CN113413337A - 一种富含麦角硫因和烟酰胺的蕈菌提取液的制备方法 - Google Patents

一种富含麦角硫因和烟酰胺的蕈菌提取液的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种富含麦角硫因和烟酰胺的蕈菌提取液的制备方法。本发明的制备方法包括：在一定量的蕈菌冻干燥粉中加入细胞表面展示的壳聚糖酶、维生素C以及蒸馏水，控制提取温度在40‑60℃，pH值控制在5.5‑6.5；提取结束后，利用过滤或离心除去蕈菌残渣，对收集的滤液进一步微滤和超滤除掉表面展示的壳聚糖酶，并进行滤液的无菌检测。本发明通过非高温处理蕈菌的方式获得的提取液，富含麦角硫因和烟酰胺等抗氧化与抗炎活性物，可作为化妆品原料，达到抗氧化、抗炎及抗敏等护肤效果。

Description

一种富含麦角硫因和烟酰胺的蕈菌提取液的制备方法
技术领域
本发明涉及一种富含麦角硫因和烟酰胺的蕈菌提取液的制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
蕈菌是一类肉眼可见的大型真菌子实体，大多数属于担子菌亚门，食用蕈菌主要包括蘑菇属、木耳属、虫草属、灵芝属等，糙皮侧耳、猴头菇和杏鲍菇等属于常见食用蕈菌，它们的子实体有伞盖、伞柄等厚壁细胞组成。通过GC-MS、LC-MS以及光谱数据分析鉴定，这些蘑菇属的食用蕈菌含有人体不能自身合成的抗氧化物，如麦角硫因，此外也含有丰富的烟酰胺和麦角甾醇等活性物质。
1909年，有学者在研究麦角真菌Claviceps purpurea时分离出一种独特的白色结晶含硫化合物，后来被确定为2-硫基-L-组氨酸三甲基内盐，随后其被命名为麦角硫因(ergothioneine，EGT)，麦角硫因是一种无味、无色化合物，分子式为C9H16N3O2S，25℃时水溶解度极限值为0.9mol/L，分子结构中含有咪唑-2-硫酮基团。目前麦角硫因已经被收录到我国颁布的化妆品原料目录，成为清除氧自由基的重要抗氧化活性物。
人体和动物机体自身不能合成麦角硫因，只能从食物中摄取并积累在组织和细胞中。麦角硫因具有很强的抗氧化性，在机体内扮演着重要的角色。随着人们对抗氧化剂研究的不断深入，麦角硫因作为一种天然的生物活性物质受到人们广泛的关注，国外已有相关报道。
蕈菌中的糙皮侧耳、猴头菇和杏鲍菇等常见食用菌中麦角硫因的含量高且具有天然安全性，是制备麦角硫因的优良原料。目前，国内外对麦角硫因的研究多集中于抗氧化与抗炎等的活性功能研究。提取方面的报道一般为水或溶剂(如乙醇)对常见食用菌的简单浸提。由于麦角硫因易被氧化，其提取得率会受溶剂、温度等因素的影响很大。采用超声、微波破壁技术等物理手段虽然可以改善麦角硫因的提取得率，但在产热容易造成提取液的温度波动，破坏麦角硫因的稳定，同时这些方法在工业化生产的过程中存在放大难度以及高能耗等问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：目前提取蕈菌中活性成分的方法存在活性产物得率低、成本高等问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种富含麦角硫因和烟酰胺的蕈菌提取液的制备方法，包括：在蕈菌冻干燥粉中加入细胞表面展示的壳聚糖酶、维生素C以及蒸馏水，控制温度在40-60℃、pH值在5.5-6.5的条件下进行酶解提取，然后过滤和离心除去蕈菌残渣，收集滤液，进一步微滤和超滤除掉表面展示的壳聚糖酶，得到蕈菌提取液。
优选地，所述的细胞表面展示的壳聚糖酶的制备方法是参考申请号为201810382811.0的专利中的方法。
优选地，所述的蕈菌包括糙皮侧耳、猴头菇和杏鲍菇中的至少一种。
优选地，所述的蕈菌冻干燥粉、维生素C以及蒸馏水的比例为30～50g：0.02～0.06g：500mL。
优选地，所述酶解提取的时间为4～6h。
优选地，所述的离心的条件为：离心转速3000～5000转/分钟，离心时间5～20分钟。
优选地，所述的微滤采用0.22μm的滤膜，所述的超滤采用1KDa的滤膜。
本发明还提供了上述的富含麦角硫因和烟酰胺的蕈菌提取液的制备方法制备所得的蕈菌提取液在制备化妆品中的应用，所述的蕈菌提取液中的麦角硫因浓度为298.7～369.2mg/L，烟酰胺浓度为30.6～38.5mg/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1.本发明利用细胞包面展示的壳聚糖酶，可专一性水解几丁质与壳聚糖的β-1,4糖苷键，促进细胞内活性物质的溶出提取，从而区别于传统水提法或溶剂法；提高麦角硫因、烟酰胺等高活性化合物溶出，从而提升产物的功效成分的含量；
2.本发明在酶解过程中采用维生素C保护麦角硫因等的稳定，同时非高温的除菌工艺也避免了目标物的被分解；本发明的制备方法所得的提取液可作为化妆品原料，达到抗氧化、抗炎及抗敏等护肤效果。
附图说明
图1为实施例2的糙皮侧耳提取液中麦角硫因的HPLC检测图谱；
图2为实施例2的糙皮侧耳提取液中烟酰胺的HPLC检测图谱；
图3为实施例2的麦角硫因对照品的HPLC检测图谱；
图4为实施例2的烟酰胺对照品的HPLC检测图谱。
具体实施方式
为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下。
实施例1
细胞表面展示的壳聚糖酶的制备(制备方法参考申请号为201810382811.0的专利中壳聚糖酶的制备方法)：
取一支成功转化入IPTG诱导型表面展示的壳聚糖酶载体的大肠杆菌CN108，挑取CN108单菌落，接种于含有100ug/mL Kan的LB培养基中，250rpm，37℃培养12h后，以5％接种量接种于更大体积的相同的培养基中，继续37℃震荡培养至OD600为0.8时，加入IPTG使其终浓度为1.0mM，继续震荡培养至OD600为1.8。于4℃，12000g离心2min收集菌体，然后将菌体重悬于去离子水中，加入含DTT的2×SDS凝胶加样缓冲液，95℃水浴10min，12000g离心1min，取样进行SDS-PAGE分析，对比胞内表达，本表面展示体系表达了一个分子量约为50.8kDa的蛋白，与目的蛋白大小相吻合。将培养液冷冻离心后的菌体保存于4℃冰箱备用。
实施例2
糙皮侧耳提取液的制备及其麦角硫因和烟酰胺检测：
取过100目筛的糙皮侧耳冻干燥粉50g，加入蒸馏水500mL，加入0.1g/L的维生素C，再调pH值5.5，水浴温度达到40℃后，再加入适量实施例1制备的细胞表面展示的壳聚糖酶，缓慢搅拌，酶解提取6小时后停止水解。然后采用中速滤纸进行抽滤，抽滤获取的液体再采用4000转/分钟的转速离心10分钟。离心获得的液体采用0.22μm的滤膜微滤，然后再采用1K的滤膜进行超滤。获得的糙皮侧耳提取液进行HPLC分析和杂菌检测。
HPLC分析方法如下：
麦角硫因的液相色谱条件：
色谱柱：Kromasil 100-5NH2柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相采用乙腈-5mmol/L醋酸铵(80∶20，v:v)恒流洗脱；流速1.0mL/min；检测波长254nm；柱温30℃；进样量20μL。
烟酰胺的液相色谱条件：
色谱柱：UITimate XB-C18柱(250mm×4.6mm，5μm)；流动相:甲醇-0.05mol/L的pH6.0醋酸铵溶液(20∶80，v:v)；检测波长:262nm；柱温：30℃；流速：1.0mL/min。
麦角硫因和烟酰胺的HPLC检测图谱如图1和图2所示，通过如图3所示的麦角硫因对照品的HPLC检测图谱从而可确定图1中保留时间在4.007min左右的出峰为麦角硫因，通过如图4所示的烟酰胺对照品的HPLC检测图谱从而可确定图2中保留时间在5.865min的出峰为烟酰胺。通过HPLC分析检测，该提取液中麦角硫因浓度为369.2mg/L，烟酰胺浓度为38.5mg/L。
实施例3
杏鲍菇提取液的制备及其麦角硫因和烟酰胺检测：
取过100目筛的杏鲍菇冻干燥粉30g，加入蒸馏水500mL，加入0.05g/L的维生素C，再调pH值6.5，水浴温度达到60℃后，再加入适量实施例1制备的细胞表面展示的壳聚糖酶，缓慢搅拌，酶解提取4小时后停止水解。水解液采用中速滤纸进行抽滤，抽滤获取的液体再采用4000转/分钟的转速离心10分钟。离心获得的液体采用0.22μm的滤膜微滤，然后再采用1K的滤膜进行超滤。获得的杏鲍菇提取液进行HPLC分析和杂菌检测，分析与检测方法同实施例2。
通过HPLC分析，该提取液中麦角硫因浓度为298.7mg/L，烟酰胺浓度为30.6mg/L。
实施例4
猴头菇提取液的制备及其麦角硫因和烟酰胺检测：
取过100目筛的猴头菇冻干燥粉20g，加入蒸馏水500mL，加入0.075g/L的维生素C，再调pH值6.0，水浴温度达到55℃后，再加入适量实施例1制备的细胞表面展示的壳聚糖酶，缓慢搅拌，酶解提取4小时后停止水解。水解液采用中速滤纸进行抽滤，抽滤获取的液体再采用4000转/分钟的转速离心10分钟。离心获得的液体采用0.22μm的滤膜微滤，最后再采用1K的滤膜进行超滤。获得的猴头菇提取液进行HPLC分析和杂菌检测，分析与检测方法同实施例2。
通过HPLC分析，该提取液中麦角硫因浓度为340.9mg/L，烟酰胺浓度为37.1mg/L。
实施例5
蕈菌提取液细菌总数的检测：
1)培养基的配制
称取蛋白胨20g、牛肉膏3g、氯化钠5g、琼脂15g、卵磷脂1g、吐温807g、蒸馏水1000ml，加热溶解，将pH值调至7.2±0.2，高压蒸汽灭菌15min后冷却至室温，储存于冷暗处备用。
2)菌落培养
用无菌吸管吸取1:100稀释的提取液2mL，分别注入到两个灭菌的平皿内，每皿1mL。将熔化冷却至室温的1)中所述培养基倾注平皿内，每皿约15mL，另倾注一个不加样品的灭菌空平皿，做空白对照，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，至37℃培养箱内培养48h。
3)菌落计数
肉眼观察，点数菌落数，求出相同稀释度各平皿生长的平均菌落数，乘以样品稀释倍数即为细菌总数。
实施例2～4制备的蕈菌提取液细菌总数的数据如表1所示，检测结果均符合化妆品中微生物的细菌总数的控制指标与标准。
表1蕈菌提取液细菌总数指标
Figure BDA0003195321620000051
对比例1
未加壳聚糖酶处理的糙皮侧耳提取液的制备：
取过100目筛的糙皮侧耳冻干燥粉50g，加入蒸馏水500mL，加入0.1g/L的维生素C，再调pH值5.5，水浴温度达到40℃后，缓慢搅拌，提取6小时后停止水解。水解液的过滤使用中速滤纸进行抽滤，抽滤获取的液体再采用4000转/分钟的转速离心10分钟。离心获得的液体采用0.22μm的滤膜微滤，然后再采用1KDa的滤膜进行超滤。
获得的糙皮侧耳提取液进行HPLC分析和杂菌检测，分析与检测方法同实施例2。通过HPLC分析，该提取液中麦角硫因浓度为77.3mg/L，烟酰胺浓度为20.8mg/L。
上述实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种富含麦角硫因和烟酰胺的蕈菌提取液的制备方法，其特征在于，在蕈菌冻干燥粉中加入细胞表面展示的壳聚糖酶、维生素C以及蒸馏水，控制温度在40-60℃、pH值在5.5-6.5的条件下进行酶解提取，然后过滤和离心除去蕈菌残渣，收集滤液，进一步微滤和超滤除掉表面展示的壳聚糖酶，得到蕈菌提取液。
2.如权利要求1所述的富含麦角硫因和烟酰胺的蕈菌提取液的制备方法，其特征在于，所述的细胞表面展示的壳聚糖酶的制备方法是参考申请号为201810382811.0的专利中的方法。
3.如权利要求1所述的富含麦角硫因和烟酰胺的蕈菌提取液的制备方法，其特征在于，所述的蕈菌包括糙皮侧耳、猴头菇和杏鲍菇中的至少一种。
4.如权利要求1所述的富含麦角硫因和烟酰胺的蕈菌提取液的制备方法，其特征在于，所述的蕈菌冻干燥粉、维生素C以及蒸馏水的比例为30～50g：0.02～0.06g：500mL。
5.如权利要求1所述的富含麦角硫因和烟酰胺的蕈菌提取液的制备方法，其特征在于，所述酶解提取的时间为4～6h。
6.如权利要求1所述的富含麦角硫因和烟酰胺的蕈菌提取液的制备方法，其特征在于，所述的离心的条件为：离心转速3000～5000转/分钟，离心时间5～20分钟。
7.如权利要求1所述的富含麦角硫因和烟酰胺的蕈菌提取液的制备方法，其特征在于，所述的微滤采用0.22μm的滤膜，所述的超滤采用1KDa的滤膜。
8.如权利要求1～7中任意一项所述的富含麦角硫因和烟酰胺的蕈菌提取液的制备方法，其特征在于，所述的蕈菌提取液中的麦角硫因浓度为298.7～369.2mg/L，烟酰胺浓度为30.6～38.5mg/L。
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