CN111848303A - 壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系在提高茶叶产量和品质中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系在提高茶叶产量和品质中的用途，本发明利用叶面喷施或根施的方式，将壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系用于茶叶的种植中，其显著提高了茶叶的产量；同时茶叶中的酚类、黄酮和茶香物质含量增加，苦涩味下降，茶叶的抗氧化性增强，有效改善了茶叶的耐冲泡性；另外还可改善茶叶中的蛋白质、茶多酚、总黄酮和维生素C等物质含量水平，提高了茶叶中的营养物质含量。

Description

壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系在提高茶叶产量和品质中 的用途

技术领域

本发明涉及茶叶种植，尤其涉及壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系在提高茶叶产量和品质中的用途。

背景技术

茶叶中含有儿茶素、胆甾烯酮、咖啡碱、肌醇、叶酸、泛酸等成分，可以增进人体健康，因此茶叶饮品-茶又被誉为“世界三大饮料之一”。

硒元素是动物和人体中一些抗氧化酶(谷胱甘肽过氧化物酶)和硒-P蛋白的重要组成部分，在体内起着平衡氧化还原氛围的作用，研究证明具有提高动物免疫力作用，在国际上硒对于免疫力影响和癌症预防的研究是该领域的热点问题。

因此，目前在茶叶种植技术中，人们开始研究如何种植一种富硒茶叶来实现茶叶更好的保健价值，例如CN105145264B中公开了富硒茶叶的种植方法，其通过在茶叶种植时采用选择阳坡、酸性砖红壤的缓坡山地等高处种植，将茶树苗按一定规格进行种植并在坑内设置缓释装置，每两周向每个缓释装置中灌富硒营养液，并配合施加有机硒肥，从而获得硒含量较高的茶叶，以满足人们对硒营养的需求，其所采用的富硒营养液是将水、硒酸钾、生化黄腐酸钾和沼液混合发酵得到，采用的有机硒肥则是将豆渣、粪便、硒矿石、生物蛋白以及纤维素降解菌混合发酵得到。由于其施用富硒营养液时需用到缓释装置，而不通过缓释装置释放富硒营养液，采用喷施法，会大大降低茶叶中硒的含量，因此对设备的要求较高，而且无论是富硒营养液还是有机硒肥，其制备方法都相对复杂。

CN101779556B中公开了一种生产富有机硒碧螺春的方法，其采用将纳米硒植物营养剂与土壤拌合得到的富硒营养剂施入茶园；第二年2-3月期间茶叶萌芽后，追加富硒营养剂施入茶园茶树根部，从而实现了茶叶富含有机硒，其中纳米硒植物营养剂选自苏州硒谷科技有限公司生产的型号为XGP001A。

在富硒茶叶种植中，大家更多的关注点是放在茶叶中硒元素含量的提高上，而对于如何提高茶叶的其它品质，例如抗氧化性、耐冲泡性以及茶叶中各营养物质含量水平，均还没有相关文献进行披露。

茶叶的冲泡性，是指茶叶在冲泡多次后是否会出现茶汤明显变淡、水味变淡的情况。而茶叶耐不耐冲泡，一方面与原料有关，一般来说，茶树有乔木、小灌木、灌木，其中乔木茶因为根系发达，能吸收到更深层土壤的养分，相对来说也会更耐泡一些；树龄越老滋味越醇厚，茶越耐泡；还与茶叶生产环境、原料采摘嫩度、茶叶加工工艺以及冲泡方法有关。

由于绿茶原料一般较嫩，嫩芽的酚氨比很高，鲜美清香，然而绿茶属于不耐泡的茶；而乌龙茶采到一芽三四叶，芽叶连枝，叶片有一定的成熟度，其中的茶梗也含有丰富的有效成分，故乌龙茶比较耐泡。而绿茶又是人们日常比较常喝到的茶叶品种，因此，如何提高这类茶叶的耐冲泡性已成为目前亟待解决的技术问题。

由于茶叶的抗氧化性以及茶叶中各营养物质含量水平，与茶叶的耐冲泡性都属于茶叶重要的品质特征，因此，如何着重提升这三大类品质已成为茶叶种植中重要的研究方向。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系在提高茶叶产量和品质中的用途，主要用于提高茶叶的产量、抗氧化性、耐冲泡性以及茶叶中主要营养物质含量水平。通过将壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系应用于茶叶种植中，其显著提高了茶叶的产量；同时茶叶中的酚类、黄酮和茶香物质含量增加，苦涩味下降，茶叶的抗氧化性增强，有效改善了茶叶的耐冲泡性；另外还可改善茶叶中的蛋白质、茶多酚、总黄酮和维生素C等物质含量水平，提高了茶叶中的营养物质含量。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

本发明提供了一种壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系在提高茶叶产量和品质中的用途。

本发明中所提及的茶叶品质是指茶叶的抗氧化性、耐冲泡性或茶叶中的营养物质含量。

本发明中的茶叶品种优选为绿茶。

本发明中，通过将壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系用于茶叶的种植中，其显著提高了茶叶的产量，其相对于清水对照可实现增产19.2％；另外，其提高了茶叶中的酚类、黄酮和茶香物质含量，苦涩味下降，茶叶的抗氧化性增强，有效改善了茶叶的耐冲泡性，尤其是对绿茶的耐冲泡性有很大的提高，其能够使得绿茶在冲泡四次后，茶汤颜色仍能表现出淡黄色的茶汤颜色；再有，其还可改善茶叶中的蛋白质、茶多酚、总黄酮和维生素C等物质含量水平，提高了茶叶中的营养物质含量。

优选地，在提高茶叶产量和品质时，具体操作是：茶叶新芽未长出之前，在茶叶植株上或茶叶的生长场所施用所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。

优选地，所述施用的时期为每年的3月10日至3月20日之间并且当地温度在5～10℃。

在该施用时期，更有利于茶叶吸收所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，从而更进一步地提高茶叶中的酚类、黄酮和茶香物质含量，使得茶叶具有更好的耐冲泡性。

优选地，所述施用的方式分为根施和叶面喷施。

优选地，采用根施时，所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶的施用浓度为60～70mg/kg，例如可以是60mg/kg、65mg/kg或70mg/kg；每亩施用总量为7～8g，例如可以是7g、7.5g或8g。

优选地，采用叶面喷施时，所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶的施用浓度为12～15mg/kg，例如可以是12mg/kg、14mg/kg或15mg/kg；每亩施用总量为7～8g，例如可以是7g、7.5g或8g。

优选地，采用叶面喷施时，需连续施用2～6次，每次喷施间隔7～10天。

优选地，所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系包括：枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、腐殖酸和壳聚糖功能化纳米硒复合物；所述枯草芽孢杆菌:乳酸片球菌:腐殖酸:壳聚糖功能化纳米硒复合物的溶液质量比为(1.6～3):(0.1～1):(10～60):(0.1～1)；

所述枯草芽孢杆菌的溶液为枯草芽孢杆菌发酵液，菌含量为8×10⁷cfu/g，所述乳酸片球菌的溶液为乳酸片球菌发酵液，菌含量为7×10⁷cfu/g；所述腐殖酸的溶液中腐殖酸的质量百分比浓度为35％；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.1.1630；所述乳酸片球菌为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CGMCCNo.1.2696。

其中，所述壳聚糖功能化纳米硒复合物为表面经壳聚糖或其衍生物功能化修饰的纳米硒。

优选地，所述壳聚糖功能化纳米硒复合物制备过程中添加壳聚糖或其衍生物浓度为0.01mg/mL～0.64mg/mL，例如可以是0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.3mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL或0.64mg/mL。

本发明中的壳聚糖衍生物例如可以是羧甲基壳聚糖。

优选地，所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系包含以下质量比的组分：

本发明中，所述壳聚糖功能化纳米硒复合物的含量为0.3～1份，例如可以是0.3份、0.5份、0.8份或1份；所述枯草芽孢杆菌的含量为1.6～3份，例如可以是1.6份、2份、2.5份或3份；所述乳酸片球菌的含量为0.4～1份，例如可以是0.4份、0.5份、0.8份或1份；所述亚硒酸钠的含量为0.9～1.5份，例如可以是0.9份、1.0份、1.2份、1.4份或1.5份。

本发明中，所述碘化钾的含量为1.0～1.7份，例如可以是1.0份、1.2份、1.4份、1.5份或1.7份；所述氯化锌盐的含量为0.2～0.6份，例如可以是0.2份、0.3份、0.5份或0.6份；所述腐殖酸的含量为20～60份，例如可以是20份、25份、30份、35份、40份、45份、50份、55份或60份；所述去离子水的含量为40～70份，例如可以是40份、45份、50份、55份、60份、65份或70份。

其中氯化锌盐具体可以选自六水合氯化锌。

优选地，所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备方法包括以下步骤：

(1)将亚硒酸钠溶液与碘化钾溶液混合，加入去离子水搅拌均匀；

(2)加入抗坏血酸溶液，进行反应；

(3)静置老化；

(4)离心后除去上清液，洗涤除去未反应的杂质；

(5)纳米硒粒子重新分散成溶胶，添加壳聚糖或其衍生物获得壳聚糖功能化纳米硒复合物；

(6)将壳聚糖功能化纳米硒复合物与枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、腐殖酸、氯化锌盐以及步骤(4)经洗涤除去未反应杂质后得到的溶液进行混合，即得壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。

优选地，所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备方法，具体包括以下步骤：

(1)将浓度为10～30mmol/L的亚硒酸钠溶液与浓度为20～40mmol/L的碘化钾溶液按1:1(v/v)混合，加入亚硒酸钠溶液20～40(v/v)倍的水，搅拌均匀；

(2)加入与亚硒酸钠溶液等体积的浓度为50～70mmol/L的抗坏血酸溶液，反应20～40分钟；

(3)静置老化24小时，得浅红色透明胶体溶液；

(4)8000～10000转/分钟的转速下离心20～40分钟除去上清液，水洗和醇洗除去未反应的杂质；

(5)纳米硒粒子重新分散成溶胶，分别添加不同浓度梯度的壳聚糖或羧甲基壳聚糖获得不同的壳聚糖功能化纳米硒复合物；所述壳聚糖或羧甲基壳聚糖的浓度梯度分别为0.01mg/mL、0.08mg/mL、0.16mg/mL、0.32mg/mL、0.48mg/mL、0.64mg/mL；

(6)将壳聚糖功能化纳米硒复合物与枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、腐殖酸、氯化锌盐、步骤(4)经洗涤除去未反应杂质后得到的溶液和去离子水混合，即可得到所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系；其中，壳聚糖功能化纳米硒复合物:枯草芽孢杆菌:乳酸片球菌:亚硒酸钠:碘化钾:氯化锌盐:腐殖酸:去离子水的质量比为(0.3～1):(1.6～3):(0.4～1):(0.9～1.5):(1.0～1.7):(0.2～0.6):(20～60):(40～70)。

由上述方法制备得到的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系，亚硒酸钠含有微量元素，将其作为硒源，碘化钾为稳定剂，抗坏血酸为还原剂；合成纳米硒粒子，随后通过离心、洗涤获得纯化的纳米硒粒子，并用壳聚糖或其衍生物功能化修饰纳米硒粒子，使纳米硒粒子表面改性，提高了纳米硒粒子的生物相容性。

本发明所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备方法中，亚硒酸钠溶液的浓度为10～30mmol/L，例如可以是10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L或30mmol/L；所述碘化钾溶液的浓度为20～40mmol/L，例如可以是20mmol/L、25mmol/L、30mmol/L、35mmol/L或40mmol/L。

所述转速为8000～10000转/分钟，例如可以是8000转/分钟、9000转/分钟或10000转/分钟，离心时间为20～40分钟，例如可以是20分钟、30分钟或40分钟。

与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：

(1)本发明中通过将壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系用于茶叶的种植中，其显著提高了茶叶的产量，相比清水对照可增产19.2％以上；

(2)本发明中通过将壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系用于茶叶的种植中，可提高茶叶中的酚类、黄酮和茶香物质含量，使苦涩味下降，茶叶的抗氧化性增强，有效改善了茶叶的耐冲泡性；

(3)本发明中通过将壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系用于茶叶的种植中，可改善茶叶中的蛋白质、茶多酚、总黄酮和维生素C等物质含量水平，提高了茶叶中的营养物质含量。

附图说明

图1A是本发明应用例1中提供的采用对照组喷施后的茶叶生长情况；

图1B是本发明应用例1中提供的采用壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液喷施后的茶叶生长情况；

图2是本发明应用例1中提供的采用壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液和对照组喷施后茶叶在浸泡0小时、6小时、24小时和72小时的茶汤颜色对比；

图3是本发明应用例1中提供的采用浓度为2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液和对照组喷施茶叶所产生的MDA水平对比；

图4是本发明应用例1中提供的采用浓度为2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液和对照组喷施茶叶所产生的营养成分含量水平对比，其中图4-1是蛋白质(Protein)含量对比，图4-2是茶多酚(Tea Polyphenols)含量对比，图4-3是总黄酮(Total flavonoid)含量对比，图4-4是维生素C(Vitamin C)含量对比；

图5是本发明应用例1中提供的采用壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液和对照组处理后的茶叶经四次冲泡后的茶汤颜色对比，其中图5-1是第一次冲泡对比，图5-2是第二次冲泡对比，图5-3是第三次冲泡对比，图5-4是第四次冲泡对比。

下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌如无特殊说明，均为可从商业途径得到。下述实施例中的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.1.1630于1983年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，自该保藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心获得该菌株。

下述实施例中的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CGMCCNo.1.2696于2000年11月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，自该保藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心获得该菌株。

下述实施例中的1号培养基为中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为2006的玉米琼脂培养基；2号培养基为中国普通微生物菌种保藏管理中心编号为0006的MRS培养基。

下述实施例中的腐殖酸购自阿法埃莎化学有限公司，货号为41747。

实施例1壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备

(1)菌的活化与扩大培养

(a)活化：将枯草芽孢杆菌接种在1号培养基上，置于30℃培养箱培养3天，将乳酸片球菌接种在2号培养基上，置于30℃培养箱培养3天，分别得到枯草芽孢杆菌发酵液(1×10⁹cfu/g)和乳酸片球菌发酵液(1×10⁹cfu/g)。

(b)扩大培养：将上述活化的枯草芽孢杆菌发酵液和乳酸片球菌发酵液分别接入两个分别装有1号培养基、2号培养基的发酵罐中，均在30℃进行静止逐级扩大培养，扩大培养过程中接种量为7.5％(体积百分比含量)。枯草芽孢杆菌发酵液中菌含量为8×10⁷cfu/g，乳酸片球菌发酵液中菌含量为7×10⁷cfu/g；

(2)将步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵液和乳酸片球菌发酵液按质量比1.6:1的比例进行混合，得到发酵混合液；

(3)向去离子水中加入腐殖酸，得到腐殖酸浓度为35％(质量百分比浓度)的有机质溶液；

(4)将浓度为20mmol/L的亚硒酸钠溶液与浓度为30mmol/L的碘化钾溶液按1:1(v/v)混合，加入亚硒酸钠溶液30(v/v)倍的水，搅拌均匀；

(5)按照滴加速率为0.6mL/min和搅拌转速为500r/min的操作，加入与亚硒酸钠溶液等体积的浓度为50mmol/L的抗坏血酸溶液，反应30分钟；

(6)在室温(28℃)下静置老化24小时，得浅红色透明胶体溶液；

(7)在10000转/分钟的转速下离心30分钟除去上清液，水洗和醇洗除去未反应的杂质；

(8)纳米硒粒子重新分散成溶胶，添加浓度为0.32mg/mL的壳聚糖获得壳聚糖功能化纳米硒复合物；

(9)将步骤(8)得到的壳聚糖功能化纳米硒复合物与步骤(2)得到的枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌的发酵混合液、步骤(3)得到的有机质溶液、六水合氯化锌、步骤(7)经除去未反应杂质得到的溶液和去离子水混合，得到所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系；其中，壳聚糖功能化纳米硒复合物:枯草芽孢杆菌发酵液:乳酸片球菌发酵液:亚硒酸钠:碘化钾:六水合氯化锌:腐殖酸:去离子水的质量比为0.5:1.6:1:1:1.6:0.2:40:55。

实施例2壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备

(1)菌的活化与扩大培养

(a)活化：将枯草芽孢杆菌接种在1号培养基上，置于30℃培养箱培养3天，将乳酸片球菌接种在2号培养基上，置于30℃培养箱培养3天，分别得到枯草芽孢杆菌发酵液(1×10⁹cfu/g)和乳酸片球菌发酵液(1×10⁹cfu/g)。

(b)扩大培养：将上述活化的枯草芽孢杆菌发酵液和乳酸片球菌发酵液分别接入两个分别装有1号培养基、2号培养基的发酵罐中，均在30℃进行静止逐级扩大培养，扩大培养过程中接种量为7.5％(体积百分比含量)。枯草芽孢杆菌发酵液中菌含量为8×10⁷cfu/g，乳酸片球菌发酵液中菌含量为7×10⁷cfu/g；

(2)将按照步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵液和乳酸片球菌发酵液按质量比3:1的比例进行混合，得到发酵混合液；

(3)向去离子水中加入腐殖酸，得到腐殖酸浓度为35％(质量百分比浓度)的有机质溶液；

(4)将浓度为30mmol/L的亚硒酸钠溶液与浓度为40mmol/L的碘化钾溶液按1:1(v/v)混合，加入亚硒酸钠溶液40(v/v)倍的水，搅拌均匀；

(5)按照滴加速率为0.3mL/min和搅拌转速为1000r/min的操作，加入与亚硒酸钠溶液等体积的浓度为60mmol/L的抗坏血酸溶液，反应40分钟；

(6)在50℃下静置老化24小时，得浅红色透明胶体溶液；

(7)在8000转/分钟的转速下离心40分钟除去上清液，水洗和醇洗除去未反应的杂质；

(8)纳米硒粒子重新分散成溶胶，添加浓度为0.64mg/mL的壳聚糖获得壳聚糖功能化纳米硒复合物；

(9)将步骤(8)得到的壳聚糖功能化纳米硒复合物与步骤(2)得到的枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌的发酵混合液、步骤(3)得到的有机质溶液、六水合氯化锌、步骤(7)经除去未反应杂质得到的溶液和去离子水混合，得到所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系；其中，壳聚糖功能化纳米硒复合物:枯草芽孢杆菌发酵液:乳酸片球菌发酵液:亚硒酸钠:碘化钾:六水合氯化锌:腐殖酸:去离子水的质量比为0.3:3:1:1:1.4:0.5:20:70。

实施例3壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备

(1)菌的活化与扩大培养

(a)活化：将枯草芽孢杆菌接种在1号培养基上，置于30℃培养箱培养3天，将乳酸片球菌接种在2号培养基上，置于30℃培养箱培养3天，分别得到枯草芽孢杆菌发酵液(1×10⁹cfu/g)和乳酸片球菌发酵液(1×10⁹cfu/g)。

(b)扩大培养：将上述活化的枯草芽孢杆菌发酵液和乳酸片球菌发酵液分别接入两个分别装有1号培养基、2号培养基的发酵罐中，均在30℃进行静止逐级扩大培养，扩大培养过程中接种量为7.5％(体积百分比含量)。枯草芽孢杆菌发酵液中菌含量为8×10⁷cfu/g，乳酸片球菌发酵液中菌含量为7×10⁷cfu/g；

(2)将步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵液和乳酸片球菌发酵液按质量比1.6:0.4的比例进行混合，得到发酵混合液；

(3)向去离子水中加入腐殖酸，得到腐殖酸浓度为35％(质量百分比浓度)的有机质溶液；

(4)将浓度为20mmol/L的亚硒酸钠溶液与浓度为30mmol/L的碘化钾溶液按1:1(v/v)混合，加入亚硒酸钠溶液30(v/v)倍的水，搅拌均匀；

(5)按照滴加速度速率为0.3mL/min和搅拌转速为1000r/min的操作，加入与亚硒酸钠溶液等体积的浓度为70mmol/L的抗坏血酸溶液，反应30分钟；

(6)在室温(28℃)下静置老化24小时，得浅红色透明胶体溶液；

(7)在10000转/分钟的转速下离心30分钟除去上清液，水洗和醇洗除去未反应的杂质；

(8)纳米硒粒子重新分散成溶胶，添加浓度为0.64mg/ml的壳聚糖获得壳聚糖功能化纳米硒复合物；

(9)将步骤(8)得到的壳聚糖功能化纳米硒复合物与步骤(2)得到的枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌的发酵混合液、步骤(3)得到的有机质溶液、六水合氯化锌、步骤(7)经除去未反应杂质得到的溶液和去离子水混合，得到所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系；其中，壳聚糖功能化纳米硒复合物:枯草芽孢杆菌发酵液:乳酸片球菌发酵液:亚硒酸钠:碘化钾:六水合氯化锌:腐殖酸:去离子水的质量比为0.8:1.6:0.4:1:1.6:0.6:55:45。

实施例4壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备

(1)菌的活化与扩大培养

(a)活化：将枯草芽孢杆菌接种在1号培养基上，置于30℃培养箱培养3天，将乳酸片球菌接种在2号培养基上，置于30℃培养箱培养3天，分别得到枯草芽孢杆菌发酵液(1×10⁹cfu/g)和乳酸片球菌发酵液(1×10⁹cfu/g)。

(b)扩大培养：将上述活化的枯草芽孢杆菌发酵液和乳酸片球菌发酵液分别接入两个分别装有1号培养基、2号培养基的发酵罐中，均在30℃进行静止逐级扩大培养，扩大培养过程中接种量为7.5％(体积百分比含量)。枯草芽孢杆菌发酵液中菌含量为8×10⁷cfu/g，乳酸片球菌发酵液中菌含量为7×10⁷cfu/g；

(2)将按照步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌发酵液和乳酸片球菌发酵液按质量比2:0.5的比例进行混合，得到发酵混合液。

(3)向去离子水中加入腐殖酸，得到腐殖酸浓度为35％(质量百分比浓度)的有机质溶液；

(4)将浓度为20mmol/L的亚硒酸钠溶液与浓度为30mmol/L的碘化钾溶液按1:1(v/v)混合，加入亚硒酸钠溶液30(v/v)倍的水，搅拌均匀；

(5)按照滴加速度速率为0.6mL/min和搅拌转速为500r/min的操作，加入与亚硒酸钠溶液等体积的浓度为60mmol/L的抗坏血酸溶液，反应30分钟；

(6)在50℃下静置老化24小时，得浅红色透明胶体溶液；

(7)在10000转/分钟的转速下离心30分钟除去上清液，水洗和醇洗除去未反应的杂质；

(8)纳米硒粒子重新分散成溶胶，添加浓度为0.32mg/mL的羧甲基壳聚糖获得表面功能化纳米硒复合物；

(9)将上述步骤(8)得到的壳聚糖功能化纳米硒复合物与步骤(2)得到的枯草芽孢杆菌和乳酸片球菌的发酵混合液、步骤(3)得到的有机质溶液、六水合氯化锌、步骤(7)经除去未反应杂质得到的溶液和去离子水混合，得到所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系；其中，壳聚糖功能化纳米硒复合物:枯草芽孢杆菌发酵液:乳酸片球菌发酵液:亚硒酸钠:碘化钾:六水合氯化锌:腐殖酸:去离子水的质量比为1:2:0.5:1:1.6:0.3:30:60。

以下将采用实施例3中制备得到的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系进行相关的应用试验。

应用例1壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系对提高茶叶的影响

首先，将壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系用于茶叶种植中，操作如下：

田间试验设计：

试验材料：实施例3中制备得到的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系(以下统一简称为“纳米硒”)、地标牌、手动喷雾器、3年茶树，茶树品种为安吉白茶。

分组设置：试验设置处理区和对照区，具体为：

(1)对照区：采用常规水肥管理，喷施纳米硒时对照组喷施清水；

(2)处理区：实施例3中制备得到的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液按照每亩每次8g、终浓度15mg/kg进行叶面喷施；间隔10天喷施一次，共喷施两次。

于3月21日和3月25日在试验区域进行试验结果观察，并拍摄照片，生长状况具体如图1A和图1B所示。由该图1A和图1B可以看出，相比采用对照组处理的茶叶，采用壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液处理的茶叶，其表现出提前发芽、叶片肥亮等优势。

进一步地，图2示出了采用壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液和对照组处理后的茶叶叶片面积的对比，由该图明显可以看出，采用壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液处理后的茶叶叶片要大于对照组，经测定，采用处理组和对照组的亩产量如表1所示。由表1明显可以看出，采用处理组收获的茶叶产量相对于对照组处理可实现增产19.2％。

表1

处理	产量(kg/亩)	比CK增产(kg)	增产率(％)
				CK	120	-	-
处理组	143	23	19.2

将上述两种处理后收获的茶叶制成可以饮用的茶叶后，对其分别进行冲泡试验，结果如图2所示，当浸泡0小时、6小时、24小时和72小时，采用壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液处理的茶叶，其在浸泡72小时后茶汤仍保持色泽清亮，氧化程度很低，而采用对照组处理后的茶叶，其在浸泡72小时后茶汤出现了严重的氧化，并且茶叶赤化，不再具有绿茶原本的茶汤颜色。

由此也可以说明，通过采用壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液处理的茶叶，其能够更好地保持绿茶原本的茶汤色泽，具有更好的抗氧化性能，并且更具有耐冲泡性。

对将上述两种处理后收获的茶叶进行酚类、黄酮和茶香物质含量的测定，具体结果如表2所示。

表2

序号	香气成分化合物	对照组处理后茶叶(％)	纳米硒处理后茶叶(％)
				1	正戊醛	2.27	0.61
2	正己醛	9.62	7.63
				3	2，3-二甲基-2-戊烯	5.01	4.69
4	丁醇	4.07	3.65
				5	β-蒎烯	2.99	7.80
6	正庚醛	5.93	5.90
				7	青叶醇	5.06	11.52
8	正辛醛	0.72	0.10
				9	7-十三烷酮	3.85	1.69
10	6-甲基-5-庚烯-2-酮	3.71	2.82
				11	十二醛	0.45	0.24
12	芳樟醇氧化物Ⅰ	8.33	5.49
				13	芳樟醇氧化物Ⅱ	12.63	10.34
14	1-壬烯	1.54	1.43
				15	芳樟醇	4.78	11.26
16	甲基苯基肟	1.34	1.84
				17	1-乙基吡咯-2-甲醛	0.84	1.58
18	苯乙醛	2.63	3.06
				19	水杨酸甲酯	0.61	0.29
20	芳樟醇氧化物Ⅱ	2.25	0.83
				21	2-甲基丁酸甲酯	3.84	1.60
22	苯酚	0.60	0.49
				24	苯乙醇	-	2.26
23	香茅醛	0.42	0.87
				24	去氢白菖烯	-	1.71
25	茉莉酮	4.70	5.46
				26	β-紫罗酮	1.07	0.57
27	吲哚	10.02	3.31
				28	2,4-二叔丁基-苯酚	0.74	1.06

由表2中的数据对比可以看出，采用壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液处理后的茶叶，相比采用对照组，其能够使得β-蒎烯、青叶醇、芳樟醇、甲基苯基肟、1-乙基吡咯-2-甲醛、苯乙醛、香茅醛、茉莉酮和2,4-二叔丁基-苯酚这些组分的含量有大幅提高，而产生苦涩味的吲哚含量大大降低，从而使得茶叶具有更好的品质和口感。

将实施例3制备得到的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液设置为2.5mg/kg、5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg这4个不同的浓度对茶叶进行叶面喷施，并设置对照组(处理组喷施纳米硒时，对照组喷施清水)，喷施4次，每次间隔7天。

图3示出了采用上述浓度下的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液和对照组喷施茶叶所产生的MDA水平对比，由该图可以看出，通过喷施所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液，相比对照组，其能够抑制氧化损伤(MDA下降)，能够显著提升鲜茶的抗氧化能力。

图4示出了采用上述浓度下的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液和对照组喷施茶叶所产生的各营养物质含量对比，由图4-1至4-4均可以看出，通过喷施所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液，相比对照组，其能够使得茶叶中的蛋白质、茶多酚、总黄酮和维生素C含量均有所增加，从而提高了茶叶的营养物质含量。

将采摘的茶叶进行冲泡性测试，具体操作如下：

田间试验设计：

在示范区域内将长势相同的茶树划分处理组及对照组，茶叶采收前40～50天内开始施用，叶面施用最后一次5～7天开始采茶。具体操作为：

(1)处理组：在茶叶采收前40-50天内，采用实施例3中制备的壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液以叶面喷施的方式，每季使用5次，每次每亩用量为1.5g(以硒计)，间隔10天；在第一次喷施后3天进行灌根，每亩地每季施用1次，每次8g(以硒计)，其他田间操作按以往常规种植方式进行；

(2)对照组(CK)：采用清水喷施，其他田间操作按以往常规种植方式进行。

将上述处理组和对照组的茶叶采收后制作成品茶，通过冲泡，观察茶叶的耐冲泡性。

冲泡方法：

(1)分别称量重量相同的处理组和对照组的茶叶；

(2)将茶叶置于透明玻璃杯中，加入落了滚的开水(纯净水)，加水量保持一致，1分钟后观察茶汤颜色，并拍照记录；

(3)将茶杯中的水沥干，重新加入开水，浸泡1分钟，观察茶汤颜色，并拍照记录；

(4)重复步骤(3)至其中至茶汤出现无色。

图5示出了采用处理组和对照组处理后的茶叶经四次冲泡后的茶水颜色对比。其中，图5-1和图5-2中显示对照组和处理组的第一泡和第二泡茶汤颜色基本一致，图5-3中显示第三泡的茶汤颜色处理组表现出更深的颜色，图5-4中显示第四泡时对照组的茶汤呈无色，而处理组的茶汤颜色还表现出明显的淡黄色。

由此也可以说明，本发明中所采用的经壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系营养液处理后的茶叶，其表现出更好的耐冲泡性。

综上可以看出，本发明中通过利用叶面喷施或根施的方式，将壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系用于茶叶尤其是绿茶的种植中，显著提高了茶叶的产量；同时茶叶中的酚类、黄酮和茶香物质含量增加，苦涩味下降，茶叶的抗氧化性增强，有效改善了茶叶的耐冲泡性；另外还可改善茶叶中的蛋白质、茶多酚、总黄酮和维生素C等物质含量水平，提高了茶叶中的营养物质含量，使得茶叶具有更高的品质。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (8)

1.壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系在提高茶叶产量和品质中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述茶叶品质为茶叶的抗氧化性、耐冲泡性或茶叶中的营养物质含量；

优选地，所述茶叶为绿茶。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于，茶叶新芽未长出之前，在茶叶植株上或茶叶的生长场所施用所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系；

优选地，所述施用的时期为每年的3月10日至3月20日之间并且当地温度在5～10℃；

优选地，所述施用的方式分为根施和叶面喷施。

4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，采用根施时，所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶的施用浓度为60～70mg/kg，每亩施用总量为7～8g；

优选地，采用叶面喷施时，所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶的施用浓度为12～15mg/kg，每亩施用总量为7～8g；

优选地，采用叶面喷施时，需连续施用2～6次，每次喷施间隔7～10天。

5.根据权利要求1-4任一项所述的用途，其特征在于，所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系包括：枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、腐殖酸和壳聚糖功能化纳米硒复合物；所述枯草芽孢杆菌:乳酸片球菌:腐殖酸:壳聚糖功能化纳米硒复合物的溶液质量比为(1.6～3):(0.1～1):(10～60):(0.1～1)；

所述枯草芽孢杆菌的溶液为枯草芽孢杆菌发酵液，菌含量为8×10⁷cfu/g，所述乳酸片球菌的溶液为乳酸片球菌发酵液，菌含量为7×10⁷cfu/g；所述腐殖酸的溶液中腐殖酸的质量百分比浓度为35％；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.1.1630；所述乳酸片球菌为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)CGMCCNo.1.2696。

6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述壳聚糖功能化纳米硒复合物制备过程中添加壳聚糖或其衍生物浓度为0.01mg/mL～0.64mg/mL。

7.根据权利要求5或6所述的用途，其特征在于，所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系包含以下质量比的组分：

8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系的制备方法包括以下步骤：

(1)将亚硒酸钠溶液与碘化钾溶液混合，加入去离子水搅拌均匀；

(2)加入抗坏血酸溶液，进行反应；

(3)静置老化；

(4)离心后除去上清液，洗涤除去未反应的杂质；

(5)纳米硒粒子重新分散成溶胶，添加壳聚糖或其衍生物获得壳聚糖功能化纳米硒复合物；

(6)将壳聚糖功能化纳米硒复合物与枯草芽孢杆菌、乳酸片球菌、腐殖酸、氯化锌盐以及步骤(4)经洗涤除去未反应杂质后得到的溶液进行混合，即得所述壳聚糖功能化纳米硒复合菌酶体系。

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