CN105461544B - 一种从酶转化液中分离提取2‑酮丁酸的方法 - Google Patents

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Abstract

一种从酶转化液中分离提取2‑酮丁酸的方法。采用酶催化法生产2‑酮丁酸时，酶催化液中除了含有2‑酮丁酸，还含有菌体、水溶性蛋白、色素、苏氨酸、钠盐等杂质，由于2‑酮丁酸具有在水相和有机相中易容、沸点低等特点，故分离提取困难。本方法首先通过双膜即微滤膜、超滤膜分离系统错流过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和色素，膜过滤液依次通过粉末活性炭脱色、加碱除蛋白、减压浓缩、阳离子交换柱除杂质、冷冻真空干燥操作步骤，得到纯度95.0％以上的2‑酮丁酸结晶，收率达到80％以上。本发明采用微滤和超滤双膜过滤菌体蛋白，菌体去除彻底，过滤液澄清透明；采用阳离子交换工艺除杂质，高效去除难分离的苏氨酸、钠盐等杂质。

Description

一种从酶转化液中分离提取2-酮丁酸的方法
技术领域
本发明涉及一种从酶转化液中分离提取2-酮丁酸的方法，属于发酵法生产有机酸的技术领域。
背景技术
2-酮丁酸又称a-羰基丁酸(a-Ketobutyric acid)，2-氧代丁酸(2-Oxobutyricacid)、3-甲基丙酮酸，分子式为C4H6O3，相对分子质量为102.09，熔点为31～32℃，沸点为82～84℃(16mmHg)，易溶于水和酒精，具有甜的烤香、奶油、焦糖和脂肪风味。是合成多种有用化合物的前体物质，如异亮氨酸、1-丙醇、正丁醇、2-羟基丁酸、保洛霉素、呋喃酮及一些食品添加剂等，特别地，2-酮丁酸能合成L-高丙氨酸，它是抗癫痫药物左乙拉西坦(LEV)和布瓦西坦片的一种重要前体。另一个下游产物4-羟基-L-异亮氨酸显示出了高效促进胰岛素分泌的能力。而利用2-酮丁酸生产1-丙醇和正丁醇进而合成高辛烷值的新型生物燃料取代传统的乙醇燃料，对节约能源，保护生态环境也起到了积极的作用。
2-酮丁酸的生产方法包括化学直接合成法和生物法，生物法生产2-酮基丁酸又包括酶法和微生物发酵法。化学合成法可以由草酸二乙酯和丙酸乙酯混合水解进行，化学合成的2-酮基丁酸至今一直用作进一步合成香料的中间体，如呋喃酮(5-乙基-3-羟基-4-甲基-2(5H)呋喃酮)，具有浓烈且特殊的香味，并以低浓度用作香料及食物的前调。酶法生产a-酮丁酸，如利用苏氨酸脱水酶催化苏氨酸生产a-酮基丁酸，直接以苏氨酸为底物，选育具有苏氨酸脱水酶活性的微生物，制成完整细胞催化剂，由于苏氨酸是比较廉价、方便得到的原料，此法可以快速生成一定量的2-酮丁酸产物。已知a-羟基丁酸仅仅经过一步氧化反应即可生成2-酮基丁酸，是酶法生产2-酮基丁酸的极佳底物，而利用含a-羟基氧化酶的微生物细胞转化a-羟基丁酸制备2-酮基丁酸的报道不多，马翠卿等选育具有a-羟酸氧化酶活性的假单胞菌，将菌体制备成具有a-羟酸氧化酶活性的完整细胞催化剂，并成功使a-羟基丁酸钠与O2反应制备出2-酮基丁酸钠，且转化率达到91.4％。
美国专利(US Patent 7015020)报道了一种利用丙酮酸脱羧酶催化的加成反应以CO2和丙醛为底物生产2-酮基丁酸，浓度为0.1mmoL/L的底物丙醛经反相液谱分离后，2-酮基丁酸的产率为52％。Furuyoshi Setsuo等人报道利用恶臭假单胞菌催化巴豆酸生产2-酮基丁酸的方法，先是在N-甲基氧化吗啉存在的条件下，催化巴豆酸生成2,3-二羟基丁酸，此步反应产率约为53％，然后用恶臭假单胞菌催化2,3-二羟基丁酸生产2-酮基丁酸，最适反应条件下，这一步摩尔转化率能达到47％，产量为4.8g/L,但该方法在经两步催化过程后，即由巴豆酸到2-酮基丁酸，其总体产率仅为25％，造成了底物的浪费。还有一些底物，如1,2-二丁醇、丁烯酸，也可以被用于利用生物催化法生产2-酮丁酸。
发酵法生产2-酮丁酸也有多例报道。美国专利(US Patent 7144715)报道一株粗糙脉胞菌的ilv-3突变体，以苏氨酸为底物生产2-酮基丁酸，通过优化培养配比，2-酮基丁酸产量可以达到8g/L，产率为90％，本法中巧合的是，缬氨酸是粗糙脉孢菌的ilv-1基因产物的激活剂，但也不能以大剂量加入，适量控制可促进2-酮基丁酸的积累。NakaharaTadaatsu等人在以硫胺素为限制因素的培养基上，筛选得到马红球菌IFO 3730，可以以1,2-丁二醇为碳源生产2-酮基丁酸，经过32h培养可将20g/L的1,2-丁二醇转变成15.7g/L的2-酮基丁酸，底物摩尔转化率约为68％。但1,2-丁二醇对获得食物成分而言并非优选，所以并不能确保在合成食物成分中微生物对食物成分或反应物的产生是无害的。天津科技大学陈宁等构建了一株2-酮基丁酸基因工程菌株，该菌株能够以葡萄糖为原料高效积累苏氨酸，通过过量表达苏氨酸脱水酶编码基因ilvA实现2-酮基丁酸的大量积累，发酵24h，2-酮基丁酸产量可以达到15g/L。
目前利用发酵法生产2-酮基丁酸最普遍的方法是通过选育L-苏氨酸脱水酶(ilvA基因编码)活力较高的微生物，在其合成并积累一定量苏氨酸的前提下，由L-苏氨酸脱水酶催化苏氨酸生成2-酮基丁酸，但通过发酵法生产a-酮丁酸产酸较低，副产物多，特别是和酮丁酸性质相近的杂酸如丙酮酸等杂酸较多，分离提取困难，造成发酵法放大生产受阻。
发明内容
本发明目的是提供一种新型的2-酮丁酸的分离提取工艺，改变现有生产工艺中存在的分离提取工艺复杂，收率低，产品纯度低，大量制备成本高等问题。本发明采用酶转化法生产2-酮丁酸，生产周期短，催化效率高，副产物少，分离提取相对容易。
针对上述问题，本发明课题组采用酶催化法生产2-酮丁酸，酶催化液含有2-酮丁酸、菌体、水溶性蛋白、色素、苏氨酸、钠盐等，根据发酵液的特点，开发了一种新型提取工艺技术，该工艺首先通过双膜即微滤膜、超滤膜分离系统错流过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和色素，膜过滤液依次通过粉末活性炭脱色、加碱除蛋白、减压浓缩、阳离子交换柱除杂质、冷冻真空干燥操作步骤，得到纯度95.0％以上的2-酮丁酸结晶，收率达到80％以上，具体步骤如下：
a、将2-酮丁酸酶转化液经活菌灭活，用稀盐酸调节pH为4.0-4.5，进入微滤膜分离系统进行微滤，得到去除菌体的2-酮丁酸微滤液；所述微滤膜分离系统采用中空纤维膜分离系统，微滤膜孔径为0.1-0.2um，操作温度为10～50℃，进膜压力与出膜压力差为0.05～0.1Mpa，过滤过程分多次加入纯化水顶洗，直至浓液中2-酮丁酸含量低于2.0g/L后停机，获得2-酮丁酸微滤液。
b、将经a步得到澄清的2-酮丁酸过滤液泵入超滤膜过滤器，过滤除蛋白，操作温度为10-50℃，操作压力差为0.05-0.1MPa，得到2-酮丁酸超滤过滤液。所述超滤膜过滤器采用中空纤维膜分离系统，截留分子量为6000。
c、将b步获得的超滤过滤液加入滤液重量的0.05％-2％的活性炭脱色，温度30-60℃，搅拌脱色20-30min，过滤获得2-酮丁酸脱色液，560nm透光90％以上。
d、将c步获得的脱色液加入氢氧化钠固体，调解pH至10.0以上，静置半小时，出现絮状蛋白沉淀后，加入液体重量的0.05％-2％的活性炭吸附絮凝蛋白，过滤后收集过滤液。
e、将d步获得的过滤液进行减压浓缩，浓缩至原体积液的15％-20％，获得2-酮丁酸浓缩液；
f、将e步获得的2-酮丁酸浓缩液上732阳离子交换树脂吸附钠离子、苏氨酸阳离子，收集pH小于4.0的2-酮丁酸流出液。
g、将f步获得的2-酮丁酸流出液放入-20℃冰箱结冰，然后将其放入冷冻真空干燥机内冷冻干燥，获得2-酮丁酸晶体。
本发明的优点和积极效果：
与现有工艺相比，本发明的方法具有以下优点：
1、本发明采用微滤和超滤双膜过滤菌体，去除菌体效果较好，过滤液澄清透明；
2、本发明采用阳离子交换工艺，高效去除难分离的钠盐、苏氨酸等杂质；
3、本发明采用冷冻真空干燥，避免了2-酮丁酸的挥发，提高了收率；
4、本发明提供一种新型的2-酮丁酸生产工艺，得到的2-酮丁酸晶体经高效液相分析仪测定纯度达95.0％以上。
具体实施方式
实施例1
a、取2-酮丁酸酶转化液5.0L(-酮丁酸含量42.3g/L)，用盐酸调节pH为4.0，进入微滤膜分离系统进行微滤，得到去除菌体的-酮丁酸微滤液；所述微滤膜分离系统采用中空纤维膜分离系统，微滤膜孔径为0.2um，操作温度为35℃，进膜压力与出膜压力差为0.1Mpa，过滤过程分多次加入纯化水顶洗，直至浓液中2-酮丁酸含量低于2.0g/L后停机，获得2-酮丁酸微滤液。清液2-酮丁酸回收率达96.2％，菌体去除率大于99.9％，膜通量达到89L·(m2·h)-1。
b、将经a步得到澄清的2-酮丁酸过滤液泵入超滤膜过滤器，过滤除蛋白，操作温度为35℃，操作压力差为0.1MPa，得到2-酮丁酸超滤过滤液。所述超滤膜过滤器采用中空纤维膜分离系统，截留分子量为6000。
c、将b步获得的超滤过滤液加入滤液重量的1.0％的活性炭脱色，温度50℃，搅拌脱色20min，过滤获得2-酮丁酸脱色液，560nm透光92.0％。
d、将c步获得的脱色液加入氢氧化钠固体，调解pH为10.6，静置半小时，出现絮状蛋白沉淀后，加入液体重量的1.0％的活性炭吸附絮凝蛋白，过滤后收集过滤液。
e、将d步获得的过滤液进行减压浓缩，浓缩至原体积液的20％，获得2-酮丁酸浓缩液；
f、将e步获得的2-酮丁酸浓缩液上732阳离子交换树脂吸附钠离子、苏氨酸阳离子，收集pH小于4.0的2-酮丁酸流出液。
g、将f步获得的2-酮丁酸流出液放入-20℃冰箱结冰，然后将其放入冷冻真空干燥机内冷冻干燥，获得2-酮丁酸晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重171.9g，计算收率为81.3％，纯炖为95.1％。
实施例2
取2-酮丁酸酶转化液6.8L(2-酮丁酸含量35.3g/L)，用盐酸调节pH为4.0，按照实施例1的方法进行微滤除菌体和超滤除蛋白(其中，微滤条件：微滤膜孔径为0.1um，温度为50℃，进出膜压力差为0.05Mpa；超滤条件：温度为20℃，操作压力差为0.05MPa)，超滤液用其重量1.5％的活性炭脱色，温度45℃，搅拌脱色25min，过滤获得2-酮丁酸脱色液，用氢氧化钠调pH为11.0后，加入脱色液重量1.5％的活性炭吸附絮状蛋白，然后进行减压蒸发至原体积液的18％，得到2-酮丁酸浓缩液，上732阳离子交换树脂，收集pH小于4.0的2-酮丁酸流出液，流出液放入-20℃冰箱结冰，然后将其放入冷冻真空干燥机内冷冻干燥，获得2-酮丁酸晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重192.3g，计算收率为80.1％，纯度为95.7％。
实施例3
取2-酮丁酸酶转化液8.4L(2-酮丁酸含量37.2g/L)，用盐酸调节pH为4.0，按照实施例1的方法进行微滤除菌体和超滤除蛋白(其中，微滤条件：微滤膜孔径为0.1um，温度为10℃，进出膜压力差为0.1Mpa；超滤条件：温度为50℃，操作压力差为0.08MPa)，超滤液用其重量1.8％的活性炭脱色，温度40℃，搅拌脱色30min，过滤获得2-酮丁酸脱色液，用氢氧化钠调pH为11.0后，加入脱色液重量1.8％的活性炭吸附絮状蛋白，然后进行减压蒸发至原体积液的20％，得到2-酮丁酸浓缩液，上732阳离子交换树脂，收集pH小于4.0的2-酮丁酸流出液，流出液放入-20℃冰箱结冰，然后将其放入冷冻真空干燥机内冷冻干燥，获得2-酮丁酸晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重255.0g，计算收率为81.6％，纯度为95.4％。

Claims (1)

1.一种从发酵液中分离提取2-酮丁酸的方法，该方法是从酶转化液中分离提取2-酮丁酸，酶催化液首先通过双膜即微滤膜、超滤膜分离系统错流过滤去除发酵液中的菌体、大部分蛋白和色素，膜过滤液依次通过粉末活性炭脱色、加碱除蛋白、减压浓缩、阳离子交换柱除杂质、冷冻真空干燥操作步骤，得到纯度95.0％以上的2-酮丁酸结晶，收率达到80％以上，具体步骤如下：
a、将2-酮丁酸酶转化液经活菌灭活，用稀盐酸调节pH为4.0-4.5，进入微滤膜分离系统进行微滤，得到去除菌体的2-酮丁酸微滤液；所述微滤膜分离系统采用中空纤维膜分离系统，微滤膜孔径为0.1-0.2um，操作温度为10～50℃，进膜压力与出膜压力差为0.05～0.1Mpa，过滤过程分多次加入纯化水顶洗，直至浓液中2-酮丁酸含量低于2.0g/L后停机，获得2-酮丁酸微滤液；
b、将经a步得到澄清的2-酮丁酸过滤液泵入超滤膜过滤器，过滤除蛋白，操作温度为20-35℃，操作压力差为0.05-0.1MPa，得到2-酮丁酸超滤过滤液；所述超滤膜过滤器采用中空纤维膜分离系统，截留分子量为6000；
c、将b步获得的超滤过滤液加入滤液重量的1.0％-1.5％的活性炭脱色，温度40-50℃，搅拌脱色20-30min，过滤获得2-酮丁酸脱色液，560nm透光90％以上；
d、将c步获得的脱色液加入氢氧化钠固体，调解pH至10.0以上，静置半小时，出现絮状蛋白沉淀后，加入液体重量的1.0％-2％的活性炭吸附絮凝蛋白，过滤后收集过滤液；
e、将d步获得的过滤液进行减压浓缩，浓缩至原体积液的15％-20％，获得2-酮丁酸浓缩液；
f、将e步获得的2-酮丁酸浓缩液上732阳离子交换树脂吸附钠离子、苏氨酸阳离子，收集pH小于4.0的2-酮丁酸流出液；
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