WO2019124604A1 - 프로안토시아니딘을 유효성분으로 함유하는 편평상피암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

프로안토시아니딘을 유효성분으로 함유하는 편평상피암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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cell carcinoma
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proanthocyanidin
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하영술
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경상대학교병원
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of squamous cell cancer containing proanthocyanidin as an active ingredient.
  • Grape is one of the most consumed fruit in the world, grape seed extract contains lipid, protein, carbohydrate and polyphenol. Polyphenols have diverse biological functions and are abundant in grape seed (60-70%) and shell (30%). Among the phenolic compounds, proanthocyanidin is a major component of grape seeds and is a polymer composed of a dimer or polymer of catechin and epicatechin. Grape seed proanthocyanidin (GSP) is known to have higher antioxidant activity than antioxidants such as vitamin C, vitamin E and gallic acid. In addition, GSP has been shown to exhibit a wide range of biological activities including antioxidant, cardioprotective, and anti-inflammatory effects, and to exhibit chemical prophylactic and antitumor effects on breast, prostate, skin, and colorectal cancer cells.
  • GSP Grape seed proanthocyanidin
  • Autophagy is an intracellular degradation system in which proteins and cell organelles are isolated, degraded and recycled. Childhood is an important housekeeping process that occurs throughout the body and is involved in the regulation of neural degenerative and muscular disorders, and mechanisms of onset such as cancer. Under physiological conditions, the subculture regulates intracellular homeostasis and is thus regarded as the underlying cell mechanism. In addition, childhood is an alternative pathway to apoptosis and is an adaptive mechanism for a number of physical stresses including protein aggregation, genotoxic agents and nutrition loss.
  • flavonoids and non-enzymatic molecules such as vitamins A, C and E and the use of enzyme-based abolishing agents such as catalase, ascorbate peroxidase and superoxide dismutase
  • enzyme-based abolishing agents such as catalase, ascorbate peroxidase and superoxide dismutase
  • GSP-induced apoptosis in various types of cancer is not known to date, and in particular, the effect of GSP on cell death and offspring in squamous cell carcinoma (SCC) potentiator) and to treat squamous cell carcinoma.
  • SCC squamous cell carcinoma
  • the present invention provides a composition for preventing, ameliorating or treating squamous cell cancer.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating squamous cell cancer containing proanthocyanidin as an active ingredient, and a health food composition for preventing or ameliorating squamous cell cancer.
  • grape seed proanthocyanidin inhibits cell proliferation in a concentration-dependent manner in a human squamous cell carcinoma cell line and decreases cell motility and invasiveness through inhibition of MMP-2/9 expression , And can induce apoptosis and child action through the production of reactive oxygen species. Furthermore, in treating cancer such as squamous cell carcinoma, grape seed proanthocyanidin can be used in combination with an anticancer agent as a child acting activator.
  • the proanthocyanidin of the present invention having the above-mentioned effects can be effectively utilized as a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of squamous cell carcinoma, and as a health food composition for preventing or ameliorating squamous cell cancer.
  • FIG. 1 shows the results of CCK-8 analysis of inhibition of cell proliferation and cell survival by grape seed proanthocyanidin (GSP) in squamous cell carcinoma cell line (SSC12).
  • FIG. 2 is a graph showing cell cycle arrest and cell death induction by GSP by flow cytometry (A), (B) statistical plots of apoptotic cells, and (C) histogram of cell cycle.
  • FIG. 3 shows the effect of GSP-induced MMP-2/9 expression and activity reduction, cell motility and inhibition of infiltration through (A) wound healing assay, (B) invasion assay, and (C) gelatin glycation and Western It is confirmed by BLAT.
  • Fig. 4 shows the effect of inducing the action of GSP by the worms (A) and the recombinant adenovirus (B).
  • FIG. 5 shows the results of (A) CCK-8 analysis and (B) flow cytometry showing the effect of 3-methyladenine (3-MA), which is a malfunction inhibitor, on reducing GSP-induced cytotoxicity.
  • FIG. 6 shows flow cytometry analysis of the effect of the presence of NAC (AAC), an antioxidant inhibitor, or (B) in the absence of GAC-induced reactive oxygen species (ROS).
  • AAC NAC
  • ROS GAC-induced reactive oxygen species
  • FIG. 7 shows the results of (A) CCK-8 analysis, (B) flow cytometry, and (C) recombinant adenovirus.
  • Fig. 8 shows the mechanism of GSP in regulating SSC12 cell invasion, apoptosis and child action.
  • grape seed proanthocyanidin can inhibit cell proliferation and cell infiltration in human squamous cell carcinoma cell line and induce reactive oxygen species mediated cell death and child action, Thereby completing the invention.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prophylaxis or treatment of squamous cell cancer containing proanthocyanidin as an active ingredient.
  • the proanthocyanidins may be extracted from grape seeds, but are not limited thereto.
  • the composition can inhibit the cell proliferation of cancer cells.
  • the composition may reduce cell motility and invasiveness through inhibition of MMP-2 and MMP-9 expression.
  • the composition can induce apoptosis and child action through the production of reactive oxygen species.
  • composition may further comprise an anti-cancer agent.
  • composition of the present invention when it is a pharmaceutical composition, for administration, it may contain a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the above-mentioned effective ingredient.
  • a pharmaceutically acceptable carrier examples include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methylcellulose, microcrystalline cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols or the like, oral preparations, suppositories or sterilized injection solutions according to conventional methods .
  • it when formulating, it can be prepared using diluents or excipients such as fillers, weights, binders, humectants, disintegrants, surfactants and the like which are usually used.
  • Solid form preparations for oral administration include, but are not limited to, tablets, pills, powders, granules, capsules and the like.
  • Such a solid preparation may be prepared by mixing at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin and the like in addition to the active ingredient.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin and the like in addition to the active ingredient.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral administration, liquid paraffin, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and tasks.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate, and the like.
  • a base for suppositories it is possible to use witepsol, macrosole, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.
  • the appropriate dose of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the condition and the weight of the patient, the degree of disease, the type of drug, and the time, but can be appropriately selected by the person skilled in the art. 0.001 mg / kg to 50 mg / kg, and may be administered once to several times per day as needed.
  • the present invention also provides a health food composition for preventing or ameliorating squamous cell cancer, which contains proanthocyanidin as an active ingredient.
  • composition of the present invention when the composition of the present invention is a health food composition, it may contain various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), flavors such as synthetic flavors and natural flavors, colorants and heavies such as cheese, chocolate, , Alginic acid and its salts, organic acids, protective colloid thickeners, pH adjusting agents, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonating agents used in carbonated drinks and the like. It may also contain flesh for the production of natural fruit juices, synthetic fruit juices and vegetable drinks. These components may be used independently or in combination.
  • the health food composition may be in the form of any one of meat, sausage, bread, chocolate, candy, snack, confectionery, pizza, ramen, gum, ice cream, soup, beverage, tea, functional water, drink, alcohol and vitamin complex .
  • the health food composition may further include a food additive, and the suitability of the food additive as a food additive is not limited to those described in the General Rules and General Test Methods approved by the Food and Drug Administration Standards and standards.
  • Examples of the above-mentioned food additives include natural products such as ketones, chemical products such as glycine, potassium citrate, nicotinic acid and cinnamic acid, detainable extracts, licorice extracts, crystalline cellulose, high-melting dyes and guar gum, A mixed preparation such as a sodium preparation, a noodle-added alkaline preparation, a preservative preparation, a tar coloring preparation and the like.
  • composition according to the present invention which is added to foods in the course of manufacturing a health food composition, can be appropriately increased or decreased as needed.
  • GSP Grape seed proanthocyanidin
  • 3-methyladenine (3-MA) was purchased from Sigma-Aldrich (Merck Millipore, Darmstadt, Germany).
  • the human squamous cell carcinoma cell line SCC12 cell line
  • SCC12 cell line was obtained from James Rheinwald (Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, Boston, USA), supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 0.5 mg / ml hydrocortisone (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA) in DMEM medium containing 5 mg / ml insulin and 10 ng / ml epidermal growth factor .
  • FBS fetal bovine serum
  • DMEM medium containing 5 mg / ml insulin and 10 ng / ml epidermal growth factor .
  • the cells were cultured in a growth medium.
  • the cultured cells were treated with various concentrations of GSP dissolved in phosphate buffered saline (PBS), and the control group treated the same amount of vehicle solution (PBS).
  • PBS phosphate buffered saline
  • SCC12 cells (5 ⁇ 10 4 cells / well) were inoculated into a 24-well plate and cultured at 37 ° C. for 24 hours.
  • Various concentrations of GSP (10, 50, 100 and 200 ⁇ g / ml) for 24 hours.
  • Cell viability was measured using Cell Counting kit-8 (CCK-8, Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japan).
  • CCK-8 solution was added to each well and incubated at 37 ° C. in 5% CO 2 And incubated in an incubator for 1 hour. Absorbance was measured at 450 nm using a microplate reader (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, Calif., USA).
  • SCC12 cells were pretreated with 3-MA (10 mM) for 1 hour, cultured for 24 hours with GSP, and absorbance was measured at 450 nm.
  • SCC12 cells inoculated in 24-well plates at a density of 2 ⁇ 10 5 cells / well, and cultured overnight at 37 °C. Using a 200 ⁇ l pipette tip, the cell layer attached to the bottom of the plate was scratched with a horizontal line. The cells were then washed with PBS and incubated for 6 hours with serum-free medium containing 10 or 50 ⁇ g / ml GSP. Images of the plate were taken using a microscope equipped with an image capture system (Nikon Corporation, Tokyo, Japan).
  • Transwell inserts (Costar, Sigma-Aldrich, Merck Millipore) equipped with a polycarbonate filter (8 ⁇ m pore size). Transwell inserts are coated with a uniform layer of BD Matrigel TM Basement Membrane Matrix (BD Biosciences). The stable cell line was resuspended in DMEM / F12 medium containing 10% FBS, and the cells were inoculated into the upper well (1 ⁇ 10 5 cells / well) and cultured at 37 ° C. for 24 hours. The infiltrated cells were fixed with 4% paraformaldehyde, stained with DAPI, and counted in five random fields under a fluorescence microscope at x100 magnification.
  • the activity of net gelatinase (MMP-2 and MMP-9) in the cell culture supernatant was measured using an SDS-containing gel prepared by copolymerizing acrylamide and gelatin at a final concentration of 0.1% (w / v).
  • the samples were dispersed in a Laemmli solubilized solution in which dithiothreitol had been removed for 10 minutes at room temperature. Electrophoresis was performed at 4 [deg.] C for 3 hours at 10 mA.
  • the gel 2.5% (v / v) Triton X-100 is an incubation for 60 minutes soak at room temperature for zymogram renaturing buffer solution containing the following, 5 mM CaCl 2 is a 50 mM Tris-HCl (pH 7.6 ) containing And incubated at 37 DEG C for 16 hours. The gel was then stained with 0.5% Coomassie Brilliant Blue G-250 according to standard protocols.
  • Total protein (30 ⁇ g) was separated by 10% SDS-PAGE and analyzed by using a quartz crystal moving device (Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell; Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, And transferred to the nitrocellulose membrane for 30 minutes. Protein-transferred membranes were blocked with 5% skim milk and incubated with primary antibody [MMP-2 (1: 1,000 dilution; sc-10736; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, ) And LC3 (1: 1000 dilution; AP1801a, Abgent; Inc., San Diego, CA, USA) overnight and washed three times with TBS (Tris-buffered saline) containing 0.1% Tween- .
  • TBS Tris-buffered saline
  • HRP was then reacted with conjugated secondary antibody (1: 3000 dilution; sc-2030; Santa Cruz Biotechnology, Inc.) for 1 hour at room temperature. Protein bands were performed using a chemiluminescence detection system (Pierce; Thermo Fisher Scientific Inc.) according to the protocol provided by the manufacturer. ⁇ -actin was used as a control.
  • ROS reactive oxygen species
  • cells were seeded in 6-well plates and cultured overnight at 37 ° C and then treated with GSP for 4 hours in the presence or absence of N-acetyl cysteine (NAC).
  • NAC N-acetyl cysteine
  • Cells were stained with 5 ⁇ M DCF-DA in serum-free medium for 15 min and removed from the plate with trypsin-EDTA (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.).
  • the fluorescence intensity of the cells was measured with a flow cytometry analyzer having an excitation wavelength of 480 nm and an emission wavelength of 525 nm (BD Biosciences) and analyzed using CellQuest Pro software (version 4.0, BD Biosciences).
  • Example 10 Recombinant adenovirus
  • Adenovirus encoding LC3 (Ad-GFP-LC3) labeled with green fluorescent protein (GFP) was prepared using the Virapower adenovirus expression system (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) according to the protocol provided by the manufacturer Respectively.
  • a DNA construct (constrcut) encoding GFP in LC3 was subcloned into pENTR vector.
  • Site-specific recombination between the entry vector (pENTR-GFP-LC3) and the adenoviral destination vector (pAd / CMV / V5-DEST) was performed using LR clonase II (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.). All structures were verified by Sanger dideoxy sequencing analysis (Bioneer Inc., Seoul, Korea).
  • the validated clone (pAd-GFP-LC3) was linearized using Pac I (New England Biolabs, Inc., Ipswich, Mass., USA) and then ligated into 293A cells using Lipofectamine 2000 (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.) . ≪ / RTI > After amplification, the virus was purified from the supernatant of 293A cells expressing the cytopathic effect using the Adeno-X TM virus purification kit (BD Biosciences), and the virus level was measured using plaque formation analysis by serial dilution.
  • Pac I New England Biolabs, Inc., Ipswich, Mass., USA
  • the cells 1 ⁇ 10 5 cells / ml and inoculated into the 6-well plates at a density of, and the day after infection multiplicity of 10 (multiplicity of infection; MOI) was injected transfected with recombinant adenovirus at.
  • MOI multiplicity of infection
  • CCK-8 analysis was performed to determine the effect of GSP on cell survival in human SCC12 cells. As a result, referring to FIG. 1, it was confirmed that GSP reduced the survival rate of SCC12 cells in a concentration-dependent manner and decreased the cell survival rate by about 50% at a concentration of 100 ⁇ g / ml.
  • Flow cytometry analysis was performed to confirm whether the GSP-induced cell survival reduction effect was due to apoptosis.
  • Cell death was assessed by measuring the number of cells in the sub-G1 region.
  • FIG. 2A and FIG. 2B it was confirmed that GSP increases cell percentage in the sub-G1 region in a concentration-dependent manner, so that the cell proliferation inhibitory effect by GSP in SCC12 cells is related to induction of apoptosis Respectively.
  • the number of cells was decreased in the G0 / G1 phase of the SCC12 cells compared with that of the control, and the number of cells was increased in the G2 / M phase . This means that treatment of GSP in SCC12 cells induces G2 / M arrest.
  • SCC12 cells have a high avidity, and GSP is known to inhibit the migration of cancer cells by destroying the mitochondrial pathway and increasing the activation of caspase-3.
  • GSP inhibition in the motility of SCC12 cells has not been elucidated to date. Therefore, the present invention analyzed the effect of GSP on mobility and invasiveness of SCC12 cells.
  • FIG. 3A cell motility was markedly reduced in SCC12 cells treated with GSP compared to the control group.
  • FIG. 3B In GSP treatment, cell infiltration was decreased compared to the control group.
  • LC3-II generation Two independent LC3 assays were performed, LC3-II generation and GFP-LC3 spot formation, to confirm the effect of GSP on induction of child action.
  • LC3 is lipidated and aggregates in childhood vacuoles.
  • FIG. 4A it was confirmed that the protein expression of LC3-I and LC3-II increased in a time-dependent manner after treatment with 100 ⁇ g / ml of GSP.
  • Recombinant adenovirus expressing the GFP-LC3 fusion protein was prepared to further confirm the GSP-induced subpopulation, and whether GSP could promote GFP-LC3 spot formation, an indicator of the autophagosome generation Respectively.
  • SCC12 cells transduced with Ad-GFP-LC3 were treated with GSP and the GFP-LC3 fusion protein was visualized under a confocal microscope.
  • FIG. 4B it was confirmed that GFP-LC3 formed a dot pattern structure, and the number of GFP-LC3 spots was increased depending on GSP concentration.
  • GSP-induced cell cytotoxicity was significantly reduced in pretreatment of cells with 3-MA but GSP-induced cell death was not blocked. This means that the antiproliferative activity of GSP is partly due to the death of child-induced cell death.
  • the present invention proposes a GSP-induced cell death mechanism associated with ROS mediated child action and activation of apoptosis.
  • GSP inhibits the growth and infiltration of SCC12 cells and induces ROS-mediated cell death and child cell death. This suggests that the regulation of ROS generation and child action can be used for the potential treatment of squamous cell carcinoma.

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Abstract

본 발명은 프로안토시아니딘을 유효성분으로 함유하는 편평상피암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따르면, 포도 씨 프로안토시아니딘(grape seed proanthocyanidin; GSP)은 인간 편평상피암 세포주에서 농도 의존적으로 세포 증식을 억제하고, MMP-2/9 발현 억제를 통해 세포의 운동성과 침윤성을 감소시키며, 반응성 산소종의 생성을 통해 세포사멸 및 자식작용을 유도할 수 있다. 또한, 편평상피암과 같은 암 치료에 있어서 포도 씨 프로안토시아니딘은 자식작용 활성제로서 항암제와 병용 투여하여 사용할 수 있다. 따라서, 상기와 같은 효과를 가지는 본 발명의 프로안토시아니딘은 편평상피암의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 편평상피암의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

프로안토시아니딘을 유효성분으로 함유하는 편평상피암의 예방 또는 치료용 약학 조성물
본 발명은 프로안토시아니딘을 유효성분으로 함유하는 편평상피암의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
포도는 전 세계적으로 가장 많이 소비되는 과일 중 하나로 포도 씨 추출물에는 지질, 단백질, 탄수화물 및 폴리페놀이 함유되어 있다. 폴리페놀은 다양한 생물학적 기능을 가지고 있으며, 포도 씨(60-70 %)와 껍질(30 %)에 많이 함유되어 있다. 페놀성 화합물 중 프로안토시아니딘(proanthocyanidin)은 포도 씨의 주요 성분이며, 카테킨(catechin)과 에피카테킨(epicatechin)의 이량체 또는 고분자로 구성된 고분자 중합체이다. 포도 씨 프로안토시아니딘(grape seed proanthocyanidin; GSP)은 비타민 C, 비타민 E, 갈산과 같은 항산화 물질 보다 높은 항산화 활성을 가지는 것으로 알려져 있다. 또한, GSP는 항산화, 심장 보호 및 항염증 효과를 비롯한 광범위한 생물학적 활성을 나타내며, 유방암, 전립선암, 피부암 및 대장암 세포에 화학적 예방 및 항종양 효과를 나타내는 것으로 보고되어져 있다.
자식작용(autophagy)은 단백질과 세포소기관이 격리되고 분해되고 재활용되는 세포 내 분해 시스템이다. 자식작용은 신체 전반에 걸쳐 일어나는 중요한 하우스키핑(housekeeping) 과정이며, 신경퇴행성 및 근육질환, 및 암과 같은 발병 기전 조절에 관여한다. 생리 조건 하에서, 자식작용은 세포 내 항상성을 조절하므로 기초 세포 메커니즘으로 간주된다. 또한, 자식작용은 세포사멸에 대한 대안 경로이며, 단백질 응집, 유전 독성 물질 및 영양 손실을 포함한 수많은 물리적 스트레스에 대한 적응 메커니즘이다. 특히, 플라보노이드 및 비타민 A, C 및 E와 같은 비 효소적 분자, 및 카탈라아제, 아스코르베이트 퍼옥시다아제(ascorbate peroxidase) 및 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)와 같은 효소 기반의 소거제를 사용하는 세포의 주요 방어 메커니즘이 산화 스트레스 하에서 원하는 결과를 달성하지 못한다면, 자식작용은 산화 물질을 제거하여 세포를 보호한다. 그러나 산화 스트레스가 이러한 방어 기작에 의해 항상 극복되는 것은 아니며, 이는 자식작용에 의한 세포사멸을 야기한다.
다양한 종류의 암에서 GSP에 의한 세포사멸의 정확한 기전은 현재까지 알려진 바가 없으며, 특히, 편평상피암(squamous cell carcinoma; SCC)에서 GSP가 세포사멸 및 자식작용에 미치는 영향을 분석하면, 항암제의 강화제(potentiator)로서의 새로운 기능 확인 및 편평상피암 치료에 활용할 수 있다.
본 발명은 편평상피암의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로안토시아니딘을 유효성분으로 함유하는 편평상피암의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 편평상피암의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 포도 씨 프로안토시아니딘(grape seed proanthocyanidin; GSP)은 인간 편평상피암 세포주에서 농도 의존적으로 세포 증식을 억제하고, MMP-2/9 발현 억제를 통해 세포의 운동성과 침윤성을 감소시키며, 반응성 산소종의 생성을 통해 세포사멸 및 자식작용을 유도할 수 있다. 또한, 편평상피암과 같은 암 치료에 있어서 포도 씨 프로안토시아니딘은 자식작용 활성제로서 항암제와 병용 투여하여 사용할 수 있다.
따라서, 상기와 같은 효과를 가지는 본 발명의 프로안토시아니딘은 편평상피암의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 편평상피암의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 편평상피암 세포주(SSC12)에서 포도 씨 프로안토시아니딘(GSP)에 의한 세포 증식 및 세포 생존율 억제 효과 CCK-8 분석으로 확인한 것이다.
도 2는 GSP에 의한 세포주기 정지 및 세포사멸 유도 효과를 (A) 유세포 분석, (B) 사멸 세포의 통계 플롯 및 (C) 세포주기의 히스토그램으로 확인한 것이다.
도 3은 GSP에 의한 MMP-2/9 발현 및 활성 감소 효과, 이를 통한 세포의 운동성 및 침윤 억제 효과를 (A) 상처 치유 분석법, (B) 침윤 분석법, 및 (C) 젤라틴 자이모그래피 및 웨스턴 블랏으로 확인한 것이다.
도 4는 GSP에 의한 자식작용 유도 효과를 (A) 웨스턴 블랏 및 (B) 재조합 아데노바이러스로 확인한 것이다.
도 5는 자식작용 억제제인 3-메틸아데닌(3-MA)에 의한 GSP 유도 세포 독성 감소 효과를 (A) CCK-8 분석 및 (B) 유세포 분석으로 확인한 것이다.
도 6은 항산화제 억제제인 N-아세틸 시스테인(NAC) (A) 존재 또는 (B) 부재 하에서, GSP 유도 반응성 산소종(ROS)의 생성 효과를 유세포 분석으로 확인한 것이다.
도 7은 ROS의 소거에 의한 세포사멸 및 자식작용 억제 효과를 (A) CCK-8 분석, (B) 유세포 분석 및 (C) 재조합 아데노바이러스로 확인한 것이다.
도 8은 SSC12 세포의 침윤, 세포사멸 및 자식작용을 조절에 있어서 GSP의 메커니즘을 도시하여 나타낸 것이다.
본 발명의 발명자들은 포도 씨 프로안토시아니딘이 인간 편평상피암 세포주에서 세포 증식 및 세포 침윤을 억제하고, 반응성 산소종 매개 세포사멸 및 자식작용을 유도함으로써 편평상피암 치료에 활용이 가능함을 확인하며 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 프로안토시아니딘을 유효성분으로 함유하는 편평상피암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 프로안토시아니딘은 포도 씨에서 추출한 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아님을 명시한다.
상기 조성물은 암세포의 세포 증식을 억제할 수 있다.
상기 조성물은 MMP-2 및 MMP-9 발현 억제를 통해 세포의 운동성 및 침윤성을 감소시킬 수 있다.
상기 조성물은 반응성 산소종 생성을 통해 세포사멸 및 자식작용을 유도할 수 있다.
상기 조성물은 항암제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당 업자에 의해 적절하게 선택될 수 있는 바, 상기 조성물의 일일 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 50 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 프로안토시아니딘을 유효성분으로 함유하는 편평상피암의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 건강식품 조성물인 경우, 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스, 합성 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강식품 조성물은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.
또한, 상기 건강식품 조성물은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, 식품첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안전처에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반 시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 식품첨가물공전에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류 첨가 알칼리제, 보존료제제, 타르색소 제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다.
이때, 건강식품 조성물을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 조성물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있다.
이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1 : 시약
포도 씨 프로안토시아니딘(grape seed proanthocyanidin; GSP)은 한림약품(Seoul, Korea))에서 제공받았다. 3-메틸아데닌(3-methyladenine; 3-MA)은 Sigma-Aldrich(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)에서 구입하였다.
실시예 2 : 세포배양 및 처리
인간 편평상피암 세포주인 SCC12 세포주는 James Rheinwald(Brigham and Women 's Hospital, Harvard Medical School, Boston, USA)로부터 제공 받았으며, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum; FBS), 0.5 mg/ml 하이드로코르티손(hydrocortisone), 5 mg/ml 인슐린 및 10 ng/ml 표피 성장 인자가 함유된 DMEM 배지를 Ham 's F-12 Nutrient Mixture(Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)와 3:1의 비율로 혼합한 성장 배지에서 배양하였다. 배양된 세포는 인산완충식염수(phosphated buffered saline; PBS)에 용해된 다양한 농도의 GSP로 처리하였고, 대조군은 동일한 양의 비히클 용액(PBS)을 처리하였다.
실시예 3 : 세포 생존율 분석(cell viability analysis)
SCC12 세포(5×104 세포/웰)를 24-웰 플레이트(24-well plate)에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 다양한 농도의 GSP(10, 50, 100 및 200 μg/ml)로 24시간 동안 처리하였다. 세포 생존율은 Cell Counting kit-8(CCK-8, Dojindo Molecular Technologies, Inc., Kumamoto, Japan)을 이용하여 측정하였다.
간략하게, CCK-8 용액 10 μl를 각 웰에 첨가하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 마이크로플레이트 리더기(microplate reader, Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
3-MA가 세포사멸에 미치는 영향을 분석하기 위해, SCC12 세포를 1시간 동안 3-MA(10 mM)로 전처리한 후, GSP를 처리하여 24시간 동안 배양하고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 4 : 유세포 DNA 분석(flow cytometric DNA analysis)
배양 후 세포를 취하여 차가운 PBS로 2회 세척하고, 70% 에탄올로 4℃에서 1시간 동안 고정시켰다. 그 다음 RNase A(Sigma-Aldrich, Merck Millipore)를 1 mg/ml 처리한 후, 프로피디움 요오드화물(propidium iodide, Sigma-Aldrich, Merck Millipore) 50 μg/ml으로 세포를 염색하였다. FACSCalibur™ 유세포 계측기(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)를 이용하여 세포 당 상대적인 DNA 함량을 측정하였다. CellQuest Pro 소프트웨어(버전 4.0, BD Biosciences)를 이용하여 데이터를 분석하고, ModFit LT 소프트웨어(버전 3.0, Verity Software House, Inc., Topsham, ME, USA)를 이용하여 세포주기의 각 단계에서 세포의 비율을 계산하였다.
실시예 5 : 세포 이동 분석(cell migration assay)
SCC12 세포를 24-웰 플레이트에 2×105 세포/웰의 밀도로 접종하고, 37℃에서 밤새 배양하였다. 200 μl의 피펫 팁을 이용하여 플레이트 바닥에 붙어있는 세포 단층을 수평 라인으로 긁어냈다. 그 후, 세포를 PBS로 세척하고, 10 또는 50 μg/ml GSP가 함유된 무혈청 배지와 함께 6시간 동안 배양하였다. 플레이트의 이미지는 이미지 캡처 시스템(Nikon Corporation, Tokyo, Japan)이 장착된 현미경을 이용하여 촬영하였다.
실시예 6 : 침윤 분석(invasion assay)
침윤 분석은 폴리카보네이트 필터(8 μm 공극 크기)가 장착된 24-웰 Transwell inserts(Costar, Sigma-Aldrich, Merck Millipore)를 이용하여 수행하였다. Transwell inserts는 BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix(BD Biosciences)가 균일한 층으로 코팅되어 있다. 안정한 세포주를 10% FBS가 함유된 DMEM/F12 배지에 재현탁하고, 상단 웰에 세포(1×105 세포/웰)를 접종한 후, 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 침윤된 세포는 4% 파라포름 알데하이드(paraformaldehyde)로 고정시키고, DAPI로 염색한 다음 형광 현미경 하에서 x100 배율로 5개의 무작위 필드를 계수하였다.
실시예 7 : 젤라틴 자이모그래피(gelatin zymography)
세포 배양 상등액의 net gelatinase(MMP-2 및 MMP-9) 활성은 아크릴아마이드와 젤라틴을 최종 농도 0.1%(w/v)로 공중합시켜 제조한 SDS 함유 겔을 사용하여 측정하였다. 시료는 실온에서 10분 동안 디티오트레이톨(dithiothreitol)이 제거된 Laemmli 가용화 용액에 분산시켰다. 전기영동은 4℃에서 10 mA로 3시간 동안 수행하였다. 전기영동 후, 겔을 2.5%(v/v) Triton X-100이 함유된 zymogram renaturing 완충액에 담가 상온에서 60분 동안 배양한 다음, 5 mM CaCl2이 함유된 50 mM Tris-HCl(pH 7.6)에 담가 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 그 다음 겔을 표준 프로토콜에 따라 0.5% Coomassie Brilliant Blue G-250로 염색하였다.
실시예 8 : 웨스턴 블랏 분석
1%(v/v) Nonidet P-40, 5 μM AEBSF, 1.5 nM 아프로티닌(aprotinin), 10 nM E-64 및 10 nM 루펩틴(leupeptin)을 함유하는 NP-40 용해 완충액(20 mM Tris, pH 7.5, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA)을 세포에 30분 동안 처리하여 세포를 용해시켰다. 그 후, 세포를 초음파 처리하고, 4℃, 12,000 x g에서 10분 동안 원심분리하여 불용성 잔해물을 제거하였다. 총 단백질(30 μg)을 10% SDS-PAGE로 분리하고, 준결정 이동장치(Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell; Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 이용하여 15 V에서 30분 동안 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이동시켰다. 단백질이 이동된 멤브레인은 5% 탈지유로 블로킹(blocking) 시킨 후, 4℃에서 1차 항체[MMP-2(1:1,000 희석물; sc-10736; Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA) 및 LC3(1:1000 희석물; AP1801a, Abgent; Inc., San Diego, CA, USA)]로 밤새 반응시키고, 0.1% Tween-20이 함유된 TBS(Tris-buffered saline)로 3회 세척하였다. 그 후, HRP가 접합된 2차 항체(1:3000 희석물; sc-2030; Santa Cruz Biotechnology, Inc.)로 상온에서 1시간 동안 반응시켰다. 단백질 밴드는 화학 발광 검출 시스템(Pierce; Thermo Fisher Scientific Inc.)을 이용하여 제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 수행하였다. β-액틴은 대조군으로 사용하였다.
실시예 9 : 반응성 산소종 측정
반응성 산소종(reactive oxygen species; ROS)의 세포 내 생성은 2',7'-디클로로디하이드로플루오레세인 디아세테이트 (DCF-DA; Molecular Probes, Thermo Fisher Scientific Inc.)를 이용하여 측정하였다. 세포에 통합된 염료는 세포 내 에스테라제(esterase)에 의해 탈아세틸화 되었다. 산화 시, DCF-DA는 고형광 2,7-디클로로플루오레세인으로 전환된다.
간략하게, 세포를 6-웰 플레이트에 접종하고 37℃에서 밤새 배양한 다음 N-아세틸 시스테인(N-acetyl cysteine; NAC)의 존재 또는 부재 하에 GSP로 4시간 동안 처리하였다. 세포는 무혈청 배지에서 5 μM의 DCF-DA을 이용하여 15분 동안 염색하고, 트립신-EDTA(Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc.)로 플레이트에서 제거하였다. 세포의 형광 강도는 여기 파장 480 nm 및 방출 파장 525 nm(BD Biosciences)를 갖는 유세포 분석 장치로 측정하고, CellQuest Pro 소프트웨어(버전 4.0, BD Biosciences)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
실시예 10 : 재조합 아데노바이러스
제조사에서 제공한 프로토콜에 따라, Virapower 아데노바이러스 발현 시스템(Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.)을 이용하여 녹색 형광 단백질(GFP)이 표지된 LC3(Ad-GFP-LC3)를 코딩하는 아데노바이러스를 제작하였다.
간략하게, LC3에 GFP를 코딩하는 DNA 구조물(constrcut)을 pENTR 벡터로 서브클로닝 하였다. LR clonase II(Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.)를 이용하여 entry 벡터(pENTR-GFP-LC3)와 adenoviral destination 벡터(pAd/CMV/V5-DEST) 사이의 부위 특이적 재조합을 수행하였다. 모든 구조물은 Sanger dideoxy sequencing analysis(Bioneer Inc., Seoul, Korea.)을 수행하여 검증하였다. 검증된 클론 (pAd-GFP-LC3)은 Pac I(New England Biolabs, Inc., Ipswich, MA, USA)를 이용하여 선형화한 다음 Lipofectamine 2000(Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.)을 이용하여 293A 세포로 형질주입(transfection) 시켰다. 증폭 후, 세포 병변 효과를 나타내는 293A 세포의 배양 상등액으로부터 Adeno-X™ 바이러스 정제 키트(BD Biosciences)를 이용하여 바이러스를 정제하였고, 바이러스 역가는 연속 희석에 의한 플라크 형성 분석을 이용하여 측정하였다.
간략하게, 세포를 1×105 세포/ml의 밀도로 6-웰 플레이트에 접종하고, 다음날 10 감염 다중도(multiplicity of infection; MOI)에서 재조합 아데노바이러스로 형질주입 시켰다.
실시예 11 : 자식작용 검출
세포를 Ad-GFP-LC3 아데노 바이러스로 감염시키고 다양한 농도의 GSP로 24시간 동안 처리하였다. 공초점 현미경(Olympus FV-1000; Olympus Corporation, Tokyo, Japan)을 이용하여 세포에서 GFP-LC3 단백질 반점(puncta) 형성을 관찰하였다.
실험예 1 : GSP에 의한 세포주기 정지 및 세포사멸 유도 효과
인간 SCC12 세포에서 GSP가 세포 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 CCK-8 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 1을 참조하여 보면, GSP는 농도 의존적으로 SCC12 세포의 생존율을 감소시켰고, 100 μg/ml의 농도에서는 세포 생존율을 약 50% 감소시키는 것을 확인하였다.
상기 GSP에 의한 세포 생존율 감소 효과가 세포사멸에 의한 것인지를 확인하기 위해 유세포 분석을 수행하였다. 세포사멸은 sub-G1 부위의 세포 수를 측정하여 분석하였다. 그 결과, 도 2A 및 도 2B를 참조하여 보면, GSP는 농도 의존적으로 sub-G1 영역에서의 세포 백분율을 증가시키는 것을 확인함으로써, SCC12 세포에서 GSP에 의한 세포 증식 억제 효과가 세포사멸 유도와 관련되어 있음을 확인하였다.
다음으로 GSP가 세포주기에 미치는 영향을 확인한 결과, 도 2C를 참조하여 보면, SCC12 세포는 GSP 처리 시, G0/G1기에서 대조군에 비하여 세포의 수가 감소하였으며, G2/M기에서는 세포의 수가 증가하는 것을 확인하였다. 이는 SCC12 세포에서 GSP의 처리가 G2/M 정지를 유도함을 의미한다.
실험예 2 : MMP-2/9 발현 억제를 통한 세포의 운동성 및 침습성 억제 효과
SCC12 세포는 높은 전이력을 가지며, GSP는 미토콘드리아 경로를 파괴하고 카스파제-3의 활성화를 증가시킴으로써 암세포의 이동을 억제하는 것으로 알려져 있다. 그러나, SCC12 세포의 운동성에서 GSP의 억제의 기전은 현재까지 밝혀진 바가 없다. 따라서 본 발명에서는 GSP가 SCC12 세포의 운동성 및 침습성에 미치는 영향을 분석하였다.
상처 치유 분석법으로 세포 운동성을 분석한 결과, 도 3A를 참조하여 보면, SCC12 세포에 GSP 처리 시, 대조군에 비하여 세포 운동성이 현저하게 감소하였으며, 도 3B를 참조하여 보면, 침윤 분석 결과에서도 SCC12 세포에 GSP 처리 시, 대조군에 비하여 세포 침윤이 감소한 것을 확인하였다.
다음으로 젤라틴 자이모그램 분석을 이용하여 GSP가 MMP-2 및 MMP-9 활성에 미치는 영향을 분석한 결과, 도 3C-a를 참조하여 보면, SCC12 세포에 GSP 처리 시, 농도 의존적으로 MMP-2 및 MMP-9의 활성을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, MMP-2 및 MMP-9의 활성 억제는 MMP-2 및 MMP-9의 발현 수준과 관련되어 있으므로 MMP-2의 발현 수준을 확인한 결과, 도 C-b를 참조하여 보면, SCC12 세포에 GSP 처리 시, MMP-2의 단백질 발현이 하향 조절되는 것을 확인하였다.
실험예 3 : GSP가 자식작용 세포죽음 및 세포사멸에 미치는 영향
자식작용 유도에 있어서 GSP의 효과를 확인하기 위해, LC3-II 생성과 GFP-LC3 반점 형성, 두 가지 독립적인 LC3 분석을 수행하였다. 자식작용의 유도에 의해 LC3는 지방질화 되고, 자식작용 공포(vacuoles) 막에 응집된다.
도 4A를 참조하여 보면, 100 μg/ml의 GSP로 처리한 후, LC3-I 및 LC3-II의 단백질 발현이 시간 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다. GSP 유도된 자식작용을 더 확인하기 위해, GFP-LC3 융합 단백질을 발현하는 재조합 아데노바이러스를 제조하였으며, GSP가 자가포식소체(autophagosome) 세대의 지표인 GFP-LC3 반점 형성을 촉진할 수 있는지에 대하여 분석하였다. Ad-GFP-LC3로 형질주입된 SCC12 세포를 GSP로 처리하고, GFP-LC3 융합 단백질을 공초점 현미경 하에서 가시화 하였다. 그 결과, 도 4 B를 참조하여 보면, GFP-LC3은 점 무늬 구조를 형성하였으며, GFP-LC3 반점의 수는 GSP 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
자식작용은 자식작용 세포죽음이라고 불리는 프로그램된 세포 죽음 유형 II와 관련되어 있다. 세포사멸 외에도 GSP가 자식작용 세포죽음을 유도할 수 있는지를 확인하기 위해, 자식작용 억제제인 3-MA의 존재 또는 부재 하에서 GSP 처리된 세포를 이용하여 세포 생존율을 분석하였다. 그 결과, 도 5A 및 도 5B를 참조하여 보면, 3-MA로 세포를 전처리 시, GSP 유도 세포 독성이 현저하게 감소한 반면, GSP 유도 세포사멸은 차단하지 못하는 것을 확인하였다. 이는 GSP의 항증식 활성이 부분적으로는 자식작용 유도 세포죽음에 의한 결과임을 의미한다.
실험예 4 : GSP가 ROS에 미치는 영향
세포 내 ROS 수준은 ROS 민감성 형광 염료인 DCF-DA를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 도 6A 및 도 6B를 참조하여 보면, SCC12 세포에 GSP 처리 시, ROS 생성이 농도 의존적으로 증가한 반면, 항산화제인 NAC로 전처리 시, GSP로 유도된 ROS 생성이 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.
증가된 ROS 수준이 GSP의 세포 독성을 효과를 중재하는지를 확인하기 위해 항산화제인 NAC를 이용하여 실험을 수행하였다. 세포를 10 mM NAC로 전처리한 다음 100 μg/ml GSP로 24시간 동안 처리하였다. 그 결과, 도 7A를 참조하여 보면, GSP 유도된 세포사멸이 NAC 전처리에 의해서 현저하게 예방되었다. 이는 GSP로 유도된 세포사멸과 자식작용이 세포 내에서 ROS의 수준을 증가시키는 활성과 관련되어 있음을 의미한다.
상기 가능성을 확인하기 위해, NAC와의 전처리가 GSP로 유도된 세포사멸을 억제할 수 있는지를 확인하였다. 그 결과, 도 7B를 참조하여 보면, SCC12 세포에서 NAC 전처리 시, GSP로 유도된 세포사멸을 유의하게 억제하는 것을 확인하였다. 자식작용에서 ROS의 연관성을 더 분석하기 위해, NAC 존재 하에 자식작용 활성에 있어서 GSP의 영향을 확인하였다. 그 결과, 도 7C를 참조하여 보면, GSP에 의한 GFP-LC3 반점 형성이 NAC의 존재 하에서 현저하게 억제되었다. 이는 GSP로 유도된 산화 스트레스가 세포사멸과 자식작용 경로를 활성화시킬 수 있음을 의미한다.
상기 결과들에 기초하여, 도 8과 같이, 본 발명에서는 ROS가 매개하는 자식작용 및 세포사멸의 활성화와 관련된 GSP 유도 세포사멸 메커니즘을 제안한다.
결론적으로, GSP는 SCC12 세포의 성장과 침윤을 억제하고, ROS 매개 세포사멸 및 자식작용 세포죽음을 유도한다. 이는 ROS 생성 및 자식작용의 조절이 편평세포암의 잠재적 치료에 활용할 수 있음을 시사한다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술한 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
본 발명의 범위는 후술하는 특허청구범위에 의하여 나타내어지며, 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (7)

  1. 프로안토시아니딘을 유효성분으로 함유하는 편평상피암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프로안토시아니딘은 포도 씨에서 추출한 것을 특징으로 하는 편평상피암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 암세포의 세포 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 편평상피암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 MMP-2 및 MMP-9 발현 억제를 통해 세포의 운동성 및 침윤성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 편평상피암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 반응성 산소종 생성을 통해 세포사멸 및 자식작용을 유도하는 것을 특징으로 하는 편평상피암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 항암제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 편평상피암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 프로안토시아니딘을 유효성분으로 함유하는 편평상피암의 예방 또는 개선용 건강식품 조성물.
PCT/KR2017/015361 2017-12-22 2017-12-22 프로안토시아니딘을 유효성분으로 함유하는 편평상피암의 예방 또는 치료용 약학 조성물 WO2019124604A1 (ko)

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