CN108676823B - 一种2-酮苯丙氨酸钙的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及药物的生物合成技术领域，具体涉及一种2‑酮苯丙氨酸钙的制备方法，通过采用微生物对苯丙氨酸进行转化制得2‑酮苯丙氨酸，再与钙离子成盐制得2‑酮苯丙氨酸钙。本发明方法条件温和，步骤简单，且转化率高。

Description

一种2-酮苯丙氨酸钙的制备方法
技术领域
本发明涉及药物的生物合成技术领域，具体涉及一种2-酮苯丙氨酸钙的制备方法。
背景技术
2-酮苯丙氨酸钙（酮基苯丙氨酸钙，也称2-氧-3-苯基丙酸钙）是脂肪族氨基酸酮酸与钙离子反应生成的钙盐，能够改善因为营养不良造成的消瘦，食欲下降和内分泌功能，是治疗尿毒症的一种非常有效的药物，目前合成方法有：以氰乙酸乙酯和苯甲醛为起始原料，经过Knoevenagel-Cope反应，制得2-亚苄基氰乙酸乙酯，然后经过氧化、水解获得α-酮苯丙氨酸钙，发明专利申请CN101759553公开了一种以3-苯基-2-氧代丙酸与碳酸氢钙反应得到α-酮苯丙氨酸钙，CN102050725以甘氨酸、苯甲醛、醋酐和有机碱反应得到4-亚苄基-2-甲基二氢噁唑酮，再与氢氧化钙反应制备的方法，过程均采用了化学合成的方式，其过程操作复杂，收率较低，产品中含有未知的杂质较多，使用了高COD的有机溶剂，能耗大且反应条件苛刻，不利于清洁生产。目前已有用生物酶法转化苯丙氨酸制备2-酮苯丙氨酸钙的报道，但野生型酶的转化率较低，需要通过复杂的基因工程对酶进行改造以提高转化率。
发明内容
针对以上技术现状，本发明提供一种成本低且转化率高的2-酮苯丙氨酸钙的制备方法。
为达到上述发明目的，本发明采用了如下的技术方案：
一种2-酮苯丙氨酸钙的制备方法，包括以下步骤：
（1）在苯丙氨酸溶液中加入复合微生物，于5-65℃下反应4-6h，所述复合微生物由蜡状芽孢杆菌CGMCC No. 7433、地衣芽孢杆菌CGMCC No. 6102和脱氮副球菌CGMCCNo.3658组成，三者的质量比为3-5:1-2:1；
（2）过滤除去复合微生物，滤液脱色后加入成盐助剂，得2-酮苯丙氨酸钙沉淀；
（3）过滤沉淀并用去离子水洗涤即得成品。
优选地，步骤（1）中所述苯丙氨酸溶液的质量浓度为0.5-40%。
进一步优选地，步骤（1）中所述苯丙氨酸溶液的质量浓度为2-20%。
进一步优选地，步骤（1）中所述微生物的加入量为苯丙氨酸质量的0.1-100%。
进一步优选地，步骤（1）中所述微生物的加入量为苯丙氨酸质量的0.3-50%。
进一步优选地，对步骤（2）中过滤脱除的微生物进行回收套用，套用次数为2-22次。
进一步优选地，步骤（2）中所述成盐助剂为氧化钙、氢氧化钙、氯化钙、碳酸钙或碳酸氢钙。
进一步优选地，步骤（2）中所述成盐助剂的加入量为：以钙离子计苯丙氨酸摩尔量的0.4-0.7倍。
本发明在研究过程中意外发现通过对三株微生物菌株进行组合后对苯丙氨酸具有高度选择性，可高效地将苯丙氨酸的氨基转化成羰基，同种的其他菌株则转化效率明显较低。
相对于现有技术，本发明采用微生物催化苯丙氨酸制备2-酮苯丙氨酸钙，避免了化学合成法中使用大量溶剂，过程操作复杂，收率低，能耗大的缺陷，较酶法转化的条件更为宽容，成本显著降低，并且具有较高的转化率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明中各微生物均从中国普通微生物菌种保藏管理中心购得。
以下实施例中所述复合微生物为分别将各微生物或经过改造的微生物用保藏指定的培养基经种子培养和发酵培养后离心获得湿菌体，将湿菌体依照干燥失重折干后，按照所述比例混合得复合微生物。
实施例1
将40kg苯丙氨酸溶解在一定量的水中配制成4%的水溶液1000L，过程控温物料温度在5-30℃之间，向料液中加入12kg复合微生物进行反应。复合微生物的组成为3:1:1的蜡状芽孢杆菌CGMCC No. 7433、地衣芽孢杆菌CGMCC No. 6102和脱氮副球菌CGMCC No.3658。过程跟踪底物剩余和产物生成量，反应4.5h后，底物苯丙氨酸剩余0.5g/L，且产物含量不再升高，反应结束，转化率大于99%。反应结束后过滤去除复合微生物，并用少量水洗涤后，投入下一批次。
所得料液在5-30℃条件下加入活性炭1.5kg进行脱色半小时，之后过滤去除活性炭，所得料液加入0.7倍摩尔量的氧化钙，加入过程有沉淀生成，加入完全后，搅拌半小时，降温至5℃，过滤，得湿粉。经鼓风干燥后得成品，高效液相检测纯度99.4%。
实施例2
将30kg苯丙氨酸溶解在一定量的水中配制成30%的水溶液100L，过程控温物料温度在31-60℃之间，向料液中加入15kg复合微生物进行反应。复合微生物的组成为5:2:1的蜡状芽孢杆菌CGMCC No. 7433、地衣芽孢杆菌CGMCC No. 6102和脱氮副球菌CGMCCNo.3658。过程跟踪底物剩余和产物生成量，反应5h后，底物苯丙氨酸剩余1g/L，且产物含量不再升高，反应结束，转化率大于99%。反应结束后过滤去除复合微生物，并用少量水洗涤后，投入下一批次。
所得料液在31-60℃条件下加入0.4倍摩尔的氯化钙，加入过程有沉淀生成，加入完全后，搅拌半小时，降温至5℃，过滤，得湿粉。经鼓风干燥后得成品，高效液相检测纯度99.3%。
实施例3
将30kg苯丙氨酸溶解在一定量的水中配制成15%的水溶液200L，过程控温物料温度在31-60℃之间，向料液中加入1.2kg复合微生物进行反应。复合微生物的组成为4:2:1的蜡状芽孢杆菌CGMCC No. 7433、地衣芽孢杆菌CGMCC No. 6102和脱氮副球菌CGMCCNo.3658。过程跟踪底物剩余和产生生成量，反应6h后，底物剩余小于0.4g/L，同时产物含量不再升高，认为反应结束。反应结束后过滤去除复合微生物，并用少量水洗涤后，投入下一批次。
所得料液在31-60℃条件下加入0.4倍摩尔的氯化钙，加入过程有沉淀生成，加入完全后，搅拌半小时，降温至5℃，过滤，得湿粉。经鼓风干燥后得成品，高效液相检测纯度99.5%，转化率99.1%。
以上所述仅为本发明的实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种2-酮苯丙氨酸钙的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）在苯丙氨酸溶液中加入复合微生物，于5-65℃下反应4-6h，所述复合微生物由蜡状芽孢杆菌CGMCC No. 7433、地衣芽孢杆菌CGMCC No. 6102和脱氮副球菌CGMCC No.3658组成，三者的质量比为3-5:1-2:1；
（2）过滤除去复合微生物，滤液脱色后加入成盐助剂，得2-酮苯丙氨酸钙沉淀；
（3）过滤沉淀并用去离子水洗涤即得成品。
2.如权利要求1所述的2-酮苯丙氨酸钙的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述复合微生物的加入量为苯丙氨酸质量的0.1-100%。
3.如权利要求2所述的2-酮苯丙氨酸钙的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述复合微生物的加入量为苯丙氨酸质量的2-30%。
4.如权利要求1所述的2-酮苯丙氨酸钙的制备方法，其特征在于：对步骤（2）中过滤脱除的复合微生物进行回收套用，套用次数为2-200次。
5.如权利要求1所述的2-酮苯丙氨酸钙的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述成盐助剂为氧化钙、氢氧化钙、氯化钙、碳酸钙或碳酸氢钙。
6.如权利要求5所述的2-酮苯丙氨酸钙的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述成盐助剂的加入量为：以钙离子计为苯丙氨酸摩尔量的0.4-0.7倍。
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