KR20230168914A - 인체 뇌 오가노이드 및 이의 제조방법 - Google Patents

인체 뇌 오가노이드 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 명세서에서는 인체 섬유아세포(fibroblast)를 인체 신경상피세포 (neuroepithelial cell)로 직접전환(direct reprogramming)되도록 배양하는 제1 배양단계 및 융합 조직이 형성되도록 상기 인체 신경상피세포를 인체 세포외 기질 (extracellular matrix, ECM)을 포함하는 유지 배지(maintenance media)에서 배양하는 제2 배양단계를 포함하고, 상기 인체 세포외 기질은, ECM 용액 및 ECM 패치로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 포함하는 뇌 오가노이드 제조방법과 직경 3 mm 이상이고 주름 또는 접힘 형태를 가지는 인체 뇌 오가노이드, 직경 500 μm 이하이고 스페로이드 형태를 가지는 뇌 오가노이드 및 직경 500 μm 내지 3 mm이고 튜브, 도넛, 원반 형태 중 하나 이상의 형태를 가지는 뇌 오가노이드가 제공된다.

Description

인체 뇌 오가노이드 및 이의 제조방법 {HUMAN BRAIN ORGANOIDS, METHOD FOR PREPARING THE SAME}
본 발명은 인체 뇌 오가노이드 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
인간의 뇌는 한순간에 만들어지는 것이 아니라 무려 15년이란 긴 시간에 걸쳐 천천히 완성된다. 뇌 발달과정은 시기적으로 단계가 있고, 기능별로 결정적 시기가 있으며, 각 단계와 시기에 뇌가 정상적으로 발달하지 못하면, 다시는 되돌릴 수 없는 치명적 장애가 발생할 수 있다.
이에, 설치류 동물모델을 활용한 뇌 발달장애 연구가 수행되고 있지만, 설치류의 뇌는 발달과정에서 뇌가 커지면서 신경세포의 크기도 커지기 때문에 신경세포의 숫자는 크게 증가하지 않으나, 인간과 같은 영장류의 뇌는 뇌가 커지면서 신경세포가 커지지 않고 신경세포의 숫자가 늘어나기 때문에 기존 설치류 동물모델을 활용한 인간 뇌 발달장애 연구는 한계가 존재한다.
특히 자폐증과 같은 발달장애는 주로 생후 1-2년에 발현되는데, 인간 태아의 뉴런은 25,000개/분 속도로 증식이 되고, 출생 이후 2년까지 지속적으로 증식이 되며, 시냅스는 30,000개/초의 속도로 만들어지므로, 뇌발달 과정이 인간과 상이한 설치류 동물모델을 이용한 자폐증 연구는 분명한 한계가 있다. 따라서 인간 뇌 발달 연구에 있어 동물 모델이 아닌 인간 뇌 오가노이드가 가장 이상적인 모델로 대두되고 있다.
오가노이드란 줄기세포를 특정 세포로 자라게 하여 장기와 같은 입체 구조물로 형성된다. 오가노이드는 2차원의 세포 기반 모델과는 다르게 3차원의 환경에서 배양되어, 보다 장기간으로 배양될 수 있다. 또한, 오가노이드는 크기가 작을 뿐 구성 세포나 구조가 실제 장기와 흡사하다.
한편, 유도만능줄기세포(Induced pluripotent stem cell, iPSC)의 개발은 환자의 유전정보를 온전히 유지하며, 윤리적인 문제가 없는 인간 뇌 오가노이드 실험 모델 시스템을 구축하게 하였다.
발명의 배경이 되는 기술은 본 발명에 대한 이해를 보다 용이하게 하기 위해 작성되었다. 발명의 배경이 되는 기술에 기재된 사항들이 선행기술로 존재한다고 인정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
현재까지 개발된 인간 뇌 오가노이드는 제한된 구조와 함께 조절되지 않는 많은 수 및 크기의 뇌실-유사 구조(ventricle-like structure)를 가지고 있다. 본 발명의 발명자들은 이러한 뇌실-유사 구조가 뇌 오가노이드에 주름 구조가 있는 것으로 착각하게 만들기도 하지만, 이를 인간의 뇌 주름이라고 볼 수 없다는 것을 인지하였고, 인간 뇌 주름 구조와 형태적 및 기능적으로 유사한 뇌 오가노이드를 개발하게 되었다.
세포외 기질(extracellular matrix)은 뇌세포 이동과 관련된 다양한 신호와, 뇌세포 증식 및 뇌주름 생성에 깊이 관여하는 것으로 알려져 있다. 특히 세포외 기질 중 라미닌(laminin), 디스트로핀(dystrophin), 릴린(reelin) 등이 뇌주름 생성에 관여하는 것으로 보고되었다.
장기 별로 세포외 기질 성분이 다른데, 뇌도 장기 특이적 세포외 기질을 가지고 있으며 뇌 안쪽과 바깥쪽의 세포외 기질 성분이 달라 다양한 신경세포층 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다.
체세포에서 유도만능줄기세포를 만들고 이를 신경상피세포, 방사아교세포 등의 뇌세포로 분화시킨 후 뇌 오가노이드로 제작하는 과정은 긴 시간과 비용을 필요로 한다. 섬유아세포는 체외 증식배양이 수월하기 때문에 직접전환하여 다량의 신경상피세포를 생산할 수 있어 비용과 시간을 현저히 줄여줄 수 있다.
한편, 본 발명의 발명자들은 인체 섬유아세포(fibroblast)로부터 직접전환(direct reprogramming)된 인체 신경상피세포(neuroepithelial cell, NEC)로부터 뇌 오가노이드(cerebral organoid)를 제작할 수 있다는 점을 인지하였다.
이에 본 발명의 발명자들은, 인체 섬유아세포로부터 직접전환된 인체 신경상피세포와 인체 세포외 기질을 이용하여 직경 3 mm 이상이며 주름 또는 접힘 형태를 가지는 인체 뇌 오가노이드를 개발하는데 이르렀다.
이에 본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 내부에 혈관 구조를 가지고 직경 3 mm 이상 이며 주름 또는 접힘 형태를 가지는 인체 뇌 오가노이드 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 과제들은 이상에서 언급한 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
전술한 바와 같은 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은, 인체 섬유아세포를 인체 신경상피세포로 직접전환되도록 배양하는 제1 배양단계 및 융합 조직이 형성되도록 상기 인체 신경상피세포를 인체 세포외 기질을 포함하는 유지 배지(maintenance media)에서 배양하는 제2 배양단계를 포함하고, 상기 인체 세포외 기질은 ECM 용액 및 ECM 패치로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 포함하는 뇌 오가노이드 제조방법을 제공한다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, “직접전환”은 분화된 세포를 유도만능줄기세포로 역분화시키는 단계를 거치지 않고, 바로 다른 종류(lineage)의 분화된 세포로 전환을 유도하는 과정을 의미할 수 있다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, “섬유아세포”는 세포외 기질과 콜라겐을 합성하는 세포의 일종으로, 동물 조직의 구조적 골격(스트로마)을 생성하고 상처 치유에 중요한 역할을 하는 세포로서, 바람직하게는 인체 피부에서 유래한 섬유아세포일 수 있다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, “신경상피세포”는 뇌 신경 기관에 맞도록 분화된 상피세포를 말하며, 신경계가 될 외배엽 부분을 의미할 수 있다. 신경상피세포는 태아 뇌 발달과정 중에 신경관 또는 신경판 발달 과정 중에 형성되며 가장 초기의 신경줄기세포(primitive neural stem cell)로 신경세포(neuron cell), 방사아교세포(glia cell) 또는 별아교세포(astrocyte)로의 분화가 가능한 다분화성을 가지고 있다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, “인체 세포외 기질”은 인체 세포에서 생성된 세포외 기질을 포함하며, 바람직하게는 인체 피부 진피 섬유아세포로부터 생산된 세포외 기질일 수 있다. 인체 세포외 기질은 모든 장기가 형성될 때, 구조적 지지대 역할을 수행하는 것으로서 신체 장기(organ)마다 세포외 기질의 성분이 다른 것으로 보고되고 있다. 또한, 태아발생(embryology), 조직형성(tissue morphogenesis) 및 뇌 발달(brain development)에 매우 중요한 생물·물리·화학적 신호를 제공하는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “ECM 패치'는 인체 진피 섬유아세포를 자극하고 활성화시켜 세포외 기질을 생산하도록 한 후, 효소와 계면활성제를 이용한 탈세포화(decellularization)과정을 거쳐 생산된 것으로서 패치 형태를 가지며, 본 명세서에서 사용되는 용어, “ECM 패치'는 상기와 같은 과정을 거쳐 생산된 것일 수 있다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, “ECM 용액”은 상기 ECM 패치를 잘게 잘라서 용매에 녹아져 있는 것일 수 있다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, “오가노이드”는 조직 또는 기관의 형태와 기능 모두를 재현하는 작은 배양체를 의미한다. 보다 구체적으로, 오가노이드는 기관 또는 조직을 구성하는 여러 종류의 세포들 중 하나 이상의 세포 종류를 포함하고 있어야 하며, 각 기관이 갖는 특수한 기능을 재현할 수 있어야 하며, 세포들끼리 서로 뭉쳐서 공간적으로 기관과 유사한 형태로 조직되어야 한다. 특히 “뇌 오가노이드”는 신경상피세포가 방사아교세포로 분화(differentiation)하면서 시작되기 때문에 신경상피세포 또는 방사아교세포는 뇌 오가노이드 생산을 위한 주요 세포 타입일 수 있다. 이러한 오가노이드는 단순한 세포들의 집합체가 아닌 계통을 이루고 있다는 점에서 스페로이드(Spheroid)와 차이를 가지며, 신약 개발, 인공 장기, 질병 치료제 및 질병 치료를 위한 환자별 모델로 이용될 수 있다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어 "유지 배지"는, 당, 아미노산, 각종 영양물질, 혈청, 성장인자, 무기질 등의 세포의 성장 및 증식 등에 필수적인 요소를 포함하는 생체 외(In vitro)에서 줄기세포 등의 세포의 성장 및 증식을 위한 혼합물을 의미한다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, “신경세포(neuron cell)”는, 예컨대 시각, 청각 등의 감각신경세포, 뇌신경세포, 연수 및 척수의 신경세포 또는 말초신경세포일 수 있으나, 바람직하게는 뇌 신경세포이다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, “별아교세포(astrocyte)”는, 뻗어 있는 많은 돌기 때문에 별처럼 보이고 뇌와 척수에 존재하며 혈뇌장벽(혈액-뇌 장벽)의 안쪽 세포들을 생화학적으로 도와주는 역할을 하고 혈관벽에 돌기가 붙어있어 신경세포에 영양분을 공급하며 신경세포의 이온농도 조절, 신경세포의 지지, 노페물의 제거, 식세포작용등의 다양한 역할을 수행하는 세포이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제1 배양단계는, 상기 인체 섬유아세포를 FBS를 포함하지 않는 제1 전환 배지에서 2 내지 4일간 배양하는 제3 배양단계, B27과 상기 인체 세포외 기질을 포함하는 제2 전환 배지에서 4 내지 7일간 배양하는 제4 배양단계 및 B27과 아스코빅산(ascorbic acid)을 포함하는 제3 전환 배지 에서 7 내지 14일간 배양하는 제5 배양단계를 포함할 수 있다. 이때, 제3 배양단계 내지 제5 배양단계의 배양 기간은 각 단계의 기간 중 적어도 하나의 기간동안 배양될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제4 내지 제5 배양단계에서 B27의 농도는 2 내지 10 부피% (v/v)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제5 배양단계에서 아스코빅산의 농도는 0.1mM 내지 1mM인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제1 배양단계는, 트리코스타틴(trichostatin) 및 5-아자시티딘(5-azacytidine)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 추가하는 단계를 포함할 수 있다. 트리코스타틴 및 5-아자시티딘의 농도는 0.5 내지 2 μM일 수 있으며, 바람직하게는 1 μM일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제1 배양단계는, Wnt 신호 억제제 (inhibitor of Wnt signaling)를 추가하는 단계를 더 포함할 수 있다. Wnt 신호 억제제는 beta-catenin/Tcf inhibitor, IWR-2, PNU-74654, IWR-1-endo, IWR-1-exo, demethoxy curcumin, CCT036447 및 KY02111로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 IWR-1-endo일 수 있다. IWR-1-endo는 최대 2.5 μM의 농도로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제2 배양단계에서 인체 신경상피세포에 인체 세포외 기질을 접종할 때, 인체 신경상피세포의 수 대비 ECM 용액의 양은 1 x 106 세포 대비 ECM 용액 0.2 mL 내지 5 mL의 비율로 투여될 수 있다. ECM 용액 내 인체 세포외 기질의 농도는 10 내지 100 μg/mL일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제2 배양단계는, 인체 신경상피세포에 ECM 패치를 넣고, 배양 면적 9 내지 11 cm2의 low-adhesive 플레이트 배양하는 것일 수 있으며, 배양 후에는 직경 3 mm 이상이며 주름 또는 접힘 형태를 가지는 뇌 오가노이드가 형성될 수 있다.
이에, 본 발명은, 직경 3 mm 이상이며 주름 또는 접힘 형태를 가지는 뇌 오가노이드를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제2 배양단계는, 인체 신경상피세포에 ECM 용액을 넣고, 평평한 바닥(flat-bottom)의 low-adhesive 플레이트에 배양하는 것일 수 있으며, 배양 후에는 직경 500 μm 이하의 스페로이드 형태를 가진 뇌 오가노이드가 형성될 수 있다. 이때, low-adhesive 플레이트는 단백질 및 세포의 부착을 최소화하기 위한 세포배양 플레이트로서 소수성 표면을 가지며, 비극성 또는 중성이온 표면처리가 된 세포배양 플레이트를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이에, 본 발명은, 직경 500 μm 이하이고, 스페로이드 형태를 가진 뇌 오가노이드를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 제2 배양단계는, 인체 신경상피세포에 상기 ECM 용액을 넣고, 둥근 바닥(round-bottom)의 low-adhesive 플레이트에 배양하는 것일 수 있으며, 배양 후에는 직경 500 μm 내지 3 mm의 튜브, 도넛, 또는 원반 형태를 가지는 뇌 오가노이드가 형성될 수 있다. 이때, low-adhesive 플레이트는 단백질 및 세포의 부착을 최소화하기 위한 세포배양 플레이트로서 소수성 표면을 가지며, 비극성 또는 중성이온 표면처리가 된 세포배양 플레이트를 의미할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이에, 본 발명은, 직경 500 μm 내지 3 mm이고, 튜브, 도넛, 원반 형태 중 하나 이상의 형태를 가지는 뇌 오가노이드를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 직경 3 mm 이상이며 주름 또는 접힘 형태를 가지는 뇌 오가노이드는 인체 신경세포 마커 및 인체 별아교세포(Astrocyte) 마커를 포함하는 군에서 하나 이상을 발현할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 인체 뇌 오가노이드는 인체 섬유아세포로부터 직접전환된 인체 신경상피세포와 인체 세포외 기질을 포함하는 조성물로부터 제조되어 인체 유래 세포외 기질 마커를 발현할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 인체 세포외 기질 마커는 인체 콜라겐 I A1일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 특징에 따르면, 인체 신경세포 마커는 TUBB3(Tubulin Beta Class III) 마커인 것을 포함하고, 상기 인체 별아교세포 마커는 GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein) 마커인 것을 포함할 수 있다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, “TUBB3 마커”는, 인체 신경세포 단백질인 TUBB3를 표지하는 마커로서, TUBB3 유전자의 마커일 수 있으며, 바람직하게는 TUBB3 단백질 항체 마커일 수 있다.
본 명세서 내에서 사용되는 용어, “GFAP 마커”는, 인체 별아교세포 단백질인 GFAP를 표지하는 마커로서, GFAP 유전자의 마커일 수 있으며, 바람직하게는 GFAP 단백질 항체 마커일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것에 불과하므로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것으로 해석되어서는 아니된다.
본 발명의 인체 뇌 오가노이드는 인체 피부 섬유아세포로부터 직접전환된 신경상피세포와 인체 세포외 기질을 이용하여 생산된 것으로서, 뇌 발달 장애 바이오마커로서 뇌 발달 장애 조기진단에 사용될 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 인체 피부 섬유아세포로부터 직접전환된 신경상피세포와 ECM 패치를 이용하여 제작된 직경 3 mm 이상의 주름이 있는 뇌 오가노이드는, 자연적으로 생긴 주름과 접힘 구조로 인해 실제 인체 뇌 조직 구조와 유사한 형태를 모사하는 효과가 있다.
나아가, 내부에 뇌실(ventricle) 구조가 여러 개가 생기지 않고 1 내지 2개만 생김으로써 실제 인체 뇌 오가노이드 구조와 유사한 형태를 모사하는 효과가 있다.
보다 구체적으로, 본 발명의 인체 뇌 오가노이드는 오가노이드 내부에 뇌실(ventricle) 구조가 여러 개가 생기지 않고 1 내지 2개만 생김으로서 실제 인체 뇌 주름 구조와 형태 및 기능적으로 유사한 효과를 나타낼 수 있다.
더 나아가, 본 발명의 뇌 오가노이드는, 직경 3 mm 이상의 뇌 오가노이드는 오가노이드 내부에 혈관을 포함할 수 있다.
즉, 본 발명은 혈관구조로 인해 기존 개발된 뇌 오가노이드의 혈관화 부재로 인한 오가노이드 내부 세포괴사(necrosis)를 극복할 수 있다.
나아가, 인체 피부 섬유아세포로부터 직접전환된 신경상피세포와 인체 세포외 기질을 이용하여 생산된 것으로서, 기존 역분화줄기세포를 포함한 만능줄기세포로부터 생산된 뇌 오가노이드의 제작과정에 비해 시간 및 비용을 절감할 수 있다.
나아가, 체세포에서 직접전환된 신경상피세포는, 냉동과 해동 후에도 형질이 유지되는 효과가 있어서, 다량을 생산해 냉동보관하고, 필요할 때마다 해동해서 뇌 오가노이드를 제작함으로 실험결과의 재현성을 높일 수 있는 효과가 있다.
본 발명에 따른 효과는 이상에서 예시된 내용에 의해 제한되지 않으며, 더욱 다양한 효과들이 본 명세서 내에 포함되어 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법의 절차를 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법에서의 제1 배양단계의 절차를 도시한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법에서의 제1 배양단계에 따른 인간 진피 섬유아세포의 광학현미경 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법에서의 제1 배양단계에 따른 섬유아세포, 신경상피세포 및 신경세포 특이 유전자 마커의 발현율을 qRT-PCR로 확인한 결과를 도시한 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법에서의 제1 배양단계에 첨가된 화합물에 대한 신경상피세포로의 직접전환 효율을 다중전극 어레이(Multi-electrode array, MEA)로 나타낸 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법의 제2 배양단계에서 신경상피세포에 ECM 용액을 혼합하여 제조하는 뇌 오가노이드 제조방법 절차를 도시한 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법의 제2 배양단계에서 신경상피세포에 ECM 용액을 혼합하여 배양한 후의 뇌 오가노이드 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법의 제2 배양단계에서 신경상피세포에 ECM 패치를 혼합하여 제조하는 뇌 오가노이드 제조방법 절차를 도시한 것이다.
도 9a 내지 9g는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법의 제2 배양단계에서 신경상피세포에 ECM 패치를 혼합하여 제조한 뇌 오가노이드 광학현미경 이미지 결과를 도시한 것이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나, 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
실시예. 뇌 오가노이드 제조 방법 및 이를 이용한 뇌 오거노이드의 형성 과정
이하에서는 도 1 내지 9g를 참조하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조 방법에서의 제1 배양단계에 대하여 구체적으로 설명한다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법의 절차를 도시한 것이다.
도 1을 참조하면, 본 발명은, 인체 섬유아세포를 인체 신경상피세포로 직접전환되도록 배양하는 제1 배양단계 및 융합 조직이 형성되도록 상기 인체 신경상피세포를 인체 세포외 기질을 포함하는 유지 배지(maintenance media)에서 배양하는 제2 배양단계를 포함하고, 상기 인체 세포외 기질은, ECM 용액 및 ECM 패치로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 포함하는 뇌 오가노이드 제조방법을 제공한다. 이하에서는 도 2, 6 및 8을 참조하여 전술한 제1 배양단계 및 제2 배양단계에 대하여 구체적으로 설명한다.
(1) 신경상피세포로의 직접전환을 위한 제1 배양단계 및 배양 결과
먼저, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법에서의 제1 배양단계의 절차를 도시한 것이다. 이하에서는 설명의 편의를 위해서 도 3 내지 4를 참조하여 설명한다.
도 2를 참조하면, 제1 배양단계는 상기 인체 섬유아세포를 FBS를 포함하지 않는 제1 전환 배지에서 1 내지 3일간 배양하는 제3 배양단계, B27과 상기 인체 세포외 기질을 포함하는 제2 전환 배지에서 4 내지 7일간 배양하는 제4 배양단계 및 B27과 아스코빅산을 포함하는 제3 전환 배지 에서 7 내지 14일간 배양하는 제5 배양단계를 포함하는 뇌 오가노이드 제조방법을 제공한다. 먼저 제3 배양단계에 앞서서 인체 섬유아세포는 10% 소 유래 혈청(FBS)을 포함하는 DMEM/F12 배양액에서 증식 배양되는데, 이후 제3 배양단계에서 FBS는 섬유아세포의 증식과 생존을 지원하기 때문에 직접전환 유도에 방해가 되므로, 제3 배양단계에서 FBS 없이 DMEM/F12 배양배지에서 배양된다. 제4 배양단계에서는 인체 섬유아세포를 10% (v/v) B27과 상기 인체 세포외 기질을 포함하는 제2 전환 배지에서 4 내지 7일간 배양한다. 제5 배양단계에서는 인체 섬유아세포를 2~10% (v/v) B27과 0.1~ 1mM 아스코빅산을 포함하는 제3 전환 배지에서 7 내지 14일간 배양한다. 제5 배양단계에서 아스코빅산은 인체 섬유아세포의 인체 신경상피세포로의 직접전환 효율 및 신경상피세포로의 성숙도를 높이기 위해 첨가되는 약물이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법에서의 제1 배양단계에 따른 인간 진피 섬유아세포의 광학현미경 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 3의 (A)를 참조하면, 인체 섬유아세포의 제3 배양단계에서의 광학현미경 사진으로서 인체 섬유아세포의 형상을 나타내고 있음을 보여주고 있다.
도 3의 (B)를 참조하면, 인체 섬유아세포는 B27과 인체 세포외기질의 복합단백질 성분에 반응하여 세포가 길고 얇으면서 둥근 세포체(cell body)를 가진 형태로 변하는 것을 확인할 수 있다.
도 3의 (C)를 참조하면, 인체 섬유아세포는 인체 신경상피세포로 전환되어 세포체가 빛 반사하면서 더 둥글게 변하고 엑손(axon) 부분이 얇아 지면서 주변의 세포들과 네트워크를 형성하는 것을 확인할 수 있다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법에서의 제1 배양단계에 따른 직접전환 14일 후, 즉 제5 배양단계 후 섬유아세포, 신경상피세포 및 신경세포 특이 유전자 마커의 발현율을 qRT-PCR로 확인한 결과를 도시한 것이다.
도 4의 (a)를 참조하면, 인체 섬유아세포(Fibroblast)에서 인체 섬유아세포의 마커인 인체 콜라겐 I a1(COL I a1)의 발현율은 떨어지고 비멘틴(vimentin)의 발현율은 유지된다. 비멘틴은 신경상피세포(NEC)의 유전자 마커이기도 하기 때문에, 인체 콜라겐 발현과 비멘틴의 발현 양상이 다르게 나온 것으로 판단된다. 참고로, 인체 섬유아세포의의 마커인 인체 콜라겐 I a1은 인체 세포외 기질의 마커일 수 있다.
도 4의 (b)를 참조하면, 신경상피세포의 마커인 SOX2와 신경세포의 마커인 TUBB3는 모두 증가하였는데, 이는 인체 섬유아세포가 신경상피세포 또는 신경세포로 직접전환될 수 있음을 보여주는 결과이다.
이상의 제1 배양단계를 통해 인체 섬유아세포는 인체 신경상피세포 및 신경세포로 직접전환됨에 따라, 나아가 제2 배양단계에서 융합조직인 뇌 오가노이드로 발달할 수 있다.
(2) 제1 배양단계에서 직접전환 효율 증가를 위해 첨가된 화합물의 검증
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법에서의 제1 배양단계에 첨가된 화합물에 대한 신경상피세포로의 직접전환 효율을 다중전극 어레이로 나타낸 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 5를 참조하면, 아스코빅산 이외에 직접전환 효율을 증가시켜줄 물질을 찾기 위해, 인체 섬유아세포를 다양한 배양배지, 즉 DMEM/F12, Stemdiff, SCM101 및 low-glucose DMEM(DMEM/Low)으로 이루어진 군에서 선택된 하나의 배양배지에서 배양하고, 다양한 화합물, 즉 트리코스타틴, 5-아자시티딘, Wnt 신호 억제제 및 Chir99021로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 추가한 후, 2일 후에 다중전극 어레이를 이용하여 신경상피세포/신경세포로의 직접전환 효율을 측정하였는데, 배양배지 중 Merck사의 SCM101이 가장 직접전환 효율이 높았고, 화합물 중에는 트리코스타틴, 5-아자시티딘 및 Wnt 신호 억제제가 직접전환 효율 증가에 효과가 있었으며, Wnt 신호 억제제가 가장 효과적인 것으로 나타난다. 또한, low-glucose DMEM 배양배지에서는 상기 화합물 모두 신경세포로의 직접전환을 유도하지 않는 것으로 나타난다.
따라서, 제1 배양단계에서의 세포 배양배지 및 첨가되는 화합물로서 아스코빅산과 B27 이외에, 트리코스타틴, 5-아자시티딘 및 Wnt 신호 억제제가 인체 섬유아세포의 신경상피세포로의 직접전환 효율을 높이는데 효과가 있음을 보여준다.
(3) 뇌 오가노이드 제조를 위한 제2 배양단계 및 배양 결과
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법의 제2 배양단계에서 인체 신경상피세포에 ECM 용액을 혼합하여 제조하는 뇌 오가노이드 제조방법 절차를 도시한 것이다. 이하에서는 도 7을 참조하여 구체적으로 설명한다.
도 7의 (a)을 참조하면, 배양배지 1mL 당 1 x 105 내지 2 x 106 개의 인체 신경상피세포에 ECM 용액 1mL을 섞은 후, 바닥이 평평한 플레이트에 넣어주고 배양하면, 배양 1~2일 안에 여러 개의 직경 500μm 크기 이하의 스페로이드 형태의 뇌 오가노이드가 생성된다. 상기 바닥이 평평한 플레이트는 6웰, 12웰, 24웰, 48웰 및 96웰 플레이트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, low-adhesive 플레이트일 수 있으며, 바람직하게는 배양 면적 9 내지 11 cm2의 6웰 low-adhesive 플레이트일 수 있다. ECM 용액 내 인체 세포외 기질의 농도는 10 내지 100 μg/mL일 수 있다. 뇌 오가노이드의 크기에 따라 배양 중에 ECM 용액을 추가로 더 넣어줄 수 있다.
도 7의 (b)를 참조하면, 배양배지 1mL 당 1 x 105 내지 2 x 106 개의 인체 신경상피세포에 ECM 용액 1mL을 섞은 후, 둥근 바닥 플레이트에 넣어주고 배양하면, 배양 1~2일 안에 여러 개의 직경 500μm~3mm 크기의 튜브, 도넛 또는 원반 형태의 뇌 오가노이드가 생성된다. 상기 둥근 바닥 플레이트는 24웰, 48웰 및 96웰 플레이트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, low-adhesive 플레이트일 수 있으며, 바람직하게는 배양 면적 0.2 내지 0.7 cm2의 96웰 low-adhesive 플레이트일 수 있다. ECM 용액 내 인체 세포외 기질의 농도는 10 내지 100 μg/mL일 수 있다. 뇌 오가노이드의 크기에 따라 배양 중에 ECM 용액을 추가로 더 넣어줄 수 있다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법의 제2 배양단계에서 신경상피세포에 ECM 패치를 혼합하여 제조하는 뇌 오가노이드 제조방법 절차를 도시한 것이다. 이하에서는 도 9a 내지 9g를 참조하여 구체적으로 설명한다.
도 9a는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법의 제2 배양단계에서 신경상피세포에 ECM 패치를 혼합하여 제조한 뇌 오가노이드 광학현미경 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 9a를 참조하면, 배양배지 1mL 당 1 x 105 내지 2 x 106 개의 인체 신경상피세포에, 상기 인체 신경상피세포가 배양되고 있는 플레이트의 면적을 50 내지 90%를 덮을 수 있는 면적의 ECM 패치 1개를 넣어주고 배양하면, 배양 수일 내에 약 1cm 직경의(도 9a (a)) 뇌 오가노이드에 주름 및 접힘 형태(도 9a (b))가 생긴 것이 확인된다. 상기 플레이트는 6웰, 12웰, 24웰, 48웰 및 96웰 플레이트로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있고, 둥근 바닥 또는 평평한 바닥 플레이트일 수 있으며, 바람직하게는 배양 면적 9 내지 11 cm2의 6웰 플레이트일 수 있다.
도 9a를 참조하면, 약 1cm 직경의(도 9a (a)) 뇌 오가노이드에 주름 및 접힘 형태(도 9a (b))가 생긴 것이 확인된다.
도 9b 내지 9c는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법의 제2 배양단계에서 신경상피세포에 ECM 패치를 혼합하여 제조한 뇌 오가노이드 형광현미경 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 9b를 참조하면, 인체 신경상피세포는 신경세포 마커인 TUBB3(붉은색)로 표시되어 있으며, 세포 핵 염색마커인 DAPI는 파란색으로 표시되어 있다. 인체 신경상피세포는 상기 인체 뇌 오가노이드의 피질에 복수 개의 세포층으로 구성되어 있으며, 뇌 오가노이드의 피질 부위는 수질 부위와 세포 및 세포외 기질이 없는 빈 공간으로 구분되어 있음을 확인할 수 있다.
도 9c를 참조하면, 뇌 오가노이드 피질에 분포하는 TUBB3로 염색된 신경세포가 도 9c의 하얀색 화살표 방향으로 길게 늘어선 방향성을 보여주고 있으며, 도 9c의 노란색 원으로 표시된 지역에서는 특정 방향성이 없이 다방향으로 뭉쳐있는 것을 보여주고 있다.
도 9d는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법의 제2 배양단계에서 신경상피세포에 ECM 패치를 혼합하여 제조한 뇌 오가노이드 생성 2주차의 형광현미경 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 9d를 참조하면, TUBB3를 발현하는 신경세포들이 방향성 없이 뇌 오가노이드 내부에 분포하고, TUBB3를 발현하지 않는 세포들은 뇌 오가노이드의 표면으로 모이는 현상이 관찰된다.
도 9e 내지 9g는 본 발명의 일 실시예에 따른 뇌 오가노이드 제조방법의 제2 배양단계에서 신경상피세포에 ECM 패치를 혼합하여 제조한 뇌 오가노이드 생성 4주차의 형광현미경 이미지 결과를 도시한 것이다.
도 9e를 참조하면, TUBB3를 발현하는 신경세포들의 밀도가 높아지면서 뇌 오가노이드의 피질에 복수 개의 세포층이 형성된다. 이 결과는 뇌 오가노이드의 배양 기간에 따라 세포 증식과 이동이 점차 고도화되고, 오가노이드 구조와 형태가 복잡해지는 것을 의미할 수 있다.
도 9f를 참조하면, GFAT을 발현하는 별아교세포가 특정 지역에 밀집되어 있음이 확인된다. 별아교세포의 분포는 뇌 신경세포의 성숙도와 관련이 있다.
도 9g를 참조하면, 직경 약 1cm 크기의 뇌 오가노이드 내부에 혈관 구조가 생성되어 있는 것이 PECAM1 면역형광염색으로 확인된다. 혈관의 부재는 뇌를 포함한 모든 장기 오가노이드 개발의 장애물로 여겨지고 있다. 혈관 구조의 생성으로 뇌 오가노이드 내부의 세포괴사를 극복할 수 있다. 나아가 뇌의 혈액뇌장벽(blood brain barrier, BBB)은 매우 특수한 구조로 되어 있는데, BBB의 기능과 발달과정을 본 발명의 혈관을 포함하는 뇌 오가노이드로 확인할 수 있다.
이상의 제2 배양단계를 통해, ECM 패치를 이용하여 제조된 직경 3 mm 이상의 주름이 있는 뇌 오가노이드는, 자연적으로 생긴 주름과 접힘 구조 및 1 내지 2개의 뇌실 구조를 가짐으로서 실제 인체 뇌 조직 구조와 유사한 형태를 모사하는 효과가 있다. 또한, 상기 뇌 오가노이드는 혈관 구조를 포함함으로써 혈관화 부재로 인한 오가노이드 내부 세포괴사(necrosis)를 극복할 수 있으며, 더 나아가 이러한 혈관구조를 통해 뇌의 혈액뇌장벽의 기능과 발달과정을 확인할 수 있는 효과가 있다.
이상의 제1 내지 제2 배양단계를 거쳐 생산된 뇌 오가노이드는 기존 역분화줄기세포를 포함한 만능줄기세포로부터 생산된 뇌 오가노이드의 제작과정에 비해 시간 및 비용을 절감할 수 있으며, 더 나아가, 체세포에서 직접전환된 신경상피세포는 냉동과 해동 후에도 형질이 유지되는 효과가 있어서 다량을 생산해 냉동보관하고, 필요할 때마다 해동해서 뇌 오가노이드를 제작함으로 실험결과의 재현성을 높일 수 있는 효과가 있다.
이상 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예들을 더욱 상세하게 설명하였으나, 본 발명은 반드시 이러한 실시 예로 국한되는 것은 아니고, 본 발명의 기술사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양하게 변형 실시될 수 있다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시 예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시 예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 그러므로, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술 사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (21)

  1. 직경 3 mm 이상이고, 주름 또는 접힘 형태를 가지는 인체 뇌 오가노이드.
  2. 직경 500 μm 이하이고, 스페로이드 형태를 가지는 뇌 오가노이드.
  3. 직경 500 μm 내지 3 mm이고, 튜브, 도넛, 원반 형태 중 하나 이상의 형태를 가지는 뇌 오가노이드.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 인체 뇌 오가노이드는 인체 신경세포(Neuron cell) 마커 및 인체 별아교세포(Astrocyte) 마커를 포함하는 군에서 하나 이상을 발현하는 인체 뇌 오가노이드.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 인체 신경세포 마커는 TUBB3(Tubulin Beta Class III) 마커인 것을 포함하고, 상기 인체 별아교세포 마커는 GFAP(Glial Fibrillary Acidic Protein) 마커인 것을 포함하는 인체 뇌 오가노이드
  6. 제 1항에 있어서,
    인체 신경상피세포를 더 포함하고, 상기 인체 신경상피세포는 상기 인체 뇌 오가노이드의 피질에 복수 개의 세포층으로 구성되는 인체 뇌 오가노이드.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 인체 뇌 오가노이드의 피질 부위는 수질 부위와 세포 및 세포외 기질이 없는 빈 공간으로 구분되는 인체 뇌 오가노이드.
  8. 제 1항에 있어서,
    오가노이드 내부에 혈관을 더 포함하는 인체 뇌 오가노이드.
  9. 제 1 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 인체 뇌 오가노이드는 인체 유래 세포외 기질(Extracellular matrix) 마커를 발현하는 인체 뇌 오가노이드.
  10. 인체 섬유아세포(fibroblast)를 인체 신경상피세포(neuroepithelial cell)로 직접전환(direct reprogramming)되도록 배양하는 제1 배양단계 및 융합 조직이 형성되도록 상기 인체 신경상피세포를 인체 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)을 포함하는 유지 배지(maintenance media)에서 배양하는 제2 배양단계를 포함하고,
    상기 인체 세포외 기질은, ECM 용액 및 ECM 패치로 이루어진 군에서 선택되는 1개 이상인 것을 포함하는 뇌 오가노이드 제조방법.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 제1 배양단계는, 상기 인체 섬유아세포를 FBS를 포함하지 않는 제1 전환 배지에서 1 내지 3일간 배양하는 제3 배양단계, B27과 상기 인체 세포외 기질을 포함하는 제2 전환 배지에서 4 내지 7일간 배양하는 제4 배양단계 및 B27과 아스코빅산을 포함하는 제3 전환 배지 에서 7 내지 14일간 배양하는 제5 배양단계를 포함하는 뇌 오가노이드 제조방법.
  12. 제 11항에 있어서,
    상기 B27의 농도는 2 내지 10 부피% (v/v)인 것을 특징으로 하는 뇌 오가노이드 제조방법.
  13. 제 11항에 있어서,
    상기 아스코빅산의 농도는 0.1 내지 1 mM인 것을 특징으로 하는 뇌 오가노이드 제조방법.
  14. 제 10항에 있어서,
    상기 제1 배양단계는, Wnt 신호 억제제(Inhibitor of Wnt signaling)를 추가하는 단계를 더 포함하는 뇌 오가노이드 제조방법.
  15. 제 10항에 있어서,
    상기 인체 신경상피세포의 수 대비 상기 ECM 용액의 양은 1 x 106 세포 대비 상기 ECM 용액 0.2 mL 내지 5 mL의 비율을 포함하고,
    상기 ECM 용액 내 인체 세포외 기질의 농도는 10 내지 100 μg/mL인 것인 뇌 오가노이드 제조방법.
  16. 제 10항에 있어서,
    상기 제1 배양단계는, 트리코스타틴(trichostatin) 및 5-아자시티딘(5-azacytidine)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 추가하는 단계를 포함하는 뇌 오가노이드 제조방법.
  17. 제 10항에 있어서,
    상기 제2 배양단계는, 상기 인체 신경상피세포에 상기 ECM 용액을 넣고, 평평한 바닥의 low-adhesive 플레이트에 배양하여 직경 500 μm 이하의 스페로이드 형태를 가진 뇌 오가노이드를 형성하는 뇌 오가노이드 제조방법.
  18. 제 10항에 있어서,
    상기 제2 배양단계는, 상기 인체 신경상피세포에 상기 ECM 용액을 넣고, 둥근 바닥의 low-adhesive 플레이트에 배양하여 직경 500 μm 내지 3 mm의 뇌 오가노이드를 형성하는 뇌 오가노이드 제조방법.
  19. 제 18항에 있어서,
    상기 뇌 오가노이드는 튜브, 도넛, 원반 형태 중 하나 이상의 형태인 것인 뇌 오가노이드 제조방법.
  20. 제 10항에 있어서,
    상기 제2 배양단계는, 상기 인체 신경상피세포에 상기 ECM 패치를 넣고, 배양 면적 9 내지 11 cm2의 low-adhesive 플레이트 배양하는 뇌 오가노이드 제조방법.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 뇌 오가노이드는 직경 3 mm 이상이고, 주름 또는 접힘 형태를 가지는 뇌 오가노이드 제조방법.
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