴胡、大黄、所述的包合物的制备方法中提取挥发油后的连翘和提取挥发油后的野菊花，所述的提取液B为所述连翘和所述野菊花提取挥发油后所获得的药液。
5.如权利要求4所述的绿原酸、芍药苷和黄芩苷的检测方法，其特征在于，所述连翘和所述野菊花的质量之比为（0.75-1.3）:1；
和/或，所述挥发油采用水蒸气蒸馏法提取得到；
和/或，所述β-环糊精的水溶液中的水和所述挥发油的体积比为≥25:1；
和/或，所述β-环糊精的水溶液中β-环糊精的质量g和所述挥发油的体积ml之比为（6-16）:1；
和/或，所述包合的温度为60-75℃；
和/或，所述挥发油的量为1-25 mL，所述包合的时间为30-90min；
和/或，所述包合后还经冷藏、抽滤和干燥后处理过程。
6.如权利要求4所述的绿原酸、芍药苷和黄芩苷的检测方法，其特征在于，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述金银花的原料用量为150-200份；
和/或，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述蒲公英的原料用量为150-200份；
和/或，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述紫花地丁的原料用量为150-200份；
和/或，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述黄芩的原料用量为120-160份；
和/或，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述赤芍的原料用量为120-160份；
和/或，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述当归的原料用量为100-150份；
和/或，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述大青叶的原料用量为100-150份；
和/或，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述柴胡的原料用量为100-150份；
和/或，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述大黄的原料用量为30-60份；
和/或，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述连翘的原料用量为120-160重量份；
和/或，以所述金银花、所述蒲公英、所述紫花地丁、所述黄芩、所述赤芍、所述当归、所述大青叶、所述柴胡、所述大黄、所述连翘和所述野菊花的药材总量为1260-1750份计，所述野菊花的原料用量为120-160重量份；
和/或，所述提取液A按照下述工艺提取得到，将金银花、蒲公英、紫花地丁、黄芩、赤芍、当归、大青叶、柴胡、大黄、提取挥发油后的连翘、提取挥发油后的野菊花和水混合，加热煎煮，获得药液，将所述药液经浓缩即可；
和/或，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述金芩花清膏为450-480份；
和/或，所述辅料为糊精、乳糖和甘露醇中的一种或多种；
和/或，所述金芩花颗粒的原料中还包括阿司帕坦、三氯蔗糖和安赛蜜中的一种或多种；
和/或，所述金芩花颗粒的原料中还包括苦味阻滞剂和/或香精。
7.如权利要求6所述的绿原酸、芍药苷和黄芩苷的检测方法，其特征在于，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述金芩花清膏为466.7份；
和/或，当所述金芩花颗粒的原料中还包括阿司帕坦时，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述阿司帕坦为8-15份；
和/或，当所述金芩花颗粒的原料中还包括三氯蔗糖时，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述三氯蔗糖为4-20份；
和/或，当所述金芩花颗粒的原料中还包括安赛蜜时，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述安赛蜜为8-15份；
和/或，当所述金芩花颗粒的原料中还包括苦味阻滞剂时，所述苦味阻滞剂为氯化钠、谷氨酸钠和呈味核苷酸二钠中的一种或多种；
和/或，当所述金芩花颗粒的原料中还包括苦味阻滞剂时，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述苦味阻滞剂的用量为1-10份；
和/或，当所述金芩花颗粒的原料中还包括香精时，所述香精为草莓香精、甜橙香精、西柚香精和黑加仑香精中的一种或多种；
和/或，当所述金芩花颗粒的原料中还包括香精时，所述金芩花颗粒以1000份重量份计，所述香精的用量为10-40份；
和/或，所述金芩花颗粒的原料中：所述金银花150-200份、所述蒲公英150-200份、所述紫花地丁150-200份、所述连翘120-160份、所述黄芩120-160份、所述赤芍120-160份、所述野菊花120-160份、所述当归100-150份、所述大青叶100-150份、所述柴胡100-150份和所述大黄30-60份。
8.如权利要求7所述的绿原酸、芍药苷和黄芩苷的检测方法，其特征在于，所述金芩花颗粒的原料中：所述金银花177.5份、所述蒲公英177.5份、所述紫花地丁177.5份、所述连翘141.6份、所述黄芩141.6份、所述赤芍141.6份、所述野菊花141.6份、所述当归118份、所述大青叶118份、所述柴胡118份和所述大黄47.2份；
和/或，当所述金芩花颗粒的原料中还包括阿司帕坦时，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述阿司帕坦为10份；
和/或，当所述金芩花颗粒的原料中还包括三氯蔗糖时，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述三氯蔗糖为5份；
和/或，当所述金芩花颗粒的原料中还包括安赛蜜时，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述安赛蜜为10份；
和/或，当所述金芩花颗粒的原料中还包括苦味阻滞剂时，所述苦味阻滞剂为谷氨酸钠；
和/或，当所述金芩花颗粒的原料中还包括苦味阻滞剂时，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述苦味阻滞剂的用量为2.5份；
和/或，当所述金芩花颗粒的原料中还包括香精时，所述香精为黑加仑香精；
和/或，当所述金芩花颗粒的原料中还包括香精时，所述金芩花颗粒以1000份重量份计，所述香精的用量为10份。
9.如权利要求8所述的绿原酸、芍药苷和黄芩苷的检测方法，其特征在于，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述金芩花颗粒的原料中还包括下述组分：阿司帕坦 10份、三氯蔗糖 5份、安赛蜜 10份。
10.如权利要求9所述的绿原酸、芍药苷和黄芩苷的检测方法，其特征在于，以所述金芩花颗粒1000份重量份计，所述金芩花颗粒的原料由下述组分组成：所述金芩花清膏，所述包合物，所述糊精，阿司帕坦10份，三氯蔗糖5份，安赛蜜10份，谷氨酸钠2.5份，黑加仑香精10份。
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