CN108813161A - 一种秸秆生物饲料原料的预处理方法 - Google Patents

一种秸秆生物饲料原料的预处理方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，属于生物饲料技术领域；本发明以秸秆为主要原料，首先通过碱液对粉碎的玉米秸秆进行预处理，然后通过漆酶和白腐菌联合脱毒的方法，脱除预处理过程中产生的多种抑制发酵菌群的酚类化合物，再将脉孢菌接种到脱毒后的玉米秸秆上进行发酵，以获得木质素降低，真蛋白显著增加的秸秆饲料原料，营养物质丰富，易消化，为秸秆的高效饲料化应用提供了一条新途径。

Description

一种秸秆生物饲料原料的预处理方法
技术领域
本发明涉及一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，具体涉及一种秸秆碱处理、生物法脱毒、发酵产真蛋白的生物饲料原料制备方法，属于生物饲料技术领域。
背景技术
玉米秸秆的细胞壁由木质素，半纤维素，纤维素紧密连接组成，这个紧密的网络结构能够抵抗生物质糖化。为了改变这种复杂的结构，以及便于酶的水解和后续发酵步骤，所以预处理就变得十分有必要。预处理是分解难降解生物质的基本工艺，合适的预处理方式可以提高秸秆孔隙率，扩大酶与底物之间相互作用区域，最终可以提高玉米秸秆的降解率。其中木质素是生物质材料的主要组成部分，也是酶解过程中最重要的限制因素之一。目前用到的预处理方式很多，一般包括物理处理（粉碎），化学处理（酸，碱，碱/氧化，湿式氧化，臭氧分解）和生物预处理（真菌降解）。实验证明，碱预处理过程对木质素具有良好的降解效果，一般用到的碱溶液包括NaOH、KOH、Ca(OH)2、NH3·H2O等，其中NaOH预处理研究最为透彻，预处理效果也较好，但是其与KOH一样，价格较高，暂时无法降低其使用成本，不利于规模化生产。氨处理虽然也能达到较好的效果，但是氨挥发性大，有刺鼻气味，不适合大规模使用，而氢氧化钙的优点除了可以达到较好的预处理效果外，其价格低廉，而且反应可以在常温条件下进行，不需要大的设备投入。不仅如此，残留在秸秆中的钙元素还可以作为营养物质被动物利用。
经过预处理之后木质纤维素一般都会产生各种不同的抑制物，碱预处理会产生酚类化合物（如香草醛，丁香醛）、酸类化合物（如十六烷酸，己酸）、酮类化合物以及烷烃类等，其中酚类物质是毒性较大的一类化合物。因此，人们一直在研究提高木质纤维素预处理后脱毒的效果，降低预处理过程中产生的化合物对后期发酵过程中微生物的生长繁殖过程。
目前对预处理原料进行脱毒的方法主要分为三类，物理法脱毒、化学法脱毒、生物法脱毒。物理法脱毒包括水洗，加热蒸发，活性炭吸附，液液萃取，固液萃取等形式，不适合大规模的脱毒流程。水洗的办法可以脱去很多水溶性的抑制物，但是会对水资源造成极大的浪费及污染。加热蒸发的方法可以降低部分易挥发抑制物的浓度，但同时会增加非挥发性化合物的浓度，一些高浓度的化合物对微生物的生长繁殖有很大的抑制作用，大大阻碍了生产过程，对后期的发酵也有很强的干扰作用。活性炭具有较强的吸附性，常被用来脱毒，但是其对抑制剂的吸附作用受到水解液的性质及处理温度、时间的影响，而且对抑制剂的性质有一定的要求。有机溶剂萃取的方法常用于混合物的分离，萃取剂的选择比较广泛，不需要发生化学反应，操作简单，且容易把混合物分离。但是萃取不一定彻底，而且一些常用的有机溶剂易燃，有毒，大规模萃取需要的成本较大。化学方法包括沉淀有毒物质，或者使某些抑制剂在一定pH条件下电离，从而改变化合物的毒性，但是对有毒化合物的去除有一定的局限性，而且成本一般较大。近年来随着对水解液脱毒研究的深入，生物法脱毒得到了越来越多研究人员的关注。生物法脱毒是指使用特定的酶或者微生物作用于水解液中的有毒化合物并改变其组成，其相对于理化脱毒来说操作简单明确且脱毒条件温和，是一种高效环保的脱毒方式。酶法脱毒具有专一性和高效性，其中利用最广泛的酶是漆酶，其脱毒过程简单，不需要其他条件的辅助，而且对一些酚类物质具有较好的脱除效果，使其工业实用性大大增强。
发明内容
本发明目的是克服现有技术中存在的技术问题，提供一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，使木质素和半纤维素得到一定程度的降解，同时减少秸秆混合物中抑制物的浓度。
在氢氧化钙作用下可以破坏秸秆的部分木质素和半纤维素，以及纤维素、半纤维素和木质素的交联结构，增加秸秆木质纤维素结构的可及性。利用碱处理和生物法脱毒相结合的预处理方法，可以得到结构松散，消化率高的生物饲料原料。
为达到上述技术目的，本发明采用的技术方案如下：
一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，具体包括如下步骤：
碱处理：通过氢氧化钙在一定温度条件下对秸秆进行处理一定时间，降解木质素和半纤维素，待冷却至室温后称取部分秸秆，添加一定量水溶解充分后固液分离，液体组分用二氯甲烷萃取测定酚类抑制物含量。
所述碱处理，是将秸秆与氢氧化钙混合，混合物中氢氧化钙质量占比为0.5%~10%，混合物含水量为50~90%，温度条件为20-100℃，时间为2-72h。
所述的酚类物质测定方法是称取部分半固态秸秆加水溶解，二氯甲烷萃取测定脱毒前后秸秆中酚类物质含量。
脱毒：将碱处理后秸秆混合物调节pH至5-7，添加一定量的离子液辅助，通过漆酶快速脱毒，之后再添加白腐菌液态培养菌丝体联合作用，或同时加入漆酶和白腐菌液态培养菌丝体脱毒，以降低碱处理过程中产生的抑制物的浓度。
所述调节pH至 5-7，所述离子为Cu2+和Mn2+；所述添加Cu2+使其终浓度为1-100mg/L，添加Mn2+使其终浓度为1-100mg/L。
所述的漆酶脱毒，漆酶添加量为0.01-1%，活性为1000-10000U/mL，漆酶脱毒温度为20-50℃，时间为20-300min。
所述的白腐菌脱毒，按秸秆质量计，白腐菌菌丝体添加量为0.1-10%，脱毒温度为20-30℃，时间为10-50h。
所述的白腐菌为黄孢原毛平革菌（Panerochaete chrysosporium）。
脉孢菌发酵预处理：在脱毒过程结束之后，制备脉孢菌发酵培养基，按10%接种量接入脉孢菌，发酵温度25-30℃，时间为48-96h，发酵湿度为50-80%。
所述脉孢菌为粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、好食脉孢菌（Neurosporasitophila）、间型脉孢菌（Neurospora intermedia）中的任意一种或多种。
所述脉孢菌发酵培养基为：加入脱毒预处理之后的玉米秸秆，按重量计，加入尿素占0.1-2%，硫酸铵占0.1-2%，葡萄糖占0.1-2%，培养基最终含水量为50-80%。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现如下：
与常规的预处理方法相比，本方法利用简单的碱处理方式降解秸秆中木质素和半纤维素，增加了木质纤维素的可及性。漆酶脱毒过程增加了pH调控和离子调控，大大缩短了漆酶降解抑制物的周期；漆酶和黄孢原毛平革菌联合作用大幅度降低了抑制物的浓度，两者协同作用效果远远优于单独脱毒的效果，减弱了碱预处理产生的抑制物对后期发酵过程中真菌生长的影响。碱预处理可以较好的破坏秸秆的木质素成分，便于后期的酶解和发酵过程，提升秸秆的适口性，便于动物消化。而碱处理过程中用到的氢氧化钙价格低，残留在秸秆中的钙元素还可以作为营养物质被动物利用，适合用于对玉米秸秆的预处理过程。同时经过脉孢菌发酵之后饲料中真蛋白含量得到很大程度提高，大大增加了秸秆作为动物饲料原料的营养价值。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图。
图2是实施例1中经过碱处理后二氯甲烷萃取测定秸秆中酚类物质结果。
图3是实施例1中经过脱毒之后测定的酚类物质含量色谱图。
图4是实施例2中脱毒之后测定的酚类物质含量色谱图。
图5是实施例3中漆酶和黄孢原毛平革菌同时加入脱毒24h后酚类物质含量色谱图。
图6是实施例4中秸秆在20℃碱处理72h后测定的酚类物质含量色谱图。
图7是实施例4中漆酶和黄孢原毛平革菌同时加入脱毒24h后测定的酚类物质含量色谱图。
图8是实施例5中秸秆在100℃碱处理后测定的酚类物质含量色谱图。
图9是实施例5中漆酶和黄孢原毛平革菌同时加入脱毒24h后酚类物质含量色谱图。
图中：1. 香草醛；2. 对羟基苯甲醛；3. 阿魏酸；4. 2-甲氧基-4-乙烯基苯酚；5.水杨酸。
具体实施方式
实施例1：
一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，该方法包括如下步骤：
（1）粉碎：将玉米秸秆粉碎成0.1mm左右颗粒；
（2）按秸秆与氢氧化钙质量比10：1 (g:g）加入Ca(OH)2，含水量80%，搅拌充分，80℃处理2h。称取部分半固态秸秆加水溶解，二氯甲烷萃取测定其中酚类物质，色谱峰图见附图2，图中可见，秸秆在80℃碱处理后香草醛、对羟基苯甲醛和阿魏酸得到了较大程度的释放。
（3）调节秸秆混合物的pH至5.0；
（4）秸秆混合物中Cu2+终浓度为30mg/L，Mn2+终浓度为30mg/L，漆酶添加量为0.1%，活性为10000U/mL，漆酶脱毒温度为30℃，脱毒时间为2h。
（5）漆酶脱毒之后，按秸秆质量计，黄孢原毛平革菌菌丝体添加量为5%，脱毒温度为30℃，时间为24h。
（6）通过对木质纤维素含量测定发现半纤维素的降解率达到了36.25%，木质素降解率达到了18.37%。脱毒结束后利用高效液相色谱法测定酚类抑制物含量，结果发现香草醛，对羟基苯甲醛，阿魏酸，2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、水杨酸的降解率分别69.70%，52.11%，98.59%，82.83%，76.82%。漆酶脱毒后的液体组分中酚类物质峰图见附图3，图中可见，香草醛和对羟基苯甲醛转化率低，而阿魏酸得到了较大程度的转化；漆酶对阿魏酸转化效率较高，但对香草醛和对羟基苯甲醛转化效率低，黄孢原毛平革菌对香草醛和对羟基苯甲醛转化效率较高。
（7）脉孢菌发酵培养基为：按重量计，加入切割、粉碎、脱毒的玉米秸秆5g，尿素添加量0.5%，硫酸铵添加量0.5%，葡萄糖添加量2%，培养基最终含水量为67%，脉孢菌孢子液接种量10%，培养温度30℃，湿度70%。经过发酵72h之后真蛋白含量提高了2.18倍。
实施例2：
采用与实施例1相同的条件，脱毒过程中黄孢原毛平革菌脱毒时间延长为36h。脱毒结束后利用高效液相色谱法测定酚类抑制物含量，结果发现香草醛，对羟基苯甲醛，阿魏酸，2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、水杨酸的降解率分别90.12%，88.73%，98.85%，86.37%，78.33%。液体组分中酚类物质峰图见附图4。图中可见，香草醛、对羟基苯甲醛和阿魏酸都得到了很大程度的转化，说明进一步延伸黄孢原毛平革菌脱毒时间可以达到较好的脱毒效果。
真菌发酵条件同例1，经过脉孢菌发酵之后真蛋白含量提高了2.64倍。
实施例3：
采用与实施例1相同的条件，但漆酶与黄孢原毛平革菌依次脱毒改为两者同时脱毒24h。脱毒结束后利用高效液相色谱法测定酚类抑制物含量，结果发现香草醛，对羟基苯甲醛，阿魏酸，2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、水杨酸的降解率分别为58.37%，64.61%，83.67%，30.70%，20.42%。液体组分中酚类物质峰图见附图5。图中可见，三种主要的酚类物质得到了较大程度的转化；漆酶和黄孢原毛平革菌脱毒具有一定的协同作用。
真菌发酵条件同例1，经过脉孢菌发酵之后真蛋白含量提高了1.93倍。
实施例4：
（1）粉碎：将玉米秸秆粉碎成0.1mm左右颗粒；
（2）按秸秆与氢氧化钙质量比10：1 (g:g）加入Ca(OH)2，含水量90%，搅拌充分，常温（约20℃）处理72h。称取部分半固态秸秆加水溶解，二氯甲烷萃取测定其中酚类物质，色谱峰图见附图6，图中可见，秸秆在20℃碱处理后香草醛和对羟基苯甲醛释放量较低，而阿魏酸释放量较大，说明阿魏酸的释放与温度关系不大，而香草醛和对羟基苯甲醛受温度影响较大。
（3）调节秸秆混合物的pH至5.0；
（4）漆酶添加量为1%，活性为2000U/mL，漆酶脱毒温度为20℃，时间为60min。黄孢原毛平革菌脱毒同例3。
（5）脱毒结束后利用高效液相色谱法测定酚类抑制物含量，结果发现香草醛，对羟基苯甲醛，阿魏酸，2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、水杨酸的降解率分别为83.21%，82.38%，98.47%，33.63%，23.22%。液体组分中酚类物质峰图见附图7，图中可见，三种主要的酚类物质基本得到转化，尤其是阿魏酸几乎被完全转化。
真菌发酵条件同例1，经过脉孢菌发酵之后真蛋白含量提高了1.52倍。
实施例5：
（1）粉碎：将玉米秸秆粉碎成0.1mm左右颗粒；
（2）按秸秆与氢氧化钙质量比10：1 (g:g）加入Ca(OH)2，含水量90%，搅拌充分，100℃处理2h。称取部分半固态秸秆加水溶解，二氯甲烷萃取测定其中酚类物质，色谱峰图见附图8，图中可见，秸秆在100℃碱处理后香草醛和对羟基苯甲醛释放量较低，而阿魏酸释放量较大。
（3）调节秸秆混合物的pH至5.0；
（4）漆酶添加量为1%，活力为2000U/mL，脱毒温度为50℃，时间为20min。与黄孢原毛平革菌脱毒同例3。
（5）脱毒结束后利用高效液相色谱法测定酚类抑制物含量，结果发现香草醛，对羟基苯甲醛，阿魏酸，2-甲氧基-4-乙烯基苯酚、水杨酸的降解率分别为93.29%，95.58%，99.33%，59.47%，93.12%。液体组分中酚类物质峰图见附图9，图中可见，漆酶和黄孢原毛平革菌同时加入脱毒24h后酚类物质含量色谱图，主要的酚类物质基本得到转化。
真菌发酵条件同例1，经过脉孢菌发酵之后真蛋白含量提高了2.73倍。
实施例6：
一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，该方法包括如下步骤：
（1）粉碎：将玉米秸秆粉碎成0.1mm左右颗粒；
（2）按秸秆与氢氧化钙质量比10：0.5 (g:g）加入Ca(OH)2，含水量50%，搅拌充分，常温处理36h。称取部分半固态秸秆加水溶解，二氯甲烷萃取测定其中酚类物质。
（3）调节秸秆混合物的pH至7.0；
（4）秸秆混合物中Cu2+终浓度为1mg/L，Mn2+终浓度为1mg/L，漆酶添加量为0.01%，活性为2000U/mL，漆酶脱毒温度为50℃，脱毒时间为300min。
（5）漆酶脱毒之后，按秸秆质量计，黄孢原毛平革菌菌丝体添加量为0.1%，脱毒温度为20℃，时间为50h。
（6）脉孢菌发酵培养基为：切割、粉碎、脱毒的玉米秸秆，尿素添加量0.1%，硫酸铵添加量2%，葡萄糖添加量0.1%，培养基最终含水量为67%，脉孢菌孢子液接种量10%，培养温度30℃，湿度50%，发酵96h。经过发酵之后真蛋白含量提高了1.32倍。
实施例7：
一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，该方法包括如下步骤：
（1）粉碎：将玉米秸秆粉碎成0.1mm左右颗粒；
（2）按秸秆与氢氧化钙质量比10：0.5 (g:g）加入Ca(OH)2，含水量50%，搅拌充分，80℃处理2h。称取部分半固态秸秆加水溶解，二氯甲烷萃取测定其中酚类物质。
（3）调节秸秆混合物的pH至5.0；
（4）秸秆混合物中Cu2+终浓度为100mg/L，Mn2+终浓度为100mg/L，漆酶添加量为0.1%，活性为2000U/mL，漆酶脱毒温度为30℃，脱毒时间为60min。
（5）漆酶脱毒之后，按秸秆质量计，黄孢原毛平革菌菌丝体添加量为10%，脱毒温度为30℃，时间为10h。
（6）脉孢菌发酵培养基为：按重量计，加入切割、粉碎、脱毒的玉米秸秆适量，尿素添加量2%，硫酸铵添加量0.1%，葡萄糖添加量2%，培养基最终含水量为67%，脉孢菌孢子液接种量10%，培养温度30℃，湿度80%，发酵48h。经过发酵之后真蛋白含量提高了1.46倍。
实施例8：
秸秆氢氧化钙预处理及脱毒同例1，脉孢菌发酵培养基为：按重量计，加入切割、粉碎、脱毒的玉米秸秆，尿素添加量0.5%，硫酸铵添加量0.5%，葡萄糖添加量2%，培养基含水量为50%，脉孢菌孢子液接种量10%，发酵48h，培养温度25℃，湿度70%。经过发酵之后真蛋白含量提高了1.37倍。
实施例9：
秸秆氢氧化钙预处理及脱毒同例1，脉孢菌发酵培养基为：按重量计，加入切割、粉碎、脱毒的玉米秸秆，尿素添加量0.5%，硫酸铵添加量0.5%，葡萄糖添加量2%，培养基含水量为80%，脉孢菌孢子液接种量10%，培养温度30℃，湿度70%，发酵48h。经过发酵之后真蛋白含量提高了1.55倍。

Claims (9)

1.一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
碱处理：通过氢氧化钙在一定温度条件下对秸秆进行处理一定时间，降解木质素和半纤维素；
脱毒：将碱处理后秸秆混合物调节pH后，添加一定量的离子液辅助，通过漆酶快速脱毒，之后再添加白腐菌液态培养菌丝体联合作用，或同时加入漆酶和白腐菌液态培养菌丝体脱毒，以降低碱处理过程中产生的抑制物的浓度；
脉孢菌发酵处理：在脱毒过程结束之后，制备脉孢菌发酵培养基，按1-15%接种量接入脉孢菌发酵。
2.根据权利要求1所述的一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，其特征在于，所述碱处理过程中，将秸秆与氢氧化钙混合，混合物中氢氧化钙质量占比为0.5%~10%，混合物含水量为50~90%，处理温度条件为20-100℃，时间为2-72h。
3.根据权利要求1所述的一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，其特征在于，所述脱毒过程中，调节pH至 5-7；所述离子为Cu2+和Mn2+，所述添加Cu2+使其终浓度为1-100mg/L，添加Mn2+使其终浓度为1-100mg/L。
4.根据权利要求1所述的一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，其特征在于，所述漆酶添加量为0.01-1%，活性为1000-10000U/Ml，漆酶脱毒温度为20-50℃，时间为20-300min。
5.根据权利要求1所述的一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，其特征在于，所述的白腐菌菌丝体添加量按秸秆质量计，添加量为0.1-10%，脱毒温度为20-30℃，时间为10-50h。
6.根据权利要求1所述的一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，其特征在于，
所述的白腐菌为黄孢原毛平革菌（Panerochaete chrysosporium）。
7.根据权利要求1所述的一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，其特征在于，所述脉孢菌为粗糙脉孢菌（Neurospora crassa）、好食脉孢菌（Neurospora sitophila）或间型脉孢菌（Neurospora intermedia）中的任意一种或多种。
8.根据权利要求1所述的一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，其特征在于，所述脉孢菌发酵培养基为：加入脱毒预处理之后的玉米秸秆，按重量计，加入尿素占0.1-2%，硫酸铵占0.1-2%，葡萄糖占0.1-2%，培养基最终含水量为50-80%。
9.根据权利要求1所述的一种秸秆生物饲料原料的预处理方法，其特征在于，
所述脉孢菌发酵预处理过程中发酵温度25-30℃，时间为48-96h，发酵湿度为50-80%。
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