CN104805045B

CN104805045B - 根际促生菌及其应用

Info

Publication number: CN104805045B
Application number: CN201510224643.9A
Authority: CN
Inventors: 解志红; 李项岳; 李岩; 宫江峰; 姜楠
Original assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Current assignee: Yantai Institute of Coastal Zone Research of CAS
Priority date: 2015-05-05
Filing date: 2015-05-05
Publication date: 2017-12-19
Anticipated expiration: 2035-05-05
Also published as: CN104805045A

Abstract

本发明涉及农业微生物领域，具体地说是一种根际促生菌及其应用。根际促生菌为根际促生菌N10，其分类命名为生癌肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)，于2015年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1.14969。本发明菌株具有固氮、解磷、产吲哚乙酸的促生特性，可以增加土壤养分，提高肥料有效性，促进植物对土壤养分吸收，具有开发成促进农作物生长的微生物接种剂或微生物菌肥的良好前景。本发明针对小麦具有显著的促生效果，菌株良好地促生特性促进了小麦地上部的生长。

Description

根际促生菌及其应用

技术领域

本发明涉及农业微生物领域，具体地说是一种根际促生菌及其应用。

背景技术

小麦为禾本科植物，世上分布最广粮食作物，播种面积为粮食作物之冠。2010年，其在世界上总产量达6.51亿吨，仅次于玉米的8.44亿吨。同时小麦是中国最重要的口粮之一，主要产于河南、山东、江苏、河北、湖北、安徽等省，小麦产业发展直接关系到国家粮食安全和社会稳定。然而，在我国科学技术对此作物的提高作用远低于种植面积的减少幅度。

在农业生产中，化肥的使用提高了小麦产量，然而也向环境释放了大量的有害物质，污染了土壤、水源以及食品本身，对人类健康及生存环境也构成了极大威胁。因此，适应绿色农业以及农业可持续发展的需求，开发利用替代化学肥料的新肥源成为当务之急。

根际促生菌是自由生活在根围土壤或附生于根表、根内的可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类。根际促生菌可以通过一种或多种机制直接或间接的促进植物生长。通过固氮、解磷、解钾、产植物激素、酶解降低乙烯等作用，增加土壤养分，促进根系对矿质的吸收利用，直接刺激和调节植物生长；另一方面，通过产生抗生素和分泌铁载体、HCN等物质，其可以抑制土壤中有害病原微生物，间接的保护和促进植物生长。接种根际促生菌，不但能够减少化肥农药的使用，也能减轻因大量使用化肥农药而造成的环境污染和食品安全问题。自1990第四届国际植物细菌年会上Keleopper等人在法国召开的做了有关根际促生菌的报告后，应用根际促生菌促进植物生长，提高农作物产量的研究再次引起人们的极大关注。目前，人们已经从玉米、小麦、苜蓿、甘蔗、水稻及多种牧草等的根际中，筛选到多种具有优良特性的促生菌株，在温室和田间接种试验中取得良好的促生效果。

发明内容

本发明目的在于提供一种根际促生菌及其应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种根际促生菌，根际促生菌为根际促生菌N10，其分类命名为生癌肠杆菌(Enterobacter cancerogenus)，于2015年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1.14969，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

一种根际促生菌的应用，所述根际促生菌应用于促进植物生长中。

进一步的说，所述根际促生菌应用于促进小麦生长中。

更进一步的说，所述根际促生菌应用于促进小麦生长中，作为接种剂(促生剂)或微生物菌肥。

具体是，将OD₆₀₀为0.8的经LB培养基中驯化培养的1ml生癌肠杆菌液(根际促生菌N10)作为作为接种剂(促生剂)或微生物菌肥喷在发芽的小麦种子表面，温室下培养，进而促进小麦生长；

其中，小麦种子是经浸泡后温育发芽的小麦种子转移种于灭菌的拌有低氮-磷酸钙培养液中；

所述灭菌的拌有低氮-磷酸钙培养液承装于蛭石的双层钵中；

所述低氮-磷酸钙培养液成分：去离子水1L，柠檬酸铁(ferric citrate)0.075g，Ca(NO₃)₂0.03g,KCl 0.075g，MgSO₄·7H₂O 0.06g，Ca₃(PO₄)₂5g,CaSO₄ 0.46g，微量元素1mL；

所述微量元素组分：去离子水1L，H₃BO₃2.86g,MnSO₄1.81g，CuSO₄·5H₂00.8g，ZnSO₄0.22g,H₂MoO₄0.02g，pH至7.0。

所述室温培养的条件为温度控制在26±2℃，光照周期12h:12h。

上述所述双层钵设计：上层为透明塑料杯盛蛭石，下层为宽口玻璃瓶盛灭菌水，塑料杯底部开孔，一根粗棉芯穿过开孔，上部埋在蛭石中央，下部伸到无菌水中。

其中菌株可用于制备促进小麦生长的微生物接种剂。

所述菌株可用于制备微生物菌肥，其有使固氮、溶磷、产吲哚乙酸能力，能增加土壤含氮量，提高土壤营养有效性，减少化肥施用量。

具体是，菌株能够将空气中的氮气还原成氨态氮，具有自生固氮能力。

菌株具有强的溶磷能力，能将磷酸钙转化成易于被植物吸收的可溶性磷酸盐。

菌株能够合成和分泌吲哚乙酸。

本发明所具有的优点：

本发明根际促生菌具有固氮、解磷、产吲哚乙酸的促生特性，可以增加土壤养分，提高肥料有效性，促进植物对土壤养分吸收，具有开发成促进农作物生长的微生物接种剂或微生物菌肥。其固氮能力达16.36nmol(C2H2mg^-1protein h^-1)；摇床温育培养下，其10天后磷酸钙转化量比不接菌的空白对照高出254.58mg L-1，吲哚乙酸60h后产量1.10μg ml^-1。

进而所获得菌株对小麦具有显著的促生效果，菌株良好地促生特性促进了小麦地上部的生长。接入菌株的小麦地上部干重增长60.87％，鲜重增长57.14％，均达到统计学的显著水平，并且没有可见的病变表征。另外，在营养相对缺乏的培养环境下，该根际促生菌能显著地促进小麦的生长。

附图说明

图1为本发明实施例提供的根际促生菌N10在LB培养基培养1天上的菌落形态。

图2为本发明实施例提供的根际促生菌N10在PVK固体培养基培养5天解磷透明圈。

图3为本发明实施例提供的温室培养50天后，接菌小麦与不接菌小麦生长状况对比及双层钵展示照片。

图4为本发明实施例提供的温室培养50天后，接菌小麦与不接菌小麦干重对比图。

具体实施方式

实施例1

菌株的鉴定

将根际促生菌N10在LB培养基上28℃培养箱中扩大培养，观察菌落特征：菌落顶部平，凸起，半透明，乳白色，表面较湿润。

所述根际促生菌为根际促生菌N10，其分类命名为生癌肠杆菌(Enterobactercancerogenus)，于2015年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.1.14969。

挑取菌落收集菌体，用天根细菌基因组DNA提取试剂盒,依据内附说明书提取所述菌株基因组DNA，保存于-20℃冰箱备用。

16S rRNA gene PCR:

①引物27F：AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG，1492R：TACGGCTACCTTGTTACGACTT。

②反应体系：25uL天根PCR Mix，1uL引物27F，1uL1492R引物，1uL提取的DNA，22uL灭菌超纯水。

③PCR反应条件为：95℃变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，从第二步开始30个循环.PCR产物序列测定委托上海生工生物技术有限公司完成，参见序列表SEQ ID No.1。

序列表SEQ ID No.1

CTGTTCGCCCGTCTCCTATGCTAGTCGAGCGGTAACACAGGGAGCTTGCTCCTGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGAGGAGGAAGGCATTAAGGTTAATAACCTTGGCGATTGACGTTACTCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGCTGTTCCCTTGAGGAGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTACTCTTGACATCCAGGGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACCGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTCCGGTCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGAGTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCGCATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTGCGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGAATGCTACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCAAAAGAAGTAGGTAGCTTAACCTTCGGGAGGGCGCTTACCACTTTAGATAAATAGC

(a)序列特征：

●长度：1444

●类型：碱基序列

●链型：单链

●拓扑结构：线性

(b)分子类型：16S rRNA

(c)假设：否

(d)反义：否

(e)最初来源：根际促生菌

实施例2

根际促生菌N10的获取及促生特性测定：

称取1g菊芋根际土样于盛有99mL无菌水的三角瓶中,摇床上振荡30min后,静置10min。吸取1ml上清液于装有9ml无菌水的试管中摇匀,浓度为10^-3。依此类推,做10^-4,10^-5,10^-6,10^-7共5个稀释梯度。分别吸取100μL涂布于无氮Ashby培养基上,28℃培养3～4d。挑取单菌落纯化，镜检，斜面保存。交替在LB培养基和无氮Ashby培养基平板上划线转接7～8次，能够正常生长的菌株为固氮菌株，用20％甘油保存于-80℃冰箱，进行下一步测试。

无氮Ashby培养基(1L):葡萄糖5g,甘露醇5g,琼脂粉15g,KH₂PO₄0.9g,CaCO₃5g,FeSO₄﹒7H₂O 0.01g,NaMoO₄﹒2H₂O 5mg,MgSO₄﹒7H₂O0.1g,CaCl﹒2H₂O 0.1g，pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。

LB培养基(1L)：胰蛋白胨10g,酵母提取物5g，氯化钠10g,琼脂粉15g。pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。

固氮酶活性测定(乙炔还原法)：

①将所述菌株用LB培养基活化后接种到含氮Ashby液体培养基中摇菌过夜后，吸取2mL菌液，4000rpm,4℃离心5min，收集菌体，用无氮Ashby液体培养基洗涤两次后，用无氮Ashby培养基充分悬浮，使OD₆₀₀＝0.2-0.5。

②三个20mL血清瓶中各加入2mL上述稀释好的菌液，用橡皮塞密封用氩气排出空气。之后充入3mL空气(3mL氩气同时排出)，使瓶内氧气浓度约为3％，形成微好氧环境。以加无菌2mL无氮Ashby培养基的血清瓶为对照，其他处理相同。

③摇床上28℃温育16h后，加入2mL乙炔，继续温育4h,用气相色谱测还原成乙烯峰面积。

④制作蛋白质浓度标准曲线：取6支试管，按下表的配比制作0-100ug/mL BSA标准曲线。

	1	2	3	4	5	6
							标准蛋白溶液(mL)	0	0.02	0.04	0.06	0.08	0.1
蒸馏水(mL)	1	0.98	0.96	0.94	0.92	0.9
							考马斯亮蓝G-25(mL)	5	5	5	5	5	5

测完后离心收集菌体，加入200uL 0.5M的NaOH煮沸5min，再加200uL0.5M的HCl混合均匀，离心吸取上清液40uL，加入5mL Bradford工作液，混匀，放置3-5min显兰色。测定OD₅₉₅值，代入标准曲线方程中，计算蛋白浓度。

⑤按下列公式计算固氮酶活

固氮酶活＝(所测乙烯峰面积×试管气体体积(mL))/(1nmol标准乙烯峰面积×蛋白含量(mg)×反应时间(h))

解磷能力测定：

三个50mL锥形瓶中各加入30mL无机磷细菌液体培养基(PVK)，灭菌降温至室温后，各接100uL菌液，摇床内28℃，200rpm温育。同时以三瓶不接种的作为空白对照，其他处理相同。

10天后，吸取5mL菌液4℃10000rpm离心10min，取上清液用钼锑钪比色法测溶解性磷含量。

其中，无机磷细菌液体培养基(PVK)(1L):葡萄糖10g,(NH₄)₂SO₄0.5g,NaCl 0.3g,KCl 0.3g,MgSO₄﹒7H₂O 0.3g,Ca₃(PO₄)₂10g,FeSO₄﹒7H₂O 0.03g,MnSO₄﹒4H₂O 0.03g,pH7.0±0.2。

产吲哚乙酸能力测定：

三个50mL锥形瓶中各加入30mLCCM培养基，灭菌降温至室温后，各接100uL菌液，摇床内28℃，200rpm温育。同时以三瓶不接种的作为空白对照，其他处理相同。

60h后，吸取5mL菌液4℃10000rpm离心10min，取上清液500uL，加入2mLSalkowski比色法(0.5mol/L FeCl₃2mL,高氯酸100mL)后,在黑暗中静止0.5h后,在530nm波长下,进行比色。代入做好的标准曲线，计算吲哚乙酸浓度。

其中，CCM培养基(1L):甘露醇5.0g,蔗糖5.0g,乳酸0.5mL,MgSO₄·7H₂O0.2g,KH₂PO₄0.2g,K₂HPO₄0.8g,CaCl₂·2H₂O 0.06g,NaCl 0.1g,NaMoO₄·2H₂O2.5mg,酵母粉0.1g,Na·Fe·EDTA 4mL(1.64％),NH₄NO₃1g,色氨酸0.1g,pH 7.0±0.2。

综合以上三项特性结果：

实施例3：所述菌株的小麦接种试验。

①小麦种子用10％(v/v)的次氯酸钠中浸泡10min表面消毒后，用无菌水洗涤5次，温育发芽，挑选生长状况相同的移种到装有灭菌的拌有低氮-磷酸钙培养液的蛭石的双层钵中，每个双层钵中各一颗，共10盆。

②将生癌肠杆菌驯化培养于LB培养基中，28℃扩大培养，当菌浓度OD₆₀₀＝0.8时，各吸取1mL菌液喷在其中5盆的发芽的小麦种子表面；同时另外5盆各喷洒1mL无菌LB培养基作为对照。③温室内培养，温度控制在26±2℃，光照周期12h:12h，整个处理遵循完全随机区组设计。

50天后收获小麦地上部分，测完鲜重后，放于烘箱内烘干至恒重，天平上称量各株干重。

实验结果统计：

将数据输入SPSS 19.0，采用配对样本T检验，分析接种与不接种差异的显著性(P<0.05)。

检验结果表明，均达到显著性水平。

综上实验表明：所述菌株Enterobacter cancerogenus N10具有良好的固氮、解磷、产吲哚乙酸特性，固氮能增加土壤氮含量，解磷能提高土壤养分有效性，产吲哚乙酸能刺激植物对土壤养分的吸收，由于上述作用为促进植物生长的共性，所以虽然该菌从菊芋的根际分离到，该菌具有作为一种广泛的促生菌应用于其他植物，促进其他植物生长的潜能。因而该菌株具开发成微生物菌肥的良好前景。

所述菌株接种小麦后，显著地促进了小麦的地上部生长，且没有可见的病变，表明所述菌株可以用于促进小麦生长的生物接种剂或微生物菌肥的制备。

Claims

1.一种根际促生菌，其特征在于：根际促生菌为根际促生菌N10，其分类命名为生癌肠杆菌（Enterobacter cancerogenus），于2015年3月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，保藏号为CGMCC No. 1.14969。

2.一种权利要求1所述的根际促生菌的应用，其特征在于：

所述菌株作为固氮菌将空气中的氮气还原成氨态氮中的应用。

3.一种权利要求1所述的根际促生菌的应用，其特征在于：所述根际促生菌应用于促进植物生长中的应用，将磷酸钙转化成易于被植物吸收的可溶性磷酸盐。

4.按权利要求3所述的根际促生菌的应用，其特征在于：所述根际促生菌应用于促进小麦生长中。

5.按权利要求4所述的根际促生菌的应用，其特征在于：所述根际促生菌应用于促进小麦生长中，作为微生物菌肥。

6.按权利要求5所述的根际促生菌的应用，其特征在于：将OD₆₀₀为0.8的经LB培养基中驯化培养的1ml生癌肠杆菌液N10作为作为微生物菌肥喷在发芽的小麦种子表面，温室下培养，进而促进小麦生长；

所述灭菌的拌有低氮-磷酸钙培养液承装于蛭石的双层钵中；

所述低氮-磷酸钙培养液成分：去离子水1L，柠檬酸铁0.075 g，Ca(NO₃)₂ 0.03 g， KCl0.075 g，MgSO₄·7H₂O 0.06 g，Ca₃(PO₄)₂ 5 g， CaSO₄ 0.46 g，微量元素 1 mL；

所述微量元素组分：去离子水1L，H₃BO₃ 2.86 g，MnSO₄ 1.81 g，CuSO₄·5H₂0 0.8 g，ZnSO₄0.22 g，H₂MoO₄ 0.02 g，pH至7.0。

7.按权利要求6所述的根际促生菌的应用，其特征在于：所述室温培养的条件为温度控制在26 ± 2℃，光照周期12h:12h。