CN102399769A

CN102399769A - 一种优化改良的中性纤维素酶meg1及其基因和应用

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Publication number: CN102399769A
Application number: CN2011103629280A
Authority: CN
Inventors: 李阳源; 胡爱红; 史宝军; 罗长财; 陈丽芝; 毕香梅; 钟开新
Original assignee: Yiduoli Biological Science & Tech Co Ltd Guangdong
Current assignee: Yiduoli Biological Science & Tech Co Ltd Guangdong
Priority date: 2011-11-16
Filing date: 2011-11-16
Publication date: 2012-04-04
Anticipated expiration: 2031-11-16
Also published as: CN102399769B

Abstract

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种优化改良的中性纤维素酶MEG1及其基因和应用。本发明提供了一种优化改良的中性纤维素酶MEG1，其具有如SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，且本发明还提供了编码上述优化改良的中性纤维素酶MEG1的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明的优化改良的中性纤维素酶MEG1在中性条件下酶活有很大的提高，并且，通过高拷贝外源基因菌株的筛选，得到能够在反应器中高效表达的生产菌株，进一步满足工业化生产的要求，因此，本发明的优化改良的MEG1可在纺织、洗涤、造纸、饲料中显示出巨大的应用潜力。

Description

一种优化改良的中性纤维素酶MEG1及其基因和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种优化改良的中性纤维素酶MEG1及其基因和应用。

背景技术

纤维素酶系由三类功能不同但又互补的酶组成。这三类酶分别是内切葡聚糖酶(EG，Cx酶)，可作用于纤维素分子内的无定形区，随机水解β-1，4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量的小分子纤维素。内切型纤维素酶可为外切酶提供大量的反应末端，同时它也能水解小分子的纤维素寡糖。外切葡聚糖酶(纤维二糖水解酶，CBH，C1酶)。这类酶作用于纤维素分子的末端，依次从纤维素分子中切下纤维二糖，它可以作用于纤维素分子内的结晶区、无定形区。β-葡萄糖苷酶(纤维二糖酶，BG)，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖，也可以从短链葡聚糖的非还原端切下葡萄糖。好氧的丝状真菌，如常见的木霉、曲霉、青霉等能大量合成纤维素酶并分泌到胞外，各种纤维素酶组分独立存在，为非复合酶系。

纤维素酶最早应用于动物饲料生产，随后是食品行业，紧接着这些酶制剂应用到纺织、洗涤剂和制浆造纸工业；之后，酶制剂的应用急剧增加，尤其是在纺织、食品、酿造和制浆造纸工业。丝状真菌所产纤维素酶大多适应酸性环境，在中性或中性偏碱性条件下酶活力丧失。随着纺织、造纸、洗涤工业的进一步发展，酸性纤维素酶的酶学性质已满足不了实际生产的需求。例如，在纺织品整理方面，中性纤维素酶与酸性纤维素酶相比，其处理效果独特，具有如下优点：1、高反差外观：中性纤维素酶能让织物具有反差大和背着色低的外观，蓝、白色的对比非常强，简化了或省略了清洁工序。2、中性纤维素酶不会使处理后的服装产生严重的背面沾污，具有抗返染，次品率低，产品质量均匀、手感好等特点。3、操作简单，操作人员只需对pH值进行少量控制便可获得稳定的磨蚀效果。此外，在洗涤及造纸工业中，中性或者中性偏碱的环境不利于酸性纤维素酶发挥其水解作用，从而造成资源的浪费和环境的污染。中性纤维素酶则能很好解决这些问题。然而，来源于细菌的中性纤维素酶的产酶量和比活性都较低，这限制了其在生产中的实际应用。丝状真菌来源的纤维素酶具有活性高，稳定性好的特点，因此可以尝试通过基因工程的对来源于丝状真菌的酸性纤维素酶进行改造，以提高其在中性或者中性偏碱性环境下的活性。

里氏木霉(Trichoderma reesei)是在研究和生产中应用最广泛的菌株，它所产的纤维素酶系至少包含2个外切酶(CBH I，CBH II)，5个内切酶(EG I，EG II，EG III，EGIV，EG V)和2个β-葡萄糖苷酶(BGL I，BGL II)。在里氏木霉内切葡聚糖酶中，EG I的含量最大，可占纤维素酶组分总量的5-10％，在内切酶的作用过程中起重要作用。编码EG I的基因序列已经被克隆，其cDNA全长为1380bp，编码459个氨基酸残基的蛋白。EG I发挥作用的最适pH值为5.5，在中性环境下酶活急剧下降。因此，通过基因改造既可以使其最适pH值向中性或者弱碱性偏移，同时也能保持其较高的比活力，在纺织、洗涤、造纸、饲料等领域有较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种优化改良的中性纤维素酶MEG1。

本发明的另一目的是提供编码上述优化改良的中性纤维素酶的基因MEG1。

本发明的另一目的是提供包含上述优化改良的中性纤维素酶基因的重组载体。

本发明的另一目的是提供包含上述优化改良的中性纤维素酶基因的重组菌株。

本发明的另一目的是提供制备上述优化改良的中性纤维素酶的方法。

本发明的另一目的是提供上述优化改良的中性纤维素酶的应用。

里氏木霉天然EG1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MAPSVTLPLT TAILAIARLV AAQQPGTSTP EVHPKLTTYK CTKSGGCVAQ

DTSVVLDWNY 60

RWMHDANYNS CTVNGGVNTT LCPDEATCGK NCFIEGVDYA ASGVTTSGSS

LTMNQYMPSS 120

SGGYSSVSPR LYLLDSDGEY VMLKLNGQEL SFDVDLSALP CGENGSLYLS

QMDENGGANQ 180

YNTAGANYGS GYCDAQCPVQ TWRNGTLNTS HQGFCCNEMD

ILEGNSRANA LTPHSCTATA 240

CDSAGCGFSP YGSGYKSYYG PGDTVDTSKT FTIITQFNTD NGSPSGNLVS

ITRKYQQNGV 300

DVPSAQPGGD TISSCPSASA YGGLATMGKA LSSGMVLVFS IWNDNSQYMN

WLDSGNAGPC 360

SSTEGNPSNI LANNPNTHVV FSNIRWGDIG STTNSTAPPP PPASSTTFST

TRRSSTTSSS 420

PSCTQTHWGQ CGGIGYSGCK TCTSGTTCQY SNDYYSQCL 459

本发明优选采用易错PCR随机突变及突变重组的方法对SEQ ID NO.1所示的里氏木霉来源的EG1进行改造，并经过高通量突变筛选的方法筛选得到中性纤维素酶MEG 1，本发明的MEG1和原有里氏木霉来源的EG1相比，有13个氨基酸的差异，其氨基酸序列中8位的P突变成A，55位的V突变成I，95位的E突变成Q，119位的S突变成R，152位的F突变成I，179位的N突变成H，214位的F突变成I，250位的P突变成A，285位的S突变成T，308位的G突变成R，345位的N突变成H，427位的H突变成N，454位的Y突变成D，突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示：

MAPSVTLALT TAILAIARLV AAQQPGTSTP EVHPKLTTYK CTKSGGCVAQ

DTSVILDWNY 60

RWMHDANYNS CTVNGGVNTT LCPDEATCGK NCFIQGVDYA ASGVTTSGSS

LTMNQYMPRS 120

SGGYSSVSPR LYLLDSDGEY VMLKLNGQEL SIDVDLSALP CGENGSLYLS

QMDENGGAHIQ 180

YNTAGANYGS GYCDAQCPVQ TWRNGTLNTS HQGICCNEMD

ILEGNSRANA LTPHSCTATA 240

CDSAGCGFSA YGSGYKSYYG PGDTVDTSKT FTIITQFNTD NGSPTGNLVS

ITRKYQQNGV 300

DVPSAQPRGD TISSCPSASAYGGLATMGKA LSSGMVLVFS IWNDHSQYMN

WLDSGNAGPC 360

SSTEGNPSNI LTNNPNTHVV FSNIRWGDIG STTNSTAPPP PPASSTTFST

TRRSSTTSSS 420

PSCTQTNWGQ CGGIGYSGCK TCTSGTTCQY SNDDYSQCL 459

该纤维素酶MEG1在作用pH值方面更加优良，在pH值为7.0时酶活最高。未改良的EG1在pH值为7.0的环境下酶活较低，说明本发明的经过改良的MEG1达到了工业化生产的中性pH要求。

本发明还提供了上述优化改良中性纤维素酶基因序列MEG1，其碱基序列如SEQID NO.4所示：

atggcgccct cagttacact ggcgttgacc acggccatcc tggccattgc ccggctcgtc 60

gccgcccagc aaccgggtac cagcaccccc gaggtccatc ccaagttgac aacctacaag 120

tgtacaaagt ccggggggtg cgtggcccag gacacctcgg tgatccttga ctggaactac 180

cgctggatgc acgacgcaaa ctacaactcg tgcaccgtca acggcggcgt caacaccacg 240

ctctgccctg acgaggcgac ctgtggcaag aactgcttca tccagggcgt cgactacgcc 300

gcctcgggcg tcacgacctc gggcagcagc ctcaccatga accagtacat gccccgcagc 360

tctggcggct acagcagcgt ctctcctcgg ctgtatctcc tggactctga cggtgagtac 420

gtgatgctga agctcaacgg ccaggagctg agcatcgacg tcgacctctc tgctctgccg 480

tgtggagaga acggctcgct ctacctgtct cagatggacg agaacggggg cgcccaccag 540

tataacacgg ccggtgccaa ctacgggagc ggctactgcg atgctcagtg ccccgtccag 600

acatggagga acggcaccct caacactagc caccagggca tctgctgcaa cgagatggat 660

atcctggagg gcaactcgag ggcgaatgcc ttgacccctc actcttgcac ggccacggcc 720

tgcgactctg ccggttgcgg cttcagcgcc tatggcagcg gctacaaaag ctactacggc 780

cccggagata ccgttgacac ctccaagacc ttcaccatca tcacccagtt caacacggac 840

aacggctcgc ccacgggcaa ccttgtgagc atcacccgca agtaccagca aaacggcgtc 900

gacgtcccca gcgcccagcc ccgcggcgac accatctcgt cctgcccgtc cgcctcagcc 960

tacggcggcc tcgccaccat gggcaaggcc ctgagcagcg gcatggtgct cgtgttcagc 1020

atttggaacg accacagcca gtacatgaac tggctcgaca gcggcaacgc cggcccctgc 1080

agcagcaccg agggcaaccc atccaacatc ctgaccaaca accccaacac gcacgtcgtc 1140

ttctccaaca tccgctgggg agacattggg tctactacga actcgactgc gcccccgccc 1200

ccgcctgcgt ccagcacgac gttttcgact acacggagga gctcgacgac ttcgagcagc 1260

ccgagctgca cgcagactaa ctgggggcag tgcggtggca ttgggtacag cgggtgcaag 1320

acgtgcacgt cgggcactac gtgccagtat agcaacgacg actactcgca atgcctttag 1380

本发明还提供了包含上述优化改良的中性纤维素酶基因MEG1的重组载体，优选为pPICzαA-MEG1。将本发明的优化改良的中性纤维素酶基因插入到表达载体合适的限制性酶切位点之间，使其核苷酸序列可操作的与表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将本发明的糖化酶基因插入到质粒pPICzαA上的EcoR I和Not I限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达质粒pPICzαA-MEG1。

本发明还提供了包含上述优化改良的中性纤维素酶基因MEG1的重组菌株，优选重组菌株是毕赤酵母菌株X33。

本发明还提供了一种制备上述优化改良的中性纤维素酶MEG1的方法，包括以下步骤：

1)用上述的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组中性纤维素酶MEG1的表达；以及

3)回收并纯化所表达的中性纤维素酶MEG1。

具体地，将重组酵母表达质粒pPICzαA-MEG1，转化到酵母宿主菌株X33中，用高浓度的抗生素平板筛选高拷贝的转化子，将筛选到的转化子，在7L的发酵罐中进行发酵，发酵过程中，每隔24h取发酵液测定OD₆₀₀以及菌体湿重，取上清液进行植酸酶活性检测。发酵结束最终平均发酵酶活达到13000U/mL，实现中性纤维素酶MEG1的高效表达。

本发明还提供了上述中性MEG1的应用，优选该酶在水解淀粉及在纺织、洗涤、造纸和饲料中的应用。

本发明为了解决现有技术的不足，利用基因工程手段对里氏木霉纤维素酶EG1进行改良，以解决其在酸性环境下酶活较低，不能适用于工业生产的要求。经过优化改良的MEG1在中性条件下酶活有很大的提高，并且，通过高拷贝外源基因菌株的筛选，得到能够在反应器中高效表达的生产菌株，进一步满足工业化生产的要求，因此，本发明的优化改良的MEG1可在纺织、洗涤、造纸、饲料中显示出巨大的应用潜力。

附图说明

图1为pPICzαA-MEG1酵母菌株在7L发酵罐中的发酵情况。

图2为纤维素酶EG1和MEG1在不同pH值环境下的相对酶活曲线图。

图3为纤维素酶EG1和MEG1在不同温度环境下的相对酶活曲线图。

图4为纤维素酶EG1和MEG1的热稳定性曲线图。

具体实施方式

实验材料和试剂：

1、菌株与载体

大肠杆菌菌株Top10、毕赤酵母X33、载体pPICzalphaA，Zeocin购自Invitrogen公司，载体pECO购自Gentarget公司。

2、酶与试剂盒

PCR酶，质粒提取试剂盒、胶纯化试剂盒、限制性内切酶试剂盒购自上海生工公司。

3、培养基

大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.0)。LB-AMP为LB培养基加100ug/mL氨苄青霉素。LB-Zeo为LB培养基加25ug/mLZeocin。

酵母培养基为YPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)。酵母筛选培养基为YPDzeo(YPD+100mg/L zeocin)。

酵母诱导培养基BMGY(1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V))和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。

重组酵母发酵培养基本盐培养基：磷酸氢二铵5％、磷酸二氢钾0.5％、七水硫酸镁1.5％、硫酸钾1.95％、硫酸钙0.1％、氢氧化钾0.1％、消泡剂0.03％。高压后每升加4.35毫升PTM1。

PTM1(微量盐溶液)：硫酸铜0.6％、碘化钾0.018％、一水硫酸锰0.3％、二水钼酸钠0.02％、硼酸0.002％、六水氯化钴0.05％、氯化锌2％、七水硫酸铁6.5％、浓硫酸0.5％、生物素0.02％。

实施例1、里氏木霉EG1基因的合成及克隆

以已公布的里氏木霉EG1基因序列作为参考，人工合成该基因序列，根据基因5’端设计PCR引物含有EcoRI内切酶位点，3’端设计PCR引物含NotI内切酶位点，起引物序列如下：

5’端引物EG1F1：ATGGCGCCCTCAGTTACACT

3’端引物EG1R1：CTAAAGGCATTGCGAGTAGT

以合成基因为模板，用上述引物进行PCR扩增，将扩增得到的片段克隆到载体pECO上，得到重组载体pECO-EG1。

实施例2、基因易错PCR随机突变

以上述pECO-EG1为模板，进行易错PCR随机突变扩增，具体地扩增方法是：

第一轮扩增：以载体启动子引物T7-F和T7-R为引物进行PCR扩增，反应体系如下：

反应程序如下：

回收第一轮PCR产物，取1uL稀释50-100倍用作第二轮PCR的模板；

第二，第三轮易错PCR以EG1异性引物EG1F及EG1R替代引物T7-F和T7-R为反应引物，重复PCR反应。

取第二、三轮的产物用NotI和EcoRI进行双酶切，连接至pECO载体上的EcoRI和NotI位点之间。连接产物转化BL21，在LB氨苄琼脂糖平板培养筛选突变菌株。

实施例3、高通量突变菌株筛选

从实施例2易错PCR平板上挑取突变单菌落，接种到96孔深孔培养平板(即母板)。每孔含500uL培养基LB-Amp。37℃摇床200rpm培养24小时后，转移50uL平台期生长菌液到新的96孔平板，平板每孔添加450uL LB-AMP培养基，含有终浓度为0.5mM IPTG(即子板)，37℃过夜摇床200rpm诱导表达EG1。含有过夜培养诱导表达EG1的菌液平板用液氮反复冻融10次后细胞裂解，在pH 7.0的缓冲液中检测培养液中纤维素酶的活性。

将中性纤维素酶活性超过对照克隆组的克隆挑选为阳性克隆。从母板上挑选阳性克隆集中到96孔平板重复上述的培养，诱导表达，检测酶活，进一步确认阳性克隆，并从中筛选到一株酶活最高的菌株。提取该菌株的质粒，进行DNA测序。

通过上述方法对800个克隆进行了筛选，从中筛选到一株中性条件下酶活最高的菌株。通过DNA测序和氨基酸序列分析发现与野生型里氏木霉EG1相比共有13处氨基酸序列发生了突变，分别为8位的P突变成A，55位的V突变成I，95位的E突变成Q，119位的S突变成R，152位的F突变成I，179位的N突变成H，214位的F突变成I，250位的P突变成A，285位的S突变成T，308位的G突变成R，345位的N突变成H，427位的H突变成N，454位的Y突变成D。

实施例4、中性纤维素酶MEG1酵母表达载体的构建和基因工程菌的筛选

培养高通量筛选得到的中性纤维素酶MEG1大肠杆菌细胞，提取质粒DNA。限制性内切酶EcoRI和NotI双酶切后纯化含有MEG1基因的DNA片段，连接到pPICzaA载体EcoRI和NotI位点，使中性纤维素酶MEG1基因插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，通过载体与毕赤酵母染色体基因组之间的同源重组事件使目的基因稳定整合到酵母染色体上。连接产物转化TOP 10大肠杆菌，LB-Zeo琼脂糖平板培养获得pPICzαA-MEG1阳性菌落。

提取pPICzaA-MEG1阳性菌落质粒，电击转化酵母X33感受态细胞，涂布含100ug/mL Zeocin和含500ug/mL Zeocin的YPDS固体培养平板，30℃培养2-3d。挑取在高浓度Zeocin YPDS平板(500ug/mL)上生长速度及菌落大小与100ug/mL ZeocinYPDS平板上相同的转化子，有可能含高拷贝的外源基因，挑选这些转化子进行进一步的表达实验。

实施例5、中性纤维素酶的活性测定

纤维素酶在一定的温度和pH条件下，水解羧甲基纤维素钠释放出还原性糖(以葡萄糖计)。在碱性、煮沸条件下，能与3，5二硝基水杨酸起显色反应，其颜色的深浅与还原糖的含量成正比。在550nm下测定其吸光度，可以计算出还原糖的量，从而得出纤维素酶的活力。其活性定义为1g固体酶粉(1ml液体酶)在50℃±0.5℃PH 7.0的磷酸缓冲液中，每分钟水解底物产生1μg葡萄糖所需酶液的量定义为一个中性纤维素酶活性单位。

1标准曲线的制作

按表1规定的量，分别吸取葡萄糖标准应用液、缓冲液和DNS试剂于各管中摇匀，将各管同时置于沸水浴中反应10分钟，取出后用冷水冷却至室温后，定溶于内直径为15mm的15ml刻度试管中摇匀，再用1cm比色杯，在分光光度计550nm波长处测吸光度，以葡萄糖的量为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，三次重复实验的均值获得线性回归方程，线性回归系数(r)应在0.9996以上方可使用(否则重新操作)。每次新配DNS试剂、更换分光光度计或更换分光光度计部件，都应重做标准曲线。

表1葡萄糖标准曲线

2样品的测定

取4支内直径15mm的15ml的刻度试管，分别加入稀释酶液0.5ml，取其中3支作为测定管，分别加入1.5ml pH 7.0的i％CMC溶液，另一支作为空白管加入2mlDNS溶液，共同在50℃±0.5℃水浴30分钟，三支测定管分别加入2ml DNS溶液，空白管加入1.5ml pH 7.0的1％CMC溶液，在沸水浴中反应10分钟，冷却后定溶至15ml，以空白管调零，在分光光度计550nm处测吸光度。

3酶活的计算：

式中：

A-根据吸光度在标准曲线上，查得的还原糖的量(mg)

n-酶液的稀释倍数

1000-由mg换算成ug的换算因子

0.5-参与反应的酶液的量(m1)

30-酶反应的时间(min)

实施例6、7L发酵罐小试

从YPD-zeo平板上选取单克隆，接种于20mL BMGY培养基中，30℃、240rpm培养20hr。以1∶50的比例接种到300mLBMGY培养基中，30℃、240rpm培养至OD₆₀₀＝5，用以接种发酵罐。

国产7L发酵罐，加入3L发酵基础培养基，121℃灭菌20min，调节温度至30℃，用氨水调节pH至4.6，加入PTM1(4.35mL/L)，接入种子菌(1∶10)。发酵过程中，温度控制在30℃，通气量维持在2vvm，转速控制在500-800rpm之间以维持溶氧20％以上。

发酵分为三个阶段：生长期，从加入种子菌，培养约16-24h，直到将发酵罐中甘油耗尽，表现为溶氧突然上升；之后进入甘油促生长期，补加50％甘油(含有PTM1，12mL/L)，补料速度为18mL/L·h，持续4-6h；最后进入诱导期，用氨水或磷酸调节pH至所需值，流加100％甲醇(含有PTM1，12mL/L)，流速从1mL/L·h经15hr线性升至4mL/L·h，持续192h。

发酵过程中，每隔24h取发酵液测定OD₆₀₀以及菌体湿重，取上清液进行中性纤维素酶活性检测。发酵结束最终平均发酵酶活达到13000U/mL，发酵过程曲线如图1所示。

实施例7、MEG1最适pH值分析

对改良前的里氏木霉内切葡聚糖酶EG1和改良后的MEG1分别进行最适pH的测定，测定方法按常规方法进行测定，结果如图2所示。从图2可见，经过改造后的MEG1最适pH值在7.0，而野生型的EG1最适pH值为5.5，改造后的MEG1最适pH值向中性偏移1.5。

实施例8、MEG1最适反应温度分析

对改良前的里氏木霉内切葡聚糖酶EG1和改良后的MEG1分别进行最适反应温度的测定，结果如图3所示。从图3可见，野生型的EG1最适反应温度为65℃，改造后的MEG1最适反应温度为60℃，改造后的MEG1最适反应温度提高了5摄氏度。

实施例9、MEG1热稳定性分析

对改良前的里氏木霉内切葡聚糖酶EG1和改良后的MEG1分别进行热稳定性分析。在不同的温度下处理发酵酶液，处理时间为20分钟，按常规方法进行酶活的测定，结果如图4所示。从图4可见，MEG1的热稳定性明显高于野生型的EG1。

Claims

1.一种优化改良的中性纤维素酶MEG1，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。

2.一种优化改良的中性纤维素酶基因MEG1，其特征在于，编码权利要求1所述的中性纤维素酶。

3.根据权利要求2所述优化改良的中性纤维素酶基因MEG1，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO.3所示。

4.包含权利要求2或3所述优化改良的中性纤维素酶基因MEG1的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载体为pPICzαA-MEG1。

6.包含权利要求2或3所述优化改良的中性纤维素酶基因MEG1的重组菌株。

7.根据权利要求6所述的重组菌株，其特征在于，所述重组菌株为毕赤酵母菌。

8.一种制备优化改良的中性纤维素酶MEG1的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用权利要求4的重组载体转化宿主细胞，得重组菌株；

2)培养重组菌株，诱导重组中性纤维素酶MEG1的表达；以及

3)回收并纯化所表达的中性纤维素酶MEG1。

9.权利要求1所述优化改良的中性纤维素酶MEG1的应用。