TW201542813A - 製備高含量麥角硫因之珊瑚菇菌絲體液態培養方法 - Google Patents

Abstract

本發明係關於一種製備高含量麥角硫因之珊瑚菇菌絲體液態培養方法及培養液。根據本發明方法，例舉之最適的珊瑚菇菌絲體深層培養條件為：溫度25ºC，接種量5%，以2%葡萄糖為碳源，以0.5%酵母抽出物作為氮源，並於培養第7天時添加綜合胺基酸液(半胱胺酸8mM、組胺酸4mM及甲硫胺酸0.5mM)，可得菌絲體培養物之麥角硫因含量為14.57mg/g dw。

Description

製備高含量麥角硫因之珊瑚菇菌絲體液態培養方法

本發明係關於製備高含量麥角硫因之珊瑚菇菌絲體液態培養方法。更特別地，本發明係關於利用反應曲面法，決定胺基酸前驅物之最佳添加濃度與比例，生產得到高麥角硫因含量的珊瑚菇菌絲體，並用於以最佳液體培養條件，製備得含有高麥角硫因含量的培養液。

麥角硫因是一種Tanret於1909年研究麥角菌(Claviceps purpurea)時所分離出的一種低分子量硫醇化合物，麥角硫因為真菌之代謝產物，存在於植物及動物組織中，但人體與脊椎動物無法合成麥角硫因，因此僅能藉由攝取食物來吸收。Genghof(Journal of Bacteriology. 103(2)：475-478,1970)研究發現麥角硫因及其前驅物組胺酸三甲基內鹽(hercynine)在真菌及放線菌中可生成，另外，黏菌(Physarum polycephalum)也具有合成麥角硫因之能力。Askari(Journal of Biological Chemistry. 237：1615-1618,1962)指出麥角硫因可以由真菌合成，透過胺基酸來合成：組織胺(histidine)、甲硫胺酸(methionine)及半胱胺酸(cysteine)。麥角硫因是唯一可以發生2-硫-咪唑的胺基酸，在自然界以硫酮型和硫醇型存在，水溶液下以硫酮型為優勢(Franzoni et al,Biomedicine & Pharmacotherapy. 60：453-457,2006)。

黃齡誼等人曾利用深層培養提高杏鮑菇菌絲體之麥角硫因含量，於溫度25℃、10%接菌量、2%葡萄糖為碳源、0.5%酵母萃取物為氮源，以125rpm搖瓶培養，並在培養7天後加入4mM組胺酸，所得菌絲體麥角硫因含量為5.05mg/g dw，所以調整培養基組成或添加胺基酸前驅物，可 提高菇類菌絲體麥角硫因含量(毛正倫、梁志弘、黃齡誼。2013。中華民國發明專利第I-408226號)。

珊瑚菇(Pleurotus citrinopileatus Sing.)分類上隸屬於擔子菌綱(Basidiomycetes)，傘菌目(Agaricales)，側耳科(Pleurotaceae)，側耳屬(Pleurotus)。其子實體外型像珊瑚因而得名，在中國大陸又名金頂蘑、榆黃蘑、玉皇蘑，在台灣則以金頂側耳、黃金菇、玉米菇或玉皇菇命名(黃，1998)。珊瑚菇食味鮮美，香甜可口，富含蛋白質、胺基酸和維生素等多種營養成分，是美味食用菌之一，且因色澤金黃，豔麗美觀，受大眾歡迎。除了其食用性外，根據福建省三明真菌研究所所長黃年來編撰的中國大型真菌原色圖鑑(1998)中記載，珊瑚菇有入藥及滋補強壯的功效，對腎虛、陽萎和痢疾等狀都有一定的幫助。『中華本草』中記載，珊瑚菇性味甘，具有滋補強壯、止痢。主虛弱萎症、肺氣腫、痢疾。

人工培養的珊瑚菇其營養要求，一般以木屑、棉籽殼、甘蔗渣及廢棉等作為原料均可充分提供。pH 4以下，8以上出菇有困難，出菇最適pH為6.0~6.5。珊瑚菇是一種分解纖維素、木質素能力較強的食用菌，栽培時需要豐富的碳源和氮源，特別是氮源豐富時，菌絲生長速度快，子實體產量高(黃仕政、楊梅春、陳勁初。金頂側耳。鄉間小路。11：45,1999)。

近年來國內外利用深層發酵來培養菌絲體已十分普遍。此法可大量培養菌絲體，且所需時間甚短，又有幾項優點：1.菌絲體生長快速且生長週期短：由於液態培養可將通氣量、溫度、酸鹼度等設備，控制在最佳培養條件，於短時間內增殖大量菌絲體和具有生理活性的代謝產物。2.可工廠化生產、無季節性：食用菌液態培養於發酵設備中，不受季節性的限制。利用液體發酵培養，雖然可以縮短食用真菌類的培養時間，但是如何控制菌絲體的生產、如何有效控制生產出有用的二次代謝物(如抗腫瘤物質或降血糖物質)、如何 分離出有效的成分，以及有效成分的產品差異如何，技術與品質的控制都是必須克服的問題，這樣才能提升食用菇菌類產品品質而有助於人體健康(王培銘。食品工業。34：32-35,2002；蔡淑瑤，國立中興大學食品暨應用生物科技學系博士論文，2006)。

而深層培養之培養基是微生物生長的基本食物，也是合成代謝產物的反應物來源，適當的選配營養源成分與比例，才能充分利用微生物來生產所需的代謝物，若無法搭配出適當的營養源，則可能會使得單位時間內的發酵成果無法符合經濟效益，造成後續的分離、純化難度提高並增加操作成本，因此有效率地選出營養成分與搭配培養基的比例是非常重要的。本研究首先以一次因子方式針對珊瑚菇菌絲體液態培養之生長條件加以探討，並在培養過程中分析菌絲體乾重、麥角硫因含量、發酵液殘糖及pH值變化之關係。

本發明基於以上之目的發現，利用一次一因子及反應曲面法，針對珊瑚菇菌絲體液態培養之生長條件加以探討，找出添加麥角硫因的三種胺基酸前驅物最佳濃度比例，可獲得高麥角硫因含量之珊瑚菇菌絲體。

於是，本發明之一方面係關於，一種製備高含量麥角硫因之珊瑚菇菌絲體液態培養方法。

於本發明之一些具體實施態樣，所述之高含量麥角硫因之珊瑚菇菌絲體製備方法包含：將珊瑚菇菌絲體於25ºC下振盪培養7天進行活化；將菌絲體培養液接種原以5%接種量，於初始pH值為10.0或不調整培養基初始pH值且包含2%碳源及0.5%氮源之培養基中，於溫度20-25℃下進行振盪培養10-20天，並於培養第7天時添加綜合胺基酸液(包含半胱胺酸8mM、組胺酸4mM及甲硫胺酸0.5mM)；及收取高含量麥角硫因之珊瑚菇菌絲體。

於本發明之一項具體實施態樣，所述之碳源為葡萄糖。於本發明之另一項具體實施態樣，所述之碳源為胰蛋白腖。

於本發明之一項具體實施態樣，所述之氮源為酵母抽出物。於本發明之另一項具體實施態樣，所述之氮源為胰蛋白腖。

於本發明之一項具體實施態樣，所述之高含量麥角硫因之珊瑚菇菌絲體製備方法進一步包含將收取之菌絲體進行冷凍乾燥的步驟。

本發明之另一方面，係關於一種經由本發明之液態培養方法製得之高含量麥角硫因珊瑚菇菌絲體。

於本發明之一些具體實施態樣，所述之高含量麥角硫因珊瑚菇菌絲體含有之麥角硫因含量為5.0mg/g dw以上。於其他具體實施態樣，所述之高含量麥角硫因珊瑚菇菌絲體含有之麥角硫因含量為10-20mg/g dw。

本發明之又另一方面，係關於一種食品添加劑，其包含經由本發明之液態培養方法製得之高含量麥角硫因的珊瑚菇菌絲體。

圖1為珊瑚菇液態發酵不同天數後調整pH值至10，對發酵22天之菌絲體乾重、最終pH值(A)及麥角硫因含量(B)之影響。

圖2係顯示珊瑚菇液態發酵期間，分別添加濃度4mM之胺基酸(半胱胺酸、組胺酸及甲硫胺酸)對發酵22天之珊瑚菇菌絲體乾重(A)及麥角硫因含量(B)之影響。

圖3為固定組胺酸(X ₂)濃度為4.00mM時，半胱胺酸(X ₁)及甲硫胺酸(X ₃)對深層培養珊瑚菇菌絲體麥角硫因含量(mg/g dw)之等高線圖(A)與曲面圖(B)。

圖4係顯示以胰蛋白腖(Tryptone)為氮源時珊瑚菇液態發酵之菌絲體乾重、殘糖量、最終pH值(A)及麥角硫因含量(B)之變化。

圖5係顯示圖6-4、培養第7天添加RSM最適條件胺基酸時珊瑚菇菌絲體乾重、殘糖量、最終pH值(A)及麥角硫因含量(B)之變化。

圖6係顯示珊瑚菇子實體和菌絲體70%乙醇萃取物之抗氧化力。

圖7係顯示珊瑚菇子實體和菌絲體70%乙醇萃取物之還原力。

本發明之其他特色及優點將於下列實施範例中被進一步舉例與說明，而該實施範例僅作為輔助說明，並非用於限制本發明之範圍。

本研究所使用之珊瑚菇(Pleurotus citrinopileatus)菌絲體，係由彰化縣大村鄉蕈優生物科技有限公司所購得之珊瑚菇子實體所繼代培養而得。珊瑚菇菌種保存於PDA(potato dextrose agar)斜面培養基並存放於4℃冰箱中，使用前已滅菌過之接種刀切取一小塊至PDA平板培養基上並置於25℃培養箱中進行活化。接種時則取於平板培養基上活化完成之菌種，同樣已滅菌過之接種刀切取外圍活性較強之菌絲作為菌種，其大小均為5mm x 5mm，接入PDB(potato dextrose broth)液體培養基中並置於25℃培養箱靜置培養，觀察菌絲體生長型態，培養12天菌落直徑平均為70~80mm，菌絲呈現白色。收集菌絲並凍乾。

以一次一因子方式探討含高麥角硫因之珊瑚菇菌絲體培養條件

本實施例主要係利用深層培養方式，探討各式培養條件對於珊瑚菇菌絲體生成麥角硫因之影響，並在培養過 程中分析菌絲體乾重、麥角硫因含量、發酵液殘糖量及pH值變化之關係。珊瑚菇菌絲體保存於PDA(potato dextrose agar)培養基中並儲存於4℃。接種時，取活化完成之培養皿，以滅菌後之接種刀切取外圍活性較強之菌絲作為菌種，其大小約為5mm×5mm，並放於25ºC下培養活化。於無菌操作台中，將保存於PDA之菌種以滅菌解剖刀切取5塊5mm×5mm大小之菌酛，將菌酛接種於盛裝100mL液態培養基(每升含有：20g葡萄糖、5g酵母抽出物、2g (NH₄)₂SO₄、0.5g KH₂PO₄,、0.5g K₂HPO₄及0.5g MgSO₄．7 H₂O)之250mL凹槽三角錐型瓶，以125rpm，25ºC下進行振盪培養7天做為種菌酛。將所得之菌絲體及培養基以Waring blender攪碎15秒，得一菌絲體均質液，然後取5mL均質液放入內裝95mL液態培養基之250mL三角錐型瓶中，作為接種原。本實驗則循環以培養於三角瓶振盪培養基中之菌絲體為接種原。

本實驗使用兩種培養基，分別為基礎培養基與礦物質培養基，兩種培養基組成成分如下表1所示。分別盛裝95mL之基礎培養基及礦物質培養基於250mL三角錐型瓶中，經由殺菌釜滅菌後，加入5mL製備好之接種原(5%)，於125rpm，25ºC下進行振盪培養。培養期間每2天分析菌絲乾重與麥角硫因含量、發酵液pH值及殘糖量，觀察珊瑚菇利用基礎培養基和礦物質培養基液態發酵之生長曲線，以選擇較適合的培養基做為後續實驗培養基，並進一步探討其最適溫度(實驗溫度為20、25及30ºC)、接種量(1、5、10、15及20%接種原)、初始pH值(實驗組為以0.1N HCl或0.1N NaOH將培養基pH值調整為2.0、4.0、8.0、10.0、12.0及14.0，而對照組為不調pH值)、碳源(包括：果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖及葡萄糖(作為控制組)，濃度皆為2%)，以及氮源(包括：玉米浸出液、麥芽抽出物、蛋白腖、胰蛋白腖及酵母抽出物(作為控制組)，濃度皆為0.5%)等培養之因子，以找出液態發酵珊瑚菇產生麥角硫因之最適培養基組成及最佳生長採收 天數，以三重覆進行各項試驗。

^a 組成物及濃度為每公升含：2.3g MgSO₄．7H₂O、0.1g FeSO₄．7H₂O、0.023g MnSO₄．H₂O、0.06g ZnSO₄．7H₂O、0.08g CaCl₂．2H₂O及0.03g CuSO₄．5H₂O

總合所有以一次一因子方式，利用不同培養基成分及培養條件進行之實驗結果可知，在5%接種量，使用葡萄糖為碳源和酵母抽出物為氮源，並調酸鹼值pH至10，於溫度25℃下經22天的時間培養，可得到最高量菌絲體(8.28g/L)及麥角硫因(10.65mg/g dw)產量。培養初期，基礎培養基及礦物質培養基兩種培養基中，珊瑚菇菌絲體乾重皆隨著培養時間增加而增加，當使用基礎培養基時，其菌絲體乾重於第14天達最高為8.70g/L；使用礦物質培養基時，菌絲體乾重則於第6天可達最高為11.22g/L。

以二階段刺激探討含高麥角硫因之珊瑚菇菌絲體最適培養條件

接著，進一步探討調整液態培養基pH值及添加前驅物之時機，觀察不同時間點調整pH值或添加前驅物對於菌絲體之乾重及麥角硫因含量之影響。本實驗設計於培養期間第0、7及14天時，以0.1N NaOH，將培養基pH值調整為 10，以二階段刺激方式進行菌絲體麥角硫因含量之探討。此外，也設計於培養第0、7及14天，分別添加麥角硫因之三種胺基酸前驅物：半胱胺酸(cysteine)、組胺酸(histidine)及甲硫胺酸(methionine)。培養22天後，分析珊瑚菇菌絲乾重與麥角硫因含量、發酵液pH值。

已知珊瑚菇菌絲最適生長pH為5.0至6.5，但由前述以一次一因子探討珊瑚菇菌絲體生成麥角硫因之結果發現，調整培養基pH值至10，能有效提升菌絲體之麥角硫因含量。

結果由圖1之結果顯示，於培養第0天即調整培養基pH值所得到的珊瑚菇菌絲體乾重最高，依序為第0天(8.28g/L)>控制組(7.59g/L)>第14天(6.20g/L)>第7天(4.41g/L)。而菌絲體麥角硫因含量方面，也同樣是培養第0天含量最高(10.65mg/g dw)，其他依序為控制組(1.81mg/g dw)>第14天(1.43mg/g dw)>第7天(0.55mg/g dw)。考慮每公升所得菌絲產量經換算，可得每公升發酵液中菌絲體之麥角硫因含量為第0天(88.19mg/L)>控制組(13.75mg/L)>第14天(8.46mg/L)>第7天(2.40mg/L)。由以上結果可知，於培養第0天即調整培養基pH值所得到的珊瑚菇菌絲體乾重(8.28g/L)及麥角硫因含量最高(10.65mg/g dw)，每公升發酵液中菌絲體之麥角硫因含量為88.19mg/L，比控制組提高了6.4倍。

而於不同生長階段添加胺基酸前驅物，皆對珊瑚菇菌絲體生長造成影響(圖2A)，但都能有效提高菌絲體麥角硫因之含量，其中又以培養第7天時添加4mM半胱胺酸所得菌絲體麥角硫因含量最高為16.31mg/g dw，比控制組提升了將近9倍(圖2B)。

以反應曲面法探討含高麥角硫因之珊瑚菇菌絲體最適培養條件

反應曲面法經常用來探討最佳培養基組成與改 善食品生產製程等，透過實驗設計可有效降低實驗次數及了解各因子間的交互關係。於是，本實驗進一步利用反應曲面法探討三種前驅物之間交互作用，以找出前驅物之最佳濃度比例。

由前述液態培養一次一因子之試驗所得結果，選出對珊瑚菇液態發酵生長時具有顯著差異之培養條件。本實驗首先以半胱胺酸(X ₁)、組胺酸(X ₂)及甲硫胺酸(X ₃)三因子為獨立變數，所選取的濃度範圍為0.64~7.36mM進行第一批實驗，經三因子之中心混成設計(central composite design,CCD)，可得到20組不同添加濃度之組合。以半胱胺酸(cysteine)、組胺酸(histidine)及甲硫胺酸(methionine)為三獨立變數，進行三因子五階層中心混成設計，總共需進行20組試驗；進行試驗時，則依表所設計的各因子濃度或條件配製於液態培養基中，並於培養箱中培養22天。所得珊瑚菇菌絲體凍乾後分析菌體乾重及麥角硫因含量，發酵液pH值，實驗結果以電腦軟體SAS(8.0版，SAS Institute Inc.,Cary,NC)及SigmaPlot(12.0版，SPSS,Inc.,Chicago,IL)計算並繪圖，可分別獲得菌絲體乾重及麥角硫因含量之二次方程式，再繪製成反應曲面圖及等高線。

由第二批菌絲體麥角硫因含量之變異數分析可知，半胱胺酸(X ₁)、組胺酸(X ₂)及甲硫胺酸(X ₃)，三種獨立變數對於珊瑚菇菌絲體麥角硫因含量而言，在0.1%下皆具有顯著性。而且，由下表2顯示，描述三種獨立變數半胱胺酸(X ₁)、組胺酸(X ₂)及甲硫胺酸(X ₃)對於麥角硫因含量之三元二次數學模式的P值小於0.0001，統計上具有顯著性差異，也就是說，即此反應曲面模式之信賴度高達99.99%；Lack of fit之P值為0.6633，所以此描述生物質之三元二次數學模式是成立的。變異係數為10.12%，表示描述生物質之數學模式具有高準確性及可靠性。而檢定係數為0.9880，也代表其相關係數為0.9940。

經ANOVA(analysis of variance)分析後所得經由三變數深層培養發酵珊瑚菇菌絲體麥角硫因含量之三元二次方程式：

Y _麥角硫因 ：深層培養珊瑚菇菌絲體之麥角硫因含量(mg/g)。

表3係列示利用反應曲面法所得之液態發酵珊瑚菇麥角硫因其不同變數分析結果，顯示針對獨立變數組胺酸(X ₂)之P值皆有顯著差異，而獨立變數半胱胺酸(X ₁)、及甲硫胺酸(X ₃)及X ₁ X ₂、X ₁ X ₃、X ₂ X ₃之交互效應皆不具有顯著性差異；在二次效應中，和皆具有顯著差異。因此，固定組胺酸(X ₂)之濃度為4mM，探討半胱胺酸(X ₁)及甲硫胺酸(X ₃)之間的交互作用，並繪製出菌絲體麥角硫因含量之等高線圖及反應曲面圖，如圖3所示，兩圖中皆可清楚看到最適點的產生。

綜合以上結果，此三元二次數學模式是成立的，而在等高線圖中與反應曲面圖中可清楚看到最適點的產生。從等高線圖中可預測當半胱胺酸、組胺酸及甲硫胺酸之正規值為0時菌絲體麥角硫因含量可達到最高，回推至實際濃度依序為半胱胺酸8mM、組胺酸4mM及甲硫胺酸0.5mM，帶 正規值於方程式中計算可得麥角硫因預測值，其值為13.90mg/g dw，而實際添加前驅物所得珊瑚菇菌絲體麥角硫因含量之實驗值為14.57mg/g dw，由此可見實際實驗值與經方程式所得之預測值結果相近，其菌絲體麥角硫因含量甚至更高。

可提高菌絲體麥角硫因含量之因子對珊瑚菇菌絲體生長曲線之影響

由先前一次一因子條件探討時發現，透過調整培養基pH值至10、以胰蛋白腖為氮源及適時添加前驅物胺基酸都可以有效提升珊瑚菇菌絲體麥角硫因之含量，然而先前實驗探討天數皆為22天，而改變培養因子或添加前驅物之濃度及比例，皆可能影響珊瑚菇菌絲體之生長曲線，因此，本實驗進一步探討因子對於菌絲體生長曲線的影響，以找出能有效提高麥角硫因含量同時縮短珊瑚菇菌絲體深層發酵培養時間的因子。

根據珊瑚菇菌絲體於培養基pH值為10時之生長曲線，於培養至第20天時菌絲體麥角硫因含量達最高7.48mg/g dw，但隨著培養時間增加培養基所產生類似氨之物質越多氣味濃厚。以胰蛋白腖為氮源時，珊瑚菇菌絲體之麥角硫因含量培養至第20天時，麥角硫因含量可達最高，其值為5.50mg/g dw，此時菌絲體乾重為7.12g/L，經換算後每公升可得之麥角硫因含量為39.17mg/L，相較於以酵母萃取物為氮源時之1.81mg/g dw及18.17mg/L高出許多，此外以胰蛋白腖作為珊瑚菇深層培養之氮源時，培養至12天菌絲體之麥角硫因，即可達以酵母萃取物為氮源時22天之含量，確實能有效縮短發酵天數(圖4)。

針對胺基酸前驅物之探討，於培養第7天添加綜合胺基酸液於培養基時，珊瑚菇菌絲體於第8天後隨著培養時間的增加菌絲乾重逐漸下降。菌絲體麥角硫因含量方面，與不添加任何胺基酸前驅物時珊瑚菇菌絲體之生長曲線比較，同樣培養第16天時，添加綜合胺基酸液所得之珊瑚菇菌 絲體中麥角硫因含量較不添加前驅物之菌絲體麥角硫因含量提高了34倍；而添加綜合胺基酸液所得之珊瑚菇菌絲體於培養第10天時菌絲體中麥角硫因含量(2.54mg/g dw)，已達到相似於不添加前驅物之菌絲體培養22天(2.87mg/g dw)之麥角硫因含量(參見圖5)。與添加單一胺基酸前驅物(4mM半胱胺酸)時珊瑚菇菌絲體之生長曲線比較，同樣培養第16天時，僅添加單一種胺基酸濃度之菌絲體麥角硫因含量為8.04mg/g dw，可知，添加綜合胺基酸液所得菌絲體麥角硫因含量，較只添加單一種胺基酸時好。由以上結果可知，於深層培養珊瑚菇之培養基中添加綜合胺基酸液，可有效縮短珊瑚菇菌絲體生成麥角硫因之時間，且能顯著提升珊瑚菇菌絲體中麥角硫因之含量。

高麥角硫因之珊瑚菇菌絲體之活性物質及抗氧化分析

由先前反應曲面法之實驗結果可知，珊瑚菇液態培養期間，添加綜合胺基酸液於培養基中可有效提高菌絲體麥角硫因之含量，而所得之菌絲簡稱為含高麥角硫因之珊瑚菇菌絲體(high ergothioneine Pleurotus citrinopileatus mycelia,HEPM)。目前利用液態發酵所得之菇類菌絲體，已有許多使用在營養食品或機能性食品的配方上，作為食品原料，在產品化學組成和非揮發性呈味成分方面，與產品接受度有高度相關性，然而在文獻回顧過程中發現，針對珊瑚菇子實體與菌絲體非揮發性呈味成分部分較少相關之研究。因此，本研究目的欲了解HEPM和低麥角硫因含量之菌絲體(low ergothioneine Pleurotus citrinopileatus mycelia,LEPM)的一般組成成分、非揮發性呈味成分包括可溶性糖和糖醇、游離胺基酸及5'-核苷酸等成分上之差異性，也探討兩種菌絲體中生物活性成分，如麥角固醇、腺苷及GABA含量上之差異，並與珊瑚菇子實體比較。

菌絲體培養時，取0.250L珊瑚菇液態菌種接於 裝有4.75L液態培養基之10L桌上型發酵槽中，所使用的液態培養基組成同液態菌種，攪拌轉速125rpm，通氣量1vvm於25ºC下培養，培養期間不添加胺基酸前驅物，培養第14天回收菌絲，利用100mesh篩網將菌絲體與發酵液分離，以去離子水清洗菌絲體，並將菌絲體凍乾，所得菌絲體為低麥角硫因之珊瑚菇菌絲體，以下即簡稱為LEPM菌絲體。取20mL液態菌種接裝有180液態培養基之500mL三角瓶中並於25ºC，125rpm培養，使用之培養基組成同液態菌種，於培養第7天時添加綜合胺基酸液，並於培養第22天回收菌絲，利用100mesh篩網將菌絲體與發酵液分離，菌絲體以去離子水清洗，隨即冷凍乾燥，所得菌絲體為含高麥角硫因之珊瑚菇菌絲體，以下簡稱為HEPM(high ergothioneine Pleurotus citrinopileatus mycelia)菌絲體。綜合胺基酸液為配製高濃度之胺基酸液，以0.22μl濾膜過濾後再添加，使其於培養基中含量為8mM半胱胺酸、4mM組胺酸及0.5mM甲硫胺酸。

珊瑚菇子實體和兩種麥角硫因含量不同之菌絲體經凍乾後其水分含量於統計下不具有顯著性差異，水分含量範圍在8.88~9.03%。菇類主要成分之一為碳水化合物之糖質，占菇類成分的40~70%。以乾重為基準來看，HEPM含有較高量的碳水化合物，其含量為53.47%。在粗蛋白質含量方面，菇類蛋白質含量約為乾物重之19%~35%，雖然蛋白質含量低於動物性食品，但能為良好之蛋白質來源，由分析結果顯示，珊瑚菇子實體與HEPM和LEPM兩種菌絲體之粗蛋白質含量不具有顯著性差異，其蛋白質範圍為33.83~34.23%。

珊瑚菇子實體含有之可溶性糖及糖醇有阿拉伯糖(arabinose)、乳糖(lactose)、甘露糖醇(mannitol)、核糖(ribose)和海藻糖(trehalose)，其中甘露糖醇含量最高為46.57mg/g，占總可溶性糖的50.5%，阿拉伯糖及海藻糖次之，含量分別為16.28和15.27mg/g。在HEPM含有之可溶性糖及糖醇為甘露糖醇、核糖和海藻糖。HEPM中核糖含量最高，其值為 18.58mg/g，占總可溶性糖的39.17%，甘露糖醇及海藻糖次之，分別為16.07和12.87mg/g。由以上結果可知，在珊瑚菇子實體及HEPM菌絲體中皆含有甘露糖醇、核糖和海藻糖。

珊瑚菇子實體之游離胺基酸含量顯著高於HEPM及LEPM菌絲體；此外，在菌絲體游離胺基酸組成中與麥角硫因有關之胺基酸前驅物含量，甲硫胺酸皆未偵測到；由於培養HEPM菌絲體之培養基中添加了高濃度4mM的組胺酸，所以組胺酸含量方面，HEPM菌絲體較LEPM菌絲體高出許多。在核甘酸含量方面，HEPM菌絲體中總5'-核苷酸含量為200.44mg/g，顯著高於子實體和LEPM菌絲體。在生理活性物質方面，HEPM菌絲體之麥角固醇含量與GABA含量，皆顯著高於珊瑚菇子實體和LEPM菌絲體。腺苷含量則以子實體含量較高，其值為5.53mg/g，顯著高於HEPM和LEPM菌絲體。

針對珊瑚菇子實體、HEPM及LEPM兩種麥角硫因含量不同之菌絲體，探討其70%乙醇萃取物之抗氧化性質及所含抗氧化成分。以70%乙醇萃取珊瑚菇子實體、HEPM與LEPM菌絲體，萃取後經減壓濃縮至乾燥，再直接用以抗氧化成分或以70%乙醇稀釋成不同濃度(0.1~10.0mg/mL)作為抗氧化性質分析用。本研究所分析的抗氧化性質之項目包括：抗氧化力、還原力、清除DPPH自由基、螯合亞鐵離子及TEAC抗氧化能力，並測定70%乙醇萃取物中抗氧化物質的含量。更進一步將實驗所得的各種抗氧化性質的評估結果，利用線性迴歸之內、外差法加以換算後，以EC₅₀(Effective concentration)值來表示，可更了解珊瑚菇子實體、HEPM與LEPM兩種菌絲體其70%乙醇萃取物之抗氧化性質；而再經70%乙醇萃取率的換算將更明白多少量的珊瑚菇子實體和菌絲體粉末可表現出EC₅₀的效果。並利用相關係數(r)評估抗氧化成分與抗氧化能力之EC₅₀值之間的相關性。

抗氧化力的測定是以共軛雙烯化合物之生成做為指標，實驗的原理是利用不飽和脂肪酸(如亞麻油酸)氧 化初期時會因脫氫作用而形成自由基，此自由基再經分子內重排而產生共軛雙烯鍵，共軛雙烯化合物可經由測定最大吸收波長234nm之吸光值而得其生成量，用以判定測試樣品是否與自由基結合，而降低共軛雙烯化合物生成，吸光值愈低表示其抗氧化能力愈強，或以抑制過氧化百分比表示，即其抑制率愈高抗氧化效果愈佳。

由圖6可知，珊瑚菇子實體、HEPM及LEPM兩種菌絲體之70%乙醇萃取物之抗氧化力，會隨萃取物濃度之增加而提高。當濃度為0.1mg/mL時，珊瑚菇子實體與HEPM及LEPM兩種菌絲體之抗氧化力皆不具有顯著性差異，其抗氧化力為45.75~50.65%，皆較BHA(93.09%)及α-生育酚(90.02%)差，但較抗壞血酸的抗氧化能力(3.02%)好。當濃度為0.5mg/mL時，子實體之抗氧化力為77.91%，顯著高於HEPM菌絲體(63.11%)及LEPM(61.72%)。當濃度為5.0mg/mL時，HEPM菌絲體(76.52%)之抗氧化力則高於LEPM菌絲體(71.44%)，而珊瑚菇子實體之抗氧化力可高達97.87%與標準品BHA(98.46%)相當。當濃度提高為10.0mg/mL時，HEPM菌絲體之抗氧化能力為82.47%，顯著高於LEPM(79.17%)。

還原力的測定是以普魯士藍(Fe₄[Fe(CN)₆]₃)之生成量做為指標，其主要的原理將赤血鹽(potassium ferricyanide,K₃Fe(CN)₆)還原成黃血鹽(K₄Fe(CN)₆)後，再與三價鐵離子作用生成普魯士藍，並以分光光度計在最大吸收波長700nm下測定普魯士藍含量，用以檢測樣品之還原力。樣品若將鐵離子還原成亞鐵離子，再與三價鐵生成普魯士藍而使吸光值上升，則表示樣品之還原力愈強。由圖7可知，在還原力方面，以HEPM菌絲體之還原力效果最佳。當樣品濃度為1.0mg/mL時，HEPM菌絲體還原力可達0.59，顯著高於子實體(0.34)和LEPM菌絲體(0.35)。而當濃度提高為5.0mg/mL時，HEPM菌絲體還原力即高達1.14，顯著高於子實體(1.02)。

此外，在清除DPPH自由基能力方面，以HEPM菌絲體之清除DPPH自由基能效果最佳，其EC₅₀濃度為0.29mg/mL。在螯合亞鐵離子能力方面，珊瑚菇子實體之70%乙醇萃取物其EC₅₀濃度為0.29mg/mL，顯著低於HEPM和LEPM菌絲體。在TEAC抗氧化力方面，珊瑚菇子實體之70%乙醇萃取物其EC₅₀濃度為3.14mg/mL，顯著低於HEPM和LEPM菌絲體。萃取物物抗氧化成分方面，HEPM菌絲體之70%乙醇萃取物中麥角硫因含量為61.53mg/g，顯著高於珊瑚菇子實體(17.04mg/g)和LEPM菌絲體(3.84mg/g)。整體而言，HEPM菌絲體之70%乙醇萃取物其抗氧化性質優於珊瑚菇子實體和LEPM菌絲體，整合結果參見下表4。

各數值係以平均值±SE表示(n=3)。不同字母表示具有顯著差異P<0.05。

以上結果可知，HEPM菌絲體之70%乙醇萃取物其抗氧化力、還原力及清除DPPH自由基能力方面皆有不錯的效果，當70%乙醇萃取物濃度為0.08mg/mL時，即可達50%的抗氧化力，與珊瑚菇子實體(0.09mg/mL)沒有顯著差異。整體而言，HEPM菌絲體之70%乙醇萃取物的抗氧化性質優於珊瑚菇子實體和LEPM菌絲體。

抗氧化成分組成方面，HEPM菌絲體之70%乙醇萃取物中總多酚含量為89.54mg/g，顯著高於珊瑚菇子實體(35.76mg/g)和LEPM(30.38mg/g)；換算成粉末，HEPM菌絲體樣品中總多酚含量(21.20mg/g)>珊瑚菇子實體(8.17mg/g)>LEPM菌絲體(2.97mg/g)，參見下表5。

^a 各數值係以平均值±SE表示(n=3)。不同字母表示具有顯著差異P<0.05。

麥角硫因為真菌之代謝產物，主要存在於植物及動物組織中，但由於人體與脊椎動物無法合成麥角硫因，因此僅能藉由攝取食物來吸收。研究指出，菇類(每克乾重約含0.1-1mg麥角硫因)與藍綠藻(cyanobacteria)是麥角硫因 最好的食物來源。Lin(International Journal of Medicinal Mushrooms. 15：315-323,2013)分析49種食藥用菇類麥角硫因含量，包括9種子實體、39種菌絲體和一種營養細胞，其中以側耳屬(Pleurotus)所得麥角硫因含量較高。本發明係揭示於最適培養基條件下培養後所得含高麥角硫因之HEPM菌絲體，本發明方法所得之HEPM菌絲體之70%乙醇萃取物中麥角硫因含量可達61.53mg/g，顯著高於珊瑚菇子實體(17.04mg/g)和LEPM菌絲體(3.84mg/g)；換算成粉末乾重，HEPM菌絲體樣品中麥角硫因含量(14.57mg/g dw)>珊瑚菇子實體(3.89mg/g dw)>LEPM菌絲體(0.37mg/g dw)。

統合以上結果可知，經過最適培養條件培養以及添加胺基酸前驅物誘導下，珊瑚菇菌絲體中麥角硫因含量可提高39倍，故本發明之深層液體培養方法可獲得含高麥角硫因之珊瑚菇菌絲體，且該菌絲體具有優異的抗氧化力、還原力及清除DPPH自由基能力，可用於生產麥角硫因之發酵菌種酛。再者，本發明培養方法所製得之菌絲體不僅具有高含量麥角硫因，並具有良好的抗氧化性質及抗氧化成分，且不影響珊瑚菇原有的鮮味，故可做為高營養成分的食品來源或添加物。

Claims (9)

1. 一種製備高含量麥角硫因之珊瑚菇菌絲體的液態培養方法，其特徵在於包含：將珊瑚菇菌絲體於25ºC下振盪培養7天進行活化；將菌絲體培養液接種原以5%接種量，於初始pH值為10.0或不調整培養基初始pH值且包含2%碳源及0.5%氮源之培養基中，於溫度20-25℃下進行振盪培養10-20天，並於培養第7天時添加綜合胺基酸液(包含半胱胺酸8mM、組胺酸4mM及甲硫胺酸0.5mM)；及收取高含量麥角硫因之珊瑚菇菌絲體。
2. 如請求項1所述之方法，其進一步包含將收取之珊瑚菇菌絲體進行冷凍乾燥的步驟。
3. 如請求項1所述之方法，其中該碳源為葡萄糖。
4. 如請求項1所述之方法，其中該氮源為酵母抽出物。
5. 如請求項1所述之方法，其中該氮源為胰蛋白腖。
6. 一種由如請求項1所述之方法製得之高含量麥角硫因之珊瑚菇菌絲體。
7. 如請求項6所述之高含量麥角硫因之珊瑚菇菌絲體，其中該菌絲體含有之麥角硫因含量為5.0mg/g dw以上。
8. 如請求項6所述之高含量麥角硫因之珊瑚菇菌絲體，其中該菌絲體含有之麥角硫因含量為10-20mg/g dw。
9. 一種食品添加劑，其包含如請求項6所述之高含量麥角硫因之珊瑚菇菌絲體。