CN114538985A - 一种混合微生物种衣剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种混合微生物衣剂及其制备方法，其解决了现有种衣剂存在降低种子发芽势、发芽率，抑制幼苗生长的技术问题，所述混合微生物种衣剂由65～70份水产品蛋白氨基酸溶液、1～3份助剂、5～10份混合活菌共生液、8.5～13.5份成膜剂、0.1～0.3份保护剂、0.2～1份七水硫酸锌和1～2份黄腐酸。同时本发明提供了其具体的制备方法。本发明可广泛应用于种衣剂生产技术领域。

Description

一种混合微生物种衣剂及其制备方法
技术领域
本申请属于为种衣剂生产技术领域，更具体地说，是涉及一种混合微生物种衣剂及其制备方法。
背景技术
中国是一个农业大国，粮食产量与质量关乎到我国国家安全与工业生产。近年来，由于环境污染、气候变化和栽培措施变更，导致粮食病虫害逐年加重，因而使用种衣剂提高作物产量、防治病虫害已成为目前保证粮食种植的重要手段之一。
种衣剂使用技术是基于传统浸种和拌种技术发展起来的一项新的种子处理技术，种衣剂的使用有利于作物规范化播种、病虫害防治和机械化管理，它是提高种子播种质量、实现农民促产增收的重要途径之一，然而，目前的种衣剂大多数是化学农药种衣剂，在杀灭有害生物的同时也对田间有益生物、甚至对作物种苗带来伤害，如降低种子发芽势、发芽率，抑制幼苗生长等。因此，生物型种衣剂在生态农业建设中的重要性逐渐被认识，成为最具发展潜力的一类种衣剂，生物型种衣剂是以活体微生物(有益或拮抗)或微生物代谢产物为活性成分，辅以一些助剂配方(如营养元素、成膜剂、防冻剂和分散剂等)，通过发酵、剂型加工等制成的种衣剂。生物种衣剂能在种子表面形成具有一定强度和通透性的生物保护层膜，生物型种衣剂中的微生物能随着种子的萌发在其表面和内部定殖，并随着植株的生长在根系和土壤中扩展和定殖，从而达到防病杀虫的目的。
发明内容
本发明就是为了解决上述背景的不足，提供了提供一种绿色，安全，能够催根促长并有效抑菌的混合生物种衣剂及其制备方法，该混合微生物种衣剂既能保证种子发芽率，又能促进植株生长，同时缩短发芽时间，提高种子质量，降低种植成本。
为此，本发明提供了一种混合微生物种衣剂，由以下重量份数的原料组成：
Figure BDA0003491875390000021
优选的，由以下重量份数的原料组成：
Figure BDA0003491875390000022
优选的，混合活菌共生液包括海洋细菌XS1412C、球形芽孢杆菌、固氮菌和共生液。
其中，海洋细菌XS1412C为棒状杆菌菌株，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，其保藏编号为CCTCC NO：M 2015149，其分类命名为Corynebacterium sp.XS1412C，保藏时间为2015年3月23日。
优选的，助剂为褐藻寡糖溶液。
优选的，保护剂为腈菌唑、三唑醇或烯唑醇中的一种。
同时，本发明提供了一种混合微生物种衣剂的制备方法，包括如下步骤：
(1)制备水产品蛋白氨基酸溶液：将水产品加工下脚料制备成匀浆，先加入木瓜蛋白酶进行初次搅拌酶解，然后调节pH至2.5～4.5，加入胃蛋白酶进行二次搅拌酶解，得到水产品蛋白氨基酸溶液；
(2)制备成膜剂：将蟹源壳聚糖用醋酸-醋酸钠溶解后，调节pH值至3.5～ 5.5，加入壳聚糖酶水解，酶解结束后,沸水浴灭酶活，冷却至室温,将溶液pH 值调至中性，离心收集上清液，制得成膜剂；
(3)制备混合活菌共生液：先将海洋细菌XS1412C和球形芽孢杆菌于共生液中初次培养，然后接种1～3份氮菌，继续培养，得到混合活菌共生液；
(4)制备助剂：先将海藻酸钠用磷酸溶液溶解，再加入褐藻胶裂解酶水解，沸水浴灭活，冷却，得到褐藻寡糖溶液；
(5)制备种衣剂：取5～10份步骤(3)制备的混合活菌共生液与65～70 份步骤(1)制备的水产品蛋白氨基酸溶液充分混合，再加入8.5～13.5份成膜剂、0.1～0.3份保护剂、1～3份褐藻寡糖溶液、1～2份黄腐酸、0.2～1份七水硫酸锌，搅拌均匀，得到混合微生物种衣剂。
优选的，步骤(1)中，初次搅拌酶解的时间为3～5h，搅拌速度为80～ 100r/min，酶解温度为35～45℃；二次搅拌酶解的时间为5～10h，搅拌速度为 60～80r/min，酶解温度为30～40℃。
优选的，水产品蛋白氨基酸溶液，其氨基酸含量≥120g/L，氨基酸种类≥15 种，并且其中必含有天冬氨酸含量≥2mM/mL，丝氨酸含量≥0.15mM/mL，亮氨酸和异亮氨酸含量≥1.5mM/mL。
优选的，步骤(2)中，醋酸-醋酸钠浓度为0.03～0.12mol/L，酶底比为7～ 14％，酶解温度为35～45℃，酶解时间为2～3h，沸水浴时间为10～15min，离心速率为5000～8000r/min，离心时间为10～15min。
壳聚糖成膜剂满足以下要求：包衣脱落率≤5.0％，包衣均匀度≥95％以上，透气性≥6％，透水性≥7％。
优选的，步骤(3)中，培养温度为26～33℃，初次培养时间为24～36h，继续培养时间为12～24h。
优选的，海洋细菌XS1412C浓度含量为2.0×106～6.0×109cfu/mL，球形芽孢杆菌孢子含量为3.0×107～6.0×109cfu/mL，固氮菌细菌浓度含量为3.0 ×106～5.0×109cfu/mL。
优选的，混合活菌共生液组分为：将蛋白胨1～5份、酵母粉1～3份、氯化钠1～3份、海藻酸钠0.5～3份，磷酸二氢钾0.05～0.1份，硫酸镁0.01～0.30份。
优选的，步骤(4)中，磷酸的浓度为10～60mmol/L，海藻酸钠溶液浓度为4～6％(W/V)，褐藻胶裂解酶添加量为0.1％～0.3％，水解温度为35～43℃，水解时间为2-5h，沸水浴时间为8～12min。
本发明的有益效果为：
(1)本发明制备的混合微生物种衣剂中含有有益微生物，其中的海洋细菌XS1412C菌株是从鲍肠道中筛选的一种棒状杆菌，不仅能够分泌产多种酶，发酵产生有益物质，而且具有良好的抑菌效果；本发明所用菌株易于培养，活力较强，发酵时间短，并能够在其周围形成保护种子的屏障，使种子消毒和防治病原菌侵染，有效促进种子生根发芽，绿色环保，而且混合活菌共生液制备简单，成本低，适合工业化生产。
(2)本发明提供的混合微生物种衣剂，通透效果良好，富含植株生长所需的多种物质，且能够完全分解。本发明富含多种氨基酸、寡糖等营养成分，有利于提高种子的吸收，增强植株的新陈代谢能力以及加快物质积累速度，增加植株抵抗力，其中，氨基酸，天冬氨酸能够提高种子发芽率，促进蛋白质的合成，并为植株压力时期的生长提供氮，异亮氨酸和亮氨酸能够提高帮助抵抗盐胁迫，提高种子及植株抵抗力，丝氨酸能够参与细胞组织分化，促进种子发芽及植株生长等。
(3)本发明提供的混合微生物种衣剂不仅成膜性较好，还具有一定抗冻和杀菌作用；其中的黄腐酸和微量肥，不仅能够满足种子生长所需，还可以促进其生根发芽和植株生长，具有良好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为不同细菌处理类型对玉米根腐病的防效图；
图2为本发明中的对比例1-3与实施例1的种衣剂对种子最早发芽时间的影响图。
图中标注：
A.海洋细菌单独处理；B.海洋细菌及球形芽孢杆菌共同处理；C.海洋细菌、球形芽孢杆菌及固氮菌混合处理。
具体实施方式
为了使本申请所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
实施例1一种混合微生物种衣剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备水产品蛋白氨基酸溶液：将贝类及鱼类等水产品加工下脚料制备成匀浆，先加入木瓜蛋白酶在搅拌器中酶解3h，搅拌速度为90r/min，酶解温度为40℃，调节初次酶解液pH为3.5，加入胃蛋白酶在搅拌器中酶解8h，搅拌速度为70r/min，酶解温度为35℃，灭活后得到水产品蛋白氨基酸溶液。
(2)制备成膜剂：将蟹源壳聚糖溶于0.08mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，pH值调至4.5，加入壳聚糖酶，酶底比为11％，在40℃条件下水浴2.5h，酶解结束后,沸水浴13min灭酶活，冷却至室温,将溶液pH值调至中性， 7000r/min离心13min，收集上清液，得到成膜剂。
(3)制备混合活菌共生液：将蛋白胨3份、酵母粉2份、氯化钠2份、海藻酸钠2份，磷酸二氢钾0.08份，硫酸镁0.02份混合制备共生液，然后将海洋细菌XS1412C和球形芽孢杆菌于共生液中30℃条件下培养30h，再接种2份固氮菌，继续培养18h，得到混合活菌共生液。
(4)制备助剂：以pH6.0的40mmol/L的磷酸缓冲液配制5％(W/V)的海藻酸钠溶液，加入0.2％的褐藻胶裂解酶，于35℃下水解2h，沸水浴8min灭活，冷却后既得褐藻寡糖溶液。
(5)制备种衣剂：将8份混合活菌共生液与67.5份水产品蛋白酶解液充分混合，再加入11.5份成膜剂、2份褐藻寡糖溶液、0.2份三唑醇、0.8份七水硫酸锌和1.5份黄腐酸，搅拌均匀，制得混合微生物种衣剂。
实施例2一种混合微生物种衣剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备水产品蛋白氨基酸溶液：将贝类及鱼类等水产品加工下脚料制备成匀浆，先加入木瓜蛋白酶在搅拌器中酶解4h，搅拌速度为80r/min，酶解温度为35℃，调节初次酶解液pH为2.5，加入胃蛋白酶在搅拌器中酶解5h，搅拌速度为60r/min，酶解温度为30℃，灭活后得到水产品蛋白氨基酸溶液。
(2)制备成膜剂：将蟹源壳聚糖溶于0.03mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，pH值调至3.5，加入壳聚糖酶，酶底比为7％，在35℃条件下水浴2h，酶解结束后,沸水浴10min灭酶活，冷却至室温,将溶液pH值调至中性，5000r/min 离心10min，收集上清液，得到成膜剂。
(3)制备混合活菌共生液：将蛋白胨1份、酵母粉1份、氯化钠1份、海藻酸钠0.5份，磷酸二氢钾0.05份，硫酸镁0.01份混合制备共生液，然后将海洋细菌XS1412C和球形芽孢杆菌于共生液中26℃条件下培养24h，然后接种 1份固氮菌，继续培养12h，得到混合活菌共生液。
(4)制备助剂：以pH6.0的10mmol/L的磷酸缓冲液配制4％(W/V)的海藻酸钠溶液，加入0.1％的褐藻胶裂解酶，于39℃下水解3.5h，沸水浴10min灭活，冷却后既得褐藻寡糖溶液。
(5)制备种衣剂：将5份混合活菌共生液与65份水产品蛋白酶解液充分混合，再加入8.5份成膜剂、1份褐藻寡糖溶液、0.1份三唑醇、0.2份七水硫酸锌和1份黄腐酸，搅拌均匀，制得混合微生物种衣剂。
实施例3一种混合微生物种衣剂的制备方法，具体步骤如下：
(1)制备水产品蛋白氨基酸溶液：将贝类及鱼类等水产品加工下脚料制备成匀浆，先加入木瓜蛋白酶在搅拌器中酶解5h，搅拌速度为100r/min，酶解温度为45℃，调节初次酶解液pH为4.5，加入胃蛋白酶在搅拌器中酶解10h，搅拌速度为80r/min，酶解温度为40℃，灭活后得到水产品蛋白氨基酸溶液。
(2)制备成膜剂：将蟹源壳聚糖溶于0.12mol/L的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，pH值调至5.5，加入壳聚糖酶，酶底比为14％，在45℃条件下水浴3h，酶解结束后,沸水浴15min灭酶活，冷却至室温,将溶液pH值调至中性，8000r/min 离心15min，收集上清液，得到成膜剂。
(3)制备混合活菌共生液：将蛋白胨5份、酵母粉3份、氯化钠3份、海藻酸钠3份，磷酸二氢钾0.1份，硫酸镁0.30份混合制备共生液，然后将海洋细菌XS1412C和球形芽孢杆菌于共生液中培养33℃条件下培养30h，然后接种3份固氮菌，继续培养24h，得到混合活菌共生液。
(4)制备助剂：以pH6.0的60mmol/L的磷酸缓冲液配制6％(W/V)的海藻酸钠溶液，加入0.3％的褐藻胶裂解酶，于43℃下水解5h，沸水浴12min灭活，冷却后既得褐藻寡糖溶液。
(5)制备种衣剂：将10份混合活菌共生液与70份水产品蛋白酶解液充分混合，再加入13.5份成膜剂、3份褐藻寡糖溶液、0.3份三唑醇、1份七水硫酸锌和2份黄腐酸，搅拌均匀，制得混合微生物种衣剂。
以上仅是本发明的实施例而已，不能以此限制本发明的保护范围，例如，步骤(5)中，保护剂还可以为腈菌唑、三唑醇其中任何一种，均可以制得本发明的混合微生物种衣剂。
性能测试
一、种衣剂基础指标、成膜性、通透性及水产蛋白氨基酸成分检测
(1)微生物种衣剂基础指标测试：将实施例1-3制备的种衣剂进行基础指标测试，其中pH按GB/T1601-1993方法进行检测，润湿性按GB/T5451-2001 方法进行检测，包衣脱落率按GB/T17768-1999方法进行检测，热贮稳定性按 GB/T19136-2003方法进行检测，结果见表1。
表1实施例1-3的混合生物种衣剂的检测结果
实施例 润湿性/s pH 包衣脱落率/％ 活芽孢下降率/％
1 146 7.32 4.65 19
2 155 7.08 4.91 24
3 137 7.44 4.87 21
由表1可知，实施例1-3制备的混合微生物种衣剂的润湿性、PH值、包衣脱离率和活芽孢下降率均符合国标要求。
(2)微生物种衣剂成膜性测定：将实施例1-3制备的微生物种衣剂在干净载玻片(2cm×8cm)上延展成膜，室温晾干，置于(35±10)℃烘箱内烘制成干燥膜，进行成膜性考察。实验重复3次。
微生物种衣剂透气性测定：用毛笔蘸取2.0g或者用吸管吸2mL实施例1-3 制备的种衣剂，均匀涂布在圆形滤纸(直径9cm)的一个表面，室温干燥后盖在盛有一定质量蒸馏水的烧杯口上，四周密封，置于80℃温水浴中，3h后通过称取烧杯中剩余水。
透水性测定：用毛笔蘸取2.0g或者用吸管吸2mL种衣剂，均匀涂布于圆形滤纸的一个表面，自然晾干，将涂有种衣剂的一面向下，盖在事先称重的培养皿盖上，在滤纸表面滴10mL蒸馏水，静止放置3h，再次称取培养皿盖的质量，两次质量差即为从滤纸中渗的下的水重量。实验重复3次。
微生物种衣剂的成膜性和通透性检测结果见表2。
表2实施例1-3的混合微生物种衣剂成膜性和通透性检测结果
实施例 成膜性 透气性/％ 透水性/％
1 成膜均匀 7.12 8.38
2 成膜均匀 7.58 8.96
3 成膜均匀 6.76 7.37
(3)水产蛋白氨基酸成分检测：将实施例1-3制中的水产品蛋白酶解液用滤纸过滤，分别吸取1mL在0.22μm滤膜进一步过滤，再从中吸取50μL于pH 为2.2的柠檬酸钠缓冲液中，放置于氨基酸全自动分析仪中进行检测，检测结果见表3。
表3实施例1-3氨基酸含量检测结果
Figure BDA0003491875390000081
通过表3可知，实施例1-3制备的混合微生物种衣剂富含植株生长所需的多种物质，如水、无机盐、有机物等，且能够完全分解。本发明富含多种氨基酸，有利于提高种子的吸收，增强植株的新陈代谢能力以及加快物质积累速度，增加植株抵抗力，其中，氨基酸，天冬氨酸能够提高种子发芽率，促进蛋白质的合成，并为植株压力时期的生长提供氮，异亮氨酸和亮氨酸能够提高帮助抵抗盐胁迫，提高种子及植株抵抗力，丝氨酸能够参与细胞组织分化，促进种子发芽及植株生长等。
二、抑菌性能检测
将玉米种子放在50℃的热水中温汤浸种10min，以促进种子萌发并起到表面消毒的作用。将温汤浸种后的种子分别放置于含有5×107cfu/mL海洋细菌培养液(A)、含有5×107cfu/mL海洋细菌及孢子含量为5.0×107cfu/mL球形芽孢杆菌混合液(B)、含有5×107cfu/mL海洋细菌，孢子含量为5.0×107cfu/mL 球形芽孢杆菌及含量为5.0×107cfu/mL固氮菌细菌混合液(C)进行包衣，晾干后放在培养皿中，置于28℃培养箱中培养3d。待出芽后取出，放在常温条件下继续培养，并向培养液中加入镰孢菌5×105个/mL的孢子液，10d后开始观察玉米生长及根部腐烂褐变情况，根据腐烂褐变根占总根数的比例计算防效，实验结果见表4和图1。
表4不同细菌处理对玉米生长的影响
细菌处理类型 主根数(个) 腐烂褐变根占比(％) 接种部位腐烂直径(cm) 茎长(cm)
A 8±0.56 19±0.43 1.02±0.03 21±2.32
B 7±0.48 15±0.58 0.58±0.26 23±1·07
C 8±0.62 11±0.72 0.20±0.11 25±1.74
通过图1可看出，经过C类混合细菌处理后的防效最高，远高于A类和B 类细菌处理后的防效；由表4中的数据可知，经过C类混合细菌处理后的玉米种子腐烂程度最低，植株茎最长，说明海洋细菌、球形芽孢杆菌及固氮菌细菌混合液不仅可以有效抑制病原菌，还可以更好的保证和促进植株的生长，充分说明本发明所提供的含有混合活菌共生液的混合微生物种衣剂的抑菌性及安全性均良好。
三、混合微生物种衣剂对种子发芽及生长的影响
(1)包衣种子制备
对比例1为5％三唑醇悬浮种衣剂，对比例2为海洋细菌XS1412C种衣剂，对比例3为海洋细菌XS1412C及球形芽孢杆菌双混合种衣剂，实施例1为混合微生物种衣剂。
分别称取玉米种子，以每60g种子加入1mL种衣剂的比例，分别制备5％三唑醇悬浮种衣剂包衣种、海洋细菌XS1412C种衣剂包衣种、海洋细菌及球形芽抱杆菌双混合种衣剂包衣种、混合微生物种衣剂包衣种进行包衣，按照GB15671 标准(药剂包敷种子表面积≥80％)，包衣后摊晾2～3h，备用。
(2)实验室发芽实验
按照室内发芽标准方法，分别将对比例1、对比例2、对比例3和实施例1 的种衣剂包衣的玉米播种于发芽盒内，每个重复100粒，每组3次重复，20℃恒温人工气候箱培养，光照12h/黑暗12h，定期补水。24h后，统计最早发芽时间，第3天计算种子萌发势，第7天计算种子发芽率，测算幼苗发芽势、发芽率、发芽指数和活力指数等指标，并于发芽初期取样测定淀粉酶活性。发芽试验按GB/T3543.4-1995《农作物种子检验规程发芽试验》进行，结果见下图 2和表5。
类型 发芽势 发芽率％ 发芽指数 种活力指数 淀粉酶活性
对比例1 62.12±1.34 97.46±1.65 40.61±1.23 22.38±0.56 3.22±1.79
对比例2 68.75±1.57 98.31±1.94 42.38±1.64 27.46±1.82 3.22±1.79
对比例3 67.34±0.92 99.27±1.37 43.15±1.83 27.15±1.55 4.47±1.92
实施例1 71.85±1.86 99.11±1.69 49.36±1.15 34.32±1.98 5.82±1.54
通过表5和图2均可看出，实施例1处理后的玉米种子，其发芽率和种子活性明显高于对比例1-3处理后的玉米种子，说明本发明制备的微生物种衣剂，可以更好的促进种子发芽，最短发芽时间仅为47h左右，并且在保证种子发芽率基础上，有效提高种子活性，缩短种子发芽时间，促进种子生长。
(3)实验室植株生长实验
以发芽实验为基础，分别于小苗期(出苗后20d)调查根长，于中苗期(出苗后35d)调查株高及植株重量，结果见表6。
类型 根长(cm) 株高(cm) 地上鲜重(g) 地下鲜重(g)
对比例1 9.34±1.57 30.21±1.86 57.82±1.34 33.71±1.15
对比例2 11.05±1.98 33.51±1.93 64.51±1.96 36.47±1.82
对比例3 12.42±1.37 34.27±1.42 65.69±1.20 38.97±1.51
实施例1 14.35±1.39 38.52±1.80 71.11±1.43 46.61±1.33
通过表6可看出，实施例1处理后的植株的根长、株高和重量相较于对比例1-3有明显的优势，充分说明本发明制备的混合微生物种衣剂，可以更好的保证和促进植株生长。由此可知，本发明提供的混合微生物种衣剂，富含多种氨基酸、寡糖等营养成分，有利于提高种子的吸收，增强植株的新陈代谢能力以及加快物质积累速度，增加植株抵抗力，促进种子发芽及植株生长。而且，本发明制备的混合微生物种衣剂中含有有益微生物，不仅能够分泌产多种酶，发酵产生有益物质，而且能够在其周围形成保护种子的屏障，使种子消毒和防治病原菌侵染，具有良好的抑菌效果，有效促进种子生根发芽；加之，本发明的混合微生物种衣剂不仅成膜性较好，还具有一定抗冻和杀菌作用；其中的黄腐酸和微量肥，不仅能够满足种子生长所需，还可以促进其生根发芽和植株生长，具有良好的应用前景。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种混合微生物种衣剂，其特征是，由以下重量份数的原料组成：
Figure FDA0003491875380000011
2.根据权利要求1所述的混合微生物种衣剂，其特征在于，由以下重量份数的原料组成：
Figure FDA0003491875380000012
3.根据权利要求1或2所述的混合微生物种衣剂，其特征在于：所述混合活菌共生液包括海洋细菌XS1412C、球形芽孢杆菌、固氮菌和共生液，所述混合活菌共生液组分为：蛋白胨1～5份、酵母粉1～3份、氯化钠1～3份、海藻酸钠0.5～3份，磷酸二氢钾0.05～0.1份，硫酸镁0.01～0.30份。
4.根据权利要求1或2所述的混合微生物种衣剂，其特征在于：所述助剂为褐藻寡糖溶液。
5.根据权利要求1或2所述的混合微生物种衣剂，其特征在于：所述保护剂为腈菌唑、三唑醇或烯唑醇中的一种。
6.一种如权利要求1-5所述的混合微生物种衣剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备水产品蛋白氨基酸溶液：将水产品加工下脚料制备成匀浆，先加入木瓜蛋白酶进行初次搅拌酶解，然后调节pH至2.5～4.5，加入胃蛋白酶进行二次搅拌酶解，得到水产品蛋白氨基酸溶液；
(2)制备成膜剂：将蟹源壳聚糖用醋酸-醋酸钠溶解后，调节pH值至3.5～5.5，加入壳聚糖酶水解，酶解结束后,沸水浴灭酶活，冷却至室温,将溶液pH值调至中性，离心收集上清液，制得成膜剂；
(3)制备混合活菌共生液：先将海洋细菌XS1412C和球形芽孢杆菌于共生液中初次培养，然后接种1～3份氮菌，继续培养，得到混合活菌共生液；
(4)制备助剂：先将海藻酸钠用磷酸溶液溶解，再加入褐藻胶裂解酶水解，沸水浴灭活，冷却，得到褐藻寡糖溶液；
(5)制备种衣剂：取5～10份步骤(3)制备的混合活菌共生液与65～70份步骤(1)制备的水产品蛋白氨基酸溶液充分混合，再加入8.5～13.5份成膜剂、0.1～0.3份保护剂、1～3份褐藻寡糖溶液、1～2份黄腐酸、0.2～1份七水硫酸锌，搅拌均匀，得到混合微生物种衣剂。
7.根据权利要求6所述的混合微生物种衣剂的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，初次搅拌酶解的时间为3～5h，搅拌速度为80～100r/min，酶解温度为35～45℃；二次搅拌酶解的时间为5～10h，搅拌速度为60～80r/min，酶解温度为30～40℃。
8.根据权利要求6所述的混合微生物种衣剂的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，醋酸-醋酸钠浓度为0.03～0.12mol/L，酶底比为7～14％，酶解温度为35～45℃，酶解时间为2～3h，沸水浴时间为10～15min，离心速率为5000～8000r/min，离心时间为10～15min。
9.根据权利要求6所述的混合微生物种衣剂的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，培养温度为26～33℃，初次培养时间为24～36h，继续培养时间为12～24h。
10.根据权利要求6所述的混合微生物种衣剂的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，磷酸的浓度为10～60mmol/L，水解温度为35～43℃，海藻酸钠溶液浓度为4～6％(W/V)，褐藻胶裂解酶添加量为0.1％～0.3％，水解时间为2～5h，沸水浴时间为8～12min。
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