CN110452935A - 一种酶法制备乙醛酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及酶催化转化技术领域，具体公开一种酶法制备乙醛酸的方法，其采用特定质量比的豌豆乙醇酸氧化酶和南瓜乙醇酸氧化酶来催化乙醇酸的氧化得到乙醛酸。该酶体系对羟基的氧化活性远远高于对醛的氧化性，有利于减少醛氧化形成的副产物的含量，提高乙醛酸的收率。本发明方法还可以加入有机胺、辅酶和黄素单核苷酸进一步抑制产物的氧化，产物的产率可达90％以上。

Description

一种酶法制备乙醛酸的方法

技术领域

本发明涉及酶催化转化技术领域，尤其涉及一种酶法制备乙醛酸的方法。

背景技术

乙醛酸由一个醛基和一个羧基构成，兼具醛和羧酸的双重特性，可同时发生醛和酸的反应，是一种重要的有机合成中间体，广泛应用于香料、医药和食品等行业中。

由于具有能耗低、副产物少、环保等优点，酶催化法已成为合成乙醛酸的研究热点。目前广泛应用的酶催化法合成乙醛酸主要是以乙醇酸氧化酶作为催化剂，但是在该反应中容易将生成的乙醛酸进一步氧化从而降低产率。为了避免产物的氧化，一般选择在反应体系中加入乙二胺、过氧化氢酶和黄素单核苷酸，以抑制产物的氧化，提高产率。该方法中乙二胺的用量较大，一般要超过原料乙醇酸的摩尔数，且乙二胺水溶性较好，在水体系中不易回收，造成原料的浪费和环境的污染，并且乙二胺和乙醛酸的沸点相近，产物不易分离，收率较低。此外，乙二胺易燃且具有强腐蚀性和刺激性，对操作人员的安全构成威胁。因此，降低乙二胺等有机胺的用量同时保证较高的收率在乙醛酸的酶法合成中具有重要意义。

发明内容

针对以上技术现状，本发明提供一种酶法制备乙醛酸的方法。

一种酶法制备乙醛酸的方法，其采用复合乙醇酸氧化酶进行催化氧化反应，所述复合乙醇酸氧化酶由质量比0.35-0.5:1的豌豆乙醇酸氧化酶和南瓜乙醇酸氧化酶组成。

本发明采用特定比例的豌豆及南瓜来源的复合乙醇酸氧化酶来催化乙醇酸的氧化，该复合酶对羟基的氧化活性远远高于对醛的氧化性，有利于减少醛氧化形成的副产物的含量，可以在胺用量减少的前提下提高乙醛酸的收率。

可选地，所述豌豆乙醇酸氧化酶和南瓜乙醇酸氧化酶分别采用豌豆叶和南瓜叶经硫酸铵沉淀法制得。

具体地，所述豌豆乙醇酸氧化酶和南瓜乙醇酸氧化酶的制备方法可为：将新鲜豌豆叶片或南瓜叶片在磷酸盐缓冲液中进行破碎和离心，取上清液，向其中加入硫酸铵进行沉淀，收集沉淀物即为所述豌豆乙醇酸氧化酶和或南瓜乙醇酸氧化酶。

采用硫酸铵将豌豆和南瓜叶片中的酶沉淀出来，所得到的酶其实为多种氧化酶的混合物，这些氧化酶共同作用实现对乙醇酸的高效氧化，达到提高产物收率的目的。

优选地，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.5-8.0，该优选的pH下有利于乙醇酸氧化酶的充分溶出，所述上清液用碱液调pH为9.0-10.0，该条件下析出的乙醇酸氧化酶对羟基具有更高的氧化活性。

优选地，本发明酶法制备乙醛酸的方法具体可为：在乙醇酸水溶液中加入所述复合乙醇酸氧化酶以及有机胺、辅酶和黄素单核苷酸，进行催化氧化。所述复合乙醇酸氧化酶的用量为30-50U/mol乙醇酸。所述有机胺为二甲胺、三甲胺或三乙胺，所述辅酶为过氧化氢酶。所述有机胺的用量为乙醇酸质量的1-5％，所述辅酶的用量为0.5×10⁴-5×10⁴U/mol乙醇酸，所述黄素单核苷酸的用量为乙醇酸质量的0.05-0.2％。，所述乙醇酸水溶液中乙醇酸的浓度为0.1-0.5mol/L。

通过加入有机胺、辅酶和黄素单核苷酸，可以抑制产物乙醛酸的氧化，优选的浓度和用量有利于进一步提高产物的收率。由有机胺的用量可见，本发明采用复合乙醇酸氧化酶后有机胺的使用量仅为乙醇酸质量的0.05-0.2％，较现有技术显著降低。

优选地，所述催化氧化反应的温度为25-45℃，pH为4.0-10.0。该条件下酶体系可以最大程度地实现对羟基的氧化，保证产物的收率。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下实施例中所用的豌豆乙醇酸氧化酶的制备方法如下：

将新鲜豌豆叶片在2倍质量的pH8.0的磷酸盐缓冲液中进行细胞破碎，四层纱布过滤后8000rpm离心10min，取上清液，用氢氧化钠溶液调pH为9.0，然后向其中按照5wt％的比例加入硫酸铵，静置30min，然后14000rpm离心10min，收集沉淀物即为所述豌豆乙醇酸氧化酶。

以下实施例中所用的南瓜乙醇酸氧化酶的制备方法如下：

将新鲜南瓜叶片在2倍质量的pH8.0的磷酸盐缓冲液中进行细胞破碎，四层纱布过滤后8000rpm离心10min，取上清液，用氢氧化钠溶液调pH为10.0，然后向其中按照4.5wt％的比例加入硫酸铵，静置30min，然后14000rpm离心10min，收集沉淀物即为所述南瓜乙醇酸氧化酶。

实施例1

取乙醇酸380g，加纯化水溶解，加入57U豌豆乙醇酸氧化酶和143U南瓜乙醇酸氧化酶，然后加入0.4g(约1.1×10⁵U)过氧化氢酶和3.8g三甲胺，加纯化水定容至10L，用30wt％的氢氧化钠调节PH至7.0，升温至35-40℃反应5h。反应结束后过滤去除乙醇酸氧化酶，所得料液过微孔滤膜得乙醛酸溶液，其中乙醛酸含量为33.8g/L，产率91.4％。

实施例2

取乙醇酸190g，加纯化水溶解，加入25U豌豆乙醇酸氧化酶和50U南瓜乙醇酸氧化酶，然后加入0.4g(约1.1×10⁵U)过氧化氢酶和3.8g三乙胺，加纯化水定容至10L，用30wt％的氢氧化钠调节PH至10.0，升温至40-45℃反应5h。反应结束后过滤去除乙醇酸氧化酶，所得料液过微孔滤膜得乙醛酸溶液，其中乙醛酸含量为16.7g/L，产率90.3％。

实施例3

取乙醇酸76g，加纯化水溶解，加入7.8U豌豆乙醇酸氧化酶和22.2U南瓜乙醇酸氧化酶，然后加入0.1g(约2.7×10⁴U)过氧化氢酶和3.8g二甲胺，加纯化水定容至10L，用30wt％的氢氧化钠调节PH至4.0，升温至35-40℃反应3h。反应结束后过滤去除乙醇酸氧化酶，所得料液过微孔滤膜得乙醛酸溶液，其中乙醛酸含量为7.0g/L，产率94.6％。

对比例1

用菠菜乙醇酸氧化酶替换实施例1中的南瓜乙醇酸氧化酶，其余条件与实施例1相同，测得乙醛酸的产率为62.7％。

对比例2

用黄瓜乙醇酸氧化酶替换实施例1中的豌豆乙醇酸氧化酶，其余条件与实施例1相同，测得乙醛酸的产率为45.5％。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种酶法制备乙醛酸的方法，其特征在于，采用复合乙醇酸氧化酶进行乙醇酸的催化氧化反应，所述复合乙醇酸氧化酶由酶活比为0.35-0.5:1的豌豆乙醇酸氧化酶和南瓜乙醇酸氧化酶组成。

2.如权利要求1所述的酶法制备乙醛酸的方法，其特征在于，所述豌豆乙醇酸氧化酶和南瓜乙醇酸氧化酶分别采用豌豆叶和南瓜叶经硫酸铵沉淀法制得。

3.如权利要求2所述的酶法制备乙醛酸的方法，其特征在于，所述豌豆乙醇酸氧化酶和南瓜乙醇酸氧化酶的制备方法为：将新鲜豌豆叶片或南瓜叶片在磷酸盐缓冲液中进行破碎和离心，取上清液，向其中加入硫酸铵进行沉淀，收集沉淀物即为所述豌豆乙醇酸氧化酶和或南瓜乙醇酸氧化酶。

4.如权利要求3所述的酶法制备乙醛酸的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.5-8.0，所述上清液用碱液调pH为9.0-10.0。

5.如权利要求1所述的酶法制备乙醛酸的方法，其特征在于，在乙醇酸水溶液中加入所述复合乙醇酸氧化酶以及有机胺、辅酶和黄素单核苷酸，进行催化氧化。

6.如权利要求5所述的酶法制备乙醛酸的方法，其特征在于，所述复合乙醇酸氧化酶的用量为30-50U/mol乙醇酸。

7.如权利要求5所述的酶法制备乙醛酸的方法，其特征在于，所述有机胺为二甲胺、三甲胺或三乙胺，所述辅酶为过氧化氢酶。

8.如权利要求7所述的酶法制备乙醛酸的方法，其特征在于，所述有机胺的用量为乙醇酸质量的1-5％，所述辅酶的用量为0.5×10⁴-5×10⁴U/mol乙醇酸，所述黄素单核苷酸的用量为乙醇酸质量的0.05-0.2％。

9.如权利要求8所述的酶法制备乙醛酸的方法，其特征在于，所述乙醇酸水溶液中乙醇酸的浓度为0.1-0.5mol/L。

10.如权利要求5-9任一项所述的酶法制备乙醛酸的方法，其特征在于，所述催化氧化反应的温度为25-45℃，pH为4.0-10.0。