CN104862290A - 一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明将改造后特基拉芽孢杆菌(Bacillus terquilensis)CGX 5-1来源的1,3-1,4-β-葡聚糖酶的第31位的天冬酰胺和187位的苏氨酸、102位的脯氨酸和125位的天冬酰胺通过重叠延伸PCR的方法突变为半胱氨酸，分别获得单突变体N31C-T187C和P102C-N125C。将两队突变位点进行整合突变，获得N31C-T187C/P102C-N125C双二硫键突变酶。三株突变酶均表现出了更好的热稳定性。这些突变酶和野生酶相比更有利于其在工业上的应用。

Description

一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体
技术领域
本发明涉及一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
β-葡聚糖是存在于禾本科植物细胞壁的一种非淀粉性多糖，在大麦、小麦、大米等经济类谷物中含量很高。其是由高达上千个β-D-葡萄糖残基通过β-1,3或β-1,4糖苷键线状排列而成，具有很高的分子量。其可以溶解于水中，形成的溶液黏度很高，这给啤酒行业及饲料行业带来了诸多不利。在啤酒工业的主要原料麦芽中含有大量β-葡聚糖，未降解的β-葡聚糖存在于麦汁中会导致麦汁黏度过大，造成过滤困难，延长麦醪过滤时间，降低浸出物含量，对于成品啤酒会影响其非生物稳定性。而在生产纯生啤酒时，过多β-葡聚糖酶会造成滤膜的膜孔堵塞，过滤能力下降。在饲料行业中，麦类饲料中的β-葡聚糖无论在人的肠道还是动物的肠道内都不能被直接消化吸收，必须经过酶促降解后才能被利用，且其阻止了有效成分在动物肠道中内的吸收，降低了饲料中有效成分转化率，是一种抗营养因子，并为微生物特别是致病菌的寄居繁殖提供了丰富的营养造成大量有害微生物在动物肠道内繁殖，引起畜禽腹泻，同时会竞争性消耗大量物质而降低饲料利用率。
来源于特基拉芽孢杆菌(B.terquilensis)CGX 5-1的1,3-1,4-β-葡聚糖酶，简称β-葡聚糖酶。1,3-1,4-β-葡聚糖酶是一类可以在3-O-吡喃葡萄糖位点专一性切割β-葡聚糖为三糖和四糖，这是其工业应用的基础。在啤酒行业麦汁糖化过程中温度是从48℃提高至78℃，而饲料行业中烘焙的温度也在65℃以上。而目前筛选得到的大部分野生1,3-1,4-β-葡聚糖酶的最适温度主要集中在45℃和55℃，并不能满足工业上的需求。而催化活性不高也是其不能推广使用的重要原因。而目前市场上几家酶制剂公司如诺维信、DMS研发生产的β-葡聚糖酶制剂价格昂贵，而目前国内也有部分酶制剂公司生产β-葡聚糖酶制剂，但其水平远不及国外酶制剂公司，且β-葡聚糖酶制剂的生产菌种及工艺都是商业机密，国内研发速率缓慢，因此国内市场在很大程度上依然依赖进口。因此，如果能够提高野生型1,3-1,4-β-葡聚糖酶的催化活性及热稳定性，获得高活性高热稳定的β-葡聚糖酶，那么就可以降低成本，推广其在工业上的应用。
为了提高1,3-1,4-β-葡聚糖酶的热稳定性，国内外已经进行了一些研究。目前研究发现，1,3-1,4-β-葡聚糖酶中唯一存在的一对二硫键对于蛋白质热稳定性影响不大。而GLN1、THR2、SER5和PHE7的突变大幅度的提高了β-葡聚糖酶的热稳定性。对β-葡聚糖酶的杂交结果显示，将来源于浸麻芽孢杆菌(B.macerans)的前16个氨基酸替换为淀粉液化芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的前16个氨基酸得到的杂交酶H(A16-M)和两者之间前12个氨基酸进行替换及删除TYR13形成的杂交酶H(A12-M)-△13在高温下有很好的稳定性。这说明β-葡聚糖酶的N端对于该酶的热稳定性有重要的影响。而钙离子对于在高温下维持β-葡聚糖酶的稳定性也有重要作用。针对β-葡聚糖酶中多有赖氨酸进行定点突变研究发现当其中3个赖氨酸突变为丝氨酸得到的三突变酶(BglTM)的热稳定性和催化活力都有了一定程度的提升。但是目前得到的改造酶BglTM的热稳定性依旧不能适应工业应用。
本发明所使用的经过改造的特基拉芽孢杆菌CGX 5-1来源的1,3-1,4-β-葡聚糖酶(BglTM)的最适温度为60℃，比活力为3936.4U/mg，并不能适应工业应用的要求。因此，进一步提高该酶的催化活力及热稳定性对其在工业上的应用推广有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体，尤其是一种具有更高热稳定性的1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体。所述突变体是通过对亲本1,3-1,4-β-葡聚糖酶(BglTM)表面进行二硫键改造得到的。
所述突变体，在本发明的一种实施方式中，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示，分别命名为N31C-T187C、P102C-N125C、N31C-T187C/P102C-N125C。
所述亲本BglTM，在本发明的一种实施方式中，是Niu C,Zhu L,Zhu P,LiQ.2015.Lysine-Based Site-Directed Mutagenesis Increased Rigidβ-Sheet Structure and Thermostability ofMesophilic 1,3–1,4-β-Glucanase.Journal ofAgricultural and Food Chemistry 63:5249-5256中构建的三重突变体K20S/K117S/K165S。
所述N31C-T187C，是在亲本BglTM的基础上，将第31位的天冬酰胺和第187位的苏氨酸突变成半胱氨酸而得到的。
所述P102C-N125C，是在亲本BglTM的基础上，将第102位的脯氨酸和第125位的天冬酰胺突变成半胱氨酸而得到的。
所述N31C-T187C/P102C-N125C，是在亲本BglTM的基础上，将第31位、第187位、第102位、第125位的氨基酸都突变成半胱氨酸而得到的。
编码所述突变体的核苷酸，在本发明的一种实施方式中，序列分别如SEQ ID NO.4、SEQID NO.5或SEQ ID NO.6所示。
本发明还要求保护含有所述突变体的氨基酸序列的载体，以及表达所述突变体的基因工程菌。
所述基因工程菌，在本发明的一种实施方式中，以pET28a(+)质粒为表达载体，以大肠杆菌为表达宿主。
所述宿主，在本发明的一种实施方式中，为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明还提供了一种所述基因工程菌的构建方法。
所述方法，在本发明的一种实施方式中，是以一株改造过的Bacillus terquilensis CGX 5-1来源1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因为模板，采用重叠延伸PCR的方法进行定点突变获得编码二硫键改造突变体的基因，随后将编码突变体的基因片段连接至原核表达载体并转化大肠杆菌进行表达。
本发明还要求保护所述突变体在食品、饲料领域的应用。
本发明的突变体命名，是以亲本氨基酸序列为基准，采用“原始氨基酸位置替换的氨基酸”来表示突变体。比如N31C代表将位置31的氨基酸由亲本的天冬酰胺N替换为半胱氨酸C，又比如N31C-T187C代表第31位和187位的氨基酸同时发生了突变，N31C-T187C/P102C-N125C代表第31、187、102、125位的氨基酸同时发生了突变。
本发明的有益效果：本发明提供的三株β-葡聚糖酶二硫键改造突变体，与野生酶相比，T50值由76℃升高至77.1℃、76.8℃和77.5℃；在60℃下的半衰期，由59min分别延长至81.4min、81.2min和87.5min，分别提高了40％、37.6％和48.3％。而三株二硫键改造酶的比活力和野生酶相比略有提高。本发明的突变体，在保证催化活性的同时使得β-葡聚糖酶的热稳定性有所提高，更有利于在工业上的应用。
附图说明
图1：野生酶与三株β-葡聚糖酶二硫键改造突变体的最适温度比较；□：野生酶，○：N31C-T187C，△：P102C-N125C，▽：N31C-T187C/P102C-N125C；
图2：野生酶与β-葡聚糖酶突变体的在60℃的半衰期比较；
图3：野生酶与β-葡聚糖酶突变体的T50值比较。
具体实施方式
实施例1：突变位点分析
将β-葡聚糖酶的推定氨基酸序列提交至SWISSMODEL在线服务器进行同源建模，并将建模得到的PDB文件输入Disulfide by Design软件进行计算，从而预测得到当突变为半胱氨酸时可以形成二硫键的潜在氨基酸对。从表1可以看出，共有29对氨基酸对被预测可能形成二硫键。
从表1可以看出，共有29对氨基酸经过预测可能形成二硫键，之后对这些氨基酸对进行了筛选。首先排除β-葡聚糖酶中自身形成二硫键的氨基酸对(C32-C61)和与其有冲突的氨基酸对C32-F59C。之后，为了保证活性中心的完整性，排除了9对位于活性中心范围内的氨基酸对。根据文献报道，形成二硫键的氨基酸对在序列上相差小于10AA可能在结构上会有所冲突，因此，4对氨基酸对也被进一步排除。最终还有14对氨基酸残基剩余。
表1 β-葡聚糖酶中形成二硫键潜在位点
编号 残基位点 氨基酸 残基位点 氨基酸 Chi3 Energy
1 3 GLY 68 GLN -83.40 3.36
2 22 ASP 36 ALA +95.88 5.73
3 23 GLY 24 TYR +114.99 6.54
4 31 ASN 187 THR +119.48 5.59
5 32 CYS 59 PHE +107.08 2.77
6 32 CYS 61 CYS +83.92 3.13
7 49 LEU 62 GLY +86.08 3.54
8 55 SER 58 LYS +112.23 4.34
9 63 GLU 182 ASN +106.69 1.80
10 65 ARG 180 MET +91.11 3.88
11 72 TYR 151 TRP +123.65 7.21
12 76 GLU 210 ARG +79.28 5.94
13 78 ARG 146 THR +108.19 1.27
14 81 PRO 89 SER +85.15 4.30
15 81 PRO 110 PHE -84.98 2.25
16 82 ALA 202 LEU +113.92 8.50
17 83 LYS 141 ALA -61.05 2.99
18 86 GLY 196 TYR -60.93 6.41
19 87 ILE 185 ASN +109.50 2.90
20 89 SER 110 PHE +123.19 6.15
21 89 SER 204 ALA -99.16 3.19
22 90 SER 109 GLU +107.66 3.06
23 93 THR 177 GLY +124.40 2.32
24 95 THR 177 GLY -78.62 2.59
25 96 GLY 103 TRP +121.16 4.80
26 102 PRO 125 ASN +100.43 5.36
27 104 ASP 173 PRO -75.81 6.69
28 150 ASP 157 LYS +109.45 2.96
29 159 TYR 164 LEU -65.38 6.06
之后本发明计算了β-葡聚糖酶的根平均涨落值(RMSF)，并对形成二硫键剩余的14对残基对的RMSF进行了相加。表2所示为14对氨基酸对RMSF之和从高到低的排列。从中我们选取RMSF值之和排名前4的氨基酸对和RMSF值之和最低的氨基酸对共5对氨基酸对进行下一步实验。
表2 野生酶与突变酶的比活力及总能量比较
实施例2 β-葡聚糖酶突变体的制备及表达
(1)定点突变
以含改造后特基拉芽孢杆菌CGX5-1分泌β-葡聚糖酶基因的质粒pET28a(+)-BglTM(NiuC,Zhu L,Zhu P,LiQ.2015.Lysine-Based Site-Directed Mutagenesis Increased Rigidβ-SheetStructure and Thermostability ofMesophilic 1,3–1,4-β-Glucanase.Journal ofAgricultural and FoodChemistry 63:5249-5256)为模板，通过重叠延伸PCR的方法扩增得到相应位点发生突变的G3C-Q68C、N31C-T187C、E63C-N182C、K83C-A141C和P102C-N125C基因。
引入G3C密码子的定点突变引物(序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8所示)为：
正向引物：5’-cggctcaaacaTGTggatcgttttttga-3’,大写字母为突变碱基，
反向引物：5’-tcaaaaaacgatccACAtgtttgagccg-3’,大写字母为突变碱基；
引入Q68C密码子的定点突变引物(序列如SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10所示)为：
正向引物：5’-aaaccgttctgttTGTacatatggcta-3’,大写字母为突变碱基，
反向引物：5’-tagccatatgtACAaacagaacggttt-3’,大写字母为突变碱基；
引入N31C密码子的定点突变引物(序列如SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12所示)为：
正向引物：5’-aaatatgttcTGTtgcacgtggc-3’,大写字母为突变碱基，
反向引物：5’-gccacgtgcaACAgaacatattt-3’,大写字母为突变碱基；
引入T187C密码子的定点突变引物(序列如SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14所示)为：
正向引物：5’-gtggaatggcTGTggtgtcgatga-3’,大写字母为突变碱基，
反向引物：5’-tcatcgacaccACAgccattccac-3’,大写字母为突变碱基；
引入E63C密码子的定点突变引物(序列如SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16所示)为：
正向引物：5’-tgactgcgggTGTaaccgttctg-3’,大写字母为突变碱基，
反向引物：5’-cagaacggttACAcccgcagtca-3’,大写字母为突变碱基；
引入N182C密码子的定点突变引物(序列如SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18所示)为：
正向引物：5’-gatcatgatgTGTttgtggaatg-3’,大写字母为突变碱基，
反向引物：5’-cattccacaaACAcatcatgatc-3’,大写字母为突变碱基；
引入K83C密码子的定点突变引物(序列如SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.20所示)为：
正向引物：5’-gaaaccagctTGTaacacaggga-3’,大写字母为突变碱基，
反向引物：5’-tccctgtgttACAagctggtttc-3’,大写字母为突变碱基；
引入A141C密码子的定点突变引物(序列如SEQ ID NO.21、SEQ ID NO.22所示)为：
正向引物：5’-gtttgatgcaTGTaatgcctatc-3’,大写字母为突变碱基，
反向引物：5’-gataggcattACAtgcatcaaac-3’,大写字母为突变碱基；
引入P102C密码子的定点突变引物(序列如SEQ ID NO.23、SEQ ID NO.24所示)为：
正向引物：5’-cagatggaactTGTtgggatgagat-3’,大写字母为突变碱基，
反向引物：5’-aatctcatcccaACAagttccatctg-3’,大写字母为突变碱基；
引入N125C密码子的定点突变引物(序列如SEQ ID NO.25、SEQ ID NO.26所示)为：
正向引物：5’-actattatacaTGTggtgcaggaaac-3’,大写字母为突变碱基，
反向引物：5’-ggtttcctgcaccACAtgtataatagt-3’,大写字母为突变碱基；
重叠延伸PCR分为三步，三步具体实施条件如下：
第一步PCR反应体系均为：2×PrimeSTAR max premix 25μL,10μM正向引物1μL，10μM反向引物1μL，模板DNA1μL，双蒸水补齐至50μL；
第一步PCR反应扩增条件：94℃预变性5min；随后进行94℃ 1min，56℃ 50s，72℃ 50s30个循环；最后保存在4℃。
第二步PCR反应体系均为：2×PrimeSTARmax premix 10μL,第一步PCR产物14μL，第一步PCR产物24μL，双蒸水补齐至20μL；
第二步PCR反应扩增条件：94℃预变性5min；随后进行94℃ 1min，56℃ 50s，72℃ 50s15个循环；最后保存在4℃。
第三步PCR反应体系均为：5U/μL rTaq 1μL,10×rTaqBuffer 5μL,2.5mM dNTPs 4μL,100μM正向引物1μL,100μM反向引物1μL,第二步PCR产物20μL，加入双蒸水补齐至50μL；
第三步PCR反应扩增条件：94℃预变性5min；随后进行94℃ 1min，56℃ 50s，72℃ 50s35个循环；最后保存在4℃。
由于二硫键改造需要同时突变两个氨基酸，因此用过重叠延伸PCR的方法获得单位点突变基因后，以其为模板进行下一轮PCR，最终获得对应两个位点突变为半胱氨酸的突变基因。将上述通过PCR扩增得到的片段使用限制性内切酶BanHI和XhoI进行双酶切后，与经同样限制性内切酶酶切的pET28a(+)质粒进行连接，并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。
(2)突变体的表达与纯化
在平板上挑取含上述重组质粒的大肠杆菌单菌落于含100μg/mL硫酸卡纳霉素的LB液体培养基，37℃ 200rpm培养10-12h，按4％接种量转接至含100μg/mL硫酸卡纳霉素的TB液体培养基。重组菌在37℃ 200rpm培养至OD600约为1.0，加入0.06mM终浓度IPTG和和8mM终浓度α-乳糖诱导表达，并在24℃ 150rpm下培养6h。将表达后的菌液在4℃、9000rpm离心20min，弃菌体收集上清。将获得的上清液加入Ni-NTA亲和层析柱，上样后使用1×BindingBuffer洗脱直至吸光值平稳，分别加入50mM、100mM及250mM终浓度的咪唑溶液洗脱目的蛋白。
通过酶活测定和SDS-PAGE分析，发现突变酶主要出现在100mM咪唑洗脱液中，且条带单一。将含有目的蛋白的洗脱液通过GE PD-10脱盐柱，使用20mM磷酸缓冲液(pH6.5)洗下目的蛋白。之后使用蛋白超滤离心管浓缩，分别得到单二硫键改造酶G3C-Q68C、N31C-T187C、E63C-N182C、K83C-A141C和P102C-N125C和双二硫键改造酶N31C-T187C/P102C-N125C制品。
实施例3：酶活及蛋白浓度分析
(1)酶活测定方法：
3,5-二硝基水杨酸(DNS)法及改良AZO测定方法相结合测定β-葡聚糖酶活力的方法：
酶活定义：1mL酶液在40℃和pH值为6.5条件下，每分钟水解β-葡聚糖生成相当于1μmol的葡萄糖还原物质的量为1个酶活力单位，以U/mL表示。
发酵清液酶活力测定：发酵液经过离心后，将上清液稀释适当倍数，测定其酶活力。
葡萄糖标准曲线的绘制：分别吸取1％葡萄糖标准溶液2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于50mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，制成每毫升分别含葡萄糖200、400、600、800、1000、1200μg的稀标准液。各取不同浓度的稀标准液0.5mL于试管中，加入pH6.5磷酸氢二钠－磷酸二氢钠缓冲液1.5mL，再加入DNS试剂3.0mL，于沸水浴中煮沸7min，取出后迅速冷却至室温后加入蒸馏水10mL，摇匀。以蒸馏水0.5mL代替葡萄糖稀标准液作为对照，用10mm比色皿，在波长550nm处用分光光度计分别测定其吸光度。以吸光度为纵坐标，相对应的葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。
样品酶活测定：精确吸取待测稀释酶液0.5mL(每个样品3支平行试管)，及pH6.5磷酸二氢钠－磷酸氢二钠缓冲液1.0mL，置于40℃水浴预热5min，加入经预热的1.0％β-葡聚糖溶液0.5mL，立即开始计时，于40℃水浴精确反应10min，立即加入3.0mlDNS液终止反应，然后置于沸水浴中7min，取出迅速冷却后加入10mL去离子水，摇匀后，测定550nm下的反应液的吸光值。同时进行空白对照测定，其步骤为吸取待测稀释酶液0.5mL，加入1.0mL pH5.0磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液，然后先加入3.0mL DNS液使酶失活，40℃水浴预热，再加入同样经预热的1.0％β-葡聚糖溶液0.5mL，40℃水浴10min，然后置于沸水浴中7min，以后步骤同于样品测定，由样品测定时得到吸光值，根据标准曲线即可得到相应的酶活力单位。
(2)蛋白浓度测定：
Bradford法测定溶液中蛋白浓度的方法：
取200μL待测样品加入2mL Bradford试剂，混匀后迅速在595nm下测定吸光值，空白为pH6.5磷酸盐缓冲液。每组样品三个平行，所得吸光值对照标准曲线方程y＝0.0042x+0.0082可得溶液中的蛋白浓度。
(3)比活力比较：实验结果列于表3。将野生酶制品和突变酶制品相比，可以发现，突变酶的比活力和野生酶相比相差不大，仅有小量提升。其中，N31C-T187C和P102C-N125C突变酶的比酶活分别4013.4U/mg和3998.0U/mg，N31C-T187C/P102C-N125C突变酶的比酶活达到4045.4U/mg。
表3 野生酶与3株β-葡聚糖酶突变体的比酶活比较
酶 比活力(U/mg)
野生酶 3936.4±32.3
N31C-T187C 4013.4±41.3
P102C-N125C 3998.0±30.2
N31C-T187C/P102C-N125C 4045.4±47.9
实施例4：野生酶和突变酶的热稳定性
(1)野生酶和突变酶的最适温度测定方法：
取获得的酶制品100μL，分别于不同温度(35、40、45、50、55、，60、65、70℃)测定酶活力。以酶活最大值作为100％相对酶活，其他温度下的酶活值除以最大值所得百分数即为该温度下的相对酶活。野生酶和突变酶的最适温度见图1。从图1可以看出，野生酶的最适温度为60℃，而G3C-Q68C、N31C-T187C、E63C-N182C和P102C-N125C突变酶的最适温度没有变化，依旧为60℃。而突变酶K83C-A141C的最适温度降低为40℃。经过组合突变后，N31C-T187C/P102C-N125C突变酶的最适温度为60℃。
(2)野生酶与突变酶在60℃的半衰期测定方法：
取获得的酶制品2mL，分别于60℃处理不同时间(10、20、30、40、50、60、70min)，立即取出置于冰上冷却10min，将处理液稀释合理倍数后取100μL测定β-葡聚糖酶活力。以处理前发酵液酶活值作为100％相对酶活，不同处理时间下的酶活值除以最大值所得百分数即为该条件下的相对酶活。从图2可以看出在60℃下野生酶在60℃下的半衰期测定为59min，而N31C-T187C和P102C-N125C突变酶在60℃下的半衰期分别为81.4min和81.2min。而N31C-T187C/P102C-N125C突变酶的半衰期更是达到87.5min，和野生酶相比提高了48.3％。
然而，对于突变酶G3C-Q68C、E63C-N182C、K83C-A141C，其60℃的半衰期分别为20.4min、31.5min和26.8min，和野生酶相比分别降低了65.4％、46.6％和54.6％。
为了验证β-葡聚糖酶热稳定性的提升是由二硫键的形成导致而不是由于氨基酸的改变，本发明也构建了四株单突变酶(N31C，T187C，P102C和N125C)。四株单突变酶在60℃下的半衰期分别为47min，48.9min，52.1min和37min，和野生酶相比均有一定程度的降低。这说明酶热稳定性的提高是由二硫键的形成带来。
(3)野生酶与突变酶的T50值测定方法：
取获得的酶制品2mL，分别于不同温度(40、45、50、55、60、65、70、75、80℃)处理15min，立即取出置于冰上冷却10min，取100μL测定β葡聚糖酶活力。以酶活最大值作为100％相对酶活，其他温度下的酶活值除以最大值所得百分数即为该温度下的相对酶活。T50值定义为经过上述处理酶活降低至初始酶活一半时的温度。
从图3可以看出，突变酶的失活曲线均比野生酶缓和。野生酶的T50值为76℃，N31C-T187C和P102C-N125C突变酶的T50值分别为77.1℃和76.8℃，而N31C-T187C/P102C-N125C突变酶的T50值为77.5℃。突变酶的T50值均高于野生酶。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种热稳定性提高的1,3-1,4-β-葡聚糖酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
2.编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列是SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6所示的序列。
4.含有权利要求1所述突变体的氨基酸序列的载体。
5.表达权利要求1所述突变体的基因工程菌。
6.根据权利要5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以pET28a(+)质粒为表达载体，以大肠杆菌为表达宿主。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主为大肠杆菌BL21(DE3)。
8.一种权利要求6所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法是：以一株改造过的Bacillus terquilensis CGX 5-1来源1,3-1,4-β-葡聚糖酶基因为模板，采用两次重叠延伸PCR的方法进行定点突变获得编码二硫键改造突变体的基因，随后将编码突变体的基因片段连接至原核表达载体并转化大肠杆菌进行表达。
9.权利要求5所述基因工程菌在食品、饲料领域的应用。
10.权利要求1所述突变体在食品、饲料领域的应用。
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