CN105294251A - 壳聚糖功能化纳米硒复合物菌酶体系及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种壳聚糖功能化纳米硒复合物菌酶体系及其制备方法和应用，属于生物技术领域。该壳聚糖功能化纳米硒复合物菌酶体系包含枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、腐殖酸和壳聚糖功能化纳米硒复合物，可以保证有足够的养分满足作物生长发育的需要，同时促进植物吸收硒元素，改善作物品质。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域中一种壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。
背景技术
植物的叶片有上下两层表皮，由表皮细胞组成，表上细胞的外侧有角质层和蜡质，可以保护表皮组织下的叶肉细胞行使光合、呼吸等功能，不受外界不利条件变化的影响，叶片表现还有许多微小的气孔，行使气体更换的功能。研究表明，角质层由一种带有羟基和羧基的长碳链脂肪酸聚合物组成，这种聚合物的分子间隙及分子上的羟基、羧基亲水基团可以让水溶液渗透进入叶内，当然，叶片表面的气孔是叶面肥进入叶片更方便的通道。既能够保证作物对必要元素很好地吸收，调节植物生长，提高作物质量，也有利于农业的可持续发展。
另一方面，硒是人体必不可少的微量元素，是中国营养学会每日膳食营养平衡标准中必备的营养素，摄入量过低会引起功能性或器质性变化，发生多种疾病，例如：人体缺硒会产生克山病、大骨节病和胃肠病等。缺硒是一个国际性的问题，在南北半球各有一条大致纬向性的低硒分布带，大约包括了40多个国家和地区，如芬兰几乎全境缺硒，美国、英国、日本、加拿大、新西兰、俄罗斯及东南亚等国家都有大面积的国土缺硒。中国是国际公认的缺硒大国，缺硒地区占国土面积的72％，其中30％为严重缺硒地区，生活在缺硒地区的人口有4亿之多。在我国，主要的粮食产区如东北平原、河南、河北、成都平原等恰恰都是缺硒或严重缺硒地区。中国营养学会对我国13个省市的调查表明，我国成人日均硒摄入量仅为26～32微克，低于世界卫生组织推荐的50微克标准，更远低于中国营养学会建议的每日补充50至200微克的量，影响国民身体素质。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明人考虑通过摄入富硒植物补充人体所需的硒元素，基于此本发明提供一种壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，该体系能促进植物对硒元素的吸收。
基于上述发明构思，本发明提供一种壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，包括枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、腐殖酸和壳聚糖功能化纳米硒复合物。所述的壳聚糖功能化纳米硒复合物为表面经壳聚糖或其衍生物功能化修饰的纳米硒。
作为优选，上述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系中所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCCNo.1.1630；所述乳酸片球菌为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)CGMCCNo.1.2696。
作为优选，上述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系中，枯草芽孢杆菌∶乳酸片球菌∶腐殖酸∶壳聚糖功能化纳米硒复合物的质量比为(1.6-3)∶(0.1-1)∶(10-60)∶(0.1-1)。
作为优选，上述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系还包括亚硒酸钠、碘化钾和氯化锌盐。
作为优选，上述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，包含以下质量比的组分：
本发明第二方面提供一种上述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将亚硒酸钠溶液与碘化钾溶液混合，加入水搅拌均匀；
(2)加入抗坏血酸溶液，进行反应；
(3)静置老化；
(4)离心后除去上清液，洗涤除去未反应的杂质；
(5)纳米硒粒子重新分散成溶胶，添加壳聚糖或其衍生物获得壳聚糖功能化纳米硒复合物；
(6)将壳聚糖功能化纳米硒复合物与枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、腐殖酸混合，即可得壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。
作为优选，上述的步骤(6)为将壳聚糖功能化纳米硒复合物与枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、亚硒酸钠、碘化钾、氯化锌盐、腐殖酸及去离子水混合，即可得壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。
本发明第三方面提供一种包含上述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的产品；优选的，所述的产品为微生物肥料或生物农药；更优选的，所述的产品为叶面肥。
本发明还提供了上述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系在制备促进植物吸收硒元素/提高植物产量/调节植物生长/防治植物病虫害/提高植物抗病性产品中的一种或多种应用。
本发明还提供了上述的产品在促进植物吸收硒元素/提高植物产量/调节植物生长/防治植物病虫害/提高植物抗病性过程中的一种或多种应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，该体系含有高效的光合、生长活性微生物，还含有丰富有机质(以腐殖酸作为有机质)和微量元素硒，可保证有足够的养分满足作物生长发育的需要，提高作物的产量，同时促进植物吸收硒元素，改善作物品质。实验证明，与其他常见的体系及产品相比，本发明的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系及包含该体系的产品使用的菌种更优，成分明确，且各个组成成分简单易得，来源广，成本低，并且有效地提升了植物中硒的含量，此外壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对植物富硒度的提升是通过有机硒富集效应来实现的。
2、进一步地，本发明惊奇地发现，以腐殖酸作为有机质，氯化锌盐作为营养调节剂，亚硒酸钠含有微量元素，以之作为硒源，碘化钾作为稳定剂，枯草芽孢杆菌与乳酸片球菌组成的复合菌与微量元素、有机质、营养调节剂、硒源、稳定剂混合后，复合菌被吸附在有机质中，无机元素被掺混在有机质中，体系中各个组分相互作用、激活，起到增效、互作、强化的效果，这些作用是单个元素或单类肥料成份难以达到的。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
本发明实施例提供一种壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，包含枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、腐殖酸和壳聚糖功能化纳米硒复合物。所述的壳聚糖功能化纳米硒复合物为表面经壳聚糖或壳聚糖衍生物功能化修饰的纳米硒。
上述的壳聚糖衍生物是指以壳聚糖为母体，对其中的原子或原子团用其他原子或原子团取代所形成的化合物，如N-三甲基壳聚糖、羧甲基壳聚糖、N，O-羧甲基壳聚糖、羟丙基壳聚糖等。壳聚糖和壳聚糖衍生物的分子链上都具有丰富的羟基和氨基，使其具有良好的组织相容性，生物可降解性，本发明采用壳聚糖或壳聚糖衍生物功能化修饰纳米硒正是利用了这一共通的性质。作为优选，所述的壳聚糖衍生物为羧甲基壳聚糖。
本发明提供的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，该体系含有高效的光合、生长活性微生物，还含有丰富有机质(以腐殖酸作为有机质)和微量元素硒，可保证有足够的养分满足作物生长发育的需要，提高作物的产量，同时促进植物吸收硒元素，改善作物品质。实验证明，与其他常见的体系及产品相比，本发明的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系及包含该体系的产品使用的菌种更优，成分明确，且各个组成成分简单易得，来源广，成本低，并且有效地提升了植物中硒的含量，此外壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对植物富硒度的提升是通过有机硒富集效应来实现的。
作为优选，上述的枯草芽孢杆菌为在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的编号为CGMCCNo.1.1630的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)；上述的乳酸片球菌为在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的编号为CGMCCNo.1.2696的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)。
作为优选，上述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系中，所述的枯草芽孢杆菌∶乳酸片球菌∶腐殖酸∶壳聚糖功能化纳米硒复合物的质量比为(1.6-3)∶(0.1-1)∶(10-60)∶(0.1-1)。
所述的枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌的质量比为具体为发酵液的质量比，其中枯草芽孢杆菌发酵液的菌含量为8×107cfu/g，乳酸片球菌发酵液的菌含量为7×107cfu/g。
上述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，该体系含有高效的光合、生长活性微生物，还含有丰富有机质(以腐殖酸作为有机质)和微量元素硒，可保证有足够的养分满足作物生长发育的需要，提高作物的产量，同时促进植物吸收硒元素，改善作物品质。实验证明，与其他常见的体系及产品相比，本发明的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系及包含该体系的产品使用的菌种更优，成分明确，且各个组成成分简单易得，来源广，成本低，并且有效地提升了植物中硒的含量，此外壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对植物富硒度的提升是通过有机硒富集效应来实现的。
作为优选，上述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系还包括亚硒酸钠、碘化钾和氯化锌盐。
上述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系以腐殖酸作为有机质，氯化锌盐作为营养调节剂，亚硒酸钠含有微量元素，以之作为硒源，碘化钾作为稳定剂，枯草芽孢杆菌与乳酸片球菌组成的复合菌与微量元素、有机质、营养调节剂、硒源、稳定剂混合后，发明人惊奇的发现，复合菌被吸附在有机质中，无机元素被掺混在有机质中，体系中各个组分相互作用、激活，起到增效、互作、强化的效果，这些作用是单个元素或单类肥料成份难以达到的。
作为优选，上述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系包含以下质量比的组分：
所述的枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌的质量比为具体为发酵液的质量比，其中枯草芽孢杆菌发酵液的菌含量为8×107cfu/g，乳酸片球菌发酵液的菌含量为7×107cfu/g。
与其他常见的体系及产品相比，例如与一种小麦富硒锌铁微生物发酵肥料(配比为：亚硒酸盐0.0005～0.110份、锌盐0.2～0.3份、亚铁盐0.35～0.5份、稻壳30～45份、鸡粪35～50份、菌糠20～30份、菜粕2.5～3.5份、棉粕4～6份、豆粕2.5～3.5份、发酵剂0.05～0.1份)相比，上述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系使用的菌种更优，同时成分明确，且各个组成成分简单易得，来源广，成本低。
本发明第二方面提供了一种上述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备方法，包括以下步骤：
(1)将亚硒酸钠溶液与碘化钾溶液混合，加入水搅拌均匀；
(2)加入抗坏血酸溶液，进行反应；
(3)静置老化；
(4)离心后除去上清液，洗涤除去未反应的杂质；
(5)纳米硒粒子重新分散成溶胶，添加壳聚糖或其衍生物获得壳聚糖功能化纳米硒复合物；
(6)将壳聚糖功能化纳米硒复合物与枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、腐殖酸混合，即可得壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。
在一个优选方案中，上述的步骤(6)为将壳聚糖功能化纳米硒复合物与枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、亚硒酸钠、碘化钾、氯化锌盐、腐殖酸及去离子水混合，即可得壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。
在另一个优选方案中，所述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备方法，包括以下步骤：
(1)将浓度为10-30mmol/L的亚硒酸钠溶液与浓度为20-40mmol/L的碘化钾溶液按1∶1(v/v)混合，加入亚硒酸钠溶液20-40(v/v)倍的水，搅拌均匀；
(2)加入与亚硒酸钠溶液等体积的浓度为50-70mmol/L的抗坏血酸溶液，反应20-40分钟；
(3)静置老化24小时，得浅红色透明胶体溶液；
(4)8000-10000转/分钟的转速下离心20-40分钟除去上清液，水洗和醇洗除去未反应的杂质；
(5)纳米硒粒子重新分散成溶胶，分别添加不同浓度梯度的壳聚糖或羧甲基壳聚糖获得不同壳聚糖功能化纳米硒复合物；所述壳聚糖或羧甲基壳聚糖的浓度梯度分别为0.01，0.08，0.16，0.32，0.48，0.64mg/ml。
(6)将壳聚糖功能化纳米硒复合物与枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、亚硒酸钠、碘化钾、氯化锌盐、去离子水混合，质量比为壳聚糖功能化纳米硒复合物∶枯草芽孢杆菌∶乳酸片球菌∶亚硒酸钠∶碘化钾∶氯化锌盐∶腐殖酸∶去离子水＝(0.1-1)∶(1.6-3)∶(0.1-1)∶(1-1.5)∶(0.1-1)∶(0.1-1)∶(10-60)∶(40-70)，即可得壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。
由上述方法制备的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，亚硒酸钠含有微量元素，以之作为硒源，碘化钾为稳定剂，抗坏血酸为还原剂，合成粒径为50nm的纳米硒粒子，随后通过离心、洗涤获得纯化的纳米硒粒子，并用壳聚糖或其衍生物功能化修饰纳米硒粒子，使纳米硒粒子表面改性，提高了纳米硒粒子的生物相容性。
本发明第三方面提供一种包含上述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的产品。作为优选，所述的产品为微生物肥料或生物农药。更优选叶面肥。通过机械掺混和生物活动的方法制成的富硒生态叶面肥料，具有高效的光合、生长活性微生物，还含有丰富有机质和微量元素硒，可保证有足够的养分满足作物生长发育的需要，同时改善作物品质。上述的产品有效地提升了植物中硒的含量，并且对植物富硒度的提升是通过有机硒富集效应来实现的。上述的产品与市场上常见的产品相比使用的菌种更优，同时成分明确，且各个组成成分简单易得，来源广，成本低。
此外，使用本发明的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系或产品可有效降低植物的病虫害发病率，提高植物的抗病性。
本发明还提供了上述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系在制备促进植物吸收硒元素/提高植物产量/调节植物生长/防治植物病虫害/提高植物抗病性产品中的一种或多种应用。
本发明还提供了上述的产品在促进植物吸收硒元素/提高植物产量/调节植物生长/防治植物病虫害/提高植物抗病性过程中的一种或多种应用。
上述的调节植物生长具体可为促进植物的营养生长和/或生殖生长。所述的营养生长可为根系的生长、茎的生长和果实的生长中的一种或多种。根系的生长具体可体现在侧根数量上，茎的生长具体可体现在茎的直径上，果实的生长具体可体现在果实的大小或成熟上。所述植物为种子植物，所述生殖生长可体现在果实成熟和/或果实数量上。
以下采取各种实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌如无特殊说明，均为可从商业途径得到的枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌。下述实施例中的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCCNo.1.1630于1983年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，自该保藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心获得该菌株。下述实施例中的乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)CGMCCNo.1.2696于2000年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，自该保藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心获得该菌株。
下述实施例中的1号培养基为中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为2006的玉米琼脂培养基。2号培养基为中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为0006的MRS培养基。
下述实施例中的腐殖酸购自阿法埃莎化学有限公司，货号为41747。
实施例1壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备
(1)、菌的活化与扩大培养
活化：将枯草芽孢杆菌接种在1号培养基上，置于30℃培养箱培养3天；将乳酸片球菌接种在2号培养基上，置于30℃培养箱培养3天；分别得到枯草芽孢杆菌发酵液(1×109cfu/g)和乳酸片球菌发酵液(1×109cfu/g)。
扩大培养：将上述的活化的枯草芽孢杆菌和活化的乳酸片球菌分别接入二个分别装有1号培养基、2号培养基的发酵罐中，均在30℃进行静止逐级扩大培养，扩大培养过程中接种量为7.5％(体积百分比含量)。枯草芽孢杆菌发酵液中菌含量为8×107cfu/g，乳酸片球菌发酵液中菌含量为7×107cfu/g。
(2)、将按照步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵液和乳酸片球菌发酵液按质量比2∶0.1的比例进行混合，得到发酵混合液。
(3)、有机质溶液的制备：向水中加入腐殖酸，得到腐殖酸浓度为35％(质量百分比浓度)的液体。
(4)、将浓度为20mmol/L的亚硒酸钠溶液与浓度为30mmol/L的碘化钾溶液按1∶1(v/v)混合，加入亚硒酸钠溶液30(v/v)倍的水，搅拌均匀；
(5)、加入与亚硒酸钠溶液等体积的浓度为60mmol/L的抗坏血酸溶液，反应30分钟；
(6)、静置老化24小时，得浅红色透明胶体溶液；
(7)、10000转/分钟的转速下离心30分钟除去上清液，水洗和醇洗除去未反应的杂质；
(8)、纳米硒粒子重新分散成溶胶，添加浓度为0.32mg/ml的壳聚糖获得表面功能化纳米硒复合物。
(9)、将上述功能化纳米硒复合物与枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵混合液、有机质溶液混合，质量比为功能化纳米硒复合物∶枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵混合液∶有机质溶液＝0.1∶2.1∶60，即可得所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。
实施例2壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备
(1)、菌的活化与扩大培养
活化：将枯草芽孢杆菌接种在1号培养基上，置于30℃培养箱培养3天；将乳酸片球菌接种在2号培养基上，置于30℃培养箱培养3天；分别得到枯草芽孢杆菌发酵液(1×109cfu/g)和乳酸片球菌发酵液(1×109cfu/g)。
扩大培养：将上述的活化的枯草芽孢杆菌和活化的乳酸片球菌分别接入二个分别装有1号培养基、2号培养基的发酵罐中，均在30℃进行静止逐级扩大培养，扩大培养过程中接种量为7.5％(体积百分比含量)。枯草芽孢杆菌发酵液中菌含量为8×107cfu/g，乳酸片球菌发酵液中菌含量为7×107cfu/g。
(2)、将按照步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵液和乳酸片球菌发酵液按质量比3∶1的比例进行混合，得到发酵混合液。
(3)、有机质溶液的制备：向水中加入腐殖酸，得到腐殖酸浓度为35％(质量百分比浓度)的液体。
(4)、将浓度为30mmol/L的亚硒酸钠溶液与浓度为40mmol/L的碘化钾溶液按1∶1(v/v)混合，加入亚硒酸钠溶液40(v/v)倍的水，搅拌均匀；
(5)、加入与亚硒酸钠溶液等体积的浓度为70mmol/L的抗坏血酸溶液，反应40分钟；
(6)、静置老化24小时，得浅红色透明胶体溶液；
(7)、8000转/分钟的转速下离心40分钟除去上清液，水洗和醇洗除去未反应的杂质；
(8)、纳米硒粒子重新分散成溶胶，添加浓度为0.64mg/ml的壳聚糖获得表面功能化纳米硒复合物。
(9)、将上述功能化纳米硒复合物与枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵混合液、有机质溶液混合，质量比为功能化纳米硒复合物∶枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵混合液∶有机质溶液＝0.5∶4∶10，即可得所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。
实施例3壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备
(1)、菌的活化与扩大培养
活化：将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCCNo.1.1630接种在1号培养基上，置于30℃培养箱培养3天；将乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)CGMCCNo.1.2696接种在2号培养基上，置于30℃培养箱培养3天；分别得到枯草芽孢杆菌发酵液(1×109cfu/g)和乳酸片球菌发酵液(1×109cfu/g)。
扩大培养：将上述的活化的枯草芽孢杆菌和活化的乳酸片球菌分别接入二个分别装有1号培养基、2号培养基的发酵罐中，均在30℃进行静止逐级扩大培养，扩大培养过程中接种量为7.5％(体积百分比含量)。枯草芽孢杆菌发酵液中菌含量为8×107cfu/g，乳酸片球菌发酵液中菌含量为7×107cfu/g。
(2)、将按照步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵液和乳酸片球菌发酵液按质量比1.6∶0.4的比例进行混合，得到发酵混合液。
(3)、有机质溶液的制备：向水中加入腐殖酸，得到腐殖酸浓度为35％(质量百分比浓度)的液体。
(4)、将浓度为20mmol/L的亚硒酸钠溶液与浓度为30mmol/L的碘化钾溶液按1∶1(v/v)混合，加入亚硒酸钠溶液30(v/v)倍的水，搅拌均匀；
(5)、加入与亚硒酸钠溶液等体积的浓度为60mmol/L的抗坏血酸溶液，反应30分钟；
(6)、静置老化24小时，得浅红色透明胶体溶液；
(7)、10000转/分钟的转速下离心30分钟除去上清液，水洗和醇洗除去未反应的杂质；
(8)、纳米硒粒子重新分散成溶胶，添加浓度为0.32mg/ml的壳聚糖获得表面功能化纳米硒复合物。
(9)、将上述功能化纳米硒复合物与枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵混合液、有机质溶液混合，质量比为功能化纳米硒复合物∶枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵混合液∶有机质溶液＝1∶2∶60，即可得所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。
实施例4壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备
(1)、菌的活化与扩大培养
活化：将枯草芽孢杆菌接种在1号培养基上，置于30℃培养箱培养3天；将乳酸片球菌接种在2号培养基上，置于30℃培养箱培养3天；分别得到枯草芽孢杆菌发酵液(1×109cfu/g)和乳酸片球菌发酵液(1×109cfu/g)。
扩大培养：将上述的活化的枯草芽孢杆菌和活化的乳酸片球菌分别接入二个分别装有1号培养基、2号培养基的发酵罐中，均在30℃进行静止逐级扩大培养，扩大培养过程中接种量为7.5％(体积百分比含量)。枯草芽孢杆菌发酵液中菌含量为8×107cfu/g，乳酸片球菌发酵液中菌含量为7×107cfu/g。
(2)、将按照步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵液和乳酸片球菌发酵液按质量比2∶0.1的比例进行混合，得到发酵混合液。
(3)、有机质溶液的制备：向水中加入腐殖酸，得到腐殖酸浓度为35％(质量百分比浓度)的液体。
(4)、将浓度为20mmol/L的亚硒酸钠溶液与浓度为30mmol/L的碘化钾溶液按1∶1(v/v)混合，加入亚硒酸钠溶液30(v/v)倍的水，搅拌均匀；
(5)、加入与亚硒酸钠溶液等体积的浓度为60mmol/L的抗坏血酸溶液，反应30分钟；
(6)、静置老化24小时，得浅红色透明胶体溶液；
(7)、10000转/分钟的转速下离心30分钟除去上清液，水洗和醇洗除去未反应的杂质；
(8)、纳米硒粒子重新分散成溶胶，添加浓度为0.32mg/ml的壳聚糖获得表面功能化纳米硒复合物。
(9)、将上述功能化纳米硒复合物与枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵混合液、亚硒酸钠、碘化钾、氯化锌盐、有机质溶液、去离子水混合，质量比为功能化纳米硒复合物∶枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵混合液∶亚硒酸钠∶碘化钾∶氯化锌盐∶有机质溶液∶去离子水＝0.1∶2.1∶1∶0.1∶0.1∶60∶40，即可得所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。
实施例5壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备
(1)、菌的活化与扩大培养
活化：将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCCNo.1.1630接种在1号培养基上，置于30℃培养箱培养3天；将乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)CGMCCNo.1.2696接种在2号培养基上，置于30℃培养箱培养3天；分别得到枯草芽孢杆菌发酵液(1×109cfu/g)和乳酸片球菌发酵液(1×109cfu/g)。
扩大培养：将上述的活化的枯草芽孢杆菌和活化的乳酸片球菌分别接入二个分别装有1号培养基、2号培养基的发酵罐中，均在30℃进行静止逐级扩大培养，扩大培养过程中接种量为7.5％(体积百分比含量)。枯草芽孢杆菌发酵液中菌含量为8×107cfu/g，乳酸片球菌发酵液中菌含量为7×107cfu/g。
(2)、将按照步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵液和乳酸片球菌发酵液按质量比3∶1的比例进行混合，得到发酵混合液。
(3)、有机质溶液的制备：向水中加入腐殖酸，得到腐殖酸浓度为35％(质量百分比浓度)的液体。
(4)、将浓度为10mmol/L的亚硒酸钠溶液与浓度为20mmol/L的碘化钾溶液按1∶1(v/v)混合，加入亚硒酸钠溶液20(v/v)倍的水，搅拌均匀；
(5)、加入与亚硒酸钠溶液等体积的浓度为50mmol/L的抗坏血酸溶液，反应20分钟；
(6)、静置老化24小时，得浅红色透明胶体溶液；
(7)、8000转/分钟的转速下离心40分钟除去上清液，水洗和醇洗除去未反应的杂质；
(8)、纳米硒粒子重新分散成溶胶，添加浓度为0.01mg/ml的羧甲基壳聚糖获得表面功能化纳米硒复合物。
(9)、将上述功能化纳米硒复合物与枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵混合液、亚硒酸钠、碘化钾、氯化锌盐、有机质溶液、去离子水混合，质量比为功能化纳米硒复合物∶枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵混合液∶亚硒酸钠∶碘化钾∶氯化锌盐∶有机质溶液∶去离子水＝0.5∶4∶1.5∶1∶1∶10∶70，即可得所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。
实施例6壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备
(1)、菌的活化与扩大培养
活化：将枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCCNo.1.1630接种在1号培养基上，置于30℃培养箱培养3天；将乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)CGMCCNo.1.2696接种在2号培养基上，置于30℃培养箱培养3天；分别得到枯草芽孢杆菌发酵液(1×109cfu/g)和乳酸片球菌发酵液(1×109cfu/g)。
扩大培养：将上述的活化的枯草芽孢杆菌和活化的乳酸片球菌分别接入二个分别装有1号培养基、2号培养基的发酵罐中，均在30℃进行静止逐级扩大培养，扩大培养过程中接种量为7.5％(体积百分比含量)。枯草芽孢杆菌发酵液中菌含量为8×107cfu/g，乳酸片球菌发酵液中菌含量为7×107cfu/g。
(2)、将按照步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵液和乳酸片球菌发酵液按质量比1.6∶0.4的比例进行混合，得到发酵混合液。
(3)、有机质溶液的制备：向水中加入腐殖酸，得到腐殖酸浓度为35％(质量百分比浓度)的液体。
(4)、将浓度为20mmol/L的亚硒酸钠溶液与浓度为30mmol/L的碘化钾溶液按1∶1(v/v)混合，加入亚硒酸钠溶液30(v/v)倍的水，搅拌均匀；
(5)、加入与亚硒酸钠溶液等体积的浓度为60mmol/L的抗坏血酸溶液，反应30分钟；
(6)、静置老化24小时，得浅红色透明胶体溶液；
(7)、10000转/分钟的转速下离心30分钟除去上清液，水洗和醇洗除去未反应的杂质；
(8)、纳米硒粒子重新分散成溶胶，添加浓度为0.32mg/ml的壳聚糖获得表面功能化纳米硒复合物。
(9)、将上述功能化纳米硒复合物与枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵混合液、亚硒酸钠、碘化钾、氯化锌盐、有机质溶液、去离子水混合，质量比为功能化纳米硒复合物∶枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵混合液∶亚硒酸钠∶碘化钾∶氯化锌盐∶有机质溶液∶去离子水＝1∶2∶1.5∶1∶1∶60∶70，即可得所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。
实施例7壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对甜瓜的产量及富硒度的影响
田间试验设计如下：实验采用随机区组设计，设置3个重复区，每个重复区随机设置3个处理区，分别为处理区1、处理区2和对照区。每个处理区的面积均为0.5亩，每个处理区均生长有10株出苗后15天的甜瓜(Cucumismelo)。本实施例中，田间实验土壤湿度为16％-18％，气温为20-30℃。
实验步骤：
1.处理区1：对处理区1进行以下处理：将实施例1制得的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液灌根施用，每株甜瓜150mL壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液，每15天灌根一次，每次每株甜瓜壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液灌根的体积均为150mL。
2.处理区2：对处理区2进行以下处理：富硒营养液灌根施用，每株甜瓜150mL富硒营养液，每15天灌根一次，每次每株甜瓜富硒营养液灌根的体积均为150mL。
3.对照区：按照上述处理区的处理方法，将壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液替换为水，其他均采用农户习惯的田间管理方法，常规农药、化肥、农家肥等照常施用。
表1壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对提高甜瓜的产量及富硒度的影响
| 项目 | 产量(公斤/亩) | 硒含量(mg/Kg) |
| 处理组1 | 3700 | 0.31 |
| 处理组2 | 3430 | 0.23 |
| 对照组 | 3250 | 0.02 |
通过实验结果可见相对于对照组，处理组1的甜瓜产量大于处理组2和对照组，且处理组1中甜瓜的硒含量远大于处理组2和对照组。
实施例8壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对甜瓜的产量及富硒度的影响
田间试验设计如下：实验采用随机区组设计，设置3个重复区，每个重复区随机设置2个处理区，分别为实验处理区和对照区。每个处理区的面积均为0.5亩，每个处理区均生长有10株出苗后15天的甜瓜(Cucumismelo)。本实施例中，田间实验土壤湿度为16％-18％，气温为20-30℃。
实验步骤：
1.实验处理区：对实验处理区进行以下处理：将实施例3制得的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液灌根施用，每株甜瓜150mL壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液，每15天灌根一次，每次每株甜瓜壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液灌根的体积均为150mL。
2.对照区：按照上述处理区的处理方法，将壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液替换为水，其他均采用农户习惯的田间管理方法，常规农药、化肥、农家肥等照常施用。
表2壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对提高甜瓜的产量及富硒度的影响
| 项目 | 产量(公斤/亩) | 硒含量(mg/Kg) |
| 实验处理组 | 3820 | 0.33 |
| 对照组 | 3250 | 0.02 |
通过实验结果可见相对于对照组，实验处理组的甜瓜产量大于对照组，甜瓜的硒含量远大于对照组。
实施例9壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对猕猴桃产量及富硒度的影响
田间试验设计如下：实验采用随机区组设计，设置2个重复区，每个重复区随机设置3个处理区，分别为处理区1、处理区2和对照区。每个处理区的面积均为0.5亩，每个处理区均生长有10株出苗后15天的猕猴桃(kiwifruit)。本实施例中，田间实验土壤湿度为16％-18％，气温为20-30℃。
实验步骤
1.处理区1：对实验处理区进行以下处理：将实施例3制得的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系稀释200倍，从坐果期到果实膨大期喷施4次，亩单次使用13袋(规格75ml/袋，120袋/箱)，晴天使用，喷至叶双面均湿，略有水珠，但不滴下为宜，不可与其他农药、肥混用。
2.处理区2：按照实施例3的方法，将第(2)步枯草芽孢杆菌发酵液和乳酸片球菌发酵液混合的质量比改为0.1∶2；将第(9)步混合各组分的质量比改为功能化纳米硒复合物∶枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵混合液∶有机质溶液＝0.01∶2.1∶200，其他步骤与实施例3的制备步骤完全相同，按照该方法制备得到壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，将该体系稀释200倍，从坐果期到果实膨大期喷施4次，亩单次使用13袋(规格75ml/袋，120袋/箱)，晴天使用，喷至叶双面均湿，略有水珠，但不滴下为宜，不可与其他农药、肥混用。
3.对照区：按照上述实验处理区的处理方法，将壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液替换为水，其他均采用农户习惯的田间管理方法，常规农药、化肥、农家肥等照常施用。
表3壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对猕猴桃产量及富硒度的影响
| 项目 | 产量(公斤/亩) | 硒含量(mg/Kg) |
| 处理组1 | 1977 | 0.35 |
| 处理组2 | 1695 | 0.09 |
| 对照组 | 1662 | 0.04 |
通过实验结果可见，处理组1和处理组2的猕猴桃产量均大于对照组，且都提升了猕猴桃中硒的含量。处理组1的猕猴桃产量和含硒量远大于处理组2。
实施例10壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对甜瓜的产量及富硒度的影响
田间试验设计如下：实验采用随机区组设计，设置3个重复区，每个重复区随机设置2个处理区，分别为处理区1、处理区2。每个处理区的面积均为0.5亩，每个处理区均生长有10株出苗后15天的甜瓜(Cucumismelo)。本实施例中，田间实验土壤湿度为16％-18％，气温为20-30℃。
实验步骤：
1.处理区1：对处理区1进行以下处理：将实施例1制得的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液灌根施用，每株甜瓜150mL壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液，每15天灌根一次，每次每株甜瓜壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液灌根的体积均为150mL。
2.处理区2：对处理区2进行以下处理：将实施例3制得的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液灌根施用，每株甜瓜150mL壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液，每15天灌根一次，每次每株甜瓜壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液灌根的体积均为150mL。
表4壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对提高甜瓜的产量及富硒度的影响
| 项目 | 产量(公斤/亩) | 硒含量(mg/Kg) |
| 处理组1 | 3700 | 0.31 |
| 处理组2 | 3940 | 0.38 |
通过实验结果可见相对于处理组1，处理组2的甜瓜产量更大，含硒量更高。
实施例11壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系系对主粮杂粮(水稻)产量及富硒度的影响
田间试验设计如下：实验采用随机区组设计，设置3个重复区，每个重复区随机设置3个处理区，分别为处理区1、处理区2和对照区。每个处理区的面积均为0.5亩，每个处理区均生长有10株出苗后15天的水稻(rice)。本实施例中，田间实验土壤湿度为16％-18％，气温为20-30℃。
实验步骤
1.处理区1：对处理区进行以下处理：使用实施例6制得的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，灌浆前后连续喷三次，单次亩用量3袋(75ml/袋，120袋/箱)，晴天使用，喷至叶双面均湿，略有水珠，但不滴下为宜，不可与其他农药、肥混用。
2.处理区2：按照实施例6的方法，将第(2)步枯草芽孢杆菌发酵液和乳酸片球菌发酵液混合的质量比改为0.1∶2；将第(9)步混合各组分的质量比改为功能化纳米硒复合物∶枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌发酵混合液∶亚硒酸钠∶碘化钾∶氯化锌盐∶有机质溶液∶去离子水＝0.02∶2.1∶8∶10∶10∶80∶20，其他步骤与实施例3的制备步骤完全相同，按照该方法制备得到壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，使用该壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，灌浆前后连续喷三次，单次亩用量3袋(75ml/袋，120袋/箱)，晴天使用，喷至叶双面均湿，略有水珠，但不滴下为宜，不可与其他农药、肥混用。
3.对照区：按照上述实验处理区的处理方法，将壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液替换为水，其他均采用农户习惯的田间管理方法，常规农药、化肥、农家肥等照常施用。
表5壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对主粮杂粮(水稻)产量及富硒度的影响
| 项目 | 产量(公斤/亩) | 硒含量(mg/Kg) |
| 处理组1 | 593 | 0.43 |
| 处理组2 | 497 | 0.07 |
| 对照组 | 478 | 0.03 |
通过实验结果可见相对于对照组2，处理组1和处理组2的水稻产量均大于对照组，且水稻中硒的含量也大于对照组。处理组1的水稻的产量和含硒量大于处理组2。
实施例12壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对麦芽苗富硒度的影响
田间试验设计如下：实验采用随机区组设计，设置3个重复区，每个重复区随机设置2个处理区，分别为实验处理区和对照区。每个处理区的面积均为0.5亩，每个处理区均生长有10株出苗后15天的麦芽苗(Maltseedling)。本实施例中，田间实验土壤湿度为16％-18％，气温为20-30℃。
实验步骤
1.实验处理区：对处理区进行以下处理：将实施例6制得的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系稀释200倍，发芽前用稀释液浸泡，生长期用稀释液喷洒3次。
2.对照区：按照上述实验处理区的处理方法，将壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液替换为水，其他均采用习惯的生产管理方法。
表6壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对麦芽苗富硒度的影响
| 项目 | 有机硒含量(mg/kg) | 无机硒含量(mg/kg) |
| 实验处理组 | 22.5 | 0 |
| 对照组 | 0.01 | 0.01 |
采用新鲜的麦芽苗，进行冷冻干燥和粉碎后，测定干燥的麦芽粉中有机硒含量，达到106mg/kg(合106μg/g)以上。通过实验结果可见相对于对照组，处理组大大增加了麦芽苗中硒的含量，且壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对富硒度的提升是通过有机硒富集效应来实现的。
实施例13壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对甜瓜抗病性的影响
田间试验设计如下：实验采用随机区组设计，设置3个重复区，每个重复区随机设置2个处理区，分别为实验处理区和对照区。每个处理区的面积均为0.5亩，每个处理区均生长有10株出苗后15天的甜瓜(Cucumismelo)。本实施例中，田间实验土壤湿度为16％-18％，气温为20-30℃。
实验步骤：
1.实验处理区：对处理区进行以下处理：将实施例6制得的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液灌根施用，每株甜瓜150mL壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液，每15天灌根一次，每次每株甜瓜壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液灌根的体积均为150mL。
2.对照区：按照上述处理区的处理方法，将壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液替换为水，其他均采用农户习惯的田间管理方法，常规农药、化肥、农家肥等照常施用。
从壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系悬浮液灌根第一天开始，连续20天每天统计甜瓜白粉病的发病株数(表7)。
表7甜瓜白粉病的平均发病株数(株)
| 时间 | 处理区 | 对照区 |
| 第1天 | 0 | 0 |
| 第2天 | 0 | 0 |
| 第3天 | 1 | 1 |
| 第4天 | 1 | 1 |
| 第5天 | 1 | 1 |
| 第6天 | 1 | 2 |
| 第7天 | 1 | 2 |
| 第8天 | 1 | 3 |
| 第9天 | 1 | 3 |
| 第10天 | 1 | 4 |
| 第11天 | 1 | 4 |
| 第12天 | 2 | 4 |
| 第13天 | 2 | 5 |
| 第14天 | 2 | 5 |
| 第15天 | 2 | 5 |
| 第16天 | 2 | 6 |
| 第17天 | 2 | 6 |
| 第18天 | 2 | 6 |
| 第19天 | 2 | 6 |
| 第20天 | 3 | 6 |
与对照区相比，实验处理区的甜瓜白粉病发病株数降低，在灌根第20天，实验处理区的甜瓜白粉病发病株数为对照处理区的50％，表明使用壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系降低了甜瓜白粉病的发病率，说明壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系可以提高甜瓜的抗病性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，其特征在于，包括枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、腐殖酸和壳聚糖功能化纳米硒复合物；所述的壳聚糖功能化纳米硒复合物为表面经壳聚糖或其衍生物功能化修饰的纳米硒。
2.根据权利要求1所述的一种壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)CGMCCNo.1.1630；所述乳酸片球菌为乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)CGMCCNo.1.2696。
3.根据权利要求1或2所述的一种壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌∶乳酸片球菌∶腐殖酸∶壳聚糖功能化纳米硒复合物的质量比为(1.6-3)∶(0.1-1)∶(10-60)∶(0.1-1)。
4.根据权利要求1或2所述的一种壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，其特征在于还包括亚硒酸钠、碘化钾和氯化锌盐。
5.根据权利要求4所述的一种壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，其特征在于包含以下质量比的组分：
。
6.一种权利要求1-5任一项所述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)将亚硒酸钠溶液与碘化钾溶液混合，加入水搅拌均匀；
(2)加入抗坏血酸溶液，进行反应；
(3)静置老化；
(4)离心后除去上清液，洗涤除去未反应的杂质；
(5)纳米硒粒子重新分散成溶胶，添加壳聚糖或其衍生物获得壳聚糖功能化纳米硒复合物；
(6)将壳聚糖功能化纳米硒复合物与枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、腐殖酸混合，即可得壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。
7.如权利要求6所述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备方法，其特征在于，所述的步骤(6)为将壳聚糖功能化纳米硒复合物与枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、亚硒酸钠、碘化钾、氯化锌盐、腐殖酸及去离子水混合，即可得壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。
8.一种包含权利要求1-5任一项所述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的产品；优选的，所述的产品为微生物肥料或生物农药；更优选的，所述的产品为叶面肥。
9.权利要求1-5任一项所述的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系在制备促进植物吸收硒元素/提高植物产量/调节植物生长/防治植物病虫害/提高植物抗病性产品中的一种或多种应用。
10.权利要求8所述的产品在促进植物吸收硒元素/提高植物产量/调节植物生长/防治植物病虫害/提高植物抗病性过程中的一种或多种应用。
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