CN104082673A - 一种同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具体步骤：A.清洗；B.高温处理；C.发酵；D.除杂酶解；E.第一道大米蛋白的制备；F.第二道大米蛋白的制备；G.大米免疫肽的制备；H.低蛋白大米干燥；所述方法所得到的低蛋白大米，粒度完整，口感与普通大米接近，保证了大米免疫肽的高提取率和高纯度，所制备的大米免疫肽具有增强免疫力等效果，为大米资源广泛应用奠定了重要的基础。

Description

一种同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法
技术领域
本发明涉及大米产品制备领域，尤其是一种同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法。
背景技术
大米蛋白以其较高的生物利用率、合理的氨基酸组成、特有的低敏性等特点被认为是优质蛋白质，在各种粮食中均居第一位，与牛乳、豆类蛋白相比更适合于饲料、婴幼儿、老年人及特殊人群。但由于大米内仅含有约8％的蛋白质，且胚乳细胞中的淀粉颗粒和蛋白质结合紧密，造成提取成本高、难度大等问题，目前关于功能性大米产品的研究也不是很深入。
在一定条件下，蛋白经酶解可以得到多种生物活性肽，分别具有降低血压、调节免疫力、增强食品风味、抗氧化作用等功能。它们大多以非活性状态存在于蛋白质长链中，一旦经过酶解成为适当长度的肽，就可表现出调节机体免疫力的生理活性并保持低过敏性。在已获得的生物活性肽中，动物源活性肽占大多数而植物源活性肽逐渐成为研究的新亮点，免疫活性肽是一类促进淋巴细胞分化和成熟，转移免疫信息，抗肿瘤和抗菌作用的活性肽。目前已有研究表明，从大米蛋白水解物中获得的免疫活性肽具有促进平滑肌收缩、刺激体外人血白细胞吞噬活性、刺激白细胞产生超氧阴离子的作用。
目前，我国对于大米免疫肽的研究还处于初步阶段，大部分研究方法是采用的将大米粉碎、磨浆并通过蛋白酶酶解制备大米活性肽的方法，如CN102229643A公开了一种高纯度大米蛋白和高纯度大米肽的制备方法，是以大大米或碎大米为原料，通过碱提酸沉方法制备大米蛋白粗品基础上，通过复合酶除杂制备高纯度大米蛋白，再经复合蛋白酶作用和交替式酶解超滤偶联技术制备大米肽。CN103555795A公开了一种联产高纯度大米淀粉和大米蛋白的方法，是以大米为原料，通过洗大米、浸泡磨浆、酶解及沉降分离等步骤处理后，得到高纯度的大米蛋白产品，再经碱性蛋白酶和乙醇纯化、分离和干燥后得到高纯度的大米淀粉产品。在上述方法中，高纯度大米蛋白和大大米肽的制备方法采用了酸碱提取大米蛋白的方法，在食品生产中容易存在安全性问题，且方法会产生大米副产物资源的浪费；而联产高纯度大米淀粉和大米蛋白的方法，虽然对大米淀粉和大米蛋白进行了提纯，但提纯后的大米淀粉在加工应用上易受限制。加工制成的淀粉制品成本提高、口感与普通大米差别大，很难满足需要低蛋白饮食人群对大米风味的需求。此外，国内也有部分专利以大米渣为原料制备大米活性肽，但由于大米渣成分复杂，提取难度较大，不易保证蛋白的提取率和纯度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具体步骤如下：
A.清洗：
常温下，将大米与水投入反应容器中，大米和水的重量比为1:2～5，搅拌1～5分钟，排掉清洗液，重复清洗(1～5次)，排掉清洗液，沥干大米；
B.高温处理：
将大米加入到60～100℃的水溶液中搅拌1～10分钟，然后倒出洗液，加水冷却清洗，沥干大米(重复1～6次，洗液可回收)；
C.发酵：
将大米、水、乳酸菌和乳酸添加到发酵容器中，其中大米和水的重量比为1:1～6，控制每公斤发酵液中乳酸菌菌数为107～1013，乳酸添加量为每公斤发酵液中加50％～80％乳酸50～500μL，发酵温度为25～50℃，时间为8～20小时，发酵终点为发酵液pH为3.5～4.5；发酵结束后将大米和发酵液分离，大米用水清洗1～6次，将清洗液与发酵液一并回收，采用135～150℃，灭菌4～6秒，即为发酵产酸溶出的蛋白溶液；
D.除杂酶解：
向反应容器中加入水，控制大米和水的质量比例为1:1～6，采用淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶水解大米，其中淀粉酶投入量为大米重量0.05～0.30％，反应温度为50～65℃，反应pH控制为5.5～7.0，时间为10～60分钟；纤维素酶投入量为大米重量的0.05～0.30％，反应温度为35～50℃，pH控制为4.0～6.0，时间为1～4小时；脂肪酶投入量为大米重量的0.05～0.20％，反应温度为40～55℃，pH控制为6.5～8.0，时间为1～4小时；酶解结束后，将酶解液放出，用水清洗大米两次，将洗液与酶解液一并回收；
E.第一道大米蛋白的制备：
将步骤C、D反应液及洗液合并，调节pH至5.0～5.5，用离心机2000～5000rpm离心10～30分钟，获得沉淀；向沉淀中加入水和0.02～0.10％淀粉酶，于50～65℃酶解10～30分钟，经相同离心方式离心，沉淀即为大米蛋白第一道产物；
F.第二道大米蛋白的制备：
将步骤D处理后的大米与水混合，大米与水的重量比为1:1～6，投入谷氨酰胺酶，投入量为大米重量的0.05～0.30％，反应温度为30～65℃，反应pH控制为5.0～7.0，酶解时间为1～3小时；投入蛋白酶，其中蛋白酶投入量为大米重量的0.2～4.0％，反应温度为30～60℃，反应pH控制为3.5～8.0，酶解时间为1～8小时；反应结束后分离反应液，用水清洗大米两次，将洗液与反应液一并回收，获得的大米即为低蛋白大米；然后将洗液与反应液用离心机2000～5000rpm离心10～30分钟，取上清液，弃除沉淀；
G.大米免疫肽的制备：
将步骤E得到的产物，与水混合，沉淀与水的质量比例为1:1～6，用蛋白酶进行酶解，蛋白酶投入量为水重的0.2～4.0％，反应温度为30～60℃，pH控制为3.5～8.0，时间为1～6小时；酶解结束后，将反应溶液用离心机2000～5000rpm离心10～30分钟，取上清液后与步骤F得到的上清液混合，于90℃灭酶5～20min；将灭酶后的上清液经超滤膜系统和纳滤膜分别进行浓缩后，对浓缩液进行喷雾干燥，得到固体粉末即为所述的大米免疫肽；
H.低蛋白大米干燥：
将得到的低蛋白大米用水清洗干净后，进行干燥。
上述同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所得干燥后低蛋白大米取部分烘干至干基状态，粉碎用于检测干基中蛋白含量。
优选的，上述同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述乳酸菌为乳杆菌属。
优选的，上述同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述乳酸菌为植物乳杆菌、短乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和德氏乳杆菌中的任意一种或两种。
优选的，上述同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述乳酸菌为植物乳杆菌时，可提供好氧条件，即1公斤大米和发酵液的混合物的无菌空气通入量为0.5～2L/min。
优选的，上述同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述乳酸菌为植物乳杆菌、短乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和德氏乳杆菌在两种组合使用时，二者菌数控制在1～2:2～1之间。
优选的，上述同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述大米原料可以替换为薏米、高粱米、黑米、大麦或燕麦。
优选的，上述同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶的添加顺序是依次加入到料液中，当一种酶作用结束后再投入另一种，并保证每种酶在其适宜的温度和pH下酶解。
优选的，上述同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述步骤E得到的沉淀可与水混合，然后重复步骤E方法2～3次，取最终沉淀。
优选的，上述同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述蛋白酶为来自动物的胰蛋白酶、胃蛋白酶，来自植物的木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶，以及来自微生物发酵的酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶中的任意两种或三种；当采用两种混合酶时，其中二者质量比例控制在1～5:5～1之间，当采用三种混合酶时，其中三者质量比例控制在1～5:5～1:5～1之间，且分步加入，反应从始至终保证每种蛋白酶作用的pH及温度。
优选的，上述同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述步骤G中超滤膜其截留分子量为3000～6000Da，纳滤膜其截留分子量为200～600Da；采用的喷雾干燥方法，喷雾干燥控制进风温度为160～210℃，出口温度为60～90℃。
优选的，上述同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，所述步骤H得到的低蛋白大米干燥的方式为在60～105℃条件下烘干，所述烘干方式为恒温干燥、真空干燥、蒸汽烘干或微波干燥的任意一种或任意两种，控制产品水分含量在14％以内。
优选的，上述同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，为了证明大米免疫肽可显著地提高机体的免疫能力，用所获得的大米免疫肽粉对昆明种小鼠进行灌胃实验，检测小鼠抗体生成细胞含量(PFC)；同时，利用体外实验检测大米免疫肽对腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响。具体方法为：将腹腔注射绵羊红细胞(SRBC)的大米免疫肽灌胃小鼠进行眼球取血处死，调整脾细胞浓度与10％豚鼠血清补体和0.2％SRBC混合，37℃水浴1小时，离心，上清在413nm处的吸光值表示抗体生成细胞含量；取正常小鼠腹腔巨噬细胞，于细胞板中37℃培养至贴壁生长，离心去上清，加入大米免疫肽刺激培养24小时，离心去上清，加入FITC标记的热灭活大肠杆菌液，培养1小时，终止吞噬后，低温离心，沉淀用PBS洗涤混匀，在485nm激发光和530nm发射光下测定吞噬及表面荧光总和，经后续处理测定表面荧光值，分析巨噬细胞吞噬能力。
本发明的有益效果是：
上述同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法所得到的低蛋白大米，粒度完整，口感与普通大米接近，可适用于肾病和PKU患者的低蛋白饮食，缓解病情；也可用于酿酒、大米加工食品等；所制备的高提取率和高纯度的大米免疫肽，适用于老年人、婴幼儿以及免疫力低下人群食用，应用于乳猪、犊牛、水产养殖等畜牧业饲料中具有增强免疫力、增加食量和提高生长速度等效果；本发明所述制备方法为大米资源广泛应用于功能性食品、医用食品、畜牧产业的发展奠定了重要的基础，可增加大米的整体经济效益和功能性效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
实施例1
一种同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具体步骤如下：
A.普通大米，投入反应容器中，加入约3倍重量的水，搅拌1分钟，倒掉清洗液，重复3次；
B.将大米用80℃水搅拌处理5min，去除浸泡水，加水冷却2次，将每次倒出的洗液进行回收备用；
C.将大米、水、植物乳杆菌添加到发酵容器中，大米和水的质量比为1:2，控制每公斤发酵液中植物乳杆菌数为8×1010，80％乳酸添加100μL，发酵温度为37℃，发酵时间16小时，发酵过程通入无菌空气，1公斤大米和发酵液的混合物通气量为1.2L/min；发酵结束后分离大米和发酵液，清洗大米3次，将发酵液与洗液于135℃灭菌4秒；
D.大米与3倍量水混合，先后采用淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶水解大米，其中淀粉酶投入大米量的0.10％，反应温度为55℃，pH控制为6.0，酶解40分钟；纤维素酶投入大米量的0.05％，于40℃，pH4.5，酶解1.5小时；脂肪酶投入大米量的0.10％，于45℃，pH6.5，酶解1.5小时；酶解结束后，将酶解液取出，用水清洗大米两次，洗液与酶解液一并回收；
E.将步骤B、C、D反应液及洗液合并，调节pH至5.0，用离心机4000rpm低温离心15分钟，获得沉淀，向沉淀中加入水和0.05％淀粉酶，于55℃酶解20分钟，再经相同条件离心，沉淀即为第一道大米蛋白产物；
F.将步骤D处理后的大米与水混合，大米与水的重量比为1:2，投入大米重量0.10％的谷氨酰胺酶，于45℃，pH7.0，酶解2小时；投入质量为大米重量的0.4％胰蛋白酶，反应温度为45℃，pH8.0，酶解2小时；再加入0.8％菠萝蛋白酶，反应温度为45℃，pH6.5，酶解4小时；再加入0.2％酸性蛋白酶，反应温度为45℃，pH3.5，酶解2小时，分离酶解液，用水清洗大米两次，将洗液与酶解液回收，剩下的大米即为低蛋白大米；然后将洗液与酶解液用离心机4000rpm离心15分钟，取上清液，弃除沉淀；
G.将步骤E得到的产物与水混合，沉淀与水的质量比例为1:3，用0.3％胰蛋白酶和0.6％菠萝蛋白酶进行酶解，反应条件与上步蛋白酶解相同；结束后，酶解液用离心机4000rpm离心15分钟，取上清液后与步骤F得到的上清液于90℃灭酶15min；上清液经3000Da超滤膜系统和200Da纳滤膜分别进行浓缩后，对浓缩液进行喷雾干燥，控制进风温度为180℃，出风温度为80℃，即得固体粉末即为大米免疫肽，经实验大米免疫肽提取率为85.9％，纯度为90.1％；
H.对低蛋白大米用水清洗后于微波烘干，至大米水含量低于13％，经凯氏定氮法测定，大米中蛋白去除率为95％。经免疫活性评价实验证明，大米免疫肽灌胃的受试小鼠组与对照组相比，抗体生成细胞含量(PFC)提高15％(P<0.05)；经体外实验结果显示，大米免疫肽可使腹腔巨噬细胞吞噬能力提高10％(P<0.05)，表明大米免疫肽可显著地提高机体的免疫能力。
实施例2
一种同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具体步骤如下：
A.黑米投入反应容器中，加入约2倍重量的水，搅拌3分钟，倒掉清洗液，重复3次；
B.将黑米用70℃水搅拌处理4min，去除浸泡水，加水冷却清洗3次，沥干黑米；
C.将黑米、水、德式乳杆菌和保加利亚乳杆菌添加到发酵容器中，黑米和水的质量比为1:3，控制每公斤发酵液中德式乳杆菌和保加利亚乳杆菌菌数各为1×109，80％乳酸添加150μL，发酵温度为37℃，发酵时间12小时，发酵结束后分离黑米和发酵液，清洗黑米3次，将清洗液与发酵液一并收回，将发酵液与洗液于140℃灭菌5秒，即为发酵产酸溶出的蛋白溶液；
D.黑米与3倍量水混合，先后采用淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶水解黑米，其中淀粉酶投入黑米量的0.10％，反应温度为60℃，pH控制为6.0，酶解30分钟；纤维素酶投入黑米量的0.07％，于42℃，pH4.5，酶解1.5小时；脂肪酶投入黑米量的0.05％，于45℃，pH7.0，酶解1.5小时；酶解结束后，将酶解液取出，用水清洗黑米两次，洗液与酶解液一并回收；
E.将步骤C、D反应液及洗液合并，调节pH至5.0，用离心机4000rpm离心20分钟，获得沉淀，向沉淀中加入水和0.05％淀粉酶，于55℃酶解20分钟，再经相同条件离心，沉淀即为黑米蛋白第一道产物；
F.将酶解后的黑米与水混合，黑米与水的重量比为1:3，投入米量0.05％的谷氨酰胺酶，于45℃，pH6.0，酶解2小时；投入质量为黑米重量的0.5％酸性蛋白酶，反应温度为45℃，pH3.5，酶解3小时；再加入1.0％碱性蛋白酶，反应温度为42℃，pH8.0，酶解3小时，分离酶解液，用水清洗黑米两次，将洗液与酶解液回收，剩下的黑米即为低蛋白黑米；然后将洗液与酶解液用离心机4000rpm离心20分钟，取上清液，弃除沉淀；
G.将步骤E得到的产物与水混合，沉淀与水的质量比例为1:3，用0.3％的酸性蛋白酶和0.4％的碱性蛋白酶酶解，反应条件与上步蛋白酶解相同；结束后，酶解液用离心机4000rpm离心20分钟，取上清液后与步骤F得到的上清液于90℃灭酶15min；上清液经5000Da超滤膜系统和300Da纳滤膜系统分别进行浓缩后，对浓缩液进行喷雾干燥，控制进风温度为200℃，出风温度为70℃，即得固体粉末即为免疫肽。经凯氏定氮法测定黑米免疫肽提取率为78％，纯度为88.7％；
H.对低蛋白黑米用水清洗后于70℃真空干燥，至黑米水含量低于12％，经凯氏定氮法测定，黑米中蛋白去除率为89.6％。经免疫活性评价实验证明，黑米免疫肽灌胃的受试小鼠组与对照组相比，抗体生成细胞含量(PFC)提高14％(P<0.05)；经体外实验结果显示，黑米免疫肽可使腹腔巨噬细胞吞噬能力提高10％(P<0.05)，表明黑米免疫肽可有效地提高机体的免疫能力。
实施例3
一种同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具体步骤如下：
A.普通大米，投入反应容器中，加入约2倍重量的水，搅拌1分钟，倒掉清洗液，重复3次；
B.将大米用60℃水搅拌处理5min，去除浸泡水，加水冷却2次；
C.将大米、水、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌添加到发酵容器中，大米和水的质量比为1:2，控制每公斤发酵液中嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌菌数各为1×109，80％乳酸添加100μL，发酵温度为40℃，发酵时间10小时。发酵结束后分离大米和发酵液，清洗大米2次，将发酵液与洗液于150℃灭菌4秒；
D.大大米与3倍量水混合，先后采用淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶水解大米，其中淀粉酶投入大米量的0.05％，反应温度为55℃，pH控制为6.0，酶解30分钟；纤维素酶投入大米量的0.05％，于40℃，pH4.5，酶解1小时；脂肪酶投入大米量的0.05％，于45℃，pH6.5，酶解1小时。酶解结束后，将酶解液取出，用水清洗大米两次，洗液与酶解液回收；
E.将步骤C、D反应液及洗液合并，调节pH至5.0，用离心机5000rpm低温离心10分钟，获得沉淀，向沉淀中加入水和0.02％淀粉酶，于55℃酶解20分钟，再经相同条件离心，沉淀即为第一道大米蛋白产物。
F.将酶解后的大米与水混合，大米与水的重量比为1:3，投入大米重量0.05％的谷氨酰胺酶，于45℃，pH7.0，酶解1小时；投入质量为大米重量的0.4％酸性蛋白酶，反应温度为45℃，pH3.5，酶解2小时；再加入0.8％碱性蛋白酶，反应温度为42℃，pH8.0，酶解4小时，分离酶解液，用水清洗大米两次，将洗液与酶解液回收，剩下的大米即为低蛋白大米。然后将洗液与酶解液用离心机5000rpm离心10分钟，取上清液，弃除沉淀；
G.将步骤E得到的产物与水混合，沉淀与水的质量比例为1:3，用0.2％酸性蛋白酶和0.4％碱性蛋白酶酶解，反应条件与上步蛋白酶解相同。结束后，酶解液用离心机5000rpm离心10分钟，取上清液后与步骤F得到的上清液于90℃灭酶10min。上清液经5000Da超滤膜系统和300Da纳滤膜系统分别进行浓缩后，对浓缩液进行喷雾干燥，控制进风温度为180℃，出风温度为80℃，即得固体粉末即为大米免疫肽，经凯氏定氮法测定大米免疫肽提取率为74％，纯度为87.3％；
H.对低蛋白大米用水清洗后于70℃真空干燥，至大米水含量低于14％，经凯氏定氮法测定，大米中蛋白去除率为82.5％。经免疫活性评价实验证明，大米免疫肽灌胃的受试小鼠组与对照组相比，抗体生成细胞含量(PFC)提高10％(P<0.05)；经体外实验结果显示，大米免疫肽可使腹腔巨噬细胞吞噬能力提高10.5％(P<0.05)，表明大米免疫肽可有效地提高机体的免疫能力。
实施例4
一种同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，具体步骤如下：
A.普通大米，投入反应容器中，加入约2倍重量的水，搅拌4分钟，倒掉清洗液，重复3次；
B.将大米用80℃水搅拌处理3min，去除浸泡水，加水冷却2次；
C.将大米、水、短乳杆菌和干酪乳杆菌添加到发酵容器中，大米和水的质量比为1:2，控制每公斤发酵液中短乳杆菌和干酪乳杆菌菌数各为2×109，80％乳酸添加100μL，发酵温度为37℃，发酵时间14小时；发酵结束后分离大米和发酵液，清洗大米3次，将发酵液与洗液于135℃灭菌4秒。淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶的条件及步骤(C、D、E)同实施例3；
F.将酶解后的大米与水混合，大米与水的重量比为1:3，投入大米重量0.04％的谷氨酰胺酶，于45℃，pH7.0，酶解1小时；投入质量为大米重量的0.6％木瓜蛋白酶，反应温度为50℃，pH7.0，酶解3小时；再加入1.0％碱性蛋白酶，反应温度为45℃，pH8.0，酶解5小时，分离酶解液，用水清洗大米两次，将洗液与酶解液回收，剩下的大米即为低蛋白大米。然后将洗液与酶解液用离心机，5000rpm离心10分钟，取上清液，弃除沉淀；
G.将步骤E得到的产物与水混合，沉淀与水的质量比例为1:2，用0.2％木瓜蛋白酶和0.5％碱性蛋白酶进行酶解，反应条件与上步蛋白酶解相同。结束后，酶解液用离心机5000rpm离心10分钟，取上清液后与步骤F得到的上清液于90℃灭酶15min。上清液经3000Da超滤膜系统和300Da纳滤膜系统分别进行浓缩后，对浓缩液进行喷雾干燥，控制进风温度为200℃，出风温度为90℃，即得固体粉末即为大米免疫肽，经实验测定大米免疫肽提取率为80％，纯度为88％；
H.对低蛋白大米用水清洗后用微波干燥，至大米水含量低于14％，经凯氏定氮法测定，大米中蛋白去除率为88.9％。经免疫活性评价实验证明，大米免疫肽灌胃的受试小鼠组与对照组相比，抗体生成细胞含量(PFC)提高13％(P<0.05)；经体外实验结果显示，大米免疫肽可使腹腔巨噬细胞吞噬能力提高11.5％(P<0.05)，表明大米免疫肽可有效地提高机体的免疫能力。
工艺分析：
上述一种同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，首先，采用高温处理结合乳酸菌发酵，去除杂菌并稳定大米粒型；同时发酵产生的乳酸具有α-羟基结构的羧酸，能与多肽链上的基团形成氢键，从而促进蛋白质的溶出；其次，利用多步联合酶解，通透大米胚乳细胞结构，将与淀粉、纤维素和脂肪紧密结合的蛋白质释放到料液中并除去这三种杂质；利用谷氨酰胺酶和蛋白酶分别对大米粒中的蛋白质进行改性(增加溶解度)和切割，充分提取大米蛋白并水解成多肽。整个工艺促进了大米整蛋白的析出和分离，保证了大米蛋白酶解的稳定性，利于肽的提取和纯化。
该工艺与传统方法相比，利用了乳酸菌发酵和多步酶解，条件温和、安全，免去了碱溶酸沉带来的营养流失、杂质干扰以及安全问题，该方法制备的大米免疫肽提取率高，达85％以上，纯度达90％以上，经实验，受试小鼠组的抗体生成细胞含量(PFC)和腹腔巨噬细胞吞噬能力各提高了15％和10％(P<0.05)，证明大米免疫肽可显著地提高机体的免疫能力。在宠物饲料、乳仔猪料、高档水产料、犊牛代奶粉中添加可代替动物蛋白制品，有利于提高幼崽对营养的吸收、增强免疫力、增加食量和提高生长速度等效果，对饲用植物蛋白的产业化具有巨大的市场利用价值。此外，还获得了蛋白去除率达95％的低蛋白大米，实验结果表明该大米能保持良好的完整性，烘干后不易碎，蒸制后在口感和风味上与普通大米接近，适用于慢性肾病患者和PKU患者。
上述参照实施例对该一种同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：具体步骤如下：
A.清洗：
常温下，将大米与水投入反应容器中，大米和水的重量比为1:2～5，搅拌1～5分钟，排掉清洗液，重复清洗1～5次，排掉清洗液，沥干大米；
B.高温处理：
将大米加入到60～100℃的水溶液中搅拌1～10分钟，然后倒出洗液，加水冷却清洗，沥干大米，重复1～6次，洗液可回收；
C.发酵：
将大米、水、乳酸菌和乳酸添加到发酵容器中，其中大米和水的重量比为1:1～6，控制每公斤发酵液中乳酸菌菌数为107～1013，乳酸添加量为每公斤发酵液中加50％～80％乳酸50～500μL，发酵温度为25～50℃，时间为8～20小时，发酵终点为发酵液pH为3.5～4.5；发酵结束后将大米和发酵液分离，大米用水清洗1～6次，将清洗液与发酵液一并回收，采用135～150℃，灭菌4～6秒，即为发酵产酸溶出的蛋白溶液；
D.除杂酶解：
向反应容器中加入水，控制大米和水的质量比例为1:1～6，采用淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶水解大米，其中淀粉酶投入量为大米重量0.05～0.30％，反应温度为50～65℃，反应pH控制为5.5～7.0，时间为10～60分钟；纤维素酶投入量为大米重量的0.05～0.30％，反应温度为35～50℃，pH控制为4.0～6.0，时间为1～4小时；脂肪酶投入量为大米重量的0.05～0.20％，反应温度为40～55℃，pH控制为6.5～8.0，时间为1～4小时；酶解结束后，将酶解液放出，用水清洗大米两次，将洗液与酶解液一并回收；
E.第一道大米蛋白的制备：
将步骤C、D反应液及洗液合并，调节pH至5.0～5.5，用离心机2000～5000rpm离心10～30分钟，获得沉淀；向沉淀中加入水和0.02～0.10％淀粉酶，于50～65℃酶解10～30分钟，经相同离心方式离心，沉淀即为第一道大米蛋白产物；
F.第二道大米蛋白的制备：
将步骤D处理后的大米与水混合，大米与水的重量比为1:1～6，投入谷氨酰胺酶，投入量为大米重量的0.05～0.30％，反应温度为30～65℃，反应pH控制为5.0～7.0，酶解时间为1～3小时；投入蛋白酶，其中蛋白酶投入量为大米重量的0.2～4.0％，反应温度为30～60℃，反应pH控制为3.5～8.0，酶解时间为1～8小时；反应结束后分离反应液，用水清洗大米两次，将洗液与反应液一并回收，获得的大米即为低蛋白大米；然后将洗液与反应液用离心机2000～5000rpm离心10～30分钟，取上清液，弃除沉淀；
G.大米免疫肽的制备：
将步骤E得到的产物与水混合，沉淀与水的质量比例为1:1～6，用蛋白酶进行酶解，蛋白酶投入量为水重的0.2～4.0％，反应温度为30～60℃，pH控制为3.5～8.0，时间为1～6小时；酶解结束后，将反应溶液用离心机2000～5000rpm离心10～30分钟，取上清液后与步骤F得到的上清液混合，于90℃灭酶5～20min；将灭酶后的上清液经超滤膜系统和纳滤膜分别进行浓缩后，对浓缩液进行喷雾干燥，得到固体粉末即为所述的大米免疫肽；
H.低蛋白大米干燥：
将得到的低蛋白大米用水清洗干净后，进行干燥。
2.根据权利要求1所述的同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所述乳酸菌为乳杆菌属。
3.根据权利要求2所述的同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所述乳酸菌为植物乳杆菌、短乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和德氏乳杆菌中的任意一种或两种。
4.根据权利要求3所述的同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所述乳酸菌为植物乳杆菌、短乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和德氏乳杆菌在两种组合使用时，二者菌数控制在1～2:2～1之间。
5.根据权利要求1所述的同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所述原料大米可以替换为薏米、高粱米、黑米、大麦或燕麦。
6.根据权利要求1所述的同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所述淀粉酶、纤维素酶和脂肪酶的添加顺序是依次加入到料液中，当一种酶作用结束后再投入另一种，并保证每种酶在其适宜的温度和pH下酶解。
7.根据权利要求1所述的同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所述步骤E得到的沉淀可与水混合，然后重复步骤E方法2～3次，取最终沉淀。
8.根据权利要求1所述的同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所述蛋白酶为胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶中的任意两种或三种；当采用两种混合酶时，其中二者质量比例控制在1～5:5～1之间，当采用三种混合酶时，其中三者质量比例控制在1～5:5～1:5～1之间，且分步加入，反应从始至终保证每种蛋白酶作用的pH及温度。
9.根据权利要求1所述的同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所述步骤G中超滤膜其截留分子量为3000～6000Da，纳滤膜其截留分子量为200～600Da；采用的喷雾干燥方法，喷雾干燥控制进风温度为160～210℃，出口温度为60～90℃。
10.根据权利要求1所述的同时制备低蛋白大米及大米免疫肽的方法，其特征在于：所述步骤H得到的低蛋白大米干燥的方式为在60～105℃条件下烘干，所述烘干方式为恒温干燥、真空干燥、蒸汽烘干或微波干燥的任意一种或任意两种，控制产品水分含量在14％以内。
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