CN109082386A - 一株改善牛瘤胃蛋氨酸营养的微生物及其应用 - Google Patents

Abstract

一株改善牛瘤胃蛋氨酸营养的微生物及其应用，本发明的微生物热带假丝酵母菌TYM‑01已于2018年01月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15251。通过实验证明：本发明的微生物具有提高牛瘤胃蛋氨酸产量和总蛋白水平的作用，同时还可以适度的改善瘤胃的PH值以及提高日粮的消化率，增加养殖经济效益，不影响食品安全，无环境污染，具有很好的应用前景。

Description

一株改善牛瘤胃蛋氨酸营养的微生物及其应用

技术领域

本发明涉及饲料领域，涉及一种微生物添加剂，具体涉及一株改善牛瘤胃蛋氨酸营养的微生物及其应用。

技术背景

蛋氨酸是唯一含硫元素的必需氨基酸。对于玉米—豆饼型日粮而言，蛋氨酸是奶牛合成乳和乳脂肪最主要的限制性氨基酸。蛋氨酸在反刍动物体内用于蛋白质合成，并能转变成胱氨酸，满足胱氨酸的需要，还能提供活性甲基和羟基基团，供机体合成胆碱、角质素、核酸，促进细胞增殖和动物生长。蛋氨酸还具有提高动物免疫力和抗霉菌毒素的作用。因此人们通过在奶牛日粮中添加瘤胃保护性蛋氨酸来提高有效到达真胃和小肠的蛋氨酸，这种方法可减少氨基酸在瘤胃的降解，提高蛋白质的利用率。但是瘤胃保护性蛋氨酸的种类形式和加工技术等影响因素对其发挥作用有着重大的影响。因此，通过给奶牛添加微生态饲料添加剂来提高内源性营养素（蛋氨酸）的产量已成为奶牛业生产的一项重要课题。

目前，在牛生产中通过提高牛瘤胃内可产生蛋氨酸的微生物的数量来提高内源性蛋氨酸的水平的报道较少，因此，从牛瘤胃中分离具有产生并分泌蛋氨酸功能的菌株为牛提供充足的内源蛋氨酸具有重要的意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株热带假丝酵母菌TYM-01。

本发明提供的热带假丝酵母菌TYM-01的保藏编号为CGMCC No.15251。

本发明的另一个目的是提供热带假丝酵母菌TYM-01的新用途。

本发明提供了上述热带假丝酵母菌TYM-01或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在提高瘤胃内蛋氨酸水平的应用。

本发明还提供了上述热带假丝酵母菌TYM-01或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂在提高瘤胃内总蛋白水平的应用。

本发明还有一个目的是提供一种产品。

本发明提供的产品的活性成分为上述热带假丝酵母菌TYM-01或其菌悬液或其培养液或其发酵产物或含有其的菌剂；

所述产品具有如下1)-2)中任一种功能：

1)提高牛瘤胃内蛋氨酸水平；

2)提高瘤胃内总蛋白水平。

本发明还有一个目的是提供一种提高瘤胃内蛋氨酸水平的方法。

本发明提供的提高瘤胃内蛋氨酸水平的方法包括如下步骤：用上述热带假丝酵母菌TYM-01或其菌悬液通过饲喂牛来提高牛瘤胃内蛋氨酸水平。

本发明提供了一种微生物热带假丝酵母菌TYM-01，该菌株已于2018年01月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15251。通过实验证明：本发明的微生物热带假丝酵母菌TYM-01不仅具有提高牛瘤胃蛋氨酸水平的功能，可用于提高牛瘤胃总蛋白水平，具有良好的应用前景。

保藏说明

菌种名称：热带假丝酵母

拉丁名：Candida tropicalis

菌株编号：TYM-01

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2018年01月22日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.15251。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1、热带假丝酵母菌TYM-01菌株的分离与鉴定

1.1热带假丝酵母菌TYM-01菌株的分离

1.1.1菌种的筛选

取瘤胃内容物1g（或瘤胃液1mL）与9mL无菌水放入装有灭菌小玻璃珠的无菌离心管中，充分混合10min后再静置5min，取上层悬液1mL添加到装有9mL无菌水的试管中，振荡混匀，并依此法分别制得梯度稀释倍数为10^-2、10^-3和10^-4的瘤胃内容物(或瘤胃液)悬液。

1.1.2涂平板培养

取各梯度稀释倍数的瘤胃内容物（或瘤胃液）悬液200μL加至平板培养基的中央，使用无菌的三角形玻璃涂布器由内至外轻轻涂布均匀^[42]。将培养皿做好标记后，连同厌氧产气包和厌氧指示剂一同放入厌氧培养袋中，39℃培养并每天观察生长情况及厌氧指示剂的颜色变化，确保培养袋中一直处于厌氧状态。如果指示剂的颜色由粉红色变成蓝紫色，则表明培养袋中有氧气进入，需要立刻更换新的厌氧产气包或更换无法密封的厌氧培养袋。

1.1.3分离纯化培养及革兰染色镜检

待平板培养基上有单一菌落出现后，用接种环挑取单一菌落，将其一部分用于革兰氏染色镜检，另一部分进行三区划线分离培养。将镜检中所占比例较大的菌株作为目标菌株，将划线后的培养基12个为一组，做好标记，连同厌氧产气包与厌氧指示剂一同装入厌氧产气包中39℃培养，期间每天观察生长情况和厌氧指示剂的颜色变化。待划线的第三区有单一菌落出现后，重复进行镜检与纯化培养，直至得到纯培养菌株。

1.1.4菌株游离蛋氨酸合成量的检测

将分离得到的菌株接种到蛋氨酸缺陷液体培养基中，39℃条件下厌氧培养48h-72h，并以培养基作为对照，委托青岛科标检测研究院有限公司对样品中游离蛋氨酸的含量进行检测。若检测结果表明培养基中游离蛋氨酸的含量升高，则该菌留作目标菌，继续进行后续试验；若培养基中游离蛋氨酸的含量没有升高或升高不明显，则将该菌株视为无效菌株，弃置不用，重新进行上述筛选试验，直到找到能够使培养基中游离蛋氨酸含量升高的菌株为止。

而试验之所以选择测定游离蛋氨酸的含量而非水解蛋氨酸的含量，是为了排除微生物自身的结构蛋白及其合成的菌体蛋白中蛋氨酸成分对试验结果造成的影响。这样做虽然使得蛋氨酸检测水平较低，但能够保证结果的真实准确。

蛋氨酸缺陷液体培养基中蛋氨酸含量的检测结果显示，接种了该菌株的菌液中蛋氨酸的含量为4.386 mg/L与空白对照组相比提高了3.124mg/L，有明显的提高。因此将该菌株留作目标菌株。

2、热带假丝酵母菌TYM-01菌株的分子鉴定

将TYM-01菌株接种于优化后培养基（葡萄糖20.0g/L、无氨基酸酵母10.0g/L、NaCl5.0g/L、MgSO₄7.0g/L和KH₂PO₄5.0g/L）中。培养条件为在发酵温度35℃、装液量3.5L、发酵时间36h、接种量180mL或发酵温度37℃、装液量2.5L、发酵时间34h、接种量180mL。取菌株培养液1mL，12000rpm离心1min，收集菌体于2ml离心管中，采用DNA提取试剂盒提取DNA。对得到的细菌基因组DNA进行PCR扩增。得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后用于测序。通用引物的合成及PCR产物的测序工作均委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行。

所用16SrRNA通用引物的序列为：

上游引物：5`-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3`，

下游引物：5`-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3`

电泳检测PCR产物并测序，测序结果表明，该菌的16SrRNA长度为523bp，经GenBank数据库的BLAST比对显示，该菌株与热带假丝酵母菌株Candida tropicalis strain的同源性为99%。结合革兰氏染色镜检结果、菌落的形态、16SrRNA测序结果以及生化反应结果，可以确定，以牛瘤胃内容物为样品，经蛋氨酸缺陷培养基筛选得到的菌株为热带假丝酵母菌，属隐球酵母目、隐球酵母科，并将其命名为热带假丝酵母（Candida tropicalis） TYM-1。

综合上述鉴定结果，TYM-1菌株名称为热带假丝酵母菌，其分类命名为Candida tropicalis，该菌株已于2018年01月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.15251。

实施例2、热带假丝酵母菌TYM-01菌株的牛瘤胃发酵体外模拟试验

1 瘤胃发酵模拟及样品采集

为准确模拟瘤胃发酵情况，试验需准确称取4g日粮置于500mL三角瓶中，随后加入瘤胃液60mL，有研究表明，当瘤胃液与人工唾液的体积比例为1：2.5时二者的协同作用最强，因此人工唾液的添加量为150mL，调整pH值至6.5并用硅胶软塞封口。其中，实验组添加热带假丝酵母菌，根据Chung等人的研究结果，添加量约为5×10⁷CFU/瓶，实验组与对照组各设置3组重复。将三角瓶连同厌氧产气包和厌氧指示剂一同放入厌氧培养袋中，于39℃摇床中厌氧培养，并分别于0h、6h、18h、24h四个时间点取样5mL，随后对样品中游离蛋氨酸、总蛋白的含量及pH值进行测定。

2指标检测

2.1、游离蛋氨酸含量及总蛋白含量的检测委托青岛科标检测研究院有限公司进行；pH值的测定于实验室完成。

2.2、待取样结束后过滤发酵液，将滤渣连同提前称重的滤纸一起置于烘箱中45℃烘至恒重，测得其消化率。

3结果

为了了解Candida tropical TYM001在牛瘤胃发酵过程中所起作用以及瘤胃pH值、总蛋白含量等指标的变化情况，因此特别进行了瘤胃模拟体外发酵试验。

由表1可知，本试验中，无论是试验组还是对照组，其pH值均呈现出先下降后上升的趋势，并且由于缓冲物质——人工唾液的加入，其变化范围不大。但对照组发酵24h时的pH值与试验伊始相比仍然有所下降，而添加了Candida tropical TYM001的试验组却有所提高。当牛采食了大量谷物或碳水化合物含量较高的日粮后，其瘤胃pH值会迅速降低，有可能造成牛瘤胃酸中毒。此病在牛养殖过程中十分常见，给养殖业带来了相当大的麻烦和损失。而Candida tropical TYM001的添加能够在一定程度上对瘤胃pH降低起到缓解和改善的作用。同时，pH值在合理范围内的升高有利于纤维素分解菌活性的增强，对日粮中粗饲料比重较大的反刍动物而言，这无疑有着重要意义。

同时热带假丝酵母菌自身的多种代谢产物也能够刺激瘤胃微生物的生长与繁殖，促进瘤胃中饲料的的快速分解，这也解释了试验组消化率高于对照组的原因。而大量繁殖的瘤胃微生物在加速饲粮分解的同时，也合成了数量可观的菌体蛋白，使得瘤胃内总蛋白的水平升高。对照组总蛋白含量的变化趋势，呈现出先增多后降低的趋势，在发酵18h时达到最大值0.54g/100g，甚至超过了试验组，但在发酵到24h后迅速下降到0.24g/100g。造成这种现象的原因很有可能是随着发酵时间的增加，瘤胃液中原有的微生物大量繁殖，使得发酵液中总蛋白含量升高，但当营养物质被消耗殆尽后，瘤胃微生物开始大量死亡，导致发酵24h时总蛋白含量降低。而添加了Candida tropical TYM001的试验组与之相比，虽然总蛋白含量的整体变化并不明显，但在发酵24h后，发酵液中总蛋白的水平依然保持一个相对较高的水平，这说明该菌株的加入能够促进瘤胃微生物的活性，并在相对较长的时间内维持瘤胃微生物的稳定。

表1 瘤胃发酵体外模拟试验结果

根据Chalupa的研究显示，人为添加的蛋氨酸在牛瘤胃中只能存在3h便会被瘤胃微生物利用合成菌体蛋白。由表2可以看出，对照组与试验组发酵液中游离蛋氨酸的变化趋势均呈现出先降低后升高的变化趋势，但添加了Candida tropical TYM001的试验组游离蛋氨酸的含量水平明显高于对照组。对照组的发酵液中游离蛋氨酸含量之所以也有所升高，是因为其中也含有能够合成蛋氨酸的微生物。而试验组通过Candida tropical TYM001的添加进一步强化了蛋氨酸的合成量。这证明本试验分离得到的该株热带假丝酵母菌能够很好的适应瘤胃环境，能够切实有效的提高瘤胃环境的蛋氨酸含量，且不会对瘤胃中原有的微生物产生毒害作用。

由瘤胃模拟体外发酵结果能明显看出，不论是添加了Candida tropical TYM001的试验组还是未处理的对照组，其游离蛋氨酸含量的变化均呈现出先升高后降低的趋势，而水解蛋氨酸含量（即样品中总蛋氨酸含量）呈现出先下降、后升高、再下降的趋势。

试验组游离蛋氨酸在0h测得的量要略小于对照组，但并无显著差异，有可能是人为添加的Candida tropical TYM001快速的消耗了一部分游离蛋氨酸用以满足自身的代谢需要。而在18h测得结果显示，试验组游离蛋氨酸的含量超过了对照组，且差异显著（P＜0.05），这表明Candida tropical TYM001确实能够有效的向环境中分泌蛋氨酸。而24h测试的结果显示，虽然试验组游离蛋氨酸含量高于对照组，但并无统计学意义，且整体呈现下降趋势，造成这种结果的原因可能是随着发酵时间的推移，瘤胃液中原有的菌群大量繁殖，以至于人为添加的Candida tropical TYM001的蛋氨酸合成能力远远无法满足其他菌群的需求。

表2 试验组与对照组蛋氨酸含量变化的差异性分析

注：P＜0.05表明不同处理组间差异显著;P＜0.01表明不同处理组之间差异极显著

由表3可知，通过比较试验组与对照组水解氨基酸含量（即样品中总蛋氨酸含量）发现，当发酵达到6h时，虽然水解氨基酸含量的整体趋势下降，但试验组明显高于对照组，且差异显著（P＜0.05），该时间点样品中蛋氨酸总量之所以会下降，有可能是瘤胃液中原本存在的菌群大量消耗培养基中的蛋氨酸以维持自身的生命需要，用以合成其他种类氨基酸，而此时Candida tropical TYM001及原有的蛋氨酸合成菌的合成能力有限，合成量低于消耗量。而18h测得的水解氨基酸含量有所上升，且试验组的结果与对照组相比差异极显著（P＜0.01），参照游离蛋氨酸变化趋势可知此时是Candida tropical TYM001合成蛋氨酸的高峰期，而总蛋白的变化趋势表明此时对照组中有大量的菌体蛋白合成，其中不乏由蛋氨酸组成的蛋白，因而水解蛋氨酸含量在18h升高。24h测得的水解蛋氨酸含量，试验组和对照组均呈下降趋势，但试验组略高于对照组，这也很好的证明了人为添加Candida tropical TYM001的蛋氨酸合成能力随着发酵进程的不断推进，呈现出衰弱的趋势。但我们通过水解蛋氨酸变化的整体趋势不难看出，添加了Candida tropical TYM001的试验组较对照组相比其变化趋势呈现出平稳的状态，这说明Candida tropical TYM001不仅能够合成和分泌蛋氨酸，而且瘤胃中原有的菌群确实能够对其进行有效利用，从而使瘤胃中蛋氨酸的整体水平呈现出一种稳定的状态。

表3 试验组与对照组蛋氨酸含量随时间变化的差异性分析

注：同列数据上标字母不同者差异显著（P＜0.05）

实施例3、肉牛育成期饲喂热带假丝酵母菌TYM-01菌株的使用方法

1、适用阶段

根据肉牛的生理特点和瘤胃微生物区系的稳定程度，推荐热带假丝酵母菌TYM-01菌株于6月龄后肉牛使用。

2、推荐用量

该菌株在应用时，根据肉牛育成期的饲养管理，热带假丝酵母TYM-01以每日摄入活菌数为4.0×10⁸CFU~8.0×10⁸CFU为标准菌，同时添加硫酸镁2~4g作为补充硫元素，尿素1~2g作为补充氮素。

3、使用效果

该菌株可提高育成期平均日增重4.50%。

实施例4、奶牛泌乳期饲喂热带假丝酵母菌TYM-01菌株的使用方法

1、适用阶段

根据奶牛的生理特点和瘤胃微生物区系的稳定程度，推荐热带假丝酵母菌TYM-01菌株于6月龄后奶牛使用。

2、推荐用量

该菌株在应用时，根据奶牛的饲养管理，热带假丝酵母TYM-01以每日摄入活菌数为6.0×10⁸CFU~1.0×10⁹CFU为标准菌，同时添加硫酸镁3~5g作为补充硫元素，尿素1.5~2.5g作为补充氮素。

3、使用效果

该菌株可提高育成期奶牛平均日增重5.00%，泌乳期奶牛乳蛋白提高5.50%。

序列表

<110> 锦州医科大学

<120> 一株改善牛瘤胃蛋氨酸营养的微生物及其应用

<130> 1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 523

<212> DNA

<213> 热带假丝酵母(Candida tropicalis)

<400> 2

ccgtaggtga cctgcggaag gatcattact gatttgctta attgcaccac atgtgttttt 60

tattgaacaa atttctttgg tggcgggagc aatcctaccg ccagaggtta taactaaacc 120

aaacttttta tttacagtca aacttgattt attattacaa tagtcaaaac tttcaacaac 180

ggatctcttg gttctcgcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgatacgt aatatgaatt 240

gcagatattc gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg cgccctttgg tattccaaag 300

ggcatgcctg tttgagcgtc atttctccct caaacccccg ggtttggtgt tgagcaatac 360

gctaggtttg tttgaaagaa tttaacgtgg aaacttattt taagcgactt aggtttatcc 420

aaaaacgctt attttgctag tggccaccac aatttatttc ataactttga cctcaaatca 480

ggtaggacta cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg agg 523

Claims (3)

1.一株改善牛瘤胃蛋氨酸营养的微生物，其特征在于该微生物为热带假丝酵母TYM-01，已于2018年01月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15251。

2.根据权利要求1所述的一株改善牛瘤胃蛋氨酸营养的微生物的应用，其特征在于，根据肉牛育成期的饲养管理，热带假丝酵母TYM-01以每日摄入活菌数为4.0×10⁸CFU~8.0×10⁸CFU为标准菌，同时添加硫酸镁2~4g作为补充硫元素，尿素1~2g作为补充氮素。

3.根据权利要求1所述的一株改善牛瘤胃蛋氨酸营养的微生物的应用，其特征在于，根据奶牛的饲养管理，热带假丝酵母TYM-01以每日摄入活菌数为6.0×10⁸CFU~1.0×10⁹CFU为标准菌，同时添加硫酸镁3~5g作为补充硫元素，尿素1.5~2.5g作为补充氮素。