CN114990027B

CN114990027B - 一株降解卤代酸的假单胞菌w52及其应用

Info

Publication number: CN114990027B
Application number: CN202210760050.4A
Authority: CN
Inventors: 王亚月; 向巧; 王梦娇; 周庆峰; 裴冬丽
Original assignee: Shangqiu Normal University
Current assignee: Shangqiu Normal University
Priority date: 2022-06-30
Filing date: 2022-06-30
Publication date: 2023-05-16
Anticipated expiration: 2042-06-30
Also published as: CN114990027A

Abstract

本发明提供了一株降解卤代酸的假单胞菌W52及其应用，所述假单胞菌W52的分类名为Pseudomonas sp.W52，已于2021年3月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2021223。本发明所述的假单胞菌W52从大连海域的海绵上分离得到，能够有效降解多种卤代酸，其中对2‑溴丙酸、单溴乙酸、单氯乙酸和二氯乙酸可完全降解，并制备假单胞菌W52的静息细胞，使菌株在降解卤代酸的同时具备对高浓度卤代酸的耐受能力。本发明拓展了降解卤代有机化合物的微生物的来源范围，有效降解了卤代酸，对治理环境中卤代酸污染、保护生态环境、防治地下水污染以及保护人类身体健康等方面都具有重要意义。

Description

一株降解卤代酸的假单胞菌W52及其应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一株降解卤代酸的假单胞菌W52及其应用。

背景技术

卤代有机化合物是一类含有卤素基团的有机化合物的总称，广泛应用于医药、工农业生产等领域，具有疏水性、低水溶性、相对的化学稳定性和空气中不易燃烧的特点，长期以来在环境中无节制的释放以及不断地转化、积累和富集，对环境和人类身体健康造成了极大的危害。因此，如何实现卤代有机化合物的有效降解是当前亟待解决的问题。

微生物作为自然界中主要分解者，将复杂的有机物转化为简单的化合物，从而保持生命元素的循环往复，而生长在被有机卤代物污染的环境中的微生物其实也具有转化这些化合物的潜在能力。近年来，微生物降解法由于获得降解效率高、降解底物广谱、菌株适应性强的特点，已成为去除有机卤代污染物的有效方法之一。

尽管目前已有不少关于卤代有机化合物降解菌菌种资源的报道，但是，一方面脱卤微生物菌株多集中在对卤代脂肪烃、卤代芳烃等的降解，有关专门降解卤代酸的菌株还比较少见；另一方面脱卤微生物菌株多分离于陆生环境，降解的效率不高且底物谱范围较窄，应用时受到限制。例如，专利号为CN111378601A的专利公开了一种从土壤中分离得到的卤代苯酚降解菌株及其生产的菌剂；专利号为CN113957014A的专利公开了一种同样从土壤中分离得到的功能菌株，兼具多卤代烃降解和铬(VI)还原活性的作用。不同分离环境的差异，可对微生物法处理有机卤代污染物的工艺及处理效果产生影响。因此，尝试从其他环境分离可降解卤代有机化合物的微生物菌株，拓展降解卤代有机化合物的微生物分离范围，并提高卤代有机化合物降解效率及拓宽卤代酸底物谱很有必要。

发明内容

针对当前脱卤微生物分离范围小以及对卤代酸降解率、降解种类研究有限的问题，本发明提出一株降解卤代酸的假单胞菌W52及其应用。

为了达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一株假单胞菌W52，菌株分类名为 Pseudomonas sp. W52，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2021223，保藏时间为2021年3月12日，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

其中，所述假单胞菌W52菌体为短杆状，在平板上为圆形，隆起，边缘不齐整，表面湿润，淡黄色不透明。

本发明内容还包括所述的假单胞菌W52在制备假单胞菌W52静息细胞降解废水卤代酸中的应用，包括以下步骤：

（1）将假单胞菌W52以2-氯丙酸液体培养基体积1%的量接入2-氯丙酸液体培养基（200mL），温度30℃、转速200rpm培养40-50h至OD₆₀₀=0.6-1，然后进行离心，去除上清液，收集得到假单胞菌W52菌体。

进一步的，所述2-氯丙酸液体培养基的配制方法为向无机盐基础培养基中加入终浓度20mmol/L的2-氯丙酸；所述无机盐基础培养基的配方为：Na₂HPO₄·12H₂O 12g/L、NaH₂PO₄·2H₂O 1g/L、NaCl 30g/L、酵母浸粉 0.1g/L、 (NH₄)₂SO₄ 2.0g/L和MgSO₄·7H₂O0.1g/L，余量为水，pH7.0-7.5。

（2）用50mmol/L、pH7.5的无菌KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液将步骤（1）收集的假单胞菌W52菌体连续洗涤两次后再重悬至假单胞菌W52的菌落总数为10⁶ CFU/mL，得到假单胞菌W52静息细胞悬液。

（3）将步骤（2）的假单胞菌W52静息细胞悬液以悬液体积5%的量接种到废水中，降解废水中的卤代酸。

上述应用中所述卤代酸为卤代乙酸、卤代丙酸、卤代丁酸和二卤代酸中的至少一种。

进一步的，所述卤代乙酸包括单氯乙酸、单溴乙酸和单碘乙酸，所述卤代丙酸包括2-氯丙酸、2-溴丙酸、2-溴-2-甲基丙酸和3-氯丙酸，所述卤代丁酸包括2-氯丁酸、2-溴丁酸，所述二卤代酸包括二氯乙酸和2，2-二氯丙酸。

本发明的有益效果：

（1）本发明从大连海域的海绵上分离筛选和鉴定得到了一个新的降解卤代酸的菌株——假单胞菌W52，该菌株可降解卤代乙酸、卤代丙酸和卤代丁酸等多种卤代酸，具有较广的降解底物谱。

（2）本发明的假单胞菌W52具有较高的卤代酸降解效率，可在36h内完全降解2-溴丙酸、48h内完全降解单溴乙酸、60h内完全降解单氯乙酸和二氯乙酸，对2-氯丙酸、2-溴-2-甲基丙酸和2-溴丁酸等也具有较强的降解能力。

（3）本发明制备的假单胞菌W52的静息细胞，具有对高浓度卤代酸的耐受能力及较强的降解能力，其中对二氯乙酸的降解能力最强，可在24h内将30mmol/L二氯乙酸全部降解，在144h内对30mmol/L的单溴乙酸、2-溴丙酸、2-溴-2-甲基丙酸、3-氯丙酸和2-溴丁酸降解率分别达到67.7%、46.3%、97.9%、35.4%和60.5%，有效避免了卤代酸浓度过高时抑制菌株的生长，在卤代酸大量存在的情况下也能实现对卤代酸的有效降解，36内对废水中总卤代酸的降解率即可达到63.7%。

（4）本发明的假单胞菌W52从海绵动物上分离得到，拓展了降解卤代有机化合物的微生物的来源范围，同时有效降解了卤代酸，对于治理环境中卤代酸污染、保护生态环境、防治地下水污染以及保护人类身体健康等方面都具有重要意义。

（5）本发明的假单胞菌W52易于分离和培养，工艺简单，使用便利，有利于该菌株的工业化生产和应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中假单胞菌W52的菌落形态图（A）、显微镜图（B）及扫描电镜图（C）。

图2为本发明实施例1中假单胞菌W52的系统发育树图。

图3为本发明实施例2中假单胞菌W52对卤代乙酸的降解变化图。

图4为本发明实施例2中假单胞菌W52对卤代丙酸的降解变化图。

图5为本发明实施例2中假单胞菌W52对卤代丁酸的降解变化图。

图6为本发明实施例2中假单胞菌W52对二卤代酸的降解变化图。

图7为本发明实施例3中假单胞菌W52静息细胞对卤代酸混合物的降解变化图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明的实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

本发明的实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明实施例中用到的培养基及平板的制备方法如下：

无机盐基础培养基：Na₂HPO₄·12H₂O 12g/L、NaH₂PO₄·2H₂O 1g/L、NaCl 30g/L、酵母浸粉0.1g/L、(NH₄)₂SO₄ 2.0g/L和MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，余量为水，pH为7.0-7.5。

2-氯丙酸显色平板：在无机盐基础培养基中加入0.04g/L溴百里酚蓝(作为pH指示剂), 终浓度18 g/L琼脂, 终浓度8-20mmol/L的2-氯丙酸。

2-氯丙酸液体培养基：在无机盐基础培养基中加入终浓度为20mmol/L的2-氯丙酸。

2216E培养基：蛋白胨5.0g/L、酵母浸粉1.0g/L、FeCl₃ 0.1g/L和NaCl 30g/L, 加入去离子水至培养基总体积为1L，用浓度为1mol/L的NaOH溶液调节培养基pH为7.0-7.5, 1×10⁵ Pa高压灭菌20min。

实施例1假单胞菌W52的分离培养及鉴定

（1）假单胞菌W52的分离培养

菌源样品来源于山东大连海域海平面以下20-30m处的新鲜海绵。首先称取海绵样品5g，用无菌水冲洗3遍后，置于研钵中研磨至匀浆状，再加入10mL无菌水，振荡获得悬液。分别将悬液稀释10倍、100倍、1000倍后，各取100μL涂布于2-氯丙酸显色平板，30℃培养72h，挑取颜色、形态不同的细菌单菌落进行纯化保存。

用2216E培养基活化所得的菌株，30℃培养48h，吸取菌液，以1%的体积比接种于2-氯丙酸液体培养基（200mL）培养，每个处理重复3次，48h后通过高效液相色谱法（HPLC）检测2-氯丙酸液体培养基中2-氯丙酸的含量，计算菌株对2-氯丙酸的降解率。结果表明，菌株W52降解2-氯丙酸的效率最高。

其中，HPLC的分析条件如下：

流动相A：磷酸水溶液，1L超纯水加入磷酸（85%）至终浓度 0.015mol/L，并用KH₂PO₄溶液调 pH 值至2.2。流动相 B：乙腈；分析柱：C18 ODS 柱 4.6mm×250mm。流动相 A：流动相 B=80:20 等度洗脱；柱温：30 °C；流速：1mL/min；检测波长：210nm；进样体积：10μL。

（2）假单胞菌W52的鉴定

将活化后的菌株W52划线接种到2-氯丙酸显色平板上，30℃培养3d，观察该菌落的形态，在平板上菌株W52菌落呈圆形，隆起，边缘不齐整，表面湿润，淡黄色不透明（图1A）；在显微镜下菌株W52呈短杆状（图1B）；扫描电镜下菌株W52呈椭圆形或卵圆形，表面光滑（图1C）。

参照《Bergey’s Manual of Determinative》和《常见细菌系统鉴定手册》进行菌株W52的生理生化特征鉴定，包括革兰氏染色，甲基红实验，葡萄糖发酵实验，VP实验及尿素酶实验等，具体情况如表1所示：

表1 菌株W52的主要生理生化特性

以无机盐基础培养基为基础加入表2中所列添加物，考察菌株W52对表2中各种添加物的利用能力。

表2 菌株W52对不同碳源的利用情况

将菌株W52以1:100的体积比分别接种于含5%（v/v）甲醇、乙醇、丙酮和乙腈的2216E培养基，37℃培养2d，检测菌株W52对甲醇、乙醇、丙酮和乙腈的耐受能力。每种有机溶剂均设三组，分别为处理组、阳性对照组及阴性对照组，其中阳性对照组不含有机溶剂，阴性对照组不接种菌株W52种子液，其余操作均相同。将培养液明显变浑浊作为菌株W52生长良好的定性指标。结果如表3：

表3 菌株W52对不同有机溶剂的耐受能力

由表3可知：菌株W52在甲醇、乙醇、丙酮和乙腈处理组的培养液中均生长良好。

提取上述菌株W52的基因组，采用引物27f（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）与1492r（5’-TACCTTGTTACGACTT-3’）进行PCR扩增。PCR反应体系50μL：PremixTap酶 25μL、模板 1μL、引物27f 1μL、引物1492r 1μL、无菌水 22μL。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后送于金唯智公司测序，得到的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。将该序列提交GenBank数据库进行BLAST分析比对，并构建如图2所示的系统进化树，结果表明，菌株W52与假单胞菌 Pseudomonas sp. strain TF12的同源性最高，为99.79%，结合菌落形态特征、生理生化特性和16S rRNA序列分析结果，初步鉴定菌株W52为假单胞菌（ Pseudomonas sp.）属。

实施例2 假单胞菌（ Pseudomonas sp.）W52对卤代酸的降解能力

将实施例1保存的假单胞菌W52以1%的体积比接入2-氯丙酸液体培养基（200mL），30℃，200rpm振荡培养45h至OD₆₀₀=0.4-0.6，得到假单胞菌W52种子液，备用。

将假单胞菌W52的种子液按种子液体积1%的量分别接种至体积为200mL的添加卤代酸的无机盐基础培养基中，其中所添加的卤代酸的种类分别为卤代乙酸（单溴乙酸、单氯乙酸和单碘乙酸）、卤代丙酸（2-溴丙酸、2-氯丙酸、2-溴-2-甲基丙酸和3-氯丙酸）、卤代丁酸（2-氯丁酸和2-溴丁酸）和二卤代酸（二氯乙酸和2，2-二氯丙酸），添加的各种卤代酸的终浓度均为20mmol/L。30℃下200rpm摇床培养，取样，通过HPLC检测培养基中各卤代酸的残留量，分别绘制假单胞菌W52对卤代乙酸、卤代丙酸、卤代丁酸和二卤代酸随时间的降解曲线。

如图3所示，对于卤代乙酸，假单胞菌W52对单溴乙酸降解能力最强，在48h内可将其完全降解；在60h内可将单氯乙酸完全降解；对单碘乙酸也表现出一定的降解能力，72h内降解率达到55%。如图4所示，对于卤代丙酸，假单胞菌W52对2-溴丙酸的降解能力最高，36h内可将其完全降解；在72h内可降解90%的2-氯丙酸；对2-溴-2-甲基丙酸与3-氯丙酸也表现出较强的降解能力，在72h内降解率分别达到82%与54%。如图5所示，对于卤代丁酸，假单胞菌W52也表现出一定降解能力，培养至72h时，对2-氯丁酸与2-溴丁酸降解率分别可以达到41%与53%。如图6所示，对二卤代酸，假单胞菌W52对二氯乙酸表现出较强的降解能力，在60h内可将其完全降解；对2，2-二氯丙酸的降解能力稍弱，72h时降解率为15%。

其中，HPLC的分析条件如下：

实施例3 假单胞菌（ Pseudomonas sp.）W52静息细胞对卤代酸的降解能力

将实施例1保存的假单胞菌W52以1%的体积比接种到2-氯丙酸液体培养基（200mL）内，30℃，200rpm摇床培养49h，OD₆₀₀=0.6-1，然后在4℃下8000rpm离心，去除上清液，收集菌体，随后用无菌KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液（50mmol/L，pH7.5）将菌体洗涤2次，再加入相同的缓冲液重悬至溶液中假单胞菌W52的菌落总数为10⁶ CFU/mL，制得假单胞菌W52静息细胞悬液。

在假单胞菌W52静息细胞悬液中分别加入30mmol/L的单溴乙酸、2-溴丙酸、3-氯丙酸、2-溴丁酸和二氯乙酸，30℃下200rpm振荡培养，在培养24h、48h、72h、96h、120h及144h分别取样，通过HPLC检测培养基中各卤代酸的残留量，绘制假单胞菌W52对单溴乙酸、2-溴丙酸、3-氯丙酸、2-溴丁酸与二氯乙酸的降解曲线。

结果表明，菌株W52静息细胞对于高浓度的卤代酸均有耐受能力，其中对二氯乙酸的降解能力最高，可在24h内将30mmol/L的二氯乙酸全部降解（图7）；在144h内，对30mmol/L的单溴乙酸、2-溴丙酸、2-溴-2-甲基丙酸、3-氯丙酸和2-溴丁酸降解率分别为67.7%、46.3%、97.9%、35.4%和60.5%（图7）。

其中，HPLC的分析条件与实施例2相同。

应用例

将实施例3制备的假单胞菌W52静息细胞悬液以悬液体积比5%的量接种到含有卤代乙酸、卤代丙酸、卤代丁酸及二卤代酸的废水中，30℃下220rpm培养，36h后，总卤代酸去除效率为63.7%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

<110> 商丘师范学院

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<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1437

<212> DNA

<213> 假单胞菌 (Pseudomonas sp. )W52

<400> 1

ccatgcgcag ctacacatgc agtcgagcgg atgaagagag cttgctctct gattcagcgg 60

cggacgggtg agtaatgcct aggaatctgc ctgatagtgg gggacaacgt ttcgaaagga 120

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tcagctcgtg tcgtgagatg ttgggttaag tcccgtaacg agcgcaaccc ttgtccttag 1080

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ggggatgacg tcaagtcatc atggccctta cggcctgggc tacacacgtg ctacaatggt 1200

cggtacaaag ggttgccaag ccgcgaggtg gagctaatcc cataaaaccg atcgtagtcc 1260

ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gtcggaatcg ctagtaatcg tgaatcagaa 1320

tgtcacggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca tgggagtggg 1380

ttgctccaga agtagctagt ctaaccttcg gggggacggt accacgagat cagttgg 1437

Claims

1.一株假单胞菌W52，其特征在于：所述假单胞菌W52的分类名为Pseudomonas sp.W52，已于2021年3月12日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2021223，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

2.权利要求1所述的假单胞菌W52在制备假单胞菌W52静息细胞降解废水卤代酸中的应用，包括以下步骤：

（1）将假单胞菌W52接入2-氯丙酸液体培养基培养，然后进行离心，去除上清液，收集得到假单胞菌W52菌体；

（2）将步骤（1）收集的假单胞菌W52菌体洗涤并重悬，得到假单胞菌W52静息细胞悬液；

（3）将步骤（2）的假单胞菌W52静息细胞悬液接种到废水中，降解废水中的卤代酸。

3.根据权利要求2所述的制备假单胞菌W52静息细胞降解废水卤代酸的应用，其特征在于：所述步骤（1）中假单胞菌W52的接种量为2-氯丙酸液体培养基体积的1%。

4.根据权利要求2或3所述的制备假单胞菌W52静息细胞降解废水卤代酸的应用，其特征在于：所述步骤（1）中2-氯丙酸液体培养基的体积为200mL，配制方法为向无机盐基础培养基中加入终浓度20mmol/L的2-氯丙酸；培养的条件为温度30℃、转速200rpm培养40-50h至OD₆₀₀=0.6-1。

5.根据权利要求4所述的制备假单胞菌W52静息细胞降解废水卤代酸的应用，其特征在于，所述无机盐基础培养基的配方为：Na₂HPO₄·12H₂O 12g/L、NaH₂PO₄·2H₂O 1g/L、NaCl30g/L、酵母浸粉 0.1g/L、 (NH₄)₂SO₄ 2.0g/L和MgSO₄·7H₂O 0.1g/L，余量为水，pH7.0-7.5。

6.根据权利要求5所述的制备假单胞菌W52静息细胞降解废水卤代酸的应用，其特征在于，所述步骤（2）中洗涤的具体操作为：用50mmol/L、pH7.5的无菌KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液连续洗涤步骤（1）收集的假单胞菌W52菌体两次。

7.根据权利要求6所述的制备假单胞菌W52静息细胞降解废水卤代酸的应用，其特征在于，所述步骤（2）中重悬的具体操作为：用50mmol/L、pH7.5的无菌KH₂PO₄-K₂HPO₄缓冲液将洗涤后的假单胞菌W52菌体重悬至假单胞菌W52的菌落总数为10⁶CFU/mL。

8.根据权利要求7所述的制备假单胞菌W52静息细胞降解废水卤代酸的应用，其特征在于：所述步骤（3）中假单胞菌W52静息细胞悬液的接种量为悬液体积的5%。

9.根据权利要求2、3或5-8任一项所述的应用，其特征在于：所述卤代酸为卤代乙酸、卤代丙酸、卤代丁酸和二卤代酸中的至少一种。

10.根据权利要求9所述的制备假单胞菌W52静息细胞降解废水卤代酸的应用，其特征在于：所述卤代乙酸包括单氯乙酸、单溴乙酸和单碘乙酸，所述卤代丙酸包括2-氯丙酸、2-溴丙酸、2-溴-2-甲基丙酸和3-氯丙酸，所述卤代丁酸包括2-氯丁酸、2-溴丁酸，所述二卤代酸包括二氯乙酸和2，2-二氯丙酸。