CN113412813B - 一种皮肤型红斑狼疮小鼠模型及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种皮肤型红斑狼疮小鼠模型及其构建方法和应用。本发明构建的皮肤型红斑狼疮小鼠模型,利用姥鲛烷(Pristane)联合紫外线(UVB)刺激来进行构建。即C57BL/6小鼠在经过Pristane皮内免疫处理后,予以适当剂量的UVB连续照射。本发明提供的皮肤型红斑狼疮小鼠模型较好的模拟了小鼠皮肤免疫细胞异常活化在UVB刺激下产生的免疫反应。该模型可用于探讨红斑狼疮疾病进展的发生机制以及靶向狼疮皮损的药物研发等研究,对加快推进科研临床转化方面意义重大。
Description
技术领域
本发明属于动物实验模型及其制备技术领域,具体涉及皮肤型红斑狼疮小鼠模型及其构建方法和应用。
背景技术
姥鲛烷(Pristane),又称2,6,10,14-四甲基十五烷、TMPD,是一种类异戊二烯烷烃类化合物,可以在植物、海洋生物和石油蒸馏的副产品中找到。同时,Pristane也是一种与磷脂双分子层相互作用的膜激活化合物。在体外和活体条件下,Pristane均能诱导小鼠淋巴细胞系和腹腔渗出液细胞程序性死亡,这提示Pristane诱导的细胞凋亡提供了充足的自身抗原底物,从而导致与干扰素α和β(IFN-α和IFN-β)的过度产生有关的免疫紊乱。自1994年Satoh M应用Pristane诱导BALB/c小鼠出现类似于人类系统性红斑狼疮的症状,首次建立了Pristane诱导的狼疮小鼠模型,该方法已成为诱导狼疮小鼠模型最常用方法。
红斑狼疮(Lupus erythematosus,LE)是一种多因素参与的慢性自身免疫性疾病,而皮肤是红斑狼疮自身免疫攻击的重要靶点。在系统性红斑狼疮(SLE)患者中,高达90%的患者有皮肤表现,25-28%的患者以皮肤为首发症状。而皮肤型红斑狼疮(CLE)主要影响皮肤和粘膜组织。临床上,一些CLE亚型可能进展为SLE,出现包括肾脏和大脑受累导致肾功能衰竭和神经系统疾病。因此CLE的成功治疗可能会显著降低全身受累的风险。
目前已有用于研究SLE发病机制和新的治疗方法的两种小鼠模型,包括自发模型和诱导模型。自发模型包括新西兰黑×白F1小鼠(NZB/W)、Murphy Roths Large/Lpr小鼠(MRL/LPR)和BXSB/Yaa小鼠。诱导模型包括上文提及的Pristane诱导小鼠和Chronicgraft-versus-host disease(cGVHD)模型。然而,这些小鼠模型主要表现为狼疮样肾炎和自身抗体的产生,且狼疮样皮损的发生并不稳定。因此,CLE患者进展为SLE的发病机制探讨及靶向红斑狼疮皮损的药物研发将囿于缺乏合适的CLE动物模型。若能构建一种较理想的CLE小鼠模型(存在类似CLE患者的皮肤损伤,且无系统受累情况),将使科研工作者及临床医生更好的了解红斑狼疮皮肤损伤的发病机制,有助于CLE向SLE发展的机制研究以及靶向红斑狼疮皮损免疫治疗的转化研究。
本发明提供一种皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法。利用Pristane联合紫外线UVB刺激来进行构建。即C57BL/6小鼠在经过Pristane皮内注射免疫处理后,予以适当剂量的UVB连续照射。本发明操作简单,造模时间短,均一性好,较好的模拟了人CLE的皮损改变,可用于探讨CLE疾病进展的发生机制以及靶向狼疮皮损的药物研发等研究。
本发明所构建的皮肤型红斑狼疮小鼠模型与申请号为202010110769.4的专利申请中人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型相比,具有诸多显著的优势:
1、人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型是将疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞皮下注射至裸鼠背部,局部模拟红斑狼疮患者免疫环境。裸鼠因编码Foxn1的基因突变,其毛发生长异常,且存在胸腺基质发育缺陷。因此裸鼠不产生成熟的CD4+和CD8+T细胞,同时由于缺乏T细胞的辅助,裸鼠B细胞的发育也会受到影响。一方面,这使得人源细胞可以在裸鼠背部皮下存活,而不被宿主免疫清除,人源化皮肤型红斑狼疮模型得以成功构建,但另一方面,也使得人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型皮损区域炎症反应以B细胞为主,而缺乏T细胞的参与,在研究皮肤型红斑狼疮T细胞相关发病机制及治疗靶点方面存在局限性,而本发明小鼠模型在免疫正常的C57BL/6小鼠上构建,模型构建成功可以看到小鼠真皮区域存在明显的T、B细胞聚集,对于研究皮肤型红斑狼疮皮损中T细胞及其亚群相关发病机制及治疗靶点,以及T-B细胞相互作用,更具优势。
2、人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建需要疾病活跃期系统性红斑狼疮患者外周血单个核细胞,而不同系统性红斑狼疮患者之间外周血存在一定的异质性,这使得造模小鼠之间皮损及局部免疫也存在异质性。本发明造模所需的Pristane,是一种可以工业化生产的烷烃,各批次产品质量及稳定性较高,可以保证造模小鼠之间具有较好的一致性;
3、构建人源化皮肤型红斑狼疮小鼠模型前,需评估提供外周血单个核细胞的狼疮患者的疾病活动性(造模需患者SLEDAI评分≥8),且临床上系统性红斑狼疮患者既往激素及免疫抑制剂的应用情况复杂且难追溯,而这些因素对造模成功与否十分关键。除此之外,一批模型的构建需要符合条件的狼疮患者数量较多,因此需要一定的医院门诊接诊量的支持。这使得造模较大程度地受限于合格造模原料的获取,在造模成功率及效率上具有一定的局限性。本发明所需原料Pristane,工业化生产,一致性高且易获得,一次性可对多只小鼠进行造模,造模受限较少,成功率及效率较高。
发明内容
本发明的首要目的在于提供一种皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法。本发明可较好的模拟人CLE的皮损改变,填补了目前CLE动物模型的空白,而且操作简单,造模时间短。
本发明的方法首次将Pristane用于构建小鼠CLE疾病模型,并结合合适的紫外线(UVB)照射处理,构建出CLE的皮损改变的动物模型。
一种皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法:将Pristane皮内注射正常小鼠,联合UVB照射处理。优选:C57BL/6小鼠。
本发明所述的构建方法,所述的皮内注射是注射在小鼠背部真表皮之间。注射前将小鼠背部皮肤进行被毛处理,用拇指和食指按住皮肤使之绷紧,在两指之间用胰岛素针30G针头穿刺,针头进入皮肤浅层,再向上挑起稍刺入,将药液注入真表皮之间。注射后皮肤出现一毛孔较明显的白色小皮丘。
进一步地,所述的构建方法,Pristane多点注射,不少于9处。
进一步地,Pristane总注射量不可少于0.25ml。
进一步地,白色小皮丘面积不小于2×3cm。
注射部位为小鼠背部中央区域,注射完成后可形成数个白色小皮丘。鉴于至今没有Pristane皮内注射来进行动物造模的相关研究,本发明模型构建时对比了不同注射深度的造模效果(皮下、皮内),同样的UVB照射处理情况下,皮下注射无法诱发CLE样皮损。
进一步地,所述的构建方法,皮内注射的姥鲛烷免疫至少一周后,采用每日总辐照剂量为150-250mJ/cm2高剂量UVB照射至造模小鼠出现持续性瘢痕样红斑,优选每日总辐照剂量为200mJ/cm2;之后采用每日总辐照剂量为50-150mJ/cm2低剂量UVB照射维持皮损,优选每日总辐照剂量为100mJ/cm2,直至建模完成。
模型构建时设立了3组不同UVB剂量来诱发皮损(100mJ/cm2、200mJ/cm2、300mJ/cm2),接受同样皮内注射剂量Pristane的情况下,不同剂量UVB连续照射5天后,100mJ/cm2处理组未能诱发出可维持的CLE样皮损,而300mJ/cm2处理组因紫外剂量过高,致使小鼠皮肤晒伤反应强烈(见附图9)。故诱发CLE样皮损的理想紫外剂量优选为每日辐照总剂量150-250mJ/cm2,最优选200mJ/cm2。
皮内注射的姥鲛烷免疫至少一周后,先用高剂量UVB照射4-6天,优选5天,然后将低剂量UVB继续连续照射1-3周,优选2周,停止UVB辐照。
进一步地,小鼠在行Pristane皮内注射免疫至少一周之后,按照每日200mJ/cm2剂量UVB照射,连续UVB照射5天,造模小鼠均存在持续性瘢痕样红斑;此后予小鼠每日100mJ/cm2剂量UVB照射连续2周,以维持皮损形态,即建立稳定的模型。
在成功诱发出CLE样皮损后,需用低剂量UVB连续照射2周。这个方法的获得是基于造模尝试初期,我们设立了对照组(皮内注射同样剂量的PBS缓冲液,予以同样剂量紫外照射),对照组在予以连续5天高剂量UVB辐射后,部分小鼠出现红斑、脱屑等皮肤损伤,系正常皮肤经较强UVB照射后产生的一种急性炎症反应。临床上,在接受UVB的光激发试验后,有20%左右的正常人可出现日光性皮炎。我们设立的对照组小鼠,在接受UVB照射后出现的皮肤损伤与人的反应类似。故在5天高剂量UVB照射后,需调低紫外照射使非CLE皮损消退,以排除日光性皮炎的混合影响,此处我们予以调低紫外剂量而非停止紫外照射的原因为,本模型需尽可能模拟人日常紫外照射情况。我们将维持期的UVB剂量设置优选为每日辐照总剂量50-150mJ/cm2,最优选100mJ/cm2。
此处模型构建要在UVB连续照射前先将Pristane注射入皮内免疫1周的原因为:本模型模拟的是CLE皮损的发生。大量研究表明腹腔注射Pristane后的模型小鼠病理检查可见单核吞噬细胞吞噬Pristane油滴,T、B淋巴细胞发生增殖聚集,而紫外线可以促进炎症细胞因子分泌增加和角质形成细胞DNA断裂,导致角质形成细胞显著凋亡,释放自身抗原,促使异常活化的T、B细胞自身反应,进而可能导致皮损的发生。基于此可能性,在予以高剂量UVB照射处理前,先进行Pristane皮内免疫,引发T、B细胞聚集,辅以UVB照射,聚集活化的T、B细胞与增加的自身抗原发生自身免疫反应,进而导致狼疮样皮肤损伤。
本发明的第二个目的是提供一种皮肤型红斑狼疮小鼠模型,是由上述方法构建得到的,是目前最佳模拟CLE的皮损改变的动物模型。
本发明的第三个目的是提供一种皮肤型红斑狼疮小鼠模型的应用。
具体包括皮肤型红斑狼疮小鼠模型在探讨CLE疾病进展的发生机制以及靶向狼疮皮损的药物研发中的应用,具有重大的医学意义。
本发明的第四个目的是提供Pristane皮内注射和紫外线在制备构建皮肤型红斑狼疮小鼠模型工具中的应用。
本发明在皮肤型红斑狼疮小鼠模型构建中发现以下这些因素也会影响模型构建是否成功。
1、保证Pristane注射深度在真表皮之间:
本模型构建的尝试中,曾将Pristane一次性注射入皮下,该注射方式与申请号为202010110769.4的专利中人源化CLE小鼠模型注射方式一致(即注射在小鼠背部皮下脂肪层。用拇指和食指捻起3-5cm宽度的皮肤,把这块皮肤挤到一起,使皮下形成空隙方便注射,确保所有的细胞注射到了脂肪层而不是其下面的肌肉里),但该注射方式下小鼠皮损诱发失败,且皮肤组织切片淋巴细胞及免疫复合物荧光染色显示淋巴细胞聚集位置较深,表皮区域未见明显淋巴细胞增多,未见C3、IgG沉积(见附图1-5中“Pristanes s.c.+UVB”)。故需选择针管直径较细的胰岛素针,用拇指和食指按住皮肤使之绷紧,在两指之间穿刺,针头进入皮肤浅层再向上挑起稍刺入,将药液注入真表皮之间,多点注射,不少于9处,注射面积不小于2×3cm,以确保造模的顺利进行。
2、造模所用小鼠品系为C57BL/6:
本模型构建的尝试中,曾用Balb/c小鼠皮内注射同样剂量的Pristane,予以适当剂量的UVB连续照射,结果未能诱导出有差异的皮损(见附图1、2中“B/CPristane i.c.+UVB”和“B/C PBS i.c.+UVB”)。
此外,造模开始时应将每组小鼠数量增大,皮内注射免疫一周后,剔除背部被毛区域皮肤呈灰黑色、黑色,或被毛区域出现点片状灰黑色、黑色皮肤斑块的小鼠,选择背部被毛区域呈现均一的粉色或粉灰色的小鼠,进行下一步造模处理,即UVB辐照。
保证造模C57BL/6小鼠实验组与对照组毛发生长情况一致:
在模型构建时,需设置正常对照来对比验证CLE造模效果,即同等剂量PBS缓冲液多点皮内注射在小鼠的背部,接受同样剂量的UVB照射。C57BL/6小鼠背覆黑色毛发,毛发生长情况的不匹配将导致皮肤UVB接受剂量的不统一,且有研究表明毛发生长期的小鼠皮肤创伤愈合率高于毛发静止期小鼠,因此仅考虑小鼠年龄、性别、体重匹配,而忽视毛发生长周期的匹配一致将影响造模的稳定性。已有研究,C57BL/6成鼠脱毛后第9天约有95%的毛囊进入生长Ⅳ期,第17天约有63.3%的毛囊进入退化期,第22天约有85%的毛囊处于退化期。
目前已有用于研究SLE发病机制和新的治疗方法的两种小鼠模型,包括自发模型和诱导模型。自发模型包括新西兰黑×白F1小鼠(NZB/W)、Murphy Roths Large/Lpr小鼠(MRL/LPR)和BXSB/Yaa小鼠。诱导模型包括Pristane诱导小鼠和Chronic graft-versus-host disease(cGVHD)模型。其中,诱导模型较自发模型更侧重于研究环境因素打破免疫耐受而致病狼疮。然而这些小鼠模型主要表现为狼疮样肾炎和自身抗体的产生,且狼疮样皮损的发生并不稳定。因此,CLE患者进展为SLE的发病机制探讨及靶向红斑狼疮皮损的药物研发将囿于缺乏合适的CLE动物模型。以往有研究表明腹腔注射Pristane后腹膜、脾脏、肝脏广泛出现脂肪肉芽肿,病理检查见单核吞噬细胞吞噬Pristane油滴,T、B淋巴细胞增殖聚集,形成异位淋巴组织。本发明认为,紫外线照射诱导角质细胞的凋亡增加,进而导致自身抗原的暴露,正常情况下,人体自身的免疫细胞可及时对这些凋亡的细胞进行清除,且不会针对暴露的自身抗原产生过激的免疫应答。而CLE患者的皮肤组织病理可见真皮血管和皮肤附属器周围较致密的灶状淋巴细胞浸润,在足量的自身抗原的刺激下,可产生一系列炎症级联反应,进而可能导致皮损的发生。基于此可能性,先予以Pristane皮内注射,在小鼠真皮层引发淋巴细胞的聚集,再予以高剂量UVB照射处理,诱发角质细胞凋亡并释放足量可引发免疫细胞反应的自身抗原,进而导致小鼠皮肤发生狼疮样皮肤损伤。
本发明构建的皮肤型红斑狼疮小鼠模型构建成功后,小鼠表现为持久的片状红斑;真表皮区域,毛囊周、附属器有明显的T、B细胞及单核细胞聚集成团,皮损真表皮交界处C3、IgG沉积为阳性,其中,淋巴细胞团中可观察到明显的T细胞聚集,较人源化皮肤性红斑狼疮小鼠模型更接近人类皮肤型红斑狼疮的病理特征,而C3、IgG线状沉积带,较人源化皮肤性红斑狼疮小鼠模型与临床皮肤性红斑狼疮患者相似度更高;小鼠血清抗核抗体、抗双链DNA检测结果为阴性;造模结束小鼠尿蛋白定性检测为阴性,肾脏IgG检测为阴性;是理想的皮肤型红斑狼疮小鼠模型。
总之,本发明提供的皮肤型红斑狼疮小鼠模型较好的模拟了CLE患者皮肤对UVB刺激下产生的免疫反应。该模型可用于探讨红斑狼疮疾病进展的发生机制以及靶向狼疮皮损的药物研发等研究,对加快推进科研临床转化方面意义重大。
附图说明
图1为本发明实施例1中构建的皮肤型红斑狼疮小鼠模型的皮损。
图2为本发明实施例1中实验小鼠皮损区域皮肤组织HE染色结果;图2中Pristanei.c.+UVB组三张附图分别可见毛囊角栓(100倍,右1)、表皮增厚、基底细胞液化变性(100倍,左2)及片状淋巴细胞浸润(200倍,右2)。
图3为本发明实施例1中实验小鼠皮肤组织的免疫细胞荧光染色结果。
图4为本发明实施例1中实验小鼠皮肤组织IgG染色结果。
图5为本发明实施例1中实验小鼠皮肤组织C3染色结果。
图6为本发明实施例1中实验小鼠PBS i.c.+UVB组和Pristane i.c.+UVB组小鼠每周的尿蛋白尿测定结果。
图7为本发明实施例1中实验小鼠肾脏组织IgG染色结果。
图8为本发明实施例1中实验小鼠血清自身抗体测定结果。
图9为本发明实施例1中Pristane i.c.+UVB组不同UVB剂量来诱发皮损结果。
上述各附图中:
PBS i.c.+UVB组为C57BL/6小鼠皮内注射PBS+UVB照射;
Pristane i.c.+UVB组为C57BL/6小鼠皮内注射Pristane+UVB照射;
Pristane i.c.组为C57BL/6小鼠皮内注射Pristane,不进行UVB照射;
Pristane s.c.+UVB组为C57BL/6小鼠皮下注射Pristane+UVB照射;
B/C PBS i.c.+UVB组为Balb/c小鼠皮内注射PBS+UVB照射;
B/C Pristane i.c.+UVB组Balb/c小鼠皮内注射Pristane+UVB照射。
具体实施方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明。基于本发明中的实施方式,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有实施案例,都属于本发明保护的范围。
试剂的准备:
1)Pristane:Sigma-Aldrich,P2870;
2)PBS溶液:1xPBS粉末,1000mL无菌去离子水;
3)PBST溶液:1xPBS粉末,5ul吐温20,1000mL无菌去离子水;
4)4%多聚甲醛:4g多聚甲醛加入100mLPBS溶液,磁力搅拌器加热搅拌,滴加NaOH调节pH值为7.4;
5)50%酒精:50mL无水酒精加入50mL无菌去离子水;
6)75%酒精:75mL无水酒精加入25mL无菌去离子水;
7)95%酒精:95mL无水酒精加入5mL无菌去离子水;
8)Harris苏木精液:2.5g苏木精,25mL无水酒精,50g钾明矾,500mL蒸馏水,1.25g氧化汞,20mL冰醋酸;
9)5%曙红酒精溶液:取1g伊红,溶于99mL70%酒精;
10)抗原修复液:
酸性修复液(pH6.0):3g柠檬酸三钠,0.4g柠檬酸,20ul吐温20,1000ml灭菌去离子水;
碱性修复液(pH8.0):1.8g EDTA,0.9g EDTA-2Na,1000ml灭菌去离子水,约8ml10%NaOH调pH值至8.0;
11)3%H2O2溶液:2mL30%H2O2溶液,8mL无菌水混匀;
12)血清封闭液:0.5g BSA粉末,10ml 1xPBS溶液,充分混匀,配置好后可4℃存放2周;
13)抗体稀释液:0.1g BSA粉末,10ml 1xPBS溶液,充分混匀,配置好后可4℃存放2周;
14)二抗溶液:1uL二抗原液(Abcam,ab205722),2000ul抗体稀释液,充分混匀,配置好后可4℃存放2周;
15)TSA染液(购自PerkinElmer),现配现用:
Opal520工作液:Opal520染色液原液与配套放大稀释液1∶100稀释;
Opal540工作液:Opal520染色液原液与配套放大稀释液1∶150稀释;
Opal570工作液:Opal520染色液原液与配套放大稀释液1∶200稀释;
Opal620工作液:Opal620染色液原液与配套放大稀释液1∶300稀释;
Opal650工作液:Opal650染色液原液与配套放大稀释液1∶250稀释;
Opal690工作液:Opal690染色液原液与配套放大稀释液1∶200稀释;
16)DAPI工作液:1uLDAPI染色液原液与100uL配套放大稀释液混匀;
17)Bradford溶液:0.25g考马斯亮蓝R250,45mL甲醇,10uL冰醋酸,45mL双蒸水;
18)EDTA溶液:4g乙二胺四乙酸二钠盐,加入1000mL无菌水加热溶解。
实施例1:皮肤型红斑狼疮实验动物模型的构建方法
1)订购来源于正规正产单位、具有动物质量证明的SPF级雌性C57BL/6小鼠、Balb/c小鼠,周龄为8W,保持外包装完整并喷洒消毒液喷雾,在紫外传递门内经紫外灭菌30min后进入SPF级屏障环境,此后该实验C57BL/6小鼠、Balb/c小鼠所涉及的实验操作均在此屏障环境内进行;
将所有C57BL/6小鼠称重并记录后按体重从小到大排列,用随机数表法将C57BL/6小鼠随机分成Pristane i.c.+UVB组、PBS i.c.+UVB组、Pristane i.c.组;其中:Pristanei.c.+UVB组和Pristane i.c组皮内多点注射Pristane 0.25ml,PBS i.c.+UVB组皮内多点注射PBS缓冲液0.25ml,Pristane s.c.+UVB组皮下注射Pristane 0.25ml。皮内注射方式为:选择针管直径较细的胰岛素针,用拇指和食指按住皮肤使之绷紧,在两指之间穿刺,针头进入皮肤浅层再向上挑起稍刺入,将药液注入真表皮之间,多点注射,不少于9处,注射面积不小于2×3cm。皮下注射方式为:将Pristane一次性注射入皮下,即注射在小鼠背部皮下脂肪层。用拇指和食指捻起3-5cm宽度的皮肤,把这块皮肤挤到一起使皮下形成空隙方便注射,确保所有的细胞注射到了脂肪层而不是其下面的肌肉里。Balb/c小鼠分为B/C PBSi.c.+UVB组、B/C Pristane i.c.+
UVB组,B/C PBS i.c.+UVB组为Balb/c小鼠皮内多点注射PBS+UVB照射,注射方式与上述的C57BL/6小鼠一致;B/C Pristane i.c.+UVB组Balb/c小鼠皮内多点注射Pristane+UVB照射;注射方式与上述C57BL/6小鼠一致。
2)各组小鼠依次编号标记,装入已标记的IVC独立通风笼具中饲养,准备好实验动物配合饲料及充足的水,每周两次定期更换垫料,不定期补充饲料及饮水;予小鼠背部皮肤被毛处理,按步骤1)的分组和具体操作分别皮内或皮下注射Pristane或PBS缓冲液,待其皮内免疫一周;
3)选取毛发生长情况匹配的小鼠,使用紫外线辐照仪器的UVB灯管(290-320nm),紫外辐照计监测紫外强度,将小鼠饲养笼的笼盖移开,并使UVB紫外灯的灯管位于笼子的正上方,确保小鼠背部充分暴露在紫外灯的辐照下,小鼠饲养笼高20cm,在每次辐照时紫外灯管距离笼子底部高度不变的前提下,小鼠每次接受的紫外强度均在10×100uW/cm2左右,故各组小鼠在行Pristane或PBS缓冲液注射一周后,每日紫外辐照时间200s(即每日总辐照剂量在200mJ/cm2左右),连续UVB照射5天;
4)此后使每日接受10×100uW/cm2强度UVB辐照150s(即每日总辐照剂量在100mJ/cm2左右)维持皮损形态2周,即建立稳定的实验动物模型,过程中持续观察并记录各组小鼠背部皮肤改变并每周监测尿蛋白及每两周取内眦静脉丛或尾静脉血清。
实施例2:实施例1中皮肤型红斑狼疮小鼠模型验证实验
2.1CLE实验小鼠皮肤和肾脏组织石蜡切片制备
1)对CLE实验小鼠施行安乐死,用锐利的刀片剪取小块皮损组织,整个肾脏从冠状面中间切开,预冷生理盐水漂洗后,迅速将皮肤组织和肾脏组织放入4%多聚甲醛中室温固定24小时;
2)使用流水对固定好的皮损组织冲洗;
3)将冲洗后的标本经50%酒精→75%酒精→95%酒精(I)→95%酒精(Ⅱ)→无水酒精(I)→无水酒精(Ⅱ),各浓度酒精依次浸泡脱水2小时;
4)脱水后的皮肤组织经1∶1无水酒精与二甲苯→二甲苯(I)→二甲苯(Ⅱ),依次浸泡1小时,可见组织呈现透明状态;
5)将装有58℃石蜡的三个蜡杯放在熔蜡箱内熔化,并使熔蜡箱的温度保持恒定(约58℃),然后将已透明的标本放入蜡杯(I)→蜡杯(Ⅱ)→蜡杯(Ⅲ),依次浸泡1小时;
6)在每孔大小为1×1×1cm的固定板的孔中加入已熔化的石蜡,随即将第三杯中已浸蜡的材料放入其中,切面朝下,位置放正,然后速将固定板半浸于冷水中,待石蜡表面凝结后,将固定板全部浸入水中冷却。石蜡全部凝固后,取出蜡块即完成皮肤组织包埋;
7)将蜡块于固定在切片机底座容器上,装在切片机固定器上,以待切片;
8)在旋转式切片机上将蜡块切成5um厚的薄片。切下的薄片和蜡带,用毛笔轻轻取下蜡带,放在蜡带盒内备用;
9)将蜡带按要求切成适当长度的蜡片,用小镊子将蜡片轻放在载玻片的水面上,再把载玻片放在展片台上(温度为45℃左右),蜡片受热后即慢慢展平;
10)待蜡片完全展平后,用解剖针将切片位置拨正,倾去载玻片上的余水;
11)将其放在烤片盒中,置于50℃恒温箱内烤干。
2.2CLE实验小鼠皮肤HE染色
1)选取CLE实验小鼠皮肤组织石蜡切片,70℃烤片2小时;依次放入二甲苯(I)→二甲苯(Ⅱ)中,各浸泡5min,然后依次在95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇、灭菌水中梯度水化10分钟;
2)将蒸馏水洗涤后的切片移入Harris苏木精液中5min,使细胞核着色;
3)用自来水洗去切片上残余的染液;
4)用1%盐酸酒精分色5min,使细胞核着色清晰,随时用显微镜检查切片,使分色适度;
5)放入1%氨水浸洗,可见组织蓝化,并在蒸馏水中浸泡5min;
6)切片放入50%酒精→75%酒精→95%酒精各2min;
7)放入0.5%曙红酒精溶液中染色5min;
8)切片依次入95%酒精(I)→95%酒精(Ⅱ)→无水酒精(I)→无水酒精(Ⅱ),依次浸泡5min;
9)切片入1∶1无水酒精、二甲苯→二甲苯(I)→二甲苯(Ⅱ),依次浸泡5min;
10)将切片从二甲苯(Ⅱ)中取出,用纸或布擦去材料组织周围的二甲苯,用无色指甲油封住切片边缘,用镊子加盖盖玻片,于室温内封存,需要读片时随时取出在显微镜下观察;
2.3CLE实验小鼠皮肤免疫细胞原位标记免疫荧光
1)选取CLE实验小鼠皮损区域皮肤组织石蜡切片,70℃烤片2小时;2小时后取出并放入预热的松节油中浸泡15分钟,然后依次在95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇、灭菌水中梯度水化10分钟;
2)配制酸性抗原修复液(pH6.0)200ml,将步骤(1)中的切片浸泡于酸性抗原修复液中,将其置于微波炉中保持高火2分钟,转低火20分钟,抗原修复结束后,冷却至室温,用灭菌水浸泡洗涤2分钟;
3)擦干切片组织周围液体,用免疫组化笔圈出玻片上的样本区域,每个样本区域滴加高碘酸溶液于石蜡切片上形成液滴,使其完全覆盖组织,湿盒内室温孵育10min,再用PBST溶液浸泡洗涤切片5min;
4)取3%H2O2溶液滴加于石蜡切片组织上,液滴覆盖组织,置于湿盒内室温孵育10min,再用PBST溶液浸泡洗涤切片5min;
5)将血清封闭液滴加于组织上,湿盒内室温孵育30min,配制Anti-Mouse B220抗体工作液:0.1ul Anti-Mouse B220抗体原液(Abcam,Ab10558),2ul胎牛血清,198ul抗体稀释液;
6)血清封闭液孵育结束后,弃去切片上的封闭液,滴加配制好的Anti-Mouse B220抗体工作液,使其充分覆盖组织,室温孵育1小时,再用PBST溶液浸泡洗涤切片3次,每次5min;
7)滴加二抗溶液(Abcam,ab205722),室温孵育20min,再用PBST溶液浸泡洗涤切片3次,每次5min;
8)滴加配制好的Opal570染液,室温保湿孵育10分钟,再用PBST溶液浸泡洗涤切片5min;
9)取酸性修复液(pH6.0)200ml,放入抗原修复盒中,然后放入已完成B220染色的切片,确保修复液已完全浸没切片的组织区域;
10)将抗原修复盒放入高压锅中(高压锅预先盛有500ml自来水),设定高压锅加热功率为1000W,待高压锅上汽后,继续修复7min;
11)修复结束后,关闭高压锅,使抗原修复液及切片自然冷却至室温,灭菌去离子水浸泡洗涤切片2min;
12)擦干切片组织周围液体,用免疫组化笔圈出玻片上的样本区域,每个样本区域滴加配制好的血清封闭液使其完全覆盖组织,湿盒内室温孵育30min;
13)配制Anti-Mouse CD11b抗体工作液:0.1ul Anti-Mouse CD11b抗体原液(Abcam,Ab133357),1.5ul胎牛血清,148.5ul抗体稀释液;
14)血清封闭液孵育结束后,弃去切片上的封闭液,滴加配制好的Anti-MouseCD11b抗体工作液,使其充分覆盖组织,室温孵育1小时,再用PBST溶液浸泡洗涤切片3次,每次5min;
15)滴加二抗溶液(Abcam,ab205722),室温孵育20分钟;
16)滴加配制好的Opal650染液,室温保湿孵育10分钟,再用PBST溶液浸泡洗涤切片3次,每次5min;
17)取酸性修复液(pH6.0)200ml,放入抗原修复盒中,然后放入已完成B220、CD11b染色的切片,确保修复液已完全浸没切片的组织区域;
18)将抗原修复盒放入高压锅中(高压锅预先盛有500ml自来水),设定高压锅加热功率为1000W,待高压锅上汽后,继续修复7min;
19)修复结束后,关闭高压锅,使抗原修复液及切片自然冷却至室温,灭菌去离子水浸泡洗涤切片2min;
20)擦干切片组织周围液体,用免疫组化笔圈出玻片上的样本区域,每个样本区域滴加配制好的血清封闭液使其完全覆盖组织,湿盒内室温孵育30min;
21)配制Anti-Mouse CD3抗体工作液:1ul Anti-Mouse CD3抗体原液(Abcam,Ab16669),1ul胎牛血清,98ul抗体稀释液;
22)血清封闭液孵育结束后,弃去切片上的封闭液,滴加配制好的Anti-Mouse CD3抗体工作液,使其充分覆盖组织,室温孵育1小时,再用PBST溶液浸泡洗涤切片3次,每次5min;
23)滴加二抗溶液(Abcam,ab205722),室温孵育20分钟;
24)滴加配制好的Opal520染液,室温保湿孵育20分钟,再用PBST溶液浸泡洗涤切片3次,每次5min;
25)滴加已配制的DAPI工作液(Vector Laboratories),室温下湿盒内避光孵育20min后于多光谱显微镜(PerkinElmer Vectra)拍照分析。
2.4CLE实验动物皮肤免疫复合物C3沉积
1)选取CLE实验小鼠皮损区域皮肤组织石蜡切片,70℃烤片2小时;2小时后取出并放入预热的松节油中浸泡15分钟,然后依次在95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇、灭菌水中梯度水化10分钟;
2)配制碱性抗原修复液(pH8.0)200ml,将步骤(1)中的切片浸泡于碱性抗原修复液中,将其置于微波炉中保持高火2分钟,转低火20分钟,抗原修复结束后,冷却至室温,用灭菌水浸泡洗涤2分钟;
3)擦干切片组织周围液体,用免疫组化笔圈出玻片上的样本区域,每个样本区域滴加高碘酸溶液于石蜡切片上形成液滴,使其完全覆盖组织,湿盒内室温孵育10min;
4)PBST溶液浸泡洗涤切片5min;
5)取3%H2O2溶液滴加于石蜡切片组织上,液滴覆盖组织,置于湿盒内室温孵育10min;
6)PBST溶液浸泡洗涤切片5min;
7)将血清封闭液滴加于组织上,湿盒内室温孵育30min,配制Anti-Mouse C3抗体工作液:1ul Anti-Mouse C3抗体原液(Abcam,Ab200999),1ul胎牛血清,98ul抗体稀释液;
8)血清封闭液孵育结束后,弃去切片上的封闭液,滴加配制好的Anti-Mouse C3抗体工作液,使其充分覆盖组织,4℃孵育13小时后,置于室温中缓慢复温1小时;
9)PBST溶液浸泡洗涤切片3次,每次5min;
11)PBST溶液浸泡洗涤切片3次,每次5min;
12)滴加已配制的DAPI工作液(Vector Laboratories),室温下湿盒内避光孵育20min后于多光谱显微镜(PerkinElmer Vectra)拍照分析。
2.5CLE实验小鼠皮肤免疫复合物IgG沉积
1)选取CLE实验小鼠皮损区域皮肤组织石蜡切片,70℃烤片2小时;2小时后取出并放入预热的松节油中浸泡15分钟,然后依次在95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇、灭菌水中梯度水化10分钟;
2)配制碱性抗原修复液(pH8.0)200ml,将步骤(1)中的切片浸泡于碱性抗原修复液中,将其置于微波炉中保持高火2分钟,转低火20分钟,抗原修复结束后,冷却至室温,用灭菌水浸泡洗涤2分钟;
3)擦干切片组织周围液体,用免疫组化笔圈出玻片上的样本区域,每个样本区域滴加高碘酸溶液于石蜡切片上形成液滴,使其完全覆盖组织,湿盒内室温孵育10min;
4)PBST溶液浸泡洗涤切片5min;
5)取3%H2O2溶液滴加于石蜡切片组织上,液滴覆盖组织,置于湿盒内室温孵育10min;
6)PBST溶液浸泡洗涤切片5min;
7)将血清封闭液滴加于组织上,湿盒内室温孵育30min,配制Anti-Mouse IgG抗体工作液:0.1ul Anti-Mouse IgG抗体原液(Abcam,Ab205724),2ul胎牛血清,198ul抗体稀释液;
8)血清封闭液孵育结束后,弃去切片上的封闭液,滴加配制好的Anti-MouseIgG抗体工作液,使其充分覆盖组织,4℃孵育13小时后,置于室温中缓慢复温1小时;
9)PBST溶液浸泡洗涤切片3次,每次5min;
10)滴加配制好的Opal540染液,室温保湿孵育25分钟;
11)PBST溶液浸泡洗涤切片3次,每次5min;
12)滴加已配制的DAPI工作液(Vector Laboratories),室温下湿盒内避光孵育20min后于多光谱显微镜(PerkinElmer Vectra)拍照分析。
2.6CLE实验小鼠尿蛋白测定
1)在SPF级屏障环境中准备无菌Ep管,清晨从IVC独立笼具中取出CLE实验小鼠,沿尿道方向轻轻按摩膀胱并用无菌Ep管收集小鼠晨尿;
2)在半小时内收集完毕,并依次将收集的晨尿于4℃保存;
3)配制BSA蛋白标准品,浓度依次为2.0、1.5、1.0、0.75、0.5、0.25、0.125、0.025ug/uL;
4)96孔板中加入200μL Bradford溶液,孔中依次加入20uL待测实验小鼠晨尿,及20uLBSA蛋白标准品;
5)混匀后室温放置5分钟,使用酶标仪测定595nm处的吸光值;
6)以蛋白质浓度为横坐标,595nm处吸光值为纵坐标,绘制标准曲线,并计算待测晨尿蛋白浓度;
2.7CLE实验小鼠肾脏免疫复合物IgG染色
1)选取CLE实验小鼠肾脏组织石蜡切片,70℃烤片2小时;2小时后取出并放入预热的松节油中浸泡15分钟,然后依次在95%乙醇、75%乙醇、50%乙醇、灭菌水中梯度水化10分钟;
2)配制碱性抗原修复液(pH8.0)200ml,将步骤(1)中的切片浸泡于碱性抗原修复液中,放入高压锅中(高压锅预先盛有500ml自来水),调节高压锅功率在1000W,待高压锅上汽后,继续修复7min,
3)抗原修复结束后,冷却至室温,用灭菌水浸泡洗涤2分钟;
4)擦干切片组织周围液体,用免疫组化笔圈出玻片上的样本区域,每个样本区域滴加高碘酸溶液于石蜡切片上形成液滴,使其完全覆盖组织,湿盒内室温孵育20min,再用PBST溶液浸泡洗涤切片5min;
5)取3%H2O2溶液滴加于石蜡切片组织上,液滴覆盖组织,置于湿盒内室温孵育20min;
6)PBST溶液浸泡洗涤切片5min;
7)将血清封闭液滴加于组织上,湿盒内室温孵育30min,配制Anti-Mouse IgG抗体工作母液:1ul Anti-Mouse IgG抗体原液(Abcam,Ab205724),1ul胎牛血清,98ul抗体稀释液;再配制Anti-Mouse IgG抗体工作液:1ul Anti-Mouse IgG抗体工作母液,29ul抗体稀释液;
8)血清封闭液孵育结束后,弃去切片上的封闭液,滴加配制好的Anti-Mouse IgG抗体工作液,使其充分覆盖组织,4℃孵育13小时后,置于室温中缓慢复温1小时;
9)PBST溶液浸泡洗涤切片3次,每次5min;
10)滴加配制好的Opal690染液,室温保湿孵育10分钟;
11)滴加已配制的DAPI工作液(Vector Laboratories),室温下湿盒内避光孵育20min后于多光谱显微镜(PerkinElmer Vectra)拍照分析。
2.8CLE实验小鼠血清自身抗体检测
1)在SPF级屏障环境中,从IVC独立笼具中取出CLE实验小鼠,用毛细吸管吸取EDTA,使管内充盈1/5体积,再从CLE实验小鼠尾静脉断端吸取外周血,动作轻柔、速度稍快,并尽量避免尾静脉血接触小鼠毛发;
2)重复毛细吸管操作,100uLEDTA吸取300uL尾静脉血;
3)收集的尾静脉血在1小时内于低速离心机离心,1800rpm,10min;
4)底面包埋有Anti-Mouse ANA/ENA Ig抗体(包含IgA,IgG,IgM)96孔板和底面包埋有Anti-Mouse dsDNA Ig抗体(包含IgA,IgG,IgM)96孔板中均依次加入100uL浓度标准品、样品及对照组;
5)轻轻敲击孔板,混合反应物并室温孵育60min;
6)PBST溶液洗涤孔板4次,并在干净吸水纸巾上拍打,吸干孔内溶液;
7)每孔加入100uLAnti-Mouse Ig HRP稀释液,室温孵育30min;
8)PBST溶液洗涤孔板5次,并在干净吸水纸巾上拍打,吸干孔内溶液;
9)每孔加入100uLTMB反应物,每孔溶液开始转为蓝色,暗室中室温孵育15min;
10)每孔加入100uL终止反应液,轻轻混匀,可见每孔溶液开始转为黄色;
11)加入终止反应液30min内使用酶标仪测定450nm处的吸光值以及测定630nm处背景孔吸光值;
12)以血清自身抗体浓度为横坐标,450nm处吸光值与背景孔吸光度值差值为纵坐标,绘制标准曲线,并计算待测血清中自身抗体浓度;
结果:图1中Pristane i.c.+UVB组实验小鼠表现为鲜红色或暗红色瘢痕样红斑,境界清楚,边缘略高起,上附灰白色粘着性鳞屑;PBS i.c.+UVB组及Pristane i.c.组小鼠注射部位未见明显红斑,而Pristane s.c.+UVB组小鼠未诱发出狼疮样皮损。用Balb/c小鼠造模Pristane i.c.+UVB组及PBS i.c.+UVB组小鼠均表现为较明显的晒伤反应。
图2可见Pristane i.c.+UVB组表皮有角化过度,毛囊角栓,基底层细胞液化,呈空泡样变性,基底膜区增厚,真皮浅层有大量淋巴细胞浸润,而PBS i.c.+UVB组小鼠皮肤组织HE染色表现正常;Pristane i.c.组小鼠可见淋巴细胞聚集在真皮深层,但真皮浅层及表皮层表现正常;Pristane s.c.+UVB组小鼠可见淋巴细胞聚集在真皮深层及肌层,但真皮浅层及表皮层表现正常。用Balb/c小鼠造模Pristane i.c.+UVB组小鼠虽较PBS i.c.+UVB组小鼠有真皮层淋巴细胞异常增多,但角化过度、毛囊角栓等不明显。
图3可见Pristane i.c.+UVB组的B220阳性细胞(B细胞)、CD3阳性(T细胞)、CD11b阳性(单核细胞)显著增多,其余组小鼠淋巴细胞均未见异常增多。
图4和图5的结果可见Pristane i.c.+UVB组皮肤基底膜带区域的IgG和C3阳性信号,呈线状沉积,而其余组小鼠均未见IgG和C3沉积;
图6Pristane i.c.+UVB组和PBS i.c.+UVB组连续尿蛋白测定浓度始终低于3g/L,两组间无统计学差异,说明Pristane i.c.+UVB组小鼠的尿蛋白始终在正常范围;
图7取有肾脏损害的Pristane诱导系统性红斑狼疮小鼠模型的肾脏组织作为狼疮样肾炎的阳性对照结果,可见IgG阳性信号,沿肾小球内毛细血管壁沉积,而Pristane i.c.+UVB组和PBS i.c.+UVB组均未见IgG沉积。
图8造模结束处死小鼠取血清,所得Pristane i.c.+UVB组的ANA滴度与PBS i.c.+UVB组、Blank组小鼠相比均无统计学差异,说明造模期间小鼠ANA为阴性。
图9为3组不同UVB剂量来诱发皮损结果
表明在接受同样注射剂量的Pristane的情况下,不同剂量UVB连续照射1周后,100mJ/cm2处理组未能诱发出CLE样皮损,而300mJ/cm2处理组因紫外剂量过高,致使小鼠背部皮肤晒伤反应过于严重。
验证CLE皮肤型红斑狼疮小鼠模型的评价标准
1)CLE实验小鼠背部出现持续性皮肤损伤,表现为鲜红色或暗红色瘢痕样红斑,境界清楚,边缘略高起,上附灰白色粘着性鳞屑(见附图1Pristane i.c.+UVB组);
2)CLE实验小鼠皮损区域皮肤组织HE染色:角化过度,毛囊角栓,基底层细胞液化,呈空泡样变性,基底膜区增厚,真皮有大量淋巴细胞浸润(见附图2Pristane i.c.+UVB组);
3)CLE实验小鼠皮损区域皮肤组织免疫细胞原位标记免疫荧光:皮肤组织真皮层CD3阳性、B220阳性、CD11b阳性细胞呈团状聚集分布(见附图3Pristane i.c.+UVB组);
4)CLE实验小鼠皮损区域皮肤组织IgG染色:皮肤基底膜带区域可见IgG带状阳性信号,为免疫复合物IgG补体沉积(见附图4Pristane i.c.+UVB组);
5)CLE实验小鼠皮损区域皮肤组织C3染色:皮肤基底膜带区域可见C3带状阳性信号,为免疫复合物C3沉积(见附图5Pristane i.c.+UVB组);
6)CLE实验小鼠蛋白尿测定:尿液蛋白质浓度始终低于3g/L(见附图6Pristanei.c.+UVB组);
7)CLE实验小鼠肾脏组织病理染色:HE染色肾小球无系膜细胞增生,无系膜基质增宽,无毛细血管拌狭窄或破坏,无基底膜增厚,无球囊粘连;IgG染色取肾脏损害的Pristane诱导SLE小鼠模型的肾脏组织作为狼疮样肾炎的阳性对照结果,可见IgG阳性信号,沿肾小球内毛细血管壁沉积,而CLE实验小鼠肾脏组织肾小球未见IgG阳性信号(见附图7);
8)CLE实验小鼠血清自身抗体测定:ANA为阴性(见附图8Pristane i.c.+UVB组);
实验小鼠符合以上8条特征即为理想的皮肤型红斑狼疮小鼠。
Claims (9)
1.一种皮肤型红斑狼疮小鼠模型的构建方法,其特征在于,将姥鲛烷皮内注射小鼠,联合UVB照射处理,所述的皮内注射为真表皮之间注射;皮内注射的姥鲛烷免疫至少一周后,采用每日总辐照剂量为150-250mJ/cm2高剂量UVB照射4-6天至造模小鼠出现持续性瘢痕样红斑;之后采用每日总辐照剂量为50-150mJ/cm2低剂量UVB照射1-3周维持皮损,直至建模完成。
2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述的小鼠包含C57BL/6小鼠。
3.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,所述的皮内注射部位为背部。
4.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,多点注射。
5.根据权利要求4所述的构建方法,其特征在于,姥鲛烷总体积不少于0.25mL。
6.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于;皮内注射的姥鲛烷免疫至少一周后,采用每日总辐照剂量为200mJ/cm2高剂量UVB照射至造模小鼠出现持续性瘢痕样红斑;之后采用每日总辐照剂量为100mJ/cm2低剂量UVB照射维持皮损,直至建模完成。
7.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,皮内注射的姥鲛烷免疫至少一周后,先用高剂量UVB照射5天,然后将低剂量UVB继续连续照射1-3周,停止UVB辐照。
8.根据权利要求1或6或7任一项所述的构建方法,其特征在于,小鼠在行Pristane皮内注射免疫至少一周之后,按照每日200mJ/cm2剂量UVB照射,连续UVB照射5天,造模小鼠均存在持续性瘢痕样红斑;此后予小鼠每日100mJ/cm2剂量UVB照射连续2周,以维持皮损形态,即建立稳定的模型。
9.权利要求1-7任一项的方法制备得到的皮肤型红斑狼疮小鼠模型在探讨CLE疾病进展的发生机制以及靶向狼疮皮损的药物研发中的应用。
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