RU2808738C1 - Способ оценки процесса формирования сосудистой сети на хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона - Google Patents
Способ оценки процесса формирования сосудистой сети на хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона Download PDFInfo
- Publication number
- RU2808738C1 RU2808738C1 RU2023113694A RU2023113694A RU2808738C1 RU 2808738 C1 RU2808738 C1 RU 2808738C1 RU 2023113694 A RU2023113694 A RU 2023113694A RU 2023113694 A RU2023113694 A RU 2023113694A RU 2808738 C1 RU2808738 C1 RU 2808738C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- chorioallantoic membrane
- vascular network
- eggs
- magnetic field
- static magnetic
- Prior art date
Links
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 title claims abstract description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 230000002792 vascular Effects 0.000 title claims abstract description 51
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 title claims abstract description 25
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 title claims abstract description 21
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims abstract description 21
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 claims abstract description 57
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 38
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims abstract description 32
- 239000000835 fiber Substances 0.000 claims abstract description 32
- 230000003068 static effect Effects 0.000 claims abstract description 30
- 229940031182 nanoparticles iron oxide Drugs 0.000 claims abstract description 23
- WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N iron(2+);iron(3+);oxygen(2-) Chemical compound [O-2].[O-2].[O-2].[O-2].[Fe+2].[Fe+3].[Fe+3] WTFXARWRTYJXII-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 21
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 6
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 11
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 229910052779 Neodymium Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims description 4
- QEFYFXOXNSNQGX-UHFFFAOYSA-N neodymium atom Chemical compound [Nd] QEFYFXOXNSNQGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910001172 neodymium magnet Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 230000009471 action Effects 0.000 abstract description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 3
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 abstract description 2
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 25
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 8
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 7
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 description 5
- 210000003278 egg shell Anatomy 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 102100022987 Angiogenin Human genes 0.000 description 4
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 4
- 230000006427 angiogenic response Effects 0.000 description 4
- 108010072788 angiogenin Proteins 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 4
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 4
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 238000002166 wet spinning Methods 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 210000002969 egg yolk Anatomy 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 3
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 2
- UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N cysteamine Chemical compound NCCS UFULAYFCSOUIOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000000622 irritating effect Effects 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 2
- 229960003151 mercaptamine Drugs 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 2
- 230000003966 vascular damage Effects 0.000 description 2
- 230000004862 vasculogenesis Effects 0.000 description 2
- 229920001410 Microfiber Polymers 0.000 description 1
- 206010044541 Traumatic shock Diseases 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000003732 agents acting on the eye Substances 0.000 description 1
- 210000004712 air sac Anatomy 0.000 description 1
- 210000003484 anatomy Anatomy 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 239000000850 decongestant Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 230000005426 magnetic field effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000004089 microcirculation Effects 0.000 description 1
- 239000003658 microfiber Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 230000004766 neurogenesis Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 229940023490 ophthalmic product Drugs 0.000 description 1
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000002304 perfume Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000006439 vascular pathology Effects 0.000 description 1
- 229940099259 vaseline Drugs 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу оценки процесса формирования сосудистой сети на хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона, для исследования возможности использования биополимерных материалов в области тканевой инженерии и регенеративной медицине, при этом способ включает отбор оплодотворенных куриных яиц, инкубирование с вращением в течение 72 часов при температуре 37,5°C, удалением участка скорлупы и размещении на освобожденной хориоаллантоисной мембране стерильного скаффолда из волокон хитозана, содержащих суперпарамагнитные наночастицы оксида железа, после чего повторно инкубируют яйца без вращения в условиях действия статического магнитного поля, после чего фотографируют поверхность хориоаллантоисной мембраны в области контакта с испытуемой пробой и выполняют анализ плотности сосудистой сети с использованием ПО ImageJ. Изобретение эффективно для сокращения времени изучения процесса васкуляризации, происходящего в присутствии исследуемых матриксов, благодаря сочетанию действия статического магнитного поля умеренной интенсивности с введенным в состав скаффолда суперпарамагнитных наночастиц оксида железа. 1 пр., 4 ил.
Description
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу оценки процесса формирования сосудистой сети на хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона, который может быть использован для исследования возможности применения биополимерного материала в области тканевой инженерии и регенеративной медицины.
Под термином скаффолд в рамках данного изобретения понимаются трехмерные пористые или волокнистые матрицы, выполняющие функцию механического каркаса для клеток [Митрошин А.Н., Федорова М.Г., Латынова И.В., Нефедов А.А. Современные представления о применении скаффолдов в регенеративной медицине (обзор литературы) // Медицинские науки. Патологическая анатомия. - 2019. - №2 (50). - С. 133-143. DOI 10.21685/2072-3032-219-2-12].
Известен метод, в ходе которого хориоаллантоисная мембрана куриного эмбриона используется для идентификации веществ, обладающих биологическим действием.
Метод исследования, или анализ, хориоаллантоисной мембраны (далее ХАМ) содержит сведения об идентификации и/или оценке веществ с биологическими эффектами (например, средств, которые влияют на ангиогенез или стимулируют нейрогенез, или которые способны подавлять определенный ген(ы)), и для оценки токсичности различных агентов (например, для тестирования токсичности агентов-кандидатов с желаемыми биологическими эффектами).
Известный метод исследования ХАМ включает этапы: (i) размещение 2-4-дневных эмбрионов цыплят, которые были извлечены из скорлупы, в отдельные чашки для поддержания указанных эмбрионов на этапах (ii)-(vii), где каждая чашка также содержит подходящее количество питательной среды, (ii) инкубация указанных эмбрионов в течение примерно 24 часов, (iii) измерение размера хориоаллантоисной мембраны (ХАМ), развившейся у каждого эмбриона, и группирование указанных эмбрионов, имеющих ХАМ по существу одинакового размера, (iv) нанесение на один или несколько эмбрионов в выбранной группе агента-кандидата, где указанный агент-кандидат наносят на каждый эмбрион путем абсорбции агента-кандидата на пористую или иным образом сорбирующую подложку и размещение указанной подложки в контакте с ХАМ таким образом, чтобы по меньшей мере часть агента-кандидата после этого диффундировала с указанной подложки на ХАМ, (v) инкубация эмбриона(ов), полученных на этапе (iv), и контрольного(ых) эмбриона(ов) из одной и той же выбранной группы в течение примерно от 18 до 24 часов, (vi) введение в ХАМ каждого эмбриона на этапе (v) контрастного вещества - композиции, содержащей латекс или подобное вещество и красящее вещество подходящего цвета, и (vii) определение того, влияет ли указанный агент-кандидат на ХАМ и/или эмбрион, путем наблюдения различий между ХАМ(и) и/или эмбрионом(ами), к которым применяли агент-кандидат, и ХАМ и/или эмбрионом(ами) контрольной группы. [Международный номер публикации WO 03/055530 A1, международная дата публикации 10.07.2003. Название: Chorioallantoic membrane (cam) assay for identifying agents with biological effects (Анализ хориоаллантоисной мембраны (CАМ) для идентификации агентов с биологическим действием)]
Недостатками аналога являются:
а) требуется извлечение 2-4-дневных эмбрионов цыплят из скорлупы и перемещение в отдельные чашки, что может повысить риск контаминации и требует наличия определенных навыков у оператора, выполняющего процедуру;
б) требуется проведение дополнительной процедуры - введение контрастного вещества - композиции, содержащей латекс или подобное вещество и красящее вещество подходящего цвета для визуализации изменений сосудистой сети;
в) непродолжительное влияние исследуемого вещества на поверхность хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона (от 18 до 24 часов).
Известен метод использования тест-системы на основе хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона для прогнозирования офтальмораздражающего потенциала геля, содержащего цистеамин.
Раздражающий потенциал офтальмологического препарата может быть определен количественно при использовании данного метода, путем контроля повреждения кровеносных сосудов.
Оплодотворенные куриные яйца были получены в нулевой день (кроссы Доркинг-Виандотт или Доркинг-Род-Айленд Ред). Поскольку яйца не были инкубированы, они были неразвиты на этом этапе. Яйца инкубировали при 37±0,5°С и влажности 40±5% в течение 9 дней. Яйца инкубировали в горизонтальном положении, чтобы обеспечить правильное расположение эмбриона (вдали от ХAM). Переворачивали вручную на 180 градусов не менее трех раз в день в течение теста, чтобы обеспечить правильное развитие и жизнеспособность эмбриона. Точное время помещения в инкубатор было отмечено как Т0. На 9-й день яйца просвечивали для проверки оплодотворенности. После 10 полных дней инкубирования, начинали эксперимент.
Каждое яйцо вынимали из инкубатора по отдельности и помещали яйцо в держатель тупым концом вверх. Скорлупу срезали чуть выше линии хориоаллантоисной мембраны с помощью Dremell Multitool (Иллинойс, США) с вращающейся режущей насадкой. Как только участок скорлупы удаляли, внутреннюю оболочку, локализованную в непосредственном контакте с ХАМ увлажняли 2 мл 0,9% физиологического раствора, добавляемого пипеткой. Внутреннюю оболочку затем аккуратно удаляли щипцами, не травмируя кровеносные сосуды, чтобы открыть доступ к хориоаллантоисной мембране, локализованной ниже. Затем тот же объем тестового раствора добавляли непосредственно на поверхность ХАМ, используя пипетку, и запускали таймер. Любой лизис, кровотечение и/или коагуляцию в разные периоды времени в течение 5 минут после нанесения исследуемого раствора регистрировали и сравнивали с контролями: физиологический раствор (отрицательный), раствор гидроксида натрия (положительный). Делали фотографии для регистрации количественных данных. Каждый тест выполняли 5 раз.
Полуколичественный анализ был выполнен с использованием фотографий, где тяжесть любого кровотечения оценивали по шкале от 0 (нет реакции) до 3 (сильная реакция) с использованием метода, разработанного Gupta и соавт. Фотографии анализировали впоследствии с использованием ПО Adobe Photoshop и ImageJ для оценки повреждения сосудов. [McKenzie, B., Kay, G., Matthews, K. H., Knott, R. M., & Cairns, D. (2015). The hen’s egg chorioallantoic membrane (HET-CAM) test to predict the ophthalmic irritation potential of a cysteamine-containing gel: Quantification using Photoshop® and ImageJ. International Journal of Pharmaceutics, 490(1-2), 1-8. doi:10.1016/j.ijpharm.2015.05.023]
Недостатками аналога являются:
а) исследуемый образец помещают на поверхность хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона на 10 эмбриональный день, т.е. инкубирование яиц предварительно осуществляют в течение 10 дней, известно, что к 10 дню пролиферация клеток капилляров значительно снижается, после чего сосудистая сеть подвергается созреванию, что исключает возможность оценки влияния исследуемого образца на формирующуюся сосудистую сеть;
б) исследуемый образец находится на поверхности хориоаллантоисной мембраны в течение непродолжительного периода времени - 5 минут, что является недостаточным для оценки особенностей формирования сосудистого русла в области контакта с материалом.
Известно изобретение, которое относится к биотехнологии и медицине. На поверхность хориоаллантоисной мембраны (ХАМ) 6-7-дневных куриных эмбрионов чистых генетических линий апплицируют диски из лигнина, импрегнированные контрольными растворами и растворами исследуемого препарата, содержащими ангиогенин. После 96 ч инкубации эмбрионов ХАМ в зоне диска извлекают, фиксируют в формалине и помещают на строго ограниченную площадь, представляющую собой круг с диаметром 10 мм, разделенный на четыре сектора. Под лупой проводят прямой подсчет сосудов в каждом секторе. Сумма числа сосудов в четырех секторах представляет собой плотность сосудов на ограниченном участке ХАМ и является показателем активности ангиогенина. Способ обеспечивает количественную оценку ангиогенной активности в стандартных условиях, что делает возможным стандартизацию различных серий препарата и сопоставимости результатов экспериментальных и клинических исследований его действия [Способ тестирования активности ангиогенина; Номер патента: RU 2166511 C1, дата публикации: 2001.05.10. Заявка: 99121596/13, 1999.10.13. Авторы: Галахарь Н.Л., Уфимцева Е.Г. https://yandex.ru/patents/doc/RU2166511C1_20010510].
Недостатками аналога являются:
а) узкая направленность, только для стандартизации различных серий препарата, содержащих ангиогенин;
б) помещение исследуемого вещества на хориоаллантоисную мембрану на 6-7 эмбриональный день, что не предоставляет возможности оценить особенности влияния исследуемого образца на процесс формирования сосудистой сети на 3-5 сутки эмбрионального развития, когда хориоаллантоисная мембрана активно формируется;
в) использованный в ходе выполнения метода прямой подсчет сосудов под лупой позволяет учесть преимущественно крупные сосуды,
г) извлечение ХАМ и последующая ее фиксация в формалине могут повлиять на морфологию сформировавшейся в области контакта с исследуемым биоматериалом сосудистой сети.
Описан способ проведения анализа ex ovo ХАМ для оценки биосовместимости и ангиогенного ответа на биоматериалы. В эксперименте использовали оплодотворенные куриные яйца. Очищали яйца от грязи, перьев, экскрементов. Помещали яйца в горизонтальном положении в инкубатор с вращением, инкубировали в течение 3 дней при температуре 37-38°С, влажности 40-60%, вращении 12 раз в день. По окончании времени инкубации яйца перемещали в условия ламинарного бокса, аккуратно разбивали их, переносили содержимое в отдельные стерильные емкости, обеспечивая доступ к хориоаллантоисной мембране, емкости накрывали крышками. Помещали ex ovo культуры в инкубатор без вращения при температуре 37-38°С, влажности 60% до конца эксперимента - до 14 дня. На 7-8 эмбриональный день ex ovo культуры переносили в условия ламинарного шкафа. Стерильным пинцетом помещали исследуемый образец между эмбрионом и наружной границей хориоаллантоисной мембраны. На 11-14 день оценивали ангиогенный ответ на биоматериал, путем анализа фотографий высокого качества с помощью ПО ImageJ [Mangir N., Dikici S., Claeyssens F., MacNeil S. Using ex Ovo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) Assay To Evaluate the Biocompatibility and Angiogenic Response to Biomaterials // ACS Biomater. Sci. Eng. 2019, 5, 3190-3200. DOI: 10.1021/acsbiomaterials.9b00172].
Одним из недостатков аналога является использование подхода ex ovo, в связи с тем, что при выборе данной модификации повышается вероятность снижения показателей выживаемости эмбрионов. А также извлечение развивающегося куриного эмбриона из скорлупы яйца предполагает наличие определенных навыков у оператора, выполняющего процедуру. Согласно способу, исследуемый образец помещают на поверхность хориоаллантоисной мембраны на 7-8 день инкубирования, однако известно, что ХАМ активно развивается в период уже с 4 эмбрионального дня, в связи с чем данный способ не позволит оценить особенности влияния биоматериала на процессы формирования сосудистой сети.
Наиболее близким по своим признакам, принятым за прототип, является метод определения и оценки токсикологических показателей безопасности продукции, заключающийся в определении возникновения сосудистого повреждения хориоаллантоисной мембраны в ответ на воздействие испытуемой пробы. По изменению, которое может возникнуть в хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона (увеличение сети капилляров, точечные и крупные кровоизлияния) при нанесении на нее испытуемой пробы, судят о ее потенциальной способности вызывать раздражение.
Испытания проводят на свежих фертильных куриных яйцах (не менее трех) массой от 50 до 60 г. В качестве контроля используют куриные яйца (не менее трех) с такими же характеристиками.
Куриные яйца ровно размещают на лотках инкубатора с автоматическим вращающимся элементом при (38,5 ± 0,5) °С и относительной влажности (62,2 ± 7,5) %. Вращение необходимо для предотвращения прилипания эмбриона к одной стороне яйца.
Необходимо проверять температуру и влажность в одно и то же время каждый день.
Через 6-7 дней после закладки просвечивают куриные яйца при помощи люминесцентной лампы для обеспечения оптимального освещения и отбраковывают «нежизнеспособные» (неоплодотворенные, тухлые или яйца с замершим зародышем).
Если яйцо пустое, тогда это означает, что эмбрион не развился или яйцо не было оплодотворено.
Если в яйце имеется развивающийся эмбрион, то хорошо видна темная масса.
При нормальном развитии зародыша на желтке видна хорошо развитая кровеносная система, а зародыш едва различим, так как он глубоко погружен в желток. При отсталом развитии зародыш лежит под скорлупой, кровеносная система на желтке развита слабо.
Удаляют неоплодотворенные яйца и яйца с зародышами, погибшими в первые дни инкубации, а также с зародышами, погибшими уже после развития кровеносной системы (кровяные кольца).
На девятый день повторно просвечивают яйца, отбраковывают все нежизнеспособные и опять помещают яйца тупыми концами вверх в инкубатор без вращения, тем самым обеспечивая доступность хориоаллантоисной мембраны.
Не допускается взбалтывание, излишний наклон и любые другие механические раздражения куриных яиц при их подготовке для проведения испытаний.
На десятый день куриное яйцо помещают на подставку для яиц тупым концом вверх. Маркером отмечают воздушную полость, медицинским пинцетом удаляют отмеченный участок скорлупы, освобождая от нее воздушную камеру. На поверхность подскорлуповой оболочки наслаивают 400 мм3 физиологического раствора для предотвращения высыхания. Куриное яйцо помещают обратно в инкубатор с температурой 38,5 ± 0,5 °С и относительной влажностью 62,2 ± 7,5 % на 20 мин для снятия травматического шока.
Последовательно, с интервалом в 3-5 мин. готовят 6 куриных яиц.
Через 20 мин последовательно, соблюдая интервал в 3-5 мин., извлекают вскрытые куриные яйца из инкубатора. Удаляют пинцетом подскорлуповую оболочку так, чтобы не повредить хориоаллантоисную мембрану. Если происходит повреждение хориоаллантоисной мембраны или возникают кровотечения, то эмбрион отбраковывают.
На освобожденную хориоаллантоисную мембрану трех из подготовленных куриных эмбрионов добавляют испытуемую пробу в дозе 0,05 г (см3), на оставшиеся три добавляют раствор NaCl с массовой долей 0,9 % или медицинское вазелиновое масло в том же объеме.
Через 5 мин аккуратно смывают физиологическим раствором испытуемый материал и регистрируют реакцию хориоаллантоисной мембраны [Межгосударственный стандарт ГОСТ 33506-2015 «Продукция парфюмерно-косметическая. Методы определения и оценки токсикологических показателей безопасности» (введен в действие приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 июля 2016 г. № 879-ст.].
Применение известного прототипа ограничивает наличие следующих недостатков:
а) исследуемый образец помещают на поверхность хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона на 10 эмбриональный день, известно, что к 10 дню пролиферация клеток капилляров значительно снижается, после чего сосудистая сеть подвергается созреванию, что исключает возможность оценки влияния исследуемого образца на формирующуюся сосудистую сеть;
б) исследуемый материал находится на поверхности хориоаллантоисной мембраны в течение непродолжительного периода времени - 5 минут, что не дает возможности оценить процесс формирования сосудистого русла в области контакта с материалом;
в) результатом выполнения метода является регистрация раздражающего действия материала на хориоаллантоисную мембрану куриного эмбриона, но не оценка влияния исследуемого материала на формирование сосудистой сети.
Из уровня техники не известен способ оценки формирования сосудистой сети на модели хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона
Задачей предлагаемого изобретения является создание способа оценки процесса формирования сосудистой сети на модели хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона.
Технический результат - сокращение до 9 дней времени, требующегося для изучения процесса формирования сосудистой сети, за счет помещения скаффолда на поверхность хориоаллантоисной мембраны куриного яйца после 72 часов инкубации, что позволит оценить особенности влияния исследуемого образца на процесс формирования сосудистой сети в период активного развития хориоаллантоисной мембраны, а также благодаря интенсификации процесса формирования сосудистой сети под воздействием статического магнитного поля умеренной интенсивности при использовании скаффолда, содержащего в своем составе суперпарамагнитные наночастицы оксида железа.
Способ оценки процесса формирования сосудистой сети на хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона, включающий отбор оплодотворенных куриных яиц, инкубирование с вращением при постоянной температуре и влажности, удаление участка скорлупы на тупом конце яйца и размещение на освобожденной хориоаллантоисной мембране испытуемой пробы, содержит следующие новые неизвестные из уровня техники признаки:
- в качестве испытуемой пробы используют стерильный скаффолд из волокон хитозана массой 1,5 х 10-3 ± 0,6 х 10-3 г, содержащих в своем составе суперпарамагнитные наночастицы оксида железа,
- указанный скаффолд размещают на хориоаллантоисной мембране через 72 часа инкубирования при температуре 37,5°C; влажности 70-80%; с поворотом на 180° каждый час,
- после размещения скаффолда смотровое окно в скорлупе яйца закрывают пленкой,
- подготовленные яйца размещают на подставке, расположенной на расстоянии 8 см от неодимового магнита NdFeB в виде прутка размером 25х30 мм с никелевым покрытием, силой сцепления - 25 кг и остаточной магнитной индукцией - 1,22-1,25 Тесла, что обеспечивает воздействие на исследуемый материал статическим магнитным полем интенсивностью 50 - 80 мТл;
- повторно инкубируют яйцо со скаффолдом без вращения при температуре 37,5°С, влажности 70-80%, содержании СО2 3%, в течение 144 часов в условиях действия статического магнитного поля,
- затем на 9 эмбриональный день фотографируют поверхность хориоаллантоисной мембраны в области контакта с испытуемой пробой и выполняют анализ плотности сосудистой сети с использованием ПО ImageJ.
Предлагаемый способ оценки изменения процесса формирования сосудистой сети в присутствии скаффолдов различной природы основан на подходе in ovo, в связи с тем, что высоко васкуляризованная внеэмбриональная хориоаллантоисная мембрана (ХАМ) оплодотворенных куриных яиц представляет простой, легкодоступный и дешевый метод ангиогенного скрининга, в сравнении с другими животными моделями [Merckx et al, 2020. интернет-ссылка https://biblio.ugent.be/publication/8661644].
Известно, что действие магнитного поля способствует улучшению микроциркуляции, оказывает противовоспалительный, противоотечный эффекты (Паршиков и др, 2017; Zhao et al, 2017; Морозов и др., 2020), но неизвестно влияние его на формирование сосудистой сети.
В отличие от прототипа исследуемый материал, содержащий в своем составе суперпарамагнитные наночастицы оксида железа, помещают на поверхность хориоаллантоисной мембраны куриного яйца после 72 часов инкубации, что позволит оценить особенности влияния исследуемого образца на процесс формирования сосудистой сети в период активного развития хориоаллантоисной мембраны.
На 9 эмбриональный день фотографируют поверхность хориоаллантоисной мембраны в области контакта с исследуемым образцом и выполняют анализ плотности сосудистой сети с использованием ПО ImageJ.
Таким образом, разработанный способ оценки формирования сосудистой сети на модели хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона позволит изучать процессы васкулогенеза и ангиогенеза в присутствии скаффолда, содержащего в своем составе суперпарамагнитные наночастицы оксида железа, в условиях действия статического магнитного поля умеренной интенсивности за более короткие сроки, что приведет к снижению затрат на проведение исследования.
Для изготовления хитозановых волокон с суперпарамагнитными наночастицами оксида железа размером 50-100 нм Sigma-Aldrich (США) использован способ, описанный в источнике [Brüggemann D., Michel J., Suter N. et al. Wet-spinning of magneto-responsive helical chitosan microfibers // Nanotechnol. 2020. №11. P. 991-999]. Сначала готовят 0,5-1,0 % раствор уксусной кислоты, pH 2,8-3,0, путем разбавления ледяной уксусной кислоты (Диаэм, Россия) ультрачистой водой. К полученному раствору уксусной кислоты добавляют наночастицы оксида железа в концентрации 10 мг/мл. Далее раствор помещают в ультразвуковую ванну (ТЭКМАНН, Россия) и обрабатывают ультразвуком в течение 10 мин. В дальнейшем к смеси добавляют порошок хитозана низкой молекулярной массы Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Германия) в концентрации 30 мг/мл и перемешивают полученную смесь на магнитной мешалке Biosan (Латвия) в течение 1 часа. Затем 1 мл полученного раствора хитозана с наночастицами оксида железа помещают в шприц объемом 5 мл с иглой 24G и выдавливают в одноразовую чашку Петри с коагулирующим раствором 95% этанола, покачивая чашку с коагулирующим раствором из стороны в сторону для создания потока воды. После коагуляции волокна сразу переносят в новые чашки Петри и оставляют до полного высыхания
Выполняют подготовку образцов хитозановых волокон с суперпарамагнитными наночастицами оксида железа для дальнейшего культивирования массой каждого образца 1,5 х 10-3 ± 0,6 х 10-3 г, и стерилизуют отвешенные образцы путем помещения их в 70% раствор этанола на 30 минут. Затем образцы подвергают облучению ультрафиолетом в течение 30 минут в ламинарном шкафу HFsafe900LC, Heal Force (Китай).
Для воздействия на исследуемый материал статическим магнитным полем умеренной интенсивности 50 - 80 мТл используют неодимовый магнит NdFeB в виде прутка размером 25х30 мм с никелевым покрытием; сила сцепления - 25 кг, остаточная магнитная индукция - 1,22-1,25 Тесла, расположенный на расстоянии 8 см от основания подставки для яиц.
Описание способа.
1 этап. Подготовка волокон.
Подготовку стерильных волокон из хитозана с наночастицами осуществляют методом мокрого прядения, для чего смешивают хитозан низкой молекулярной массы Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Германия) из расчета 30 мг/мл раствора уксусной кислоты с рН 2,8-3,0 и суперпарамагнитные наночастицы оксида железа Sigma-Aldrich (США) из расчета 10 мг/мл раствора уксусной кислоты с рН 2,8-3,0, осуществляют коагуляцию посредством 95% этанола, высушивают и стерилизуют [Brüggemann D. et al. // Beilstein J. Nanotechnol. 2020. V. 11. P. 991-999].
Подготовку стерильных волокон из хитозана без наночастиц осуществляют методом мокрого прядения, для чего смешивают хитозан низкой молекулярной массы Sigma-Aldrich Chemie GmbH (Германия) из расчета 30 мг/мл раствора уксусной кислоты с pH 2,8-3,0, осуществляют коагуляцию посредством 95% этанола, высушивают и стерилизуют [Brüggemann D. et al. // Beilstein J. Nanotechnol. 2020. V. 11. P. 991-999 с модификацией].
2 этап. Подготовка яиц.
В ходе выполнения эксперимента используют подход in ovo. Оплодотворенные яйца массой 55 - 75 г курицы домашней (Gallus gallus) очищают от механических загрязнений салфеткой, слегка смоченной водопроводной водой, помещают в условия инкубатора с вращением на 72 часа при температуре 37,5°C; влажности 70-80%; с поворотом на 180° каждый час.
По окончании времени инкубации яйца извлекают из инкубатора, протирают 3% раствором перекиси водорода или кислородсодержащим дезинфицирующим средством БебиДез Ультра (Lysoform, Россия) в рабочей концентрации 3%, вносят в ламинарный бокс.
Создают смотровое окно в яйце с тупого конца, диаметром примерно 1-2 см.
Удаляют 3-7 мл белка, удаляют подскорлуповые оболочки, образующие воздушный мешок.
3 этап. Формирование экспериментальных и контрольной групп.
В первой экспериментальной группе через смотровое окно помещают стерильные волокна из хитозана с суперпарамагнитными наночастицами оксида железа массой 1,5 х 10-3 ± 0,6 х 10-3 г на поверхность хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона для последующей инкубации в условиях действия статического магнитного поля умеренной интенсивности. Смотровое окно в скорлупе яйца закрывают пленкой Parafilm M (Pechiney Plastic Packaging Company, США).
Во второй экспериментальной группе через смотровое окно помещают стерильные волокна из хитозана массой 1,5 х 10-3 ± 0,6 х 10-3 г без суперпарамагнитых наночастиц оксида железа на поверхность хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона для последующей инкубации без воздействия статического магнитного поля умеренной интенсивности. Смотровое окно в скорлупе закрывают пленкой Parafilm M (Pechiney Plastic Packaging Company, США).
В третьей экспериментальной группе через смотровое окно помещают стерильные волокна из хитозана без суперпарамагнитых наночастиц оксида железа массой 1,5 х 10-3 ± 0,6 ч 10-3 г на поверхность хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона для последующей инкубации в условиях действия статического магнитного поля умеренной интенсивности. Смотровое окно в скорлупе яйца закрывают пленкой Parafilm M (Pechiney Plastic Packaging Company, США).
В контрольной группе смотровое окно в скорлупе яйца сразу закрывают пленкой Parafilm M (Pechiney Plastic Packaging Company, США) и не подвергают воздействию статического магнитного поля .
4 этап. Инкубация.
Яйца первой экспериментальной группы весом первое -75 г, второе - 65г, третье - 55г с волокнами из хитозана с наночастицами, а также третьей экспериментальной группы весом первое -75 г, второе - 63г, третье - 57г с волокнами из хитозана без наночастиц помещают на подставке в статические условия инкубатора без вращения при температуре 37,5°С, влажности 70-80%, содержании СО2 3%, инкубируют в течение 144 часов в условиях действия статического магнитного поля, для чего подставку с установленными в ней яйцами размещают на расстоянии 8 см от основания подставки до магнита, что обеспечивает воздействие статическим магнитным полем на яйца весом 75 г - 80 мТл, на яйца весом 65-63 г - 65 мТл, на яйца 55-57 г. - 50 мТл. В эксперименте используют неодимовый магнит NdFeB в виде прутка размером 25х30 мм с никелевым покрытием; сила сцепления - 25 кг; остаточная магнитная индукция - 1,22-1,25 Тесла.
Яйца второй экспериментальной группы с волокнами из хитозана без наночастиц помещают на подставке в статические условия инкубатора без вращения при температуре 37,5°С, влажности 70-80%, содержании СО2 3%, инкубируют в течение 144 часов без воздействия статического магнитного поля.
Яйца контрольной группы без волокон помещают в статические условия инкубатора без вращения без воздействия статического магнитного поля, инкубируют в течение 144 часов при температуре 37,5°С, влажности 70-80%, содержании СО2 3%.
5. Оценка процесса формирования сосудистой сети.
По окончании времени инкубации через 144 часа увеличивают размер смотрового окна в скорлупе каждого яйца, открывая доступ к хориоаллантоисной мембране.
С помощью камеры, установленной в канал визуализации тринокулярной насадки стереомикроскопа Микромед MC-2-ZOOM вар. 2CR (Китай), при увеличении х30 (ПО ToupView 3.7) получают фотографии хориоаллантоисной мембраны яиц контрольной и трех экспериментальных групп на 6 день инкубирования материала на поверхности ХАМ, т.е. на 9 эмбриональный день.
Оценку ангиогенного ответа выполняют путем анализа цифровых изображений хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона, предварительно обработанных с помощью программы ImageJ с использованием плагина Vessel Analysis, Vascular Density, по плотности сформировавшихся сосудов. При этом, в 1, 2 и 3 экспериментальных группах оценивают участок, локализованный на расстоянии 0-3000 мкм от внесенного волокна из хитозана без суперпарамагнитных наночастиц оксида железа или из хитозана с суперпарамагнитными наночастицами оксида железа, анализируя не менее 6 фрагментов изображения 1000х1000 мкм на каждой фотографии.
В контрольной группе 4 оценивают случайно выбранный участок, локализованный на периферии хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона, анализируя не менее 6 фрагментов изображения 1000х1000 мкм на каждой фотографии.
Результаты полученных изображений представлены на следующих фигурах.
Фигура 1. Сосудистая сеть хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона. Контрольная группа 4. Увеличение 30х. Изображение получено с использованием стереомикроскопа Микромед MC-2-ZOOM вар. 2CR (Китай), видеоокуляра ToupCam 10.0 MP (Touptek, Россия) и программного обеспечения ToupView. Размер выделенной области 1000 х 1000 мкм. VD (Vascular Density, плотность сосудов) составляет 16,519 % от общей площади.VLD (Vascular Length Density, плотность длины сосудов) составляет 1,644 % от общей площади.
Фигура 2. Сосудистая сеть хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона. Яйцо весом 75 г из первой группы с волокнами из хитозана с наночастицами, изготовленными методом мокрого прядения, инкубация в течение 144 часов в условиях действия статического магнитного поля умеренной интенсивности 80 мТл. Увеличение 30х. Изображение получено с использованием стереомикроскопа Микромед MC-2-ZOOM вар. 2CR (Китай), видеоокуляра ToupCam 10.0 MP (Touptek, Россия) и программного обеспечения ToupView. Размер выделенной области 1000 х 1000 мкм. Стрелка на фигуре указывает на волокно из хитозана с наночастицами. VD (Vascular Density, плотность сосудов) = 33,680 % от общей площади. VLD (Vascular Length Density, плотность длины сосудов) = 3,078 % от общей площади.
Фигура 3. Сосудистая сеть хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона. Яйцо из группы 2 с волокнами из хитозана, изготовленными методом мокрого прядения, инкубация в течение 144 часов без воздействия статического магнитного поля умеренной интенсивности. Увеличение 30х Изображение получено с использованием стереомикроскопа Микромед MC-2-ZOOM вар. 2CR (Китай), видеоокуляра ToupCam 10.0 MP (Touptek, Россия) и программного обеспечения ToupView. Размер выделенной области 1000 х 1000 мкм. Стрелка на фигуре указывает на волокно из хитозана. VD (Vascular Density, плотность сосудов) = 18,009 % от общей площади. VLD (Vascular Length Density, плотность длины сосудов) = 1,820 % от общей площади.
Фигура 4. Сосудистая сеть хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона. Яйцо весом 75г из группы 3 с волокнами из хитозана, изготовленными методом мокрого прядения, инкубация в течение 144 часов в условиях действия статического магнитного поля умеренной интенсивности 80 мТл. Увеличение 30х. Изображение получено с использованием стереомикроскопа Микромед MC-2-ZOOM вар. 2CR (Китай), видеоокуляра ToupCam 10.0 MP (Touptek, Россия) и программного обеспечения ToupView. Размер выделенной области 1000 х 1000 мкм. Стрелка на фигуре указывает на волокно из хитозана. VD (Vascular Density, плотность сосудов) = 19,371 % от общей площади. VLD (Vascular Length Density, плотность длины сосудов) = 1,971 % от общей площади.
При анализе данных были использованы медианные значения, полученные после обработки не менее 6 фрагментов ХАМ размером 1000х1000 мкм на каждом изображении в соответствующей группе. Общее количество изображений составляло не менее 3 для каждой группы.
Выявлено, что вблизи контакта хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона с хитозановым волокном, содержащим в своем составе суперпарамагнитные наночастицы оксида железа, в условиях действия статического магнитного поля умеренной интенсивности на 9 эмбриональный день на расстоянии 0 - 3000 мкм от внесенного волокна происходило увеличение плотности сосудов (VD), а также плотности длины сосудов (VLD) в сравнении с контрольной группой 4. Так, плотность сосудов в экспериментальной группе 1 была выше на 9,5%, а плотность длины сосудов в экспериментальной группе была выше на 35,7%. (p<0,05).
Установлено, что вблизи контакта хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона с волокнами из хитозана, не имеющими в своем составе суперпарамагнитных наночастиц оксида железа, без воздействия статического магнитного поля, на 9 эмбриональный день на расстоянии 0 - 3000 мкм от волокна (фигура 3) происходило увеличение плотности длины сосудов (VLD) в сравнении с контрольной группой на 5,1%, однако отмечалось снижение плотности сосудов (VD) на 21% (p<0,05). В сравнении с группой с волокнами из хитозана, имеющими в своем составе суперпарамагнитные наночастицы оксида железа, инкубированные на поверхности хориоаллантоисной мембраны в условиях воздействия статического магнитного поля умеренной интенсивности, показатели, характеризующие плотность длины сосудов (VLD) и плотность сосудов (VD), имели меньшее значение, на 22,5% (p<0,05) и 27,9% (p<0,05) соответственно.
В группе с волокнами из хитозана, не имеющими в своем составе суперпарамагнитных наночастиц, инкубированными на поверхности хориоаллантоисной мембраны в условиях воздействия статического магнитного поля умеренной интенсивности, на 9 эмбриональный день на расстоянии 0 - 3000 мкм от волокна наблюдалось увеличение плотности длины сосудов (VLD) в сравнении с контрольной группой на 12,7% (p<0,05), однако отмечалось снижение плотности сосудов (VD) на 12,8%. В сравнении с группой с волокнами из хитозана, имеющими в своем составе суперпарамагнитные наночастицы оксида железа, инкубированные на поверхности хориоаллантоисной мембраны в условиях воздействия статического магнитного поля, показатели, характеризующие плотность длины сосудов (VLD) и плотность сосудов (VD), имели меньшее значение - на 17% и 20,3% (p<0,05) соответственно (фигура 4).
Полученные данные свидетельствуют об эффекте стимуляции процессов формирования сосудистой сети совокупным воздействием волокон из хитозана, содержащих суперпарамагнитные наночастицы оксида железа, и статического магнитного поля умеренной интенсивности 50 - 80 мТл.
Таким образом, разработанный способ оценки формирования сосудистой сети позволит изучать процессы васкуляризации за более короткие сроки за счет внесения в состав скаффолда суперпарамагнитных наночастиц оксида железа и действия статического магнитного поля умеренной интенсивности, что приведет к снижению затрат на проведение исследования.
А также предлагаемый способ может быть применен для количественной оценки ангиогенного действия веществ, в том числе, для тестирования средств для лечения ран, ожогов, язв, сердечно-сосудистой и сосудистой патологии, других патологий, при которых необходимо поддержание и оценка процессов васкулогенеза и ангиогенеза, а также для тестирования ангиогенного эффекта биоматериалов, применение которых планируется для замещения дефектов тканей, в связи с тем, что различные физико-химические характеристики имплантируемых образцов, такие как форма, плотность, твердость, свойства поверхности, способны влиять на характер тканевого ответа, в том числе на процессы формирования сосудистой сети.
Claims (1)
- Способ оценки процесса формирования сосудистой сети на хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона, включающий отбор оплодотворенных куриных яиц, инкубирование с вращением при постоянной температуре и влажности, удаление участка скорлупы на тупом конце яйца и размещение на освобожденной хориоаллантоисной мембране испытуемой пробы, отличающийся тем, что в качестве испытуемой пробы используют стерильный скаффолд из волокон хитозана массой 1,5×10-3±0,6×10-3 г, содержащих в своем составе суперпарамагнитные наночастицы оксида железа, который размещают на хориоаллантоисной мембране через 72 часа инкубирования при температуре 37,5°C, влажности 70-80% с поворотом на 180° каждый час, затем смотровое окно в скорлупе яйца закрывают пленкой и повторно инкубируют без вращения при температуре 37,5°С, влажности 70-80%, содержании СО2 3%, в течение 144 часов в условиях действия статического магнитного поля, для чего яйца размещают на подставке, расположенной на расстоянии 8 см от неодимового магнита NdFeB в виде прутка размером 25×30 мм с никелевым покрытием, силой сцепления – 25 кг и остаточной магнитной индукцией – 1,22-1,25 Тл, что обеспечивает воздействие на исследуемый материал статическим магнитным полем интенсивностью 50-80 мТл, затем на 9 эмбриональный день фотографируют поверхность хориоаллантоисной мембраны в области контакта с испытуемой пробой и выполняют анализ плотности сосудистой сети с использованием ПО ImageJ.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2808738C1 true RU2808738C1 (ru) | 2023-12-04 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2166511C1 (ru) * | 1999-10-13 | 2001-05-10 | Институт цитологии и генетики СО РАН | Способ тестирования активности ангиогенина |
| WO2003055530A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-10 | Medvet Science Pty Ltd | Chorioallantoic membrane (cam) assay for identifying agents with biological effects |
| WO2010054022A1 (en) * | 2008-11-05 | 2010-05-14 | Institute Of Multiple Myeloma & Bone Cancer Research | An improved chorioallantoic membrane assay |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2166511C1 (ru) * | 1999-10-13 | 2001-05-10 | Институт цитологии и генетики СО РАН | Способ тестирования активности ангиогенина |
| WO2003055530A1 (en) * | 2001-12-21 | 2003-07-10 | Medvet Science Pty Ltd | Chorioallantoic membrane (cam) assay for identifying agents with biological effects |
| WO2010054022A1 (en) * | 2008-11-05 | 2010-05-14 | Institute Of Multiple Myeloma & Bone Cancer Research | An improved chorioallantoic membrane assay |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ANA GUERRA, JORGE BELINHA, NASIDE MANGIR, SHEILA MACNEIL, RENATO NATAL JORGE, Simulation of the process of angiogenesis: Quantification and assessment of vascular patterning in the chicken chorioallantoic membrane, Computers in Biology and Medicine, Volume 136, 2021, 104647, ISSN 0010-4825, https://doi.org/10.1016/j.compbiomed.2021.104647. MAUGERI A, LOMBARDO GE, NAVARRA M, CIRMI S, RAPISARDA A. The chorioallantoic membrane: A novel approach to extrapolate data from a well-established method. J Appl Toxicol. 2022 Jun;42(6): 995-1003. doi: 10.1002/jat.4271. Epub 2021 Dec 7. PMID: 34874573; PMCID: PMC9300073. MCKENZIE, B., KAY, G., MATTHEWS, K. H., KNOTT, R. M., & CAIRNS, D. The hen’s egg chorioallantoic membrane (HET-CAM) test to predict the ophthalmic irritation potential of a cysteamine-containing gel: Quantification using Photoshop and ImageJ. International Journal of Pharmaceutics, 2015, 490(1-2), 1-8. doi: 10.1016/j.ijpharm.2015.05.023. ЛИВАНОВА А.А., ДЕЕВ Р.В., РИЗВАНОВ А.А. Совре * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Liu et al. | Use of animal models for the imaging and quantification of angiogenesis | |
| Wilson et al. | Astrogliosis in a dish: substrate stiffness induces astrogliosis in primary rat astrocytes | |
| Smith et al. | Avian models in teratology and developmental toxicology | |
| JP2019510480A (ja) | 肝線維症のモデル系ならびにその作製および使用方法 | |
| CN112870228B (zh) | 一种多功能微环境保护外泌体水凝胶及其制备方法和应用 | |
| CN107796674B (zh) | 一种动物角膜长期培养评价眼刺激性损伤及修复的方法 | |
| Er et al. | Studying pre-formed fibril induced α-synuclein accumulation in primary embryonic mouse midbrain dopamine neurons | |
| JP2021145677A (ja) | 細胞構造体及び細胞構造体の製造方法 | |
| CN110100788A (zh) | 基于基因操作策略构建疾病模型的方法和应用 | |
| RU2466680C1 (ru) | Способ диагностики состояния кожи пациента (варианты) | |
| RU2808738C1 (ru) | Способ оценки процесса формирования сосудистой сети на хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона | |
| JP2013540276A (ja) | 創傷を治癒するメタカリオート（ｍｅｔａｋａｒｙｏｔｉｃ）幹細胞、およびその使用方法 | |
| Fietz et al. | Establishment of a primary porcine retinal pigment epithelium monolayer to complement retinal ex vivo cultures | |
| Kretz et al. | A primary culture technique of adult retina for regeneration studies on adult CNS neurons | |
| Bracke et al. | Chick heart invasion assay | |
| CN115025034A (zh) | 一种间充质干细胞外泌体组合物及其制备方法与应用 | |
| RU2455937C1 (ru) | Способ выявления псевдоэксфолиативного материала на ранних стадиях заболевания глаза | |
| Herlenius et al. | Functional stem cell integration assessed by organotypic slice cultures | |
| Fraga et al. | Assessment of the Teratogenic Effect of Drugs on the Chicken Embryo | |
| RU2593725C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ex vivo КУЛЬТУР АЛЬВЕОЛЯРНЫХ МАКРОФАГОВ ИЗ ОПЕРАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА БОЛЬНЫХ ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ И СПОСОБ ОЦЕНКИ ВИРУЛЕНТНОСТИ Mycobacterium tuberculosis С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛУЧЕННЫХ ex vivo КУЛЬТУР АЛЬВЕОЛЯРНЫХ МАКРОФАГОВ | |
| WO2006057444A1 (ja) | 細胞の分化度自動診断方法 | |
| Verdile et al. | Preparation of Biological Scaffolds and Primary Intestinal Epithelial Cells to Efficiently 3D Model the Fish Intestinal Mucosa | |
| WO2021123682A1 (fr) | Modèle organoïde cardiaque vascularisé apres incorporation de cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites humaines | |
| Imai et al. | Kaede‐centrin1 labeling of mother and daughter centrosomes in mammalian neocortical neural progenitors | |
| Zijlstra et al. | Angiogenesis assays in the chick |