CN114854650B - 一种微生物菌剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物领域，具体提供了一种贝莱斯芽孢杆菌，保藏编号为CGMCC No.24706，于2022年04月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌能够促进作物生长，并有较好的抑菌效果，在肥料和农药领域均有较好的应用前景。

Description

一种微生物菌剂及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种促进作物生长、抑制病原菌的微生物菌剂及其制备方法。
背景技术
贝莱斯芽孢杆菌属于芽孢杆菌，在自然界中广泛分布，该菌生长快、抗逆性强、代谢产物丰富，对人和动物安全无毒。同时，该菌在生物防治、药物研发、食品发酵和工业应用等方面具有重要作用。
现有技术中公开了多种已分离的贝莱斯芽孢杆菌菌株，其作用主要在于促进植物生长，抑制作物病原菌。其可以针对多种农作物进行病害防治，如杨树溃疡病菌、小麦赤霉病菌、黄瓜枯萎病菌、苦瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、烟草赤星病菌等等。
申请号为CN202010064721.4的中国发明专利公开了一种贝莱斯芽孢杆菌及其在小麦全蚀病防治中的应用，该贝莱斯芽孢杆菌的培养条件为：采用液体LB培养基进行振荡培养，振荡培养速度为200r/min，培养温度为28℃，培养时间为24h。该发明首次将贝莱斯芽孢杆菌应用到小麦全蚀病的防治中，贝莱斯芽孢杆菌的剂型为菌悬液或可湿性粉剂；数据表明，与对照组相比，贝莱斯芽孢杆菌(编号为XJ-4)对小麦幼苗的生长有促进作用，株高与干重均明显增加，对接种小麦全蚀病菌的小麦有明显的防治效果，使用其菌液灌根缓解了发病小麦植株矮化和颈基部、根部发黑的症状，平均防效高达52.46％。但其对于小麦的促进生长作用十分有限，仅为13%-15%。
申请号为CN202110129025.1的中国发明专利公开了一株贝莱斯芽孢杆菌QBB3及其生防制剂和应用，该生防制剂活性成分包括上述贝莱斯芽孢杆菌QBB3的菌体、菌液、发酵滤液或其活性提取物。贝莱斯芽孢杆菌QBB3对小麦茎基腐病菌、黄瓜枯萎病菌、苹果白绢病菌和辣椒疫霉等多种常见的土传植物病害病原菌具有防治作用，可将其制备成防治小麦茎基腐病、黄瓜枯萎病、苹果白绢病等重要土传病害的生防制剂。但其发酵液用量较大，实际应用时较为不便。
贝莱斯芽孢杆菌在作物种植中应用广泛，扩大贝莱斯芽孢杆菌的种质资源库有利于促进农业发展。
发明内容
本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌，并将其应用于促进作物生长和抑制病原菌。
一方面，本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌。
所述的贝莱斯芽孢杆菌保藏编号为CGMCC No. 24706，于2022年04月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为中国北京，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis。
本发明还提供了该贝莱斯芽孢杆菌的制备物，所述的制备物中包括前述的贝莱斯芽孢杆菌，所述的制备物包括但不限于培养物、培养物提取物、发酵液、发酵液上清、发酵液沉淀、冻干粉中的一种或多种。
本发明还提供了一种菌剂，其包括前述的贝莱斯芽孢杆菌。
另一方面，本发明提供了该贝莱斯芽孢杆菌的培养方法。
所述的培养方法中包括将前述的贝莱斯芽孢杆菌接种于培养基。
优选地，所述的培养基为营养琼脂培养基。
优选地，所述的培养方法为好氧培养、厌氧培养或者兼性厌氧培养。
优选地，所述的培养条件为：37℃，20-24h，pH7.3，需通气，120m3/h-180m3/h。
再一方面，本发明提供了前述的贝莱斯芽孢杆菌及其制备物的应用。
所述的应用为制备肥料和/或促生长剂；
或者，所述的应用为制备抑菌剂和/或农药。
所述的抑菌剂和/或农药针对苹果轮纹病菌和/或苹果红点病菌。
在一些实施例中，所述的肥料相对于原始发酵液稀释5-10倍。
在一些实施例中，所述的促生长剂相对于发酵原液稀释1000倍使用；优选地，用于小麦浸种。
在一些实施例中，所述的促生长剂相对于发酵原液稀释100-500倍使用；优选地，用于小麦拌种。
在一些实施例中，所述的抑菌剂或农药中包括的发酵液相对于发酵原液稀释3000倍以内。
又一方面，本发明提供了包括前述贝莱斯芽孢杆菌的产品。
所述的产品为肥料、促生长剂、抑菌剂、农药中的一种或多种。
所述的产品中包括前述贝莱斯芽孢杆菌和/或其制备物。
所述的抑菌剂和/或农药针对苹果轮纹病菌和/或苹果红点病菌。
在一些实施例中，所述的肥料相对于原始发酵液稀释5-10倍。
在一些实施例中，所述的促生长剂相对于发酵原液稀释1000倍使用；优选地，用于小麦浸种。
在一些实施例中，所述的促生长剂相对于发酵原液稀释100-500倍使用；优选地，用于小麦拌种。
在一些实施例中，所述的抑菌剂或农药中包括的发酵液相对于发酵原液稀释3000倍以内。
又一方面，本发明提供了前述的贝莱斯芽孢杆菌在作物种植中的应用。
所述的贝莱斯芽孢杆菌发酵后使用。
优选地，发酵液播种前稀释5-10倍后使用；进一步地，用于土壤处理：稀释液喷施地面，翻地整平，亩用量2-6L。
优选地，用于冲施或灌根：发酵液亩用量2-4L。
优选地，用于移栽定植100倍稀释蘸根或者淋根。
优选地，用于滴灌，亩用量2L。
优选地，用于小麦浸种。
优选地，用于小麦拌种。
本发明的有益效果：
本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌至少具有以下优势：
（1）耐高温，70℃保存5h，菌数300亿/mL；
（2）对苹果轮纹病菌生长的抑制作用可达90%以上；
（3）对苹果红点病菌的抑菌效果80%以上；
（4）去除菌体后，菌液对病原菌的抑制作用仅微微减弱；
（5）小麦拌种可促进麦苗生长，增加株高；浸种可增加地上、地下部的干鲜重；
（6）菌剂产品为保存活性，一般以固体剂型较多，本菌株液体产品在54℃条件下保存4个月，仍未腐败变质，有效活菌数未降低，其抑菌促生作用均未受影响。
附图说明
图1为不同温度下保存的贝莱斯芽孢杆菌菌液。
图2为54℃保存贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数变化趋势。
图3为54℃保存的贝莱斯芽孢杆菌的抑菌效果。
图4为70℃保存的贝莱斯芽孢杆菌的抑菌效果。
图5为不同浓度贝莱斯芽孢杆菌菌液对种子萌发的影响。
图6为贝莱斯芽孢杆菌菌液浸种对小麦株高的影响。
图7为贝莱斯芽孢杆菌菌液浸种对小麦鲜干重的影响。
图8为贝莱斯芽孢杆菌菌液浸种后小麦生长情况。
图9为不同浓度贝莱斯芽孢杆菌菌液拌种对小麦萌发的影响。
图10为不同浓度贝莱斯芽孢杆菌菌液拌种对小麦株高的影响。
图11为不同稀释倍数的贝莱斯芽孢杆菌发酵液对苹果红点病菌的抑菌效果。
图12为不同稀释倍数的贝莱斯芽孢杆菌发酵液对苹果轮纹病菌的抑菌效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种贝莱斯芽孢杆菌
本发明菌种为进行其他产品对葡萄白腐病原菌平板对峙实验时筛选得出，编号YTHY20220301。进行分离纯化后，由青岛派森诺基因生物技术有限公司测序确定为贝莱斯芽孢杆菌。并于2022年04月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 24706。
该菌株培养可采用营养琼脂培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠（NaCl）5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH值7.2-7.5。
具体发酵条件为：37℃，20-24h，pH7.3，需通气，120m3/h-180m3/h。
发酵步骤：将菌种接种于5L发酵罐制备种子液，种子液转移至100L种子罐发酵后再转移至5KL主发酵罐发酵。发酵条件可根据需要自行调节。
发酵过程中起泡较多，因此发酵罐中发酵液体积为发酵罐容积的一半左右。
使用本实施例的发酵液进行后续性能测试。
实施例2 不同温度下贝莱斯芽孢杆菌有效活菌数变化及抑菌能力
为了验证不同温度对贝莱斯有效活菌数的影响，设计了在温度为15℃（室温）、38℃、 54℃条件下的常规保存试验。另外，增加了水浴70℃处理 5h 和高温高压121℃处理20min的高温试验。通过平板涂布测定有效活菌数，平板对峙验证抑菌能力。
（1）不同温度下的保存
将贝莱斯芽孢杆菌菌液分装，分别存放于15℃（室温）、38℃和54℃温度下。
结果见图1，38℃保存第54d（上）和54℃保存第 2d（下）。
15℃保存的贝莱斯分层缓慢，未发现胀气；
38℃保存的贝莱斯分层慢，轻微胀气；
54℃保存的贝莱斯分层较快，第2d出现分层，第5d瓶子胀气；
（2）有效活菌数的测定
15℃和38℃保存的菌每隔一月测量一次；54℃保存的菌前期每天取样一次测定，后期每隔一星期取样测定。
不同温度下测定有效活菌数结果见表1，由于取样时间不一致，所列试验数据结果均为近期最后一次测定值。
Figure 39593DEST_PATH_IMAGE001
结果表明：15℃时，温度较低微生物处于休眠状态，活性较低，有效活菌数在100亿/mL左右。38℃时温度适宜微生物生长，有效活菌数保持在400亿/mL左右。54℃时前期菌数增加较快，后期由于长期高温菌数开始下降，随时间增加菌数变化见图2。
水浴70℃处理5h后，仍有300 亿/mL左右的有效活菌数，说明该贝莱斯芽孢杆菌耐高温条件。高温高压121℃处理20min后，未检测到有微生物存在。
（3）抑菌能力
为了验证在较高温度下贝莱斯芽孢杆菌是否仍具有抑菌性，设计了54℃和70℃该菌对苹果红点病菌的抑菌试验。
如图3和图4所示，54℃和70℃条件下贝莱斯芽孢杆菌对苹果红点病菌的抑菌能力仍较强。贝莱斯芽孢杆菌在54℃下保存一个月，对苹果红点病菌的抑菌率达到85%以上（见表2），相比于正常温度下贝莱斯对苹果红点的抑菌率（80%左右）未发生变化。
Figure 550209DEST_PATH_IMAGE002
贝莱斯水浴70℃处理5小时后，对苹果红点病菌的抑菌率达到78%以上（见表3），相比于正常温度下贝莱斯对苹果红点的抑菌率（80%左右）略微降低，但抑菌率仍较高。
Figure 64367DEST_PATH_IMAGE003
以上试验反映了贝莱斯在较高温度下抑菌能力不会发生明显下降，仍具有较高的抑菌能力。
综上，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌不同温度下有效活菌数差异较大，但抑菌能力无明显差异。15℃时由于温度低，微生物活性较低，测得有效活菌数在100亿/mL左右。38℃时温度适宜，菌数稳定，测得有效活菌数在400亿/mL左右。54℃时菌数变化起伏较大，先升高后降低，保存一月后测得有效活菌数在300亿/mL左右，抑菌率达到85%左右。70℃时温度较高，处理5小时后测得有效活菌数在300亿/mL左右，抑菌率达到78%左右。
实施例3 贝莱斯芽孢杆菌浸种对小麦出苗的影响
挑选颗粒饱满的小麦种子，首先用10%的次氯酸钠消毒10min，蒸馏水冲洗3次，然后用不同浓度的贝莱斯浸种小麦过夜，用蒸馏水清洗3次，将种子整齐摆放在铺有2层滤纸的培养皿中（加5mL蒸馏水），每皿30粒种子，每个处理重复3次，置于人工气候箱中，温度25℃，湿度70%，光暗周期12h/12h，观察萌发及生长情况。
贝莱斯芽孢杆菌菌液浓度处理为：CK（清水）、T0（原液）、T1（稀释500倍）、T2（1000倍）、T3（3000倍）、T4（5000倍）。
（1）不同浓度贝莱斯芽孢杆菌菌液对种子萌发的影响
由图5可以看出，贝莱斯芽孢杆菌菌液浸种后，第2天，除T0外，其他处理均已萌发，第3天更明显，T0处理个别种子有萌发迹象，其他处理均已看到明显的根系及麦芽。
（2）贝莱斯芽孢杆菌菌液对浸种小麦苗生长的影响
贝莱斯芽孢杆菌菌液处理第6天时，不同浓度处理均增加了小麦的株高，T4（5000倍）处理下，麦苗株高增加6.68%，其次是T2（1000倍），麦苗株高增加3.95%。（图6）
（3）贝莱斯芽孢杆菌菌液对浸种小麦鲜干重的影响
由图7可以看出，贝莱斯芽孢杆菌菌液浸种后，不同程度增加了小麦地上部、地下部的干鲜重，随着稀释倍数的增大，小麦干鲜重先增加后降低，在T2（1000倍）处理下，小麦干鲜重达最高值，地上部鲜重增加32.54%、地上部干重增加43.43%、地下部鲜重增加22.65%、地下部干重增加32.81%。
综上可知，贝莱斯芽孢杆菌菌液高浓度时，对小麦种子萌发有抑制作用，适宜浓度下促进种子的萌发及生长。小麦生长情况见图8，其中上图为第6天采收时的正面图，下图为第6天采收时的侧面图。
综合株高及地上部干鲜重指标，因株高不能反应麦苗生长的整体情况，以小麦地上部及地下部重量作为评定依据，贝莱斯芽孢杆菌菌液稀释500-5000倍均可以促进小麦种子的萌发生长，稀释1000倍浸种，对麦苗的促生效果最好。
实施例4 贝莱斯芽孢杆菌拌种对小麦出苗的影响
称取等量的农田土壤装入长条盆中，用水浇透后，放置2天。每盆播种7g（约80粒）小麦种子。小麦种子用不同浓度的贝莱斯芽孢杆菌菌液浸泡2h后，倒掉菌液，撒播于长条盆中，覆土。
贝莱斯芽孢杆菌菌液浓度处理为：CK（清水）、T1（原液）、T2（稀释100倍）、T3（500倍）、T4（1000倍）。
（1）不同浓度贝莱斯芽孢杆菌菌液拌种对小麦萌发的影响
小麦萌发情况见图9，播种后第5天（上）、播种后第6天（下）。
播种第4天，小麦陆续发芽，第5天时，可以看到基本都出芽，但T1（原液）几乎没有发芽；第6天时，可以明显看到贝莱斯芽孢杆菌菌液稀释液拌种后，麦苗出苗齐，且苗高。
（2）不同浓度贝莱斯芽孢杆菌菌液拌种对小麦株高的影响
出苗15天后，随机测量40株麦苗的株高。由图10可以看出，T2（100倍）、T3（500倍）拌种处理下麦苗株高增加，分别增加8.21%、5.57%。
综上可知，贝莱斯芽孢杆菌原液拌种，对小麦种子萌发有抑制作用，稀释100-500倍拌种，可促进种子萌发，增加株高。
实施例5 贝莱斯芽孢杆菌对苹果红点病菌生长的影响
苹果红点病菌由烟台农业科学研究院提供，拉丁名为Alternaria alternata。
实验方法：取1mL贝莱斯芽孢杆菌菌液加入到99mL无菌水中稀释，即试验所用母液。吸取不同体积的母液加入到灭菌的PDA培养基中（培养基温度50℃，稀释倍数：500、1000、2000和3000倍），混匀后倒入9cm培养皿中，冷凝后分别接入直径为6mm的苹果红点病菌菌饼，置于25℃的培养箱中培养，以不加菌液而接种菌饼的PDA平板为对照。每个处理3个重复，培养7d后用十字交叉法测定菌落直径，根据下式计算抑制效果：
抑菌率(%)=（对照组菌落直径−处理组菌落直径）/（对照组菌落直径−6mm）×100%。
结果见图11和表4。图11中上图为苹果红点病菌培养7d后菌落正面图，中间图为苹果红点病菌菌饼培养7d后的菌落背面图，下图为苹果红点病菌培养7d后菌落正面图放大。
表4苹果红点病菌菌落直径
菌落直径/cm CK T1（500倍） T2（1000倍） T3（2000倍） T4（3000倍）
1 8.35 1.75 1.95 1.9 2
2 8.05 1.75 1.7 1.8 2.05
3 7.95 1.95 1.9 1.85 1.95
平均 8.12 1.82 1.85 1.85 2.00
抑菌率/% - 83.81 83.37 83.37 81.37
结果表明：贝莱斯芽孢杆菌对苹果红点病菌生长有明显的抑制作用，随着菌液稀释倍数的增加，对苹果红点病菌的抑菌作用略微降低，但总体抑菌率仍较高，保持在83%左右。
实施例6 贝莱斯芽孢杆菌对苹果轮纹病菌生长的影响
苹果轮纹病菌由烟台农业科学研究院提供，拉丁名为Botryosphaeria dothidea。
实验方法：取1mL贝莱斯芽孢杆菌菌液加入到99mL无菌水中稀释，即试验所用母液。吸取不同体积的母液加入到灭菌的PDA培养基中（培养基温度50℃，稀释倍数：500、1000、2000和3000倍），混匀后倒入9cm培养皿中，冷凝后分别接入直径为6mm的苹果轮纹病菌菌饼，置于25℃的培养箱中培养，以不加菌液而接种菌饼的PDA平板为对照。每个处理3个重复，培养7d后用十字交叉法测定菌落直径，根据下式计算抑制效果：
抑菌率(%)=（对照组菌落直径−处理组菌落直径）/（对照组菌落直径−6mm）×100%。
结果见图12和表5。图12中，上图为苹果轮纹病菌培养7d后菌落正面图，中间图为苹果轮纹病菌培养7天后菌落背面图，下图为苹果轮纹病菌培养7d后菌落正面图放大。
表5 苹果轮纹病菌菌落直径
菌落直径/cm CK T1（500倍） T2（1000倍） T3（2000倍） T4（3000倍）
1 7.25 0.85 1 1.1 1
2 7.1 0.9 0.95 1.05 1.1
3 - 0.9 0.95 0.95 1.05
平均 7.18 0.88 0.97 1.03 1.05
抑菌率/% - 95.69 94.42 93.41 93.16
结果表明：贝莱斯芽孢杆菌对苹果轮纹病菌生长有明显的抑制作用，随着菌液稀释倍数的增加，对苹果轮纹病菌的抑菌作用略微降低，但总体抑菌率仍较高，保持在93-95%左右。

Claims (15)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于，于2022年04月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 24706，保藏地址为中国北京，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌 Bacillus velezensis。
2.一种贝莱斯芽孢杆菌的制备物，其特征在于，所述的制备物中包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌，所述的制备物为培养物、发酵液、冻干粉中的一种或多种。
3.一种菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌。
4.一种贝莱斯芽孢杆菌的培养方法，其特征在于，包括将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌接种于培养基。
5.根据权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述的培养基为营养琼脂培养基。
6.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的制备物在制备肥料和/或促生长剂中的应用。
7.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的制备物在制备抑菌剂和/或农药中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的抑菌剂和/或农药针对苹果轮纹病菌和/或苹果红点病菌。
9.一种肥料，其特征在于，包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的制备物。
10.一种抑菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的制备物。
11.根据权利要求10所述的抑菌剂，其特征在于，针对苹果轮纹病菌和/或苹果红点病菌。
12.一种农药，其特征在于，包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的制备物。
13.一种植物促生长剂，其特征在于，包括权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的制备物。
14.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2所述的制备物在作物种植中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，对发酵液进行稀释后使用；所述的应用为土壤处理、冲施、灌根、蘸根、淋根、滴灌、拌种或浸种。
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