CN104774094B

CN104774094B - 复合微生物海藻肥的制备方法

Info

Publication number: CN104774094B
Application number: CN201510152232.3A
Authority: CN
Inventors: 王熙涛; 徐永平; 续彦龙; 龚改林; 王丽丽; 李晓宇; 车鉴
Original assignee: Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology
Priority date: 2015-04-01
Filing date: 2015-04-01
Publication date: 2018-04-27
Anticipated expiration: 2035-04-01
Also published as: CN104774094A

Abstract

本发明公开了一种复合微生物海藻肥的制备方法，采用筛选出的具有高褐藻酸裂解酶活性的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WB1及可产生多种抑菌素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ABTNL‑2对经微切助互作技术处理过的海藻进行发酵，产生大量对农作物生长具有促进作用的海藻寡糖等小分子特效代谢产物，提高海藻肥料的生物活性。与此同时，发挥解淀粉芽孢杆菌WB1和枯草芽孢杆菌ABTNL‑2可以抑制多种农作物病原菌的优势，在提供海藻肥料高营养附加值的同时，又起到改良土壤性状，防止多种病害的“药肥合一”的复合功效。

Description

复合微生物海藻肥的制备方法

技术领域

本发明涉及肥料技术领域，更具体地说，涉及一种复合微生物海藻肥的制备方法。

背景技术

化肥的长期大量使用已经逐渐造成土壤贫瘠、板结，营养失衡等问题的出现，而农药的长期滥用也导致了致病菌抗药性增强，污染环境等严重问题。为保证农业的高速可持续绿色发展，目前，我国农业部已经越来越重视有机肥料的使用，并提出逐步减少化肥及农药在农业中的使用量。海藻富含多种营养成分，是制造天然有机肥的上佳原料，其经发酵降级的小分子寡糖类内溶物中含有天然的植物生长调节剂，具有很高的生理活性，促进光合作用，调节内源激素的平衡。海藻肥含有的糖醛酸苷类物质，能改良土壤性状，提高土壤保水能力，改善土壤团粒结构，刺激植物根系及有益微生物的生长。然而，目前利用微生物充分发酵海藻以有效释放其营养物质还存在困难，因为海藻中含有大量难以被分解的多糖类物质及高浓度的盐。现阶段，发酵法制备海藻肥还存在很多缺陷，一是缺乏高效降解海藻多糖且可以直接用作菌肥的有效菌种；二是发酵菌种单一，缺乏多菌种间的协同作用，难以有效降解海藻内大分子物质，影响海藻肥的应用效果；三是为保证发酵效果，缺乏对海藻原料的有效预处理技术，传统的酸碱法处理海藻，会破坏海藻中营养元素，并对环境造成污染。

发明内容

本发明针对现有技术中传统化学肥料和普通发酵法制备海藻肥料的不足，利用筛选到的两株可产多种有益代谢产物的芽孢杆菌发酵制备复合微生物海藻肥料，经过微切助技术处理之后，海藻原料中的营养成分可被充分释放更易于微生物的利用和降解，极大提高了海藻肥料的品质。而肥料中含有的有益微生物解淀粉芽孢杆菌WB1和ABTNL-2广泛的抑菌活性又可以一定程度上防治农作物的多种病害问题，减少农药的使用，起到“药肥合一”的复合功效。

为了达到上述目的，本发明一种复合微生物海藻肥的制备方法，包括如下步骤：

S1、取解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WB1(保藏号CGMCCNo.8873)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ABTNL-2(保藏号CGMCC NO.10038)，分别以种子培养基比发酵培养基体积比5～10％的比例接种到海藻发酵培养基中，发酵培养得到发酵液；其中，所述种子培养基中菌体浓度10⁹～10¹⁰CFU mL^-1；

S2、将S1所得发酵液于0～4℃、6000～8000rpm离心，收集上清液；

S3、将S2所得上清液用0.22μm滤膜进行过滤，收集滤出液，得海藻液体肥；

S4、收集S2离心后的固形物，25～35℃风干，得海藻固体肥。

其中，本发明复合微生物海藻肥的制备方法，步骤S1所述海藻培养基的获得包括如下步骤：

S11、海带原料，干燥至含水量不高于10％，粉碎至40～60目；

S12、加入质量分数1～2％的海藻酸钠，混匀；

S13、利用高能振动磨产生的微剪切作用对S12中原料处理5～30分钟，得600～800目海带粉；

S14、步骤S13所得海带粉3～5％、尿素0.1～0.3％、NaCl 2～2.5％、蔗糖0.1～0.25％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钙0.01％，加入蒸馏水，混合，经121℃灭菌20分钟。

优选方式下，步骤S1中所述发酵条件为：发酵温度25～37℃，发酵初始pH 7.5，200r min^-1发酵72～108h。最优方式下，两种种子培养基的接种比例相当。

此外，所述解淀粉芽孢杆菌WB1(保藏号CGMCC No.8873)和枯草芽孢杆菌ABTNL-2(保藏号CGMCC NO.10038)经活化获得种子培养基。活化菌种的培养基：过80目筛的海带粉1％，蛋白胨0.5％，NaCl 2％、蔗糖0.25％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钙0.01％，蒸馏水配置，经121℃灭菌20分钟。

与现有技术相比，本发明的优势和积极效果为：本发明从海泥中筛选得到可以高效降解海藻多糖的解淀粉芽孢杆菌WB1和枯草芽孢杆菌ABTNL-2，此两种菌株含有丰富的糖苷酶活性和蛋白酶活性，能有效对海藻进行发酵，产生高浓度有利于植物生长的小分子褐藻寡糖类物质。微切助技术处理过的海藻超微粉提升了营养物质的释放，再经复合菌株发酵后，极大增强了海藻肥料的肥效。此外，解淀粉芽孢杆菌WB 1和枯草芽孢杆菌ABTNL-2具有广泛的抑菌谱，可一定程度上防治多种植物病害，减少农药的使用，起到“药肥合一”的复合功效。

本发明可提高土壤肥力，有利于土壤形成团粒结构从而改良土壤性状，促进植物种子萌发及生长，增强植物抗逆能力，安全环保，改善产品品质，使产品达到绿色或有机标准。

本发明提供的复合微生物海藻肥液体肥料可直接作用于植物，含有活性解淀粉芽孢杆菌WB1和枯草芽孢杆菌ABTNL-2的海藻菌肥可用于土壤基肥或生产复合肥。

保藏说明

本发明涉及的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WB1，已于2014年2月27日于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏(简称CGMCC；地址：中国科学院微生物研究所；邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.8873。

本发明涉及的微生物(株)为ABTNL-2，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，于2014年11月21日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号CGMCC NO.10038。CGMCC地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

具体实施方式

本发明技术方案如下：

一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WB1，菌种保藏编号为：CGMCC No.8873，革兰氏染色阳性，杆状，菌落表面粗糙，有隆起，边缘不规则，可降解海藻多糖，分泌多种糖苷酶和蛋白酶，具有广泛的抑菌活性。

解淀粉芽孢杆菌WB1特征如下：白色，半透明，光滑湿润菌落，稍隆起，圆形齐整菌落；革兰氏染色阳性，细胞呈杆状，运动，好氧，可耐1％～10％NaCl浓度，最佳生长温度为30℃，在褐藻胶选择性培养基上菌落形态为白色，圆形，边缘整齐，最适生长pH为7.0～7.5，最适生长温度25～35℃。

利用16S通用引物对该菌株进行PCR扩增得到16SrDNA序列，将所得结果在genbank进行同源序列比对，该菌株与解淀粉芽孢杆菌属(Bacillus amyloliquefaciens)的基因组99％相似，由此可以确定该菌株属于解淀粉芽孢杆菌属。

一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ABTNL-2，菌种保藏编号为：CGMCCNO.10038，革兰氏染色阳性，杆状，菌落相对较大，表面粗糙，边缘不规则，菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质对多种致病菌有明显的抑制作用。

取解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WB1和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ABTNL-2，活化后，等比例接种于海藻培养基中，半固体发酵培养得到发酵液。发酵液于4℃，1000g离心，收集上清液。上清液用0.22μm滤膜过滤，收集滤出液，得到海藻液体肥，富含褐藻寡糖。而离心后含有活性解淀粉芽孢杆菌WB1和枯草芽孢杆菌ABTNL-2的海藻肥固形物，低温烘干，得海藻固体肥，用于复混肥的生产。

其中，所述解淀粉芽孢杆菌WB1和枯草芽孢杆菌ABTNL-2经活化获得。活化菌种的培养基：过80目筛的海带粉1％，蛋白胨0.5％，NaCl 2％、蔗糖0.25％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钙0.01％，蒸馏水配置，经121℃灭菌20分钟。

而用于制备发酵液的所述海藻培养基主要成分是经过微切助互作技术处理的海带边角料超微粉，由如下步骤获得：

1)预处理海带原料，干燥至含水量不高于10％，粗粉碎至40～60目；

2)加入质量分数为1～2％的海藻酸钠作为助剂，置于搅拌机中充分混匀；

3)利用高能振动磨产生的微剪切作用对2)中原料进行处理，处理时间为5～30分钟，得到600～800目的微切超微海带粉原料。

海藻培养基的优选制备方法：微切助技术处理的海带粉3～5％、尿素0.1～0.3％、NaCl 2～2.5％、蔗糖0.1～0.25％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钙0.01％蒸馏水配置，经121℃、20分钟灭菌后使用。利用所述优选海藻培养基制备发酵液，其发酵条件为：发酵温度25～37℃，发酵初始pH 7.5，200r min^-1发酵72～108h。

经上述步骤，制得的所述海藻液体肥中寡糖终浓度>500mg L^-1；所述海藻固体肥中的有效活菌数>7×108CFU g^-1，有机质含量>30％。

实施例1

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)WB1，菌种保藏编号为：CGMCC No.8873，革兰氏染色阳性，杆状，菌落表面粗糙，有隆起，边缘不规则，可降解海藻多糖，分泌多种糖苷酶和蛋白酶，具有广泛的抑菌活性。

2.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)ABTNL-2，菌种保藏编号为：CGMCCNO.10038，革兰氏染色阳性，杆状，菌落相对较大，表面粗糙，边缘不规则，菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质对多种致病菌有明显的抑制作用。

3.将步骤1和步骤2中的两株芽孢杆菌活化后，分别以5％(V/V)的等比例接种量接种到海藻发酵培养基中等比例，半固体发酵培养得到发酵液

4.将步骤3中得到的发酵液于4℃，8000rpm离心，收集上清液；

5.将步骤4中上清液用0.22μm滤膜进行过滤，收集滤出液，得到含有褐藻寡糖的液体肥，即海藻液体肥，待用。

6.步骤3中活化菌种的培养基成分为：过80目筛的海带粉1％，蛋白胨0.5％，NaCl2％、蔗糖0.25％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钙0.01％，蒸馏水配置，经121℃，20分钟灭菌后使用。

7.步骤3中海藻培养基主要成分是经过微切助互作技术处理的海带边角料超微粉，其特征在于如下步骤：

2)加入质量分数为1％～2％的海藻酸钠作为助剂，置于搅拌机中充分混匀；

8.步骤3中的海藻培养基为：微切助技术处理的海带粉3～5％、尿素0.1～0.3％、NaCl 2～2.5％、蔗糖0.1～0.25％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钙0.01％蒸馏水配置，经121℃、20分钟灭菌后使用。

9.步骤3中所述发酵条件为：发酵温度25～37℃，发酵初始pH 7.5，200r min^-1发酵72～108h。

肥料效果试验：

试验分A、B、C、D四组进行小麦、玉米和大豆的种植试验，每组100株作物。A组为土壤施用实施例1所得海藻液体肥组，种子浸泡使用清水；B组为土壤不施肥组(施用等量清水)，种子浸泡海藻液体肥；C组为土壤施用海藻液体肥+种子浸泡海藻液体肥组；D组为对照组，种子浸泡和土壤施用均使用清水。

土壤和种子的准备：

土壤经20目筛网筛选后保存备用。

选取籽粒饱满、形状完整的小麦、玉米和大豆种子各100粒，用高锰酸钾溶液(0.05％)消毒30min后用水反复冲洗干净后保存备用，并在播种前浸入清水(或海藻液体肥)24h。

种植试验：在种植槽中加入筛选的均匀细致的湿润土壤后播种，并用一定量的土壤埋没种子，在每粒种子周围施用海藻液体肥(或等量的清水)。以上操作完成后在室温下进行萌发实验，每天进行一定的浇水管理。

统计各组种子的萌发时间，结果如下表所示

表1本发明液体海藻液体肥对种子萌发的影响效果

结果显示，经过液肥浸泡和施用液肥的A、B、C三组相较于对照组D组，小麦、大豆和玉米种子的发芽率更高、且种子的萌发时间有所提前，尤其是当播种前经过液肥浸种且在播种后施用液肥的C组的优势更为明显。由此可得，实验组比对照组对种子的萌发影响效果更好，说明本发明中的海藻液体肥对种子萌发有促进作用。

实施例2

3.将步骤1和步骤2中的两株芽孢杆菌活化后，分别以5％(V/V)的等比例接种量接种到海藻发酵培养基中，半固体发酵培养得到发酵液

4.将步骤3中得到的发酵液于4℃，8000rpm离心，收集离心后含有活性解淀粉芽孢杆菌WB 1和枯草芽孢杆菌ABTNL-2的海藻肥固形物，30℃低温烘干，即海藻固体肥。粉碎过筛，制成粉料，待用。

5.步骤3中活化菌种的培养基成分为：过80目筛的海带粉1％，蛋白胨0.5％，NaCl2％、蔗糖0.25％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钙0.01％，蒸馏水配置，经121℃，20分钟灭菌后使用。

6.步骤3中海藻培养基主要成分是经过微切助互作技术处理的海带边角料超微粉，其特征在于如下步骤：

1)预处理海带原料，干燥至含水量不高于10％，粗粉碎至60目；

2)加入质量分数为2％的海藻酸钠作为助剂，置于搅拌机中充分混匀；

3)利用高能振动磨产生的微剪切作用对2)中原料进行处理，处理时间为20分钟，得到600～800目的微切超微海带粉原料。

7.步骤3中的海藻培养基为：微切助技术处理的海带粉5％、尿素0.3％、NaCl2.5％、蔗糖0.25％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钙0.01％蒸馏水配置，经121℃、20分钟灭菌后使用。

8.步骤3中所述发酵条件为：发酵温度37℃，发酵初始pH 7.5，200r min^-1发酵108h。

肥料效果试验：

试验分A、B两组进行小麦、玉米和大豆的种植试验，每组100株作物。A组为施用海藻固体肥组；B组为对照组，土壤不施肥(施用等量土壤)。

土壤和种子的准备：

土壤经20目筛网筛选后保存备用。

选取籽粒饱满、形状完整的小麦、玉米和大豆种子各100粒，用高锰酸钾溶液(0.05％)消毒30min后用水反复冲洗干净后保存备用，并在播种前浸入清水24h。

种植试验：在种植槽中加入筛选的均匀细致的混合有海藻固体肥的湿润土壤(固体海藻肥以5t/hm²施用)后播种，并用一定量的土壤埋没种子。以上操作完成后在室温下，每日进行一定的浇水管理，并观察做好记录。15～20d时，作物处于幼苗期。分别对小麦、玉米、大豆幼苗土壤接种足量的土传致病菌，其中，小麦为纹枯病真菌、玉米为丝黑穗病菌、大豆为疫病菌。三种病害均为以上作物主要真菌性病害。接种病菌后，5～10天内基本的基本管理不变，观察记录患病株数并计算比例。

统计各组种子的萌发时间，结果如下表所示：

表2本发明固体和液体海藻肥对作物土传疾病的防控效果

结果显示，经过施用海藻固体肥的A组相较于对照组B组，小麦、大豆和玉米患病株数明显偏少，意味着对以小麦纹枯病、大豆疫病、玉米丝黑穗病等常见真菌土传疾病具有有效的防治效果，这是由于海藻固体肥中含有的大量特有解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对病菌具有有效的抑制作用。由表2可知，固体海藻肥的施用对真菌类病菌有明显的抑制作用，可应用于农业生产真菌性疾病的防治。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种复合微生物海藻肥的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、取解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.8873和枯草芽孢杆菌CGMCC NO.10038，分别以种子培养基比发酵培养基体积比5～10％的比例接种到海藻发酵培养基中，发酵培养得到发酵液；其中，所述种子培养基中菌体浓度10⁹～10¹⁰CFU mL^-1；

S4、收集S2离心后的固形物，25～35℃风干，得海藻固体肥。

2.根据权利要求1所述复合微生物海藻肥的制备方法，其特征在于，步骤S1所述海藻发酵培养基的获得：

S11、海带原料，干燥至含水量不高于10％，粉碎至40～60目；

S12、加入质量分数1～2％的海藻酸钠，混匀；

3.根据权利要求2所述复合微生物海藻肥的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述发酵条件为：发酵温度25～37℃，发酵初始pH 7.5，200r· min^-1发酵72～108h。

4.根据权利要求1～3任一所述复合微生物海藻肥的制备方法，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌CGMCC No.8873和枯草芽孢杆菌CGMCC NO.10038经活化获得种子培养基；

活化菌种的培养基：过80目筛的海带粉1％，蛋白胨0.5％，NaCl 2％、蔗糖0.25％、硫酸镁0.02％、磷酸二氢钾0.05％、氯化钙0.01％，蒸馏水配置，经121℃灭菌20分钟。