RS55472B1 - Životinje sa humanizovanim il-15 - Google Patents

Životinje sa humanizovanim il-15

Info

Publication number
RS55472B1
RS55472B1 RS20161140A RSP20161140A RS55472B1 RS 55472 B1 RS55472 B1 RS 55472B1 RS 20161140 A RS20161140 A RS 20161140A RS P20161140 A RSP20161140 A RS P20161140A RS 55472 B1 RS55472 B1 RS 55472B1
Authority
RS
Serbia
Prior art keywords
human
mouse
humanized
gene
protein
Prior art date
Application number
RS20161140A
Other languages
English (en)
Inventor
Jose F Rojas
Ka-Man Venus Lai
Andrew J Murphy
Original Assignee
Regeneron Pharma
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Regeneron Pharma filed Critical Regeneron Pharma
Publication of RS55472B1 publication Critical patent/RS55472B1/sr

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
    • A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Knock-in vertebrates, e.g. humanised vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5443—IL-15
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
    • C12N2015/8527—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic for producing animal models, e.g. for tests or diseases

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Description

OBLASTPRONALASKA
[0001] Ne-humane životinje koje u svojoj germinativnoj liniji sadrže endogeni ne-humani IL-15 lokus. Ne-humane životinje koje u svojoj germinativnoj liniji sadrže humanizovanu IL-15 enkodirajuću sekvencu pod kontrolom endogenih ne-humanih regulatornih elemenata. Ne-humane životinje( npr., sisah kao što su glodah,na primer, miševi, pacovi i hrčci) koje imaju neku genetsku modifikaciju uključujući zamenu, na nekom endogenom lokusu, ne-humane IL-15 genske sekvence humanom ili humanizovanom IL-15 genskom sekvencom. Glodari i druge ne-humane životinje koje eksprimuju humani ili humanizovani IL-15 sa nekog endogeno modifikovanog ne-humanog IL-15 lokusa. Ne-humane životinje koje eksprimuju humani ili humanizovani IL-15 pod kontrolom nekog ne-humanog IL-15 promotera i/ili regulatornih sekvenci.
STANJE TEHNIKE
[0002] Transgeni miševi sa nasumično ubačenim transgenima koji sadrže sekvencu humanog IL-15 poznati su u struci. Međutim, transgeni miševi koji eksprimuju humani IL-15 iz nasumično integrisanih transgena nisu optimalni ni u kom pogledu Na primer, većina miševa transgenih u pogledu humanog IL-15 ispoljavaju nenormalne količine i/ili odnose određenih ćelija uključujući limfocite (npr., T-ćelije), što je verovatno usled disregulacije funkcije imunih ćelija. Takvi miševi imaju više patologija, verovatno zbog disregulacije transgenog IL-15. Ova disregulacija može biti posledica sekvence IL-15 koja je udaljena od endogenog IL-15 lokusa.
[0003] U stanju tehnike i dalje ostaje potreba za ne-htimanim životinjama koje uključuju IL-15 enkodirajuće sekvence, pri čemu se humane IL-15 enkodirajuće sekvence nalaze na nekom endogenom ne-humanom IL-15 lokusu, odnosno, nalaze se pod kontrolom endogenih ne-humanih IL-15 elemenata (npr. posle, odnosno, pre nekodirajućih regija). U struci postoji potreba i za ne-humanim životinjama koje eksprimuju humani IL-15. pri čemu ne-humanim životinjama nedostaje značajna abnormalnost populacije limfocita. npr,, populacije T-ćelija. U struci još postoji potreba za ne-humanim životinjama koje eksprimuju humani ili humanizovani IL-15 i kojima nedostaje jedna ili više patologija koje ispoljavaju ne-humane životinje koje su transgene u pogledu humanog IL-15. Ohta et al. (J Immunol, 169: pp 460-468 (2002) opisuju Th1 tip CD8+NK1.1 + T-ćelije koji zavisi od IL-15 i indukovan je aktivacijom i rezistentan na ćelijsku smrt kod razvijanja upale creva. Marks-Konczalik et al. (PNAS 97: pp 11445-11450
(2000)) kažu da kod IL-15 transgenih miševa dolazi do inhibicije IL-2 indukovane i aktivacijom indukovane ćelijske smrti. Patent WO01/58914 opisuje haplotipove IL-5 gena. Fehringer et al.
(Blood Cells Molecules and Diseases, 27:pp 223-230 (2001) opisuju fatalnu leukemiju kod interleukin-15 transgenih miševa. VVO2003/063556 opisuje humanizovani IL-6 i IL-6 receptor. Devoy et al. (Nat. Rev. Genetics, 13: pp 14-20 (2012) opisuju genomski humanizovanog miša. Steel et al.JTrends in Pharmacological Sciences 33; pp 35-41 (2011) opisuju biologiju IL-15 i terapijske implikacije kod karcinoma.
KRATAK OPIS PRONALASKA
[0004] Ovim pronalaskom se dobija genetski modiftkovam miš čiji genom sadrži zamenu, na endogenom mišjem IL-15 lokusu, jednog fragmenta mišjeg genoma koji kodira IL-15 polipeptid odraslog miša humanim genomskim segmentom koji kodira IL-15 polipeptid odraslog čoveka, pri čemu egzoni u humanom IL-15 u pomenutom humanom genomskom segmentu sadrže protein kodirajuće egzone 3, 4, 5 i 6 humanog IL-15 za formiranje IL-15 gena, pri čemu je taj humanizovani IL-15 gen pod kontrolom svih endogenih mišjih regulatornih elemenata posle IL-15 na tom endogenom mišjem IL-15 lokusu.
[0005] Ovim pronalaskom se još obezbeđuje i postupak dobijanja genetski modifikovanog miša promenom genoma miša tako što se mišji genomski fragment koji kodira zreli IL-15 polipeptid na endogenom mišjem IL-15 lokusu zamenjuje humanim genomskim segmentom koji kodira IL-15 polipeptid odraslog čoveka, pri čemu se egzoni humanog IL-15 u pomenutom humanom genomskom segmentu sastoje od humanih IL-15 protein kodirajućih egzona 3,4,5 i 6, čime se dobija humanizovani IL-15 gen. pri čemu se IL-15 egzoni numerišu prvim tako da prvi kodirajući egzon nosi obeležje 1 i pri čemu je taj humanizovani IL-15 gen pod kontrolom svih endogenih mišjih regulatornih elemenata pre IL-15 na endogenom mišjem IL-15 lokusu.
[0006] Ovim pronalaskom se još dobija genetski modifikovani miš čiji genom sadrži humanizovani IL-15 gen, pri čemu pomenuti humanizovani IL-15 gen sadrži mišje IL-15 protein kodirajuće egzone 1 i 2 i humani genomski segment pri čemu se humani IL-15 egzoni u pomenutom humanom genomskom segmentu sastoje od humanih IL-15 protein kodirajućih egzona 3,4,5, i 6, pri čemu su ti IL-15 egzoni numerisani tako da je prvi kodirajući egzon označen brojem 1 i pri čemu je taj humanizovani IL-15 gen pod kontrolom svih mišjih regulatornih elemenata pre IL-15 sa endogenog mišjeg IL-15 lokusa, a pomenuti humanizovani IL-15 gen enkodira protein koji sadrži IL-15 polipeptidnu sekvencu odraslog čoveka.
[0007] Ovim pronalaskom se još obezbeđuje postupak dobijanja genetski modifikovanog miša time što se u genom miša unosi humanizovani IL-15 gen koji sadrži mišje IL-15 protein kodirajuće egzone 1 i 2 i humani genomski segment pri čemu se humani IL-15 egzoni u pomenutom humanom genomskom segmentu sastoje od humanih IL-15 egzona 3.4,5 i 6, pri čemu su ti IL-15 egzoni numerisani tako da je prvi kodirajući egzon označen brojem 1 i pri čemu je taj humanizovani IL-15 gen pođ kontrolom svih mišjih regulatornih elemenata pre IL-15 sa endogenog mišjeg IL-15 lokusa, a pomenuti humanizovani IL-15 gen enkodira protein koji sadrži IL-15 polipeptidnu sekvencu odraslog čoveka.
[0008] Opisuju se genetski modifikovani ne-humani organizmi koji sadrže IL-15 lokus. Opisuju se ne-humani organizmi koji sadrže humanizovani IL-15 gen, pri čemu je taj humanizovani IL-15 gen pod kontrolom jednog ili više endogenih ne-humanih regulatornih elemenata. Opisuju se ne-humani organizmi koji sadrže endogeni humanizovani IL-15 lokus sposoban da se provuče kroz germinativne linije tih organizama. Opisuju se ne-humane životinje, npr., sisari (npr., glodari, npr., miševi ili pacovi) koji eksprimuju humani IL-15 sa izmenjenog endogenog IL-15 lokusa, pri čemu je eksprimovani IL-15 potpuno Ni delimično ljudski
[0009] Opisuju se genetski modifikovane ne-humane životinje, embrioni, ćelije, tkiva i nukleinske kiseline koji sadrže humanu IL-15 genomsku sekvencu koja se reguliše pod kontrolom ne-humanog IL-15. Te ne-humane životinje eksprimuju humanizovani IL-15 protein ili potpuni humani IL-15 protein (npr., potpuni IL-15 protein odraslog čoveka), a ne ispoljavaju jednu ili više patologija transgenog humanog IL-15 ne-humanih životinja poznatih u ovoj stručnoj oblasti. Te ne-humane životinje mogu biti sisari, npr., glodari. npr , miševi, pacovi, hrčci itd. Taj sisar može biti glodar: glodar može biti miš ili pacov.
[0010] Opisuju se genetski modifikovane ne-humane životinje, embrioni, ćelije, tkiva, kao i nukleinske kiseline, koji sadrže genomsku sekvencu humanog IL-15 na endogenom ne-humanom IL-15 lokusu. Te ne-humane životinje eksprimuju humanizovani IL-15 protein ili potpuno humani IL-15 protein (npr., potpuno humani IL-15 protein odraslog čoveka) sa modifikovanog endogenog ne-humanog lokusa koji reguliše jedna ili više endogenih ne-humanih regulatornih sekvenci tog modifikovanog endogenog IL-15 lokusa, a ne ispoljavaju jednu ili više patologija transgenih humanih IL-15 ne-humanih životinja poznatih u ovoj stručnoj oblasti. Te ne-humane životinje mogu biti sisari. npr., glodari, npr, miševi, pacovi, hrčci itd. Sisar može biti glodar; glodar može biti miš ili pacov.
[0011] Ne-humane životinje mogu da sadrže modifikovani IL-15 lokus u genomu ne-humane životinje, tako da taj modifikovani IL-15 lokus može da se provuče kroz germmativnu liniju, pri čemu taj modifikovani endogeni IL-15 lokus uključuje humanizaciju bar jednog kodirajućeg dela zrelog proteina tog endogenog IL-15 lokusa. Te ne-humane životinje mogu biti sisari Ti sisari mogu biti glodari, a oni su heterozigotni ili homozigotni u pogledu tog modifikovanog IL-15 lokusa. Ti glodari mogu biti miševi i pacovi. Ti miševi i pacovi mogu biti homozigotni u pogledu modifikovanog IL-15 lokusa i ne mogu ekspnrnovati endogeni isključivo mišji ili isključivo pacovski protein, a ti miševi i pacovi mogu eksprimovati zreli humani IL-15 protein.
[0012] Opisuje se ne-humana životinja koja ima prvi endogeni divlji IL-15 alel i humanizovani drugi endogeni IL-15 alel.
[0013] Opisuje se ne-humana životinja kojoj nedostaje prvi endogeni IL-15 alel i humanizovani drugi endogeni IL-15 alel
[0014] Opisuje se ne-humana životinja kojoj nedostaje funkcionalni endogeni IL-15 alel i koja sadrži najmanje jednu kopiju humanizovanog IL-15 alela pod kontrolom endogenih ne-humanih regulatornih elemenata Ta bar jedna kopija humanizovanog IL-15 alela može biti na endogenom IL-15 lokusu
[0015] Humanizacija se može odvijati na jednom ili više egzona i/ili introna na endogenom ne-humanom IL-15 lokusu Opisuju se ne-humane životinje koje imaju modifikovani IL-15 lokus, pri čemu se jedna ili obe endogena ne-humana 5 -netranslatirana regija i endogena ne-humana 3'-netranslantirana regija zadržavaju u toj modifikovanoj ne-humanoj životinji.
[0016] Humanizacija endogenog ne-humanog IL-15 lokusa može se odvijati kod kodirajuće regije (ili njenog fragmenta) koja je genomski fragment humanog IL-15 lokusa koji sadrži najmanje jedan humani IL-15 protein kodirajući egzon
[0017] Humanizacija endogenog ne-humanog IL-15 lokusa može se odvijati kod kodirajuće regije koja je genomski fragment humanog IL-15 lokusa koji sadrži svaki humani IL-15 protein kodirajući egzon, ali ne sadrži ne-humani IL-15 protein kodirajući egzon.
[0018] IL-15 lokus koji sadrži humani genomski fragment može da za posledicu ima ekspresiju IL-15 proteina koji je u potpunosti humani kada sazri. Humanizacija endogenog ne-humanog IL-15 lokusa može se vršiti tako što cDNK enkodira humani IL-15 protein tako da je, nakon obrade u ne-humanoj životinji, taj zreo IL-15 protein koga proizvodi humanizovani lokus u potpunosti ljudski.
[0019] Opisuje se genetski modifikovana ne-humana životinja koja sadrži endogeni IL-15 lokus koji je humanizovan u celosti ili jednom delu, pri čemu taj humanizovani IL-15 lokus sadrži humanizovani IL-15 kodirajući gen koji je pod kontrolom endogenih ne-humanih regulatornih elemenata. Ti endogeni ne-humani regulatorni elementi mogu da sadrže sve endogene IL-15 regulatorne elemente posle (u pogledu transkripcionog pravca IL-15 gena) prve protein kodirajuće regije ili egzona humanizovanog IL-15 gena Taj humanizovani IL-15 kodirajući gen može da sadrži humani 3'UTR.
[0020] Opisuje se genetski modifikovani glodar kod kojeg na endogenom glodarskom IL-15 lokusu postoji zamena endogene glodarske IL-15 genomske sekvence humanom IL-15 genomskom sekvencom. Ova genetska modifikacija može biti u germinativnoj liniji ne-humane životinje.
[0021] Taj genetski modifikovani glodar može da sadrži prvu glodarsku regulatornu sekvencu pre (u pogledu transkripcionog pravca IL-15 gena) humane IL-15 genomske sekvence i drugu glodarsku regulatornu sekvencu posle humane IL-15 genomske sekvence. Ta prva glodarska regulatorna sekvenca može da sadrži glodarski promoter i/ili pojačivač, a druga glodarska regulatorna sekvenca sadrži 3'-UTR.
[0022] Opisuje se genetski modifikovana ne-humana životinja koja ekspnmuje humani ili humanizovani IL-15 protein.
[0023] Opisuje se genetski modifikovani miš kod kojeg na endogenom mišjem IL-15 lokusu postoji zamena endogene mišje IL-15 genomske sekvence (ili njenog fragmenta) humanom IL-15 genomskom sekvencom (ili njenog fragmenta) tako da se dobije modifikovani lokus, pri čemu ta humana IL-15 genomska sekvenca sadrži najmanje jedan protein kodirajući egzon
[0024] Ta zamena može da sadrži humani genomski fragment koji sadrži najmanje dva protein kodirajuća egzona humanog IL-15. Ova zamena može da sadrži humani genomski fragment koji sadrži najmanje tri protein kodirajuća egzona humanog IL-15. Zamena može da sadrži humani genomski fragment koji sadrži najmanje četiri protein kodirajuća egzona humanog IL-15. Zamena može da sadrži humani genomski fragment koji sadrži protein kodirajuće egzone 3,4,5 i 6 humanog IL-15. Zamena može da sadrži manje od celokupnog broja humanih IL-15 egzona, pri čemu se ti humani egzoni u zameni sastoje od četiri protein kodirajuća egzona humanog IL-15 koji su najudaljeniji (u pogledu pravca transkripcije IL-15) Ta zamena se može suštinski sastojati od humanog genomskog fragmenta koji sadrži ne više od četiri protein kodirajuća egzona humanog IL-15. Ta zamena se još može suštinski sastojati od humane intronske sekvence pre 5' najhumanijeg egzona, a humana neproteinska kodirajuća sekvenca posle humanog stop kodona i posle humanog 3'UTR.
[0025] Opisuje se genetski modifikovani miš koji sadrži humanizovani IL-15 lokus, pri čemu taj humanizovani IL-15 lokus sadrži neprotein kodirajuće mišje egzone, pri čemu se svaki (zreo) protein kodirajući mišji egzon zamenjuje (zrelim) protein kodirajućim humanim egzonima. Taj humanizovani IL-15 lokus može da sadrži zamenu mišjeg genomskog fragmenta koji enkodira zrele (tj., ne pre-proteinske) mišje IL-15 proteinske sekvence humanim genomskim fragmentom koji enkodira zrele (tj., ne-preproteinske) humane IL-15 proteinske sekvence
[0026] Opisuje se genetski modifikovani miš koji sadrži sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%. 98% ili 99% identična ili potpuno identična SEQ ID NO:5.
[0027] Opisuje se genetski modifikovani miš koji sadrži sekvencu koja je najmanje 95%, 96%, 97%, 98% ili 99% identična ili potpuno identična SEG ID NO:5, pri čemu tom mišu nedostaju endogeni sekvenca enkodirajući egzoni 3 do 6 mišjeg IL-15 proteina, kao što je ovde opisano; taj miš takođe ima sekvencu nukleinske kiseline na endogenom mišjem IL-15 lokusu pri čemu ta sekvenca nukleinske kiseline enkodira humane IL-15 egzone 3,4,5, i 6 kao što je ovde opisano.
[0028] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji ekspnmuje humani ili humanizovani IL-15 protein sa endogenog mišjeg IL-15 lokusa koji je modifikovan da sadrži najmanje jedan humani IL-15 egzon koji enkodira amino kiseline u zreli humani IL-15 protein U jednoj realizaciji, endogeni glodarski IL-15 lokus sadrži najmanje dva humana IL-15 egzona koji enkodiraju amino kiseline u zrelom humanom IL-15 proteinu. Taj endogeni glodarski IL-15 lokus može da sadrži najmanje tri humana IL-15 egzona koji enkodiraju amino kiseline u zrelom humanom IL-15 proteinu. Taj endogeni glodarski IL-15 lokus može da sadrži najmanje četiri humana IL-15 egzona koji enkodiraju amino kiseline u zrelom humanom IL-15 proteinu. Taj endogeni glodarski IL-15 lokus sadrži humane IL-15 egzone 3,4,5. i 6 koji enkodiraju amino kiseline u zrelom humanom IL-15 proteinu. Taj endogeni glodarski IL-15 lokus može da sadrži najmanje celokupnu humanu sekvencu nukleinske kiseline koja enkodira amino kiseline u zrelom humanom IL-15 proteinu.
[0029] Humanizacija može da sadrži humani IL-15 3 UTR Glodarski lokus može da sadrži najmanje jedan egzon koji ne enkodira amino kiseline zrelog IL-15 proteina ili najmanje jedan egzon koji sadrži nukleotidnu sekvencu koja ne enkodira amino kiseline zrelog IL-15 proteina. Glodarski lokus može da sadrži najmanje dva egzona koji ne enkodiraju amino kiseline zrelog IL-15 proteina. Glodarski lokus može da sadrži najmanje tri egzona koji ne enkodiraju amino kiseline zrelog IL-15 proteina. Glodarski lokus može da sadrži četiri egzona koji ne enkodiraju amino kiseline zrelog IL-15 proteina.
[0030] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humanizovani IL-15 protein, pri čemu se populacija limfocita tog glodara karakteriše svojom populacijom T-ćelija koja je po brojnosti slična populaciji T-ćelija kod miša divljeg tipa iste starosti Taj modifikovani glodar se može karakterisati populacijom zrelih T-ćelija koja je po brojnosti slična populaciji T-ćelija kod miša divljeg tipa iste starosti.
[0031] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humanizovani IL-15 protein, pri čemu se populacija limfocita tog glodara karakteriše svojom populacijom T-ćelija koja je po brojnosti slična populaciji T-ćelija kod miša divljeg tipa iste starosti Taj modifikovani glodar se može karakterisati populacijom zrelih T-ćelija koja je po brojnosti slična populaciji T-ćelija kod miša divljeg tipa iste starosti. Taj modifikovani glodar se može karakterisati populacijom perifernih T-ćelija koja je po brojnosti slična populaciji perifernih T-ćelija kod miša divljeg tipa iste starosti. Taj zreli humanizovani IL-15 protein može biti identičan zrelom humanom IL-15 proteinu.
[0032] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji ekspnmuje humanizovani IL-15 protein, pri čemu se populacija limfocita tog glodara karakteriše svojom populacijom T-ćelija čiji je CD4:CD8 odnos skoro isti kao odnos CD4:CD8 u populaciji T-ćelija miša divljeg tipa iste starosti. Taj humanizovani IL-15 protein može biti identičan humanom IL-15 proteinu.
[0033] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji ekspnmuje humanizovani IL-15 protein, pri čemu se populacija limfocita tog glodara karakteriše prirodnom populacijom ćelija ubica (NK) koja je otprilike iste veličine kao populacija NK ćelija miša divljeg tipa iste starosti. Taj humanizovani IL-15 protein može biti identičan humanom IL-15 proteinu
[0034] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-15 protein, pri čemu se populacija limfocita tog glodara karakteriše populacijom T-ćelija i populacijom NK ćelija od kojih je svaka otprilike iste veličine kao populacija T-ćelija i populacija NK ćelija miša divljeg tipa iste starosti
[0035] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humanizovani IL-15 protein, pri čemu taj glodar ne dobija spontanu upalu creva Taj glodar ne mora da ispolji veću sklonost ka dobijanju upale creva od glodara divljeg tipa iste starosti
[0036] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humanizovani IL-15 protein, pri čemu taj glodar ne dobija spontanu upalu creva u području duodenuma i jejunuma. Taj glodar ne mora da ispolji veću sklonost ka dobijanju upale creva u području duodenuma i jejunuma od glodara divljeg tipa iste starosti.
[0037] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humanizovani IL-15 protein, pri čemu taj glodar ne pokazuje destrukciju intestinalnog epitela u većoj men nego glodar divljeg tipa iste starosti.
[0038] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humanizovani IL-15 protein, pri čemu taj glodar ne ispoljava bolest celijakije u većem stepenu od glodara divljeg tipa iste starosti.
[0039] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humanizovani IL-15 protein, pri čemu taj glodar ne ispoljava veću rezistenciju na adipozitet nastao ishranom i ne ispoljava veću osetljivost na insulm od glodara divljeg tipa iste starosti
[0040] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humanizovani IL-15 protein, pri čemu taj glodar koji ima infekciju usled delovanja patogena nije osetljiviji na letalnu povredu jetre izazvanu lipopolisaharidom od glodara divljeg tipa iste starosti,
[0041] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humanizovani IL-15 protein, pri čemu taj glodar ne razvija psorijatične promene u većoj men i učestalije od glodara divljeg tipa iste starosti.
[0042] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humanizovani IL-15 protein, pri čemu taj glodar ne razvija artritis u većoj meri i učestalije od glodara divljeg tipa iste starosti.
[0043] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humanizovani IL-15 protein, pri čemu taj glodar ne razvija infiltraciju limfocita u zglobovima u većem stepenu ili učestalije od glodara divljeg tipa iste starosti.
[0044] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humanizovani IL-15 protein, pri čemu taj glodar ne razvija inflamatorni sinovitis u većoj meri od glodara divljeg tipa iste starosti.
[0045] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-15 protein, pri čemu taj glodar ne razvija jednu ili više patologija u većoj meri i učestalije od glodara divljeg tipa iste starosti, pri čemu ta jedna ili više patologija pripada grupi koja obuhvata artritis, limfocitnu infiltraciju zglobova, zapaljenski sinovitis, psorijatične promene, letalnu povredu jetre izazvanu patogen srodnim lipopolisaharidom, rezistenciju na insulin, rezistenciju na adipozitet izazvan hranom, spontanu upalu creva. spontanu upalu u predelu duodenuma i jejunuma, destrukciju crevnog epitela. celijakiju. kao i neku kombinaciju ovih oboljenja.
[0046] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-15 protein, pri čemu taj glodar ne razvija dve ili više patologija u većoj meri i učestalije od glodara divljeg tipa iste starosti, pri čemu dve ili više patologija pripadaju grupi koja obuhvata artritis, limfocitnu infiltraciju zglobova, zapaljenski sinovitis. psorijatične promene. letalnu povredu jetre izazvanu patogen srodnim lipopolisaharidom, rezistenciju na insulin, rezistenciju na adipozitet izazvan hranom, spontanu upalu creva, spontanu upalu u predelu duodenuma i jejunuma, destrukciju crevnog epitela, kao i celijakiju.
[0047] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-15 protein, pri čemu taj glodar ne razvija tri ili više patologija u većoj meri i učestalije od glodara divljeg tipa iste starosti, pri čemu tri ili više patologija pripadaju grupi koja obuhvata artritis, limfocitnu infiltraciju zglobova, zapaljenski sinovitis, psorijatične promene, letalnu povredu jetre izazvanu patogen srodnim lipopolisaharidom, rezistenciju na insulin, rezistenciju na adipozitet izazvan hranom, spontanu upalu creva. spontanu upalu u predelu duodenuma i jejunuma, destrukciju crevnog epitela, kao i celijakiju.
[0048] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humani ih humanizovani IL-15 protein, pri čemu taj glodar ne razvija četiri ili više patologija u većoj meri i učestalije od glodara divljeg tipa iste starosti, pri čemu četiri ili više patologija pripadaju grupi koja obuhvata artritis, limfocitnu infiltraciju zglobova, zapaljenski sinovitis. psorijatične promene, letalnu povredu jetre izazvanu patogen srodnim lipopolisaharidom, rezistenciju na insulin, rezistenciju na adipozitet izazvan hranom, spontanu upalu creva, spontanu upalu u predelu duodenuma i jejunuma, destrukciju crevnog epitela, kao i celijakiju.
[0049] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji eksprimuje humani ili humanizovani IL-15 protein, pri čemu taj glodar ne razvija pet ili više patologija u većoj meri i učestalije od glodara divljeg tipa iste starosti, pri čemu tih pet ili više patologija pripadaju grupi koja obuhvata artritis, limfocitnu infiltraciju zglobova, zapaljenski sinovitis. psorijatične promene, letalnu povredu jetre izazvanu patogen srodnim lipopolisaharidom, rezistenciju na insulin, rezistenciju na adipozitet izazvan hranom, spontanu upalu creva, spontanu upalu u predelu duodenuma i jejunuma, destrukciju crevnog epitela, kao i celijakiju
[0050] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji ekspnmuje humani ili humanizovani IL-15 protein, pri čemu taj glodar ne razvija šest ili više patologija u većoj men i učestalije od glodara divljeg tipa iste starosti, pri čemu tih šest ili više patologija pripadaju grupi koja obuhvata artritis, limfocitnu infiltraciju zglobova, zapaljenski sinovitis, psorijatične promene, letalnu povredu jetre izazvanu patogen srodnim lipopolisaharidom rezistenciju na insulin, rezistenciju na adipozitet izazvan hranom, spontanu upalu creva. spontanu upalu u predelu duodenuma i jejunuma, destrukciju crevnog epitela, kao i celijakiju.
[0051] Opisuje se genetski modifikovana ne-humana životinja koja sadrži humanizaciju endogenog IL-15 lokusa, pri čemu ta životinja eksprimuje, delimično ili potpuno humani zreli IL-15 protein i pri čemu se taj delimično ili potpuno humani zreli IL-15 protein eksprimuje u sličnim nivoima i u istim tkivima kao endogeni IL-15 protein kod životinje divljeg tipa iste starosti.
[0052] Opisuje se veliki ciljajući vektor (LTVEC) koji sadrži homologne krake ka endogenom ne-humanom IL-15 lokusu, pri čemu LTVEC sadrži, između pomenutih homolognih kraka, kontinualni genomski fragment koji sadrži protein kodirajuće egzone humanog IL-15 gena. Taj kontinualni humani genomski fragment može da sadrži ne-protein kodirajuće egzone humanog IL-15 lokusa. Taj kontinualni humani genomski fragment može još da sadrži humani 3'UTR nekog IL-15 gena.
[0053] Opisuje se koncept nukleinske kiseline (npr. DNK) koji sadrži od 5' do 3' u pogledu pravca transkripcije, sekvencu nukleinske kiseline homolognu mišjoj IL-15 5' nekodirajućoj sekvenci, humani genomski fragment koji sadrži humane IL-15 protein enkodirajuće egzone, ali ne sadrži humanu regulatornu sekvencu pre humane IL-15 protein enkodirajuće sekvence. kao i sekvencu nukleinske kiseline koja je homologna mišjoj IL-15 3' nekodirajućoj sekvenci. Taj humani genomski fragment može još da sadrži humani IL-15 3'UTR
[0054] Opisuje se koncept nukleinske kiseline (npr DNK) koji sadrži od 5' do 3' u pogledu pravca transkripcije, sekvencu nukleinske kiseline koja sadrži regiju homolognu mišjoj IL-15 5' sekvenci gena pre prvog mišjeg IL-15 protein kodirajućeg egzona, humani genomski fragment koji enkodira humani IL-15 protein, ali ne sadrži humanu regulatornu sekvencu pre sekvence koja enkodira humani IL-15 protein, kao i sekvencu nukleinske kiseline koja je homologna mišjoj IL-15 3' nekodirajućoj sekvenci Taj humani genomski fragment može još da sadrži humani IL-15 3'UTR.
[0055] Opisuje se genetski modifikovana ne-humana ćelija, pri čemu ta ne-humana ćelija sadrži zamenu, na nekom endogenom ne-humanom IL-15 lokusu, genske sekvence koja enkodira ne-humani IL-15 humanom genomskom sekvencom koja enkodira humani IL-15.
[0056] Ta humana genomska sekvenca može da sadrži kontinualnu sekvencu humane nukleinske kiseline koja obuhvata sve protein kodirajuće egzone tog humanog IL-15 gena.
[0057] Genetski modifikovani glodar može da sadrži ne-humani IL-15 promoter na endogenom ne-humanom IL-15 lokusu.
[0058] Genetski modifikovana ne-humana životinja može da sadrži sve glodarske neprotein kodirajuće egzone i regulatorne regione pre prvog protein kodirajućeg egzona tog glodarskog IL-15 gena.
[0059] Ćelija može biti pluripotentna ćelija, indukovana pluripotentna ćelija, totipotentna ćelija, neka ES ćelija, somatska ćelija, kao i jajna ćelija.
[0060] Ta ćelija može da eksprimuje humani IL-15 protein
[0061] Ta ne-humana životinja može biti sisar Sisar može biti neki glodar. Taj glodar može biti miš ili pacov.
[0062] Opisuje se ne-humani embrion, pri čemu taj embrion sadrži najmanje jednu ne-humanu donorsku ćeliju (npr., ES ćeliju, pluripotentnu ćeliju totipotentnu ćeliju td.) koja sadrži zamenu endogene ne-humane IL-15 enkodirajuće sekvence nukleinske kiseline humanom IL-15 enkodirajućom sekvencom nukleinske kiseline na endogenom ne-humanom IL-15 lokusu. Ta donorska ćelija može biti ne-humana ES ćelija, a ovaj embrion, koji je pre-morula. morula ili blastocit, je embrion ne-humane životinje domaćina
[0063] Taj ne-humani embrion može biti embrion pacova i najmanje jedna ne-humana donorska ćelija je ćelija pacova. Ta ne-humana ES ćelija može biti ES ćelija pacova, a embrion domaćin je embrion pacova
[0064] Taj ne-humani embrion može biti embrion miša i najmanje jedna ne-humana donorska ćelija je ćelija miša. Ta ne-humana ES ćelija može biti ES ćelija miša, a embrion domaćin je embrion miša.
[0065] Opisuje se tkivo glodara koje sadrži humanizovani IL-15 gen na endogenom glodarskom IL-15 lokusu. To tkivo može biti epitelno tkivo, kožno tkivo, kao i mišićno tkivo.
[0066] Opisuje se genetski modifikovani glodar koji sadrži sekvencu nukleinske kiseline (npr., DNK) koja enkodira humani IL-15 protein, pri čemu glodar ne eksprimuje glodarski IL-15 i pri čemu glodar ima populaciju NK ćelija koja je skoro iste veličine kao populacija NK ćelija glodara divljeg tipa. Taj glodar može biti pacov Taj glodar može biti miš
[0067] Taj glodar može da ima populaciju perifernih T-ćelija koja je skoro iste veličine kao populacija T-ćelija glodara divljeg tipa iste starosti
[0068] Opisuje se postupak dobijanja ne-humane životinje koja ispoljava humani ili humanizovani IL-15 protein, koji se sastoji iz genetske modifikacije gore opisane ne-humane životinje radi formiranja sekvence nukleinske kiseline u toj ne-humanoj životinji koja sadrži sekvencu nukleinske kiseline (npr., DNK) koja enkodira humani ili humanizovani IL-15 protein, pri čemu je ta sekvenca nukleinske kiseline pod kontrolom endogenih ne-humanih regulatornih elemenata pre i posle nje.
[0069] Ta ne-humana životinja može se genetski izmeniti zamenom endogene IL-15 genomske sekvence (ili njenog dela), na endogenom IL-15 lokusu. humanom IL-15 genomskom sekvencom (ili njenim delom) da se dobije izrnenjeni lokus, pri čemu ta humana IL-15 genomska sekvenca sadrži najmanje jedan humani protein kodirajući egzon. Ta zamena može da sadrži humani genomski fragment koji sadrži najmanje dva protein kodirajuća egzona humanog IL-15. Ta zamena može da sadrži humani genomski fragment koji sadrži najmanje tri protein kodirajuća egzona humanog IL-15. Ta zamena može da sadrži humani genomski fragment koji sadrži najmanje četiri protein kodirajuća egzona humanog IL-15. U konkretnom predmetu, ta zamena sadrži humani genomski fragment koji sadrži protein kodirajuće egzone 3,4,5 i 6 humanog IL-15. Ta zamena još može da sadrži humanu neprotein kodirajuću sekvencu pre humanog stop kodona (npr., humani 3'UTR),
[0070] Ova ne-humana životinja može se proizvesti od pluripotentne ili totipotentne ćelije (npr , ES ćelije). Ta ne-humana životinja može se proizvesti pnmenom faze nuklearne injekcije, pri čemu se konstrukt nukleinske kiseline koji sadrži humanizovani IL-15 gen (neobavezno sa endogenim ne-humanim regulatornim sekvencama pre i posle njega) unosi pronuklearnom injekcijom. Taj konstrukt nukleinske kiseline može da sadrži humani genomski fragment koji sadrži protein kodirajuće egzone 3,4.5 i 5 humanog IL-15. Taj konstrukt nukleinske kiseline može još da sadrži humanu neprotein kodirajuću sekvencu pre humanog stop kodona (npr., humani 3' UTR). Ova ne-humana životinja može se proizvesti primenom ne-humanog fibroblasta koji je genetski izmenjen nekim humanim ili humanizovanim IL-15 genom (neobavezno) pre i/ili posle ne-humanih IL-15 regulatornih elemenata
[0071] Opisuje se postupak identifikacije agensa koji je antagonist humanom IL-15 koji sadrži fazu primene agensa kod genetski modifikovanog glodara, kao što je ovde opisano, radi određivanja dejstva tog agensa na humani IL-15 posredovanu funkciju kod tog glodara, kao i identifikacije tog agensa kao IL-15 antagonista ako se suprotstavlja funkciji humanog IL-15 kod genetski modifikovanog glodara
[0072] Taj agens može da sadrži neki imunoglobulin varijabilni domen koji vezuje IL-15. Ovaj agens konkretno može da veže humani IL-15, ali ne i glodarski IL-15. Taj agens može biti antitelo.
[0073] Opisuje se postupak određivanja da li neki agens smanjuje IL-15-posredovani razvoj limfocita, koji sadrži korak primene nekog IL-15 antagonista ovde opisanom genetski modifikovanom glodaru tokom nekog vremena i pri tome mereći broj limfocita tog glodara jednom ili više puta nakon primene i određivanja da li IL-15 antagonist smanjuje populaciju limfocita.
[0074] Opisuje se postupak određivanja da li neki agens smanjuje IL-15-posredovanu infiltraciju limfocita u tkivo ili zglob, koji sadrži korak primene nekog IL-15 antagonista ovde opisanom genetski modifikovanom glodaru tokom nekog vremena i pri tome mereći infiltraciju limfocita u tkivo ili zglob jednom ili više puta nakon primene i određivanja da li IL-15 antagonist smanjuje infiltraciju limfocita u tkivo ili zglob.
[0075] Opisuje se postupak određivanja da li neki agens smanjuje IL-15-posredovanu progresiju artritisa, koji sadrži korak primene nekog IL-15 antagonista ovde opisanom genetski modifikovanom glodaru tokom nekog vremena, i dalje sadrži indukovani artritis pri tome mereći progresiju artritisa i određivanja da li IL-15 antagonist utiče na progresiju artritisa kod glodara.
[0076] Ako nije drugačije navedeno ili ako nije očigledno iz konteksta, moguće je kombinovati dva ili više varijantnih rešenja i/ili izvođenja ovog pronalaska.
KRATAK OPIS SLIKA
[0077] SLIKA 1 opisuje (ne u punoj veličini) shemu IL-15 genskog lokusa miša divljeg tipa (na vrhu) i humanizovanog endogenog IL-15 lokusa miša (na dnu). Otvoreni simboli označavaju humanu sekvencu; zatvoreni simboli označavaju sekvencu miša; tačkasti simboli označavaju netranslantirane regione. Donji (sa leve strane slike) nekodirajući egzoni mišjeg IL-15 gena nisu prikazani (i nisu bili humanizovani). Donji konstrukt opisuje izvođenje pronalaska kao humanizovanog IL-15 gena koji sadrži humanizovani 3'UTR (tačkasto) i pokretnu kasetu za selekciju leka, koji se neobavezno uklanja kod humanizovane životinje. SLIKA 2 je sekvenca nukleinske kiseline (SEQ ID NO:1) koja opisuje donji (uzimajući u obzir pravac transkripcije IL-15 gena) spoj mišje sekvence i humane sekvence; prikazana sekvenca počinje sekvencu miša velikim slovima nakon čega sledi Asisl mesto restrikcije malim slovima nakon čega sledi sekvenca nukleinske kiseline humanog IL-15 velikim slovima. Elipse ukazuju na to da se sekvenca pruža pre i posle prikazane sekvence. SLIKA 3 je izvođenje pronalaska sekvence nukleinske kiseline (SEQ ID NO:2) koja označava donju sekvencu kodiranja humanog IL-15 i nekodirajuću sekvencu velikim slovima (humani 3'UTR podvučeno) nakon čega sledi Xhol mesto malim slovima nakon čega sledi lox mesto (velikim slovima, podvučeno) nakon čega sledi donja neo selekciona kaseta (velikim slovima), koja se prostire 2,6 kb nadole.
SLIKA 4 je sekvenca nukleinske kiseline (SEQ ID NO:3) koja prikazuje spoj donjeg dela neo selekcione kasete (velikim slovima) sa lox mestom (velikim slovima podvučeno) nakon čega sledi Nhel mesto (malim slovima) nakon čega sledi mišja sekvenca posle humanizacije (velikim slovima); 2.6 kb ukazuje na to da se selekciona kaseta prostire još naviše; elipse znače da se ta sekvenca nastavlja.
SLIKA 5 opisuje liniju proteinske sekvence za mišji IL-15 proteinski prekursor (gore, ,,mlL-15-prekursor", SEQ ID NO:4); hibridni mišji/humani IL-15 proteinski prekursor (sredina, ,,Regn_Hybridjn/h", SEQ ID NO:5) dobijen humanizacijom lokusa opisanog na slici 1; kao i poznatu humanu IL-15 izoformu 1 preprotema (dole. ,.hlL 15 izoforma 1", SEQ ID NO;6); veza koja je posledica humanizacije opisane na slici 1 označena je vertikalnom strelicom koja označava C kao prvu amino kiselinu u toj zameni; početak zrelog hlL-15 proteina označen je savijenom strelicom na prvoj amino kiselini N,
SLIKA 6 prikazuje IL-15 detektovan u serumu heterozigotnih hlL_15 miševa kojima je ubrizgana poly l:C. Kontrola ukazuje na to da hlL-15 nije detektovan u kulturi splenocita miševa divljeg tima kome je ubrizgana poly l;C
[0079] SLIKA 7 pokazuje da humani IL-15 ne reaguje sa mišjim IL-15 ili sa poly l:C ni na
jednoj ELISA probi. Mišji IL-15 je bio 1000 pg/ml
[0083] SLIKA 8 pokazuje da je BM-DC miša heterozigotan kod humanog IL-15 koristeći 7
puta koncentrovani BM-DC supernatant kod netretiranih miševa, miševa tretiranih sa poly l:C, kao i kod miševa tretiranih sa LPS.
SLIKA 9 pokazuje da mišji BM-DC heterozigotni za humani IL-15 proizvodi transkript humanog IL-15 (podaci sa RT-PCR). Staza 1: netretirani miševi; staza 2: miševi tretirani sa poly l:C; staza 3; samo LPS; staza 4; netretirani miševi divljeg tipa; staza 5: miševi divljeg tipa tretirani sa poly l:C; staza 6: miševi divljeg tipa tretirani sa LPS; staza 7: kontrola bez kDNK (samo voda).
SLIKA 10 pokazuje da su MAID 5218 het miševi proizvodili humani IL-15 posle injekcije poly l:C u istoj koncentraciji kao i MAiD 5217 het miševi
DETALJNI OPIS
[0078] Opisuju se genetski modifikovani ne-humani organizmi koji sadrže modifikovani endogeni IL-15 lokus koji sadrži neku humanu sekvencu npr. zamenu jedne ili više ne-humanih sekvenci jednom ili više humanih sekvenci. Ti organizmi su, u načelu, sposobni da tu izmenu prenesu potomstvu, tj., transmisijom germinativne linije. Opisuju se posebno genetski modifikovane ne-humane životinje.
[0079] Ta genetski modifikovana ne-humana životinja može biti neka iz grupe koja obuhvata miša, pacova, zeca, svinju, govedo (npr. krava, bik, bivo). jelen, ovce. koze, pilići, mačka, pas, lasica, primati (npr , mrmot, rezus majmun). Ako za ove ne-humane životinje nema odgovarajućih trenutno dostupnih genetski promenljivih ES ćelija, koriste se drugi postupci dobijanja ne-humane životinje koja sadrži genetsku modifikaciju Ti postupci uključuju, npr., modifikaciju genoma ne-ES ćelije (npr., fibroblasta ili indukovane pluripotentne ćelije) i transfer embrionskog nukleusa u cilju prenosa tog modifikovanog genoma u pogodnu ćeliju, npr., oocit, kao i gestaciju modifikovane ćelije (npr., modifikovanog oocita) u nekoj ne-humanoj životinji pod pogodnim uslovima da bi se dobio embrion.
[0080] Ta ne-humana životinja može biti sisar. Ta ne-humana životinja može biti mali sisar, npr., iz familijeDipodoideailiMuroidea.U jednom izvođenju pronalaska, ta genetski modifikovana životinja je glodar. Taj glodar se može izabrati između miša, pacova i hrčka Taj glodar se može izabrati u superfamilijiMuroidea.Ta genetski modifikovana životinja može biti iz familije koja se bira izCalomyscidae(npr., mišu-slični hrčci),Cricetidae(npr., hrčak, miševi i pacovi iz Novog Sveta, voluhanca),Muridae(pravi miševi i pacovi, skočimiševi, miševi iz roda Acomys, ćubasti pacov),Nesomyidae(miševi penjači, miševi kamenjari, belorepi pacovi, Malagasy pacovi i miševi),Platacanthomyidae(npr. indijski skočimiš). kao iSpalacidae(npr., slepi kučići, Sumatranski pacovi i zokori). Genetski modifikovani glodar može se izabrati između pravog miša ili pacova, (familijaMuridae),skočimiša. miša iz roda Acomvs, kao i ćubastog pacova. Genetski modifikovani miš može biti iz nekog člana familijeMuridae.Ta životinja može biti glodar. Taj glodar može se birati između miša i pacova Ne-humana životinja može biti miš.
[0081] U jednom specifičnom izvođenju pronalaska, miš je soja C57BL izabran između C57BL/A, S57BL(An, C57BL/GrFa, C57BL/Kal_wN. C57BL/6 C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn. C57BL/10Cr i C57BL/Ola U drugom izvođenju pronalaska, taj miš je iz soja 129 izabran iz grupe koja se sastoji iz soja koji je 129P1, 129P2. 129P3, 129X1, 129S1 (npr., 129S1/SV. 129S1/Svlm). 129S2, 129S4, 129S5. 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (vidi npr Festmg et al. (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836 vidi takođe, Auerbach et al.
(2000) Establishment and Chimera Analvsis of 129/SvEv-and C57BL/6-Denved Mouse Embrvonic Stem Cell Lines). U jednoj specifičnom izvođenju pronalaska, taj genetski modifikovani miš je mešavina gore navedenog soja 129 i gore navedenog soja C57BL/6. U drugoj specifičnom izvođenju pronalaska, taj miš je mešavina gore navedenih sojeva 129 ili mešavina gore navedenih sojeva BL/6 U jednom izvođenju pronalaska, soj 129 mešavine je soj 129S6 (129/SvEvTac) U drugoizvođenju pronalaska, taj miš je soja BALB, npr., soja BALB/c. U još jednom izvođenju pronalaska, taj miš je mešavina soja BALB i nekog drugog gore navedenog soja. U nekom drugom izvođenju pronalaska, taj miš je iz hibridne linije (npr., 50% BALB/c - 50% 129S4/Sv; ili 50% C57BL/6 - 50% 129; npr.. F1H4 ćelije, vidi npr Auerbach et al. (2000)).
[0082] Ta ne-humana životinja može biti pacov. Pacov se može izabrati iz soja Vistar, LEA, soja Sprague Dawley, soja Fischer, F344 F6. kao i Dark Agouti Taj soj pacova može biti mešavina dve ili više sojeva iz grupe koja obuhvata VVistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 i Dark Agouti.
[0083] Ova ne-humana životinja može imati jednu ili više genetskih modifikacija, odnosno druge modifikacije, koje su pogodne za konkretnu namenu za koju se taj humanizovani IL-15 miš pravi. Na primer, pogodni miševi za održavanje ksenografta (npr humanog karcinoma ili tumora) mogu da sadrže jednu ili više modifikacija koje ugrožavaju, deaktiviraju ili uništavaju imunološki sistem te ne-humane životinje u celosti ili delimično. Ugrožavanje, deaktivacija ili uništenje imunološkog sistema ne-humane životinje može da obuhvata, na primer uništavanje hemopoetičkih ćelija i/ili imunoloških ćelija hemijskim putem (npr, davanjem nekog toksina), fizičkim putem (npr., zračenjem životinje), kao i genetskom modifikacijom (npr, izbacivanjem jednog ili više gena), Primeri takvih miševa, između ostalog su npr, NOD miševi, SCID miševi, NOD/SCID miševi, IL2Ry nokaut miševi, NOD/SCIDA/C"<1>"' miševi, goli miševi, kao i Ragi i/ili Rag2 nokaut miševi. Ovi miševi se mogu eventualno zračiti ili na neki drugi način tretirati da im se uništi jedan ili više tipova imunoloških ćelija Prema tome, opisuje se genetski modifikovani miš koji sadrži humanizaciju najmanje jednog dela endogenog ne-humanog IL-15 lokusa i još sadrži modifikaciju koja ugrožava, deaktivira ili uništava imunološki sistem (ili jedan ili više tipova ćelija imunološkog sistema) te ne-humane životinje u celosti ili delimično. Ta modifikacija se, npr , bira u grupi koja se sastoji od modifikacije čiji su rezultati NOD miševi, SCID miševi, NOD/SCID miševi. IL2Ry nokaut miš, NOD/SClD/vC"<1>"' miš, goli miševi, Ragi i/ili Rag2 nokaut miševi, kao i njihove kombinacije Takav miš može da sadrži zamenu kodirajuće sekvence svih zrelih IL-15 humanom zrelom IL-15 kodirajućom sekvencom.
[0084] Miš može da sadrži zamenu kodirajuće sekvence svih zrelih IL-15 kodirajućom sekvencom humanih zrelih IL-15 i taj miš je NOD miš Miš može da sadrži zamenu kodirajuće sekvence svih zrelih IL-15 kodirajućom sekvencom humanih zrelih IL-15 i taj miš je SCID miš. Miš može da sadrži zamenu kodirajuće sekvence svih zrelih IL-15 kodirajućom sekvencom humanih zrelih IL-15 i taj miš je NOD/SCID miš.Miš može da sadrži zamenu kodirajuće sekvence svih zrelih IL-15 kodirajućom sekvencom humanih zrelih IL-15 i taj miš je IL2Rv nokaut miš. Miš može da ima zamenu kodirajuće sekvence svih zrelih IL-15 kodirajućom sekvencom humanih zrelih IL-15 i taj miš je NOD/SCID/vC""" miš Miš može da ima zamenu kodirajuće sekvence svih zrelih IL-15 kodirajućom sekvencom humanih zrelih IL-15 i taj miš je goli miš. Miš može da ima zamenu kodirajuće sekvence svih zrelih IL-15 kodirajućom sekvencom humanih zrelih IL-15 i taj mišjeRagii/iliRag2nokaut miš.
[0085] Opisuju se genetski modifikovane ne-humane životinje koje sadrže modifikaciju endogenog humanog IL-15 lokusa, pri čemu ta modifikacija sadrži sekvencu humane nukleinske kiseline koja enkodira najmanje jedan deo zrelog IL-15 proteina. Mada se opisuju i genetski modifikovane ćelije koje sadrže modifikacije opisane u prethodnom tekstu (npr., ES ćelije, somatske ćelije), genetski modifikovane ne-humane životinje mogu da imaju modifikaciju endogenog IL-15 lokusa u germinativnoj liniji životinje
[0086] Opisuju se genetski modifikovane ne-humane životinje koje sadrže zamenu genske sekvence ne-humanog IL-15 genskom sekvencom humanog IL-15 Endogeni ne-humani IL-15 lokus može se modifikovati u celosti ili delimično da sadrži sekvencu nukleinske kiseline koja enkodira najmanje jedan protein kodirajući egzon zrelog IL-15 proteina. Ta humana sekvenca može biti humana genomska sekvenca, npr.. kontinualna humana genomska sekvenca koja sadrži jedan ili više egzona koji enkodiraju deo zrelog IL-15 proteina ili, npr . kDNK koja enkodira bar jedan ili više egzona koji enkodiraju deo zrelog IL-15 proteina. Svi IL-15 protein kodirajući egzoni koji enkodiraju sekvencu koja se javlja u zrelom IL-15 proteinu, mogu se humanizovati. Humanizovani IL-15 lokus može biti pod kontrolom endogenih uzvodno regulišućih sekvenci (npr., svih endogenih sekvenci pre humanizacije) Humanizacija može da sadrži humani 3'UTR.
[0087] Te ne-humane životinje mogu biti sisari. Sisan mogu biti glodari. Opisuju se glodari koji sadrže humanizaciju IL-15 gena, na endogenom glodarskom lokusu Opisuju se postupci za dobijanje glodara, npr.. miševa, koji imaju zamenu endogenog IL-15 gena ili njegovog fragmenta (npr., fragmenta koji sadrži jedan ili više egzona) humanizovanim IL-15 genom ili njegovim fragmentom (npr.. fragmentom koji sadrži jedan ili više egzona) na endogenom IL-15 lokusu. Opisuju se ćelije, tkiva i miševi koji sadrže humanizovane gene kao i ćelije, tkiva i miševi koji eksprimuju humani IL-15 sa endogenog ne-humanog IL-15 lokusa Takođe se opisuju glodari koji eksprimuju humani IL-15 protein pod kontrolom endogenog promotera glodara,
[0088] IL-15 je otkriven kao IL-2 nezavisan faktor rasta T-ćelija koji stimuliše proliferaciju T-ćelija i podržava razvoj timusa i razvoj ćelija prirodnih ubica (NK) (Burton, J.D. et al (1994) A Ivmphokine, provisionallv designated mterleukin T and produced by a human adult T-cell leukemia line, stimulates T-cell proliferation and the mduction of lymphokine-activated killer cells. Proc. Natl. Acad. Sci, USA 91:4935-4939: Grabstein. K.H. et al (1994) Cloning of a T Cell Grovvth Factor That Interacts with the |3 Chain of the lnterleukin-2 Receptor Science 264:965-968). IL-2 i IL-15 imaju zajedničke receptorske podjedinice Međutim, nezavisni značaj IL-15 za održavanje populacije imunoloških ćelija je nesporan; IL-15/IL-15R nokaut miševi ispoljavaju nizak nivo CD8+T ćelija. CD8+T ćelija slabe memorije, kao i nizak nivo NK ćelija, kao i druge tipove ćelija (Steel, J C et al (2012) lnterleukin-15 biology and its therapeutic implications in cancer. Trends in Pharmacologica! Sciences, 33(1):35-41),
[0089] Poznato je da se IL-15 eksprimuje u endotelnim ćelijama; IL-15 dobijen iz endotelnih ćelija stimuliše transendotelnu migraciju T-ćelija (vidi Oppenheimer-Marks, N. (1998) Interleukin 15 is Produced by Endothelial Cells and Increases the Transendothelial Migration of T Cells in Vitro and in the SCID Mouse-Human Rheumatoid Arthritis Model in Vivo, J Clin. Invest. 101 (6): 1261 -1272). Prema tome, rani rad je utvrdio verovatnoću da je regrutovanje T-ćelija na mesta upale posredovano pomoću IL-15. Ova činjenica je značajna, jer nepravilna ili prekomerna ekspresija IL-15 može odmah da dovede do patološkog fenotipa - situacija koja se sreće kod transgenih ne-humanih životinja koje eksprimuju poremećaj regulacije IL-15 Pravilna regulacije IL-15 je važna, jer se veruje da je IL-15 proinflamatorni citokin koji je na vrhu kaskade proinflamatornih citokina i da prethodi ekspresiji mnogih inflamatornih medijatora (Mclnnes, LB. et al. (1997) lnterleukin-15 mediates T cell-dependent regulation of tumor necrosis factor-a production in rheumatoid arthritis Nature Med 3:189-195, quoted in vValđmann, T A. (2006) The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design. Nature Rev. Immunol 6:595-601
[0090] Transgeni miševi koji eksprimuju humani IL-15 pod kontrolom enterocit-specifićnog promotera (T3b promoter) radi ekspresije humanog IL-15 u mtestinalnim epitelnim ćelijama razvijaju spontane upale (inflamacije) u regionu duodenuma i jejunuma (Yokoyama, S. et al.
(2008) Antibodv-mediated blockade of IL-15 reverses the autoimmune intestinal damage in transgemc mice that overexpress IL-15 in enteroevtes, Proc Natl. Acad Sci USA 106(37)15849-15854; Ohta, N. et al. (2002) IL-15-dependent activation-induced cell death-resistant Th1 type CD8 alpha beta + NK1 .1 + T cells for the development of small intestinal inflammation, J Immunol. 169:460-468). Vidi. takođe, Nishimura. H et al. (2005) A novel autoregulatory mechanism for transcriptional activation of the IL-15 gene by nonsecretable isoform of IL-15 generated by alternative splicing, FASEB J 19:19-28 (transgenski miševi sa nasumično ubačenom varijantom gena m IL-15)..
[0091] Dobijeni su miševi transgeni u pogledu sekretablne forme IL-15 pod kontrolom promotera klase I MHC, ali oni prekomerno eksprimuju IL-15 (Yajima. T. et al. (2001 ) Memory phenotype CD8(+) T cells in IL-15 transgenic mice are involved in early protection against a primary infection with Listeria monocytogenes, Eur.J Immunol. 31 (3):757-766). Prekomema ekspresija IL-15 je u korelaciji sa uništavanjem intestinalnog epitela od strane IL-15 aktiviranih citotoksičnih T-limfocita kod celijakije (Yokoyama S. et al. (2008 ) Transgenic Mice that Overexpress Human IL-15 in Enterocytes Recapitulate Both B and T Cell-Mediated Pathologic Manifestations of Celiac Disease. J. Clin Immunol 31 1038-1044), verovatno zbog pospeuivanja proliferacije CD8+ T ćelija koje ciljaju eritrocite putem NKG2D (prirodni ubica iz grupe 2, član D) posredovanog procesa koi obuhvata poznate receptore kao što je MICA/B (ld., at 1039). Do sada je, izgleda, jasno da, kod celijakije, lokalno-eksprimovani IL-15 izaziva T-čelijama posredovano oštećenje tkiva u crevima (ld 25).
[0092] Najmanje jedna studija transgenih miševa koji su projektovani da prekomerno eksprimuju IL-15 u mišićnom tkivu i u krvotoku (pomoću promotera skeletnih mišića) utvrdila je da prekomerna ekspresija IL-15 ima štetan uticaj na metabolizam; kod takvih miševa se, izgleda, IL-15 upotrebljava kao miokin koji smanjuje teiesnu masnoću i izaziva rezistenciju na adipozitet izazvan ishranom (Quinn, L.S. et al (2009) Oversecretion of interleukin-15 from skeletal muscle reduces adiposity, Am J
[0093] Takođe se misli da je IL-15 umešan u reumatoidni artritis, možda kroz poremećenu infiltraciju T-ćelija u zglobovima (npr. Fehninger T A and Caligiuri. M A. (2001 ) Interleukin 15: biology and relevance to human disease, Blood 97(1 ) 14-32) Pacijenti sa sarkoidozom takođe proizvode alveolarne makrofage koje eksprimuju IL-15 koji može da bude medijator proliferacija T-ćelija u plućima (ld. 23). IL-15 može da posreduje u odbijanju organa u slučaju alografta preko proliferacije T-ćelija (ld. 24). IL-15 može da učestvuje u leukemiji T-ćelija kod odraslih (npr. HTLV-1 posredovana leukemija), a to učešće se bar delimično zasniva na aktivaciji IL-15 posredovanih puteva kod pacijenata sa leukemijom zrelih T-ćelija (ld ).In vitrorad ukazuje na to da IL-15 aktivira replikaciju HIV-a. što može biti slučaj i kod ljudi (ld. 25).
[0094] Kod transgenih životinja koji eksprimuju IL-15 posredstvom klase I MHC promotera inficiranog saMycobacterium bovicBACILOM Calmette-Guerin, prekomerna produkcija IL-15 dala je miševe osetljive na LPS-indukovanu letalnu povredu jetre, što je efekat koji nije bio primećen kada su CD8+T-ćelije bile uzete iz miševa (Yajima, T (2004) Overexpression of lnterleukin-15 Increases Susceptibility to Lipopolysaccharide-lnduced Liver lnjury in Mice Primed with Mycobacterium bovis Bactllus Calmette-Guenn, Infection and lmmunity 72(7) 3855-3862), što ukazuje na efekat posredovan prekomernom produkcijom IL-15.
[095] Transgeni miševi koji eksprimuju IL-15 posredstvom promotera skeletnih mišića ispoljavali su povišenu osetljivosti na insulin i rezistenciju na gojaznost indukovanu hranom, a izgleda da učestvuju u promociji metabolizma masnih kiselina (Quinn, L.S. et al, (209 ) Overexpression of interleukin-15 in mice promotes resistance to diet-induced obesity, increased insulin sensitivity, and markers of oxidative skeletal muscle metabolism, International Journal of Interferon, Cytokine and Mediator Research, 3:29-42).
[095] Ispitivana je selektivna blokada mišjeg IL-15. uključujući i rastvorljivi IL-15Ra, što može biti od kliničkog značaja u kontroli reumatoidnog artritisa Prema tome, ne-humane životinje koje eksprimuju humani ili humanizovani IL-15, takođe i na fiziološki relevantan način, korisne su za procenu ili identifikaciju selektivnih blokatora humanog IL-15, Prema jednom analitičaru, „razvoj delotvornih sredstava za blokadu zasnovanim na IL-15 koji ispoljavaju blokirajuće dejstvoin vivo,mogao bi olakšati brzu translaciju takvih pristupa na klinički nivoM Prema tome, genetski modifikovane ne-humane životinje, npr. ne-humane životinje koje sadrže humani IL-15 gen u svojoj germinativnoj liniji, pri čemu te ne-humane životinje eksprimuju humani IL-15 na fiziološki pogodan način, bile bi veoma korisne
[097] IL-15 je pleiotropni citokin koji je potreban za razvoj i rad NK ćelija i homeostazu T-ćelija. Posebno je važan za memoriju CD+T-ćelija. IL-15 proizvode prvenstveno dendritske ćelije i makrofage posle čega se on preko kompleksa IL-15/IL-15R prenosi u NK i T-ćelije. Još je poznato da je IL-15 proinflamatorni citokin koji mdukuje proizvodnju ostalih citokina, regrutuje i aktivira T-ćelije i druge inflamatorne ćelije, stimuliše razvoj i preživljavanje NK ćelija, kao i angiogenezu; mnoge ove karakteristike se ispoljavaju u psorijatičnim promenama (za koje je analizu i izveštaj dao Villadsen, L.S. (2003) Resolution of psoriasis upon blockade of IL-15 biological activity in a xenograft mouse model, J. Clin Invest 112(10):1571 -1580). Smatra se da se IL-15 nalazi na vrhu kaskade proinflamatornih citokina, a u razvoju su različite strategije modulacije IL-15 signala za lečenje bolesti (vidi VValdman (2006) The biology of interleukin-2 and interleukin-15: implications for cancer therapy and vaccine design. Nature Reviews lmmmunology, 6:595-601 ) Kod jednog miša koji je bio model ksenografta psorijaze, SCID miša, blokada IL-15 pomoću antitela na IL-15R (ili IL-15) imala je za posledicu smanjenje težine psorijaze (ld.). Prema tome, ne-humane životinje koje eksprimuju IL-15 na fiziološki značajan način su korisne (npr., njihova korist je utvrđena) kao modela oboljenja kod ljudi, uključujući, između ostalog, modela imunološki ugroženih miševa kao što su SCID miševi, kao i drugi imunološki ugroženi miševi. Prema tome. opisuje se neki glodar (npr., miš) koji sadrži humani ili humanizovani IL-15 gen pod kontrolom endogenih ne-humanih regulatornih elemenata (npr., humanizacija kodirajućeg gena za IL-15 kod glodara, npr., miša)
[098] Gen IL-15 se nalazi na ljudskom hromozomu 4q31, kao i na hromozomu 8 miša. Taj humani gen sadrži 8 egzona (7 kodiranja) i izgleda da postoji u dve izoforme kako kod ljudi, tako i kod miševa (vidi Fehninger T A and Caligiun. M A (2001 ) Interleukin 15: biologv and relevance to human disease, Blood 97(1 ) 14-32) iRNK za IL-15 proizvodi se u mnogim tkivima i tipovima ćelija, a čini se da kod ljudi regulacija IL-15 gena podleže negativnoj regulaciji od strane prethodnog regiona čije brisanje ima za posledicu dramatično povećanje aktivnosti promotera IL-15 (ld. 17). Transgeni miševi kojima nedostaje post-transkripciona kontrola IL-15 ispoljavaju fatalni limfocitnu leukemiju (ld.). Izgleda da je regulacija ekspresije IL-15 veoma jaka i posredovana od strane najmanje 5' netranslantiranih regiona AUG trojki, 3' regulatornih elemenata, kao i regulatornim mestom pretpostavljenog regiona C-terminala (vidi Mclnnes, LB. and Gracie. J A. (2004) Interleukin-15: a new cvtokine target for the treatment of inflammatorv diseases. Current Opinion in Pharmacologv 4 392-397) Humani IL-15 gen ima devet egzona i osam introna, uključujući i egzon 4a koji je prisutan kod ljudi, ali ne i kod miševa, mada zreli IL-15 protein enkodiraju samo egzoni 5 do 8 (vidi Budagian, V. et al. (2006) IL-15/IL-15 receptor biologv: A guided tour through an expanding universe, Cvtokine & Grovvth Factor Revievvs 17:259-280). Postoje dva alternativna vezana iRNK proizvoda koji produkuju sve IL-15 izoforme koje se razlikuju samo po dužini signalnog peptida. što se odnosi kako za proteine miša, tako i ljudi (vidi, npr/đ.)Na slici 1, koja prikazuje strategiju humanizacije IL-15 lokusa kod miša, izostavljene su prethodne sekvence miša koje nisu humanizovane (uključujući egzone koji se ne javljaju u zrelom proteinu) radi jednostavnosti, a prikazano je ponovljeno numerisanje egzona važnih za prikazanu humanizaciju.
[099] IL-15 se eksprimuje u mnogim tipovima ćelija i tkiva, uključujući monocite. makrofage, dendritske ćelije, keratocite. ćelije epiderma. fibroblaste, kao i epitehjalne ćelije nerva, bubrega, placente, pluća, srca i mišića (Grabstem, K.H et al. (1994) Cloning of a T Cell Grovvth Factor That Interacts with the [3 Chain of the lnter!eukm-2 receptor, Science 264:965-968).
[0100] IL-15 kodirajuće sekvence miša bile su humanizovane kao što je prikazano na slici 1 na kojoj nisu prikazana dva nekodirajuća egzona (koja nisu bila humanizovana) koja se nalaze mnogo pre kodirajućih egzona. 12299 nukleotida u sekvenci miša bili su zamenjeni sa 12896 nukleotida humane sekvence u cilju humanizacije IL-15 gena.
[0101] Tom humanizovanom IL-15 lokusu može da nedostaje humani IL-15 5'UTR. Humanizovani IL-15 lokus može da sadrži glodarski 5'UTR. Taj glodar može biti miš, tako da humanizovani IL-15 lokus sadrži mišji IL-15 5'UTR
[0102] Glodari koji eksprimuju humani ili humanizovani IL-15 protein, npr., na fiziološki pogodan način, mogu se koristiti na razne načine koji uključuju, između ostalog, razvijanje terapijskih sredstava za lečenje bolesti i poremećaja kod ljudi. Antagonisti IL-15, npr., rastvorljivi oblici IL-15 receptora, mogu sprečiti razvoj kolagen posredovanog artritisa na životinjskom modelu (vidi, Ruchatz, H et al.. (1998) Soluble IL-15 receptor a-chain administration prevents murine collagen-induced arthritis: a role for IL-15 in development of antigen-induced immunopathologv, J. Immunol. 160:5654-5660;); anti-IL-15 antitela bila su efikasna protiv raznih bolesti, uključujući psorijazu i reumatoidni artritis; na životinjskom modelu artritisa, antagonist IL-15 receptora ne samo da sprečava nastanak i progresiju artritisa, već i smanjuje infiltraciju limfocita u zglobove (Ferrari-Lacraz, S et al. (2004) Targeting IL-15 Receptor-Bearing Cells with an Antagonist Mutant IL-15/Fc Protein Prevents Disease Development and Progression in Murine Collagen-induced Arthritis, J. Immunol.. 173:5815-5826); IL-15-mediated signaling has also been implicated in IBD, SLE, inflammatorv svnovitis, diabetes mellitus, and asthma (revievved in Budagian, V et al. (2006) IL-15/IL-15 receptor biologv: A guided tour through an expanding universe, Cvtokine & Grovvth Factor Reviews 17:259-280).
[0103] Ispitivanja na IL-15 nokaut miševima utvrdila su da je IL-15 neophodan za razvoj određenih imunoloških ćelija, posebno NK ćelija (revievved in Lodolce. J. P. (2002) Regulation of Ivmphoid homeostasis by interleukin-15. Cvtokine & Grovvth Factor Reviews. 13:429-439). Zaista, IL-15 nokaut miševi ne preživljavaju dugo ako se izlože dejstvu određenih patogena (npr. vaccinia virus), verovatno zbog nedostatka NK i CD8+T-ćelija Prema tome, dejstvo antagonista hlL-15 na funkciju NK ćelija kod čoveka predstavlja značajnu primenu humanizovane IL-15 životinje.
[0104] Opisuju se genetski modifikovane životinje koje eksprimuju humani ili humanizovani IL-15, što je korisno za ispitivanje antagonista humanog IL-15 Ove genetski modifikovane životinje još mogu da uključe životinjski model nekog oboljenja kod ljudi, npr., data bolest se indukuje genetski (izbacivanjem-nokaut) ili na drugi način Te genetski modifikovane ne-humane životinje još mogu da uključe i poremećaj imunološkog sistema, npr., ne-humana životinja se može genetski modifikovati da podnese ili održava neki ljudski ksenograft, npr.. humani čvrsti tumor ili tumor krvnih ćelija (npr. tumor limfocita. npr., tumor B ili T-ćelija).
PRIMERI
Primer1:Humanizacija IL-15 lokusa miša
[0105] ES ćelije miša modifikovane su tako da zamene određene mišje IL-15 genske sekvence određenim humanim IL-15 genskim sekvencama na endogenom IL-15 lokusu miša, pod kontrolom regulatornih elemenata mišjeg IL-15, koristeći VEL OCiGLNL:; tehnologiju za genetski inženjering, radi dobijanja humanizovanog lokusa kao što je prikazano na slici 1. Slika 1 ne prikazuje ono što se dešava pre (u pogledu pravca transkripcije IL-15 gena) 5' netranslantiranih egzona gena miša. Ex1 na slici 1 prikazuje malo netranslantirano polje (nepopunjeno) pre kodirajućeg egzona. Kako je prikazana humanizacija na dnu slike 1. kodirajući egzoni 1 i 2 miša su zadržani, dok su kodirajući egzoni 3 do 6 miša zamenjeni humanim egzonima 3 do 6. Na kraju posle ovoga, humani egzon 6 praćen je stop kodonom i humanim 3'UTR, a još dalje humanom sekvencom koja sledi posle humanog 3'UTR. Za potrebe selekcije, uključena je selekciona kaseta (upletena radi uklanjanja pomoću Cre). Ovaj humanizovani lokus na slici 1 eksprimuje zreli IL-15 protein koji je u potpunosti ljudski.
[0106]Ciljajući konstrukt:Bakterijska homologna rekombinacija (BHR) obavlja se radi dobijanja velikog ciljajućeg vektora (LTVEC) koji sadrži sekvence humanog IL-15 gena za ciljanje mišjeg IL-15 lokusa pnmenom standardnih BHR tehnika (vidi npr. Valenzuela et al.
(2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analvsis, Nature Biotech. 21 (6):652-659) i BHR za zatvaranje procepa. Linearni fragmenti se dobijaju podvezivanjem PCR-generisanih homolognih boksova (kutija) za klonirane kasete posle čega sledi izolacija produkata podvezivanja gelom i elektroporacija u BHR kompetentne bakterije koje imaju ciljni bakterijski veštaćki hromozom (BAC) Mišji BAC RPC123-203P7 se koristi kao izvor mišje sekvence: humani BAC RP11-103B12 se koristi kao izvor humane sekvence IL-15 gena Posle koraka selekcije, identifikuju se tačno rekombinovani klonovi koristeći PCR novih čvorova, kao i analizu restrikcije. Napravljen je veliki ciljajući vektor (LTVEC) koji sadrži homologne krake i humane IL-15 genske sekvence. ES ćelije miša su elektroporirane pomoću LTVEC konstrukata, uzgajane na podlozi za selekciju i korišćene kao donorske ES ćelije za dobijanje humantzovanih IL-15 miševa koji sadrže zamenu na endogenom mišjem IL-15 lokusu humanom sekvencom kako je opisano na slici 1.
[0107] Taj mišji IL-15 gen (mouse GeneID 103014; RefSeq transcript: NM 008357.2; ensemble elD:16168) se modifikuje pomoću genomskih koordinata za brisanje GRCM38:ch 8: 82331173-82343471 (minus spirala), genomskih koordinata za zamenu GRCh37: ch4: 142642924-142655819 (plus spirala). 12299 nukleotida mišje sekvence zamenjeno je sa 128996 nukleotida humane sekvence. Zamena gore opisane mišje IL-15 sekvence grafički je predstavljena na slici 1.
[0108] LTVEC koji sadrži humanizovani IL-15 gen imao je prethodnu mišji ciljajući krak od oko 13 kb koja je sa gornje (leve) strane podbočena Mlul mestom i od oko 27 kbmišju ciljajuću ruku iza koja je sa donje strane prirubna sa AscI mestom. LTVEC je bio u liniji sa Mlul i Asc! radi elektroporacije.
[0109] Posle konstrukcije LTVEC, nukleotidna sekvenca LTVEC u 5' čvoru miš/čovek, kao i 3' čvoru čovek/miš je kao što je prikazano na slikama 2-4
[0110] Posle elektroporacije ES ćelije, vrši se ispitivanje gubitka nativnog alela (vidi npr, Valenzuela et al. (2003)) da se detektuje gubitak endogene IL-15 sekvence usled ciljanja
[0111] Pravilno ciljane ES ćelije (MAID 5217) bile su dalje elektroporirane prolaznim Cre-eksprimujućim vektorom da se ukloni Neo selekciona kaseta leka, Rezultujuće ES ćelije iz izbrisane kasete označene su kao MAID 5128.
Primer 2: Humanizovani IL-15 miševi
[0112] Dobijanje humanizovanih IL-15 miševa: ES ćelije miša donora koje sadrže humanizovani IL-15 lokus (npr., MAID 5217 ili MAID 5218) uvode se u embrion miša u ranoj fazi postupkom VELOCIMOUSE® (Pouevmirou et al (2007) F0 generation mice fully derived from gene-targeted embryonic stem cells allovving immediate phenotypic analyses, Nat Biotechnol 25:91 -99). Dobijaju se heterozigotni miševi, a da bi se dobili homozigoti u pogledu humanizovanog IL-15, gaje se heterozigoti.
Primer 3: Fenotip humanizovanih IL-15 miševa
[0113] Miševi: Miševi su bili ili divljeg tipa (WT) Balb/c ženke stare 8-10 nedelja ili MAID 5217 ženke iste starosti (heterozigotne u pogledu humanog IL-15 gena). Alternativno, miševi su bili ili divljeg tipa (WT) ili MAID 5217 ili MAID 5218 iste starosti (oba heterozigotna u pogledu humanog IL-15 gena)
[0114] In vivo poly l:C injekcija: vVT Balb/c ili MAID 5217 het miševima data je injekcija od 50 j.ig poly l:C u repnu venu (IV injekcija). Posle 24 sata, miševi su žrtvovani, pušteni da iskrvare punkturom srca i izolovan je serum Uzete su slezine i splenociti pripremljeni mehaničkim filtriranjem slezine kroz 70 jleM mrežicu filtera posle čega je primenjen tretman ACK puferom da dođe do lize crvenih krvnih zrnaca (RBC) Izolovani splenociti su gajeni radi dodatne stimulacije (videti u nastavku teksta). Serum je analiziran na humani IL-15 pomoću kompleta R&D Systems human IL-15 OUANTIKINEH kita WT ili MAID 5218 het miševima je data IP injekcija od 50 ng poly l:C (Invivogen; Cat#tlrl-pic) putem IP Sledećeg dana miševi su pušteni da iskrvare usled punkture srca i serum je analiziran na humani IL-15 ELISA testom (R&D Systems OUANTIKINE™ ELISA kita.
[0115] Priprema dendritskih ćelija iz koštane srži (BM-DC) Koštana srž je uzeta iz tibije neinjektovanih miševa i urađena liza RBC primenom ACK pufera Ćelije su oprane sa RPMI kompletom (w/HEPES, gentamicin, natrijum piruvat, L-glutamin i ne-esencijalne amino kiseline) + 10% fetusnog goveđeg seruma (FBS) i prebrajane. Gajeno je 2 x 10<b>ćelija po otvoru na ploči sa 6 otvora primenom 3 ml/otvoru RPMI kompleta + 10% FBS + 50 ug/ml mišjeg GM-CSF + 50 ,ug/ml mišjeg IL-4. Ćelije su gajene na 37 C / 5% C02, a dana 2 i 4 dodavan je sveži GM-CSF/IL-4. Petog dana su skupljene BM-DC koje nisu bile siepljene, a njihove hranljive podloge sačuvane (kondicionirane podloge).
[0116]Kultura splenocita:Uzete su slezine i splenociti pripremljeni mehaničkim filtriranjem slezine kroz 70 uM mrežicu filtera nakon čega je primenjen tretman ACK puferom da dođe do lize crvenih krvnih zrnaca (RBC). Izolovani splenociti su gajeni na ploči sa 48 otvora u koncentraciji od 2 x 10<r>7mL splenocita po 1 ml RPMI kompleta + 10% FBS. Ćelije su tretirane sa 10f-ig/ml poly l:C, 10 ug/ml PMA ili nisu bile ničim tretirane Ćelije su gajene kao takve tokom noći i sledećeg dana je odvojena gornja tečnost i koncentrovana 8 puta primenom Amicon 2ml filtera sa 3kd odsečka molekularne težine (MVVCO). Koncentrovani supernatanti su analizirani na humani IL-15 primenom R&D sistema humanog IL-15 OUANTIKINE00 kompleta.
[0117]BM-DC kultura:2 x 10<6>/ml BM-DC je stavljeno na ploču sa 24 otvora u 0,5 ml svežeg RPMI kompleta + 10% FBS i 0,5 ml kondicioniranih podloga. Ćelije su tretirane sa 25 ug/ml poiy l:C, 1(.ig/ml LPS ili nisu ničim tretirane. Sve probe su izvođene u duplikatu. Ćelije su gajene kao takve tokom 36 sati posle čega je odvojena gornja tečnost. Gornja tečnost je koncentrovana 7 puta primenom Amicon 2 ml filtera sa 3kd MVVCO Koncentracija humanog IL-15 je analizirana primenom R&D sistema humanog IL-15 GUANTIKINE® kompleta RNK je izolovana iz ovih proba pomoću RNAeasy'<A1>mini prep kompleta za RT-PCR analizu stepena transkripta humanog IL-15.
[0118]ELISA:R&D sistemi za humani IL-15 QUANTIKINE"< komplet je korišćen za merenje humanog IL-15 u serumu i koncentrovanim spienocitima ili BM-DC supernatantima Komplet je korišćen prema uputstvima proizvođača. Sprovođene su dodatne kontrole radi validacije specifičnosti ovog kompleta (detektuje samo humani, ne i mišji IL-15) i da se potvrdi da ne reaguje na poly l:C. Prema tome. ELISA testom je određivano 1000 pg/mL mišjeg IL-15 (napomena: najviši standard za humani IL-15 je 250 pg/mL) i samo poly l:C u koncentraciji od 25 ug/ mL i 12,5 ug/ mL. Utrđeno je da komplet specifično reaguje na humani IL-15 (nije bilo detekcije mišjeg IL-15) i da ne reaguje na poly I C
[0119]RT-PCR:kDNK je pripremljena od približno 200 ng izolovane RNK pomoću SUPERSCRIPT<IV1>III sistema sinteze prve spirale za RT-PCR komplet (Invitrogen) prema uputstvima proizvođača. Specifični humani IL-15 transkript je pojačan primenom Taqman DNK polimeraze sa sledećim prajmerima: hlL-15 Forvvard prajmer: giaaraagtg atttgaaaaa aallgaagal (SEQ ID NO:7); hlL-15 Reverse prajmer: tacaaaactc igcaaaaati ctltaatal (SEQ ID NO:7). PCR reakcija je sprovedena u 40 ciklusa sledećeg. denatunsanjem na 94 C tokom 15 sekundi, zagrevanjem na 60<i5>C tokom 30 sekundi, produžavanjem na 72"C posle čega je reakcija čuvana na 4°C. Transkript je rađen na 1% agar gelu primenom boje za gel Promega 6x.
[0120]Rezultati:Humani IL-15 je praćen u serumu MAID 5217 het miševa kojima je ubrizgan poly l:C, ali nije praćen kod VVT Balb/c miša iste starosti/pola kojima je takođe ubrizgan poly l:C (slika 6 i slika 10, desni panel). Slično tome, humani IL-15 je praćen u serumu MAID 5218 het miševa kojima je ubrizgan poiy I.C, ali nije praćen kod VVT miša iste starosti/pola kojima je takođe ubrizgan poly l:C (slika 10, levi panel). Proizvedena količina IL-15 kod MAID 5218 bila je slična kao ona kod MAID 5217 (slika 10). PMA-stimulisani splenociti MAID 5217 luče male količine IL-15 in vitro (uopšte nisu primećeni kod VVT miša)
[0121] Osim toga, BM-DC dobijeni od MAID 5217 het miševa ukazuju na lučenje humanog IL-15 nakonin vitrostimulacije primenom poly l:C (TLR3 agonist) i LPS (TLR4 agonist), kao i na značajne nazalne nivoe. RT-PCR analiza je dokazala specifični humani transkript IL-15 samo kod BM-DC dobijeni od MAID 5217 genetski modifikovanih miševa,
[0122] Sve u svemu, podaci ukazuju na to da MAID 5217 i MAID 5218 het miševi eksprimuju humani IL-15.
Primer 4: Miš homozigotni u pogledu humanog IL-15
[0123] Gajeni su heterozigotni miševi čiji je genotip zatim određen kao što je prethodno opisano. Homozigotni hlL-15 miševi su dobijeni parenjem bliskih srodnika.

Claims (12)

1. Genetski modifikovani miš, čiji genom sadrži zamenu, na endogenom mišjem IL-15 lokusu, mišjeg genomskog fragmenta koji kodira zreli mišji IL-15 polipeptid humanim genomskim segmentom koji kodira humani IL-15 polipeptid, pri čemu se humani IL-15 egzoni u pomenutom humanom genomskom segmentu sastoje od humanih IL-15 protein kodirajućih egzona 3,4,5 i 6, čime se dobija humanizovani IL-15 gen, naznačen time što su IL-15 egzoni numerisani tako da je prvi kodirajući egzon egzon 1 i pri čemu je taj humanizovani IL-15 gen pod kontrolom svih endogenih regulatornih elemenata ispred mišjeg IL-15 na endogenom mišjem IL-15 lokusu,
2. Genetski modifikovani miš iz zahteva 1, naznačen time što humanizovani IL-15 kodirajući gen enkodira protein koji sadrži sekvencu amino kiselina SEQ ID N0 5
3. Genetski modifikovani miš iz zahteva 1, naznačen time što taj humani genomski segment još sadrži humanu intronsku sekvencu ispred 5' najhumanijeg egzona i humanu neproteinsku kodirajuću sekvencu iza humanog stop kodona i iza humanog 3'UTR.
4. Postupak za dobijanje genetski modifikovanog miša koji se sastoji od modifikacije genoma miša zamenom mišjeg genomskog fragmenta koji kodira zreli mišji IL-15 polipeptid, na endogenom mišjem IL-15 lokusu, humanim genomskim segmentom koji kodira humani IL-15 polipeptid, naznačen time što se humani IL-15 egzoni u pomenutom humanom genomskom segmentu sastoje od humanih IL-15 protein kodirajućih egzona 3,4,5 i 6, čime se dobija humanizovani IL-15 gen, i što su IL-15 egzoni numerisani tako da je prvi kodirajući egzon egzon 1 i što je taj humanizovani IL-15 gen pod kontrolom svih endogenih regulatornih elemenata ispred mišjeg IL-15 na endogenom mišjem IL-15 lokusu.
5. Postupak iz zahteva 4, naznačen time što taj humani genomski segment još sadrži humanu intronsku sekvencu ispred 5' najhumanijeg egzona i humanu neproteinsku kodirajuću sekvencu iza humanog stop kodona i iza humanog 3'UTR.
6. Postupak iz zahteva 4, naznačen time što humanizovani IL-15 kodirajući gen enkodira protein koji sadrži sekvencu amino kiselina SEG ID NO:5.
7. Genetski modifikovani miš čiji genom sadrži humanizovani IL-15 gen, naznačen time što humanizovani IL-15 gen sadrži mišje IL-15 protein kodirajuće egzone 1 i 2 i humani genomski segment i što se humani IL-15 egzoni u pomenutom humanom genomskom segmentu sastoje od humanog IL-15 protein kodirajućih egzona 3,4,5 i 6, i što su ti IL-15 egzoni numerisani tako da je prvi kodirajući egzon egzon 1 i što je humanizovani IL-15 gen pod kontrolom svih regulatornih elemenata ispred mišjeg IL-15 na endogenom mišjem IL-15 lokusu, a pomenuti humanizovani IL-15 gen enkodira protein koji sadrži polipeptidnu sekvencu zrelog humanog IL-15.
8. Genetski modifikovani miš iz zahteva 7, naznačen time što humanizovani IL-15 kodirajući gen enkodira protein koji sadrži sekvencu amino kiselina SEQ ID NO:5.
9. Genetski modifikovani miš iz zahteva 7, naznačen time što humani genomski segment još sadrži humanu intronsku sekvencu ispred 5' najhumanijeg egzona i humanu neproteinsku kodirajuću sekvencu iza humanog stop kodona i iza humanog 3'UTR,
10. Genetski modifikovani miš iz zahteva 7, naznačen time što je humanizovani IL-15 gen na nekom drugom mestu u genomu miša koje nije endogeni IL-15 lokus
11. Postupak za dobijanje genetski modifikovanog miša koja se sastoji od uvođenja u genom miša humanizovanog IL-15 gena koji sadrži mišje IL-15 kodirajuće egzone 1 i 2 i humani genomski segment naznačen time što se humani IL-15 egzoni u pomenutom humanom genomskom segmentu sastoje od humanih IL-15 egzona 3.4,5 i 6, i što su ti IL-15 egzoni numerisani tako da je prvi kodirajući egzon egzon 1 i što je taj humanizovani IL-15 gen pod kontrolom svih endogenih regulatornih elemenata ispred mišjeg IL-15 na endogenom mišjem IL-15 lokusu, a pomenuti humanizovani IL-15 gen enkodira protein koji sadrži polipeptidnu sekvencu zrelog humanog IL-15.
12. Postupak iz zahteva 11, pri čemu je humanizovani IL-15 gen integrisan u genom na nekom drugom mestu koje nije endogeni IL-15 lokus.
RS20161140A 2013-10-15 2014-10-15 Životinje sa humanizovanim il-15 RS55472B1 (sr)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361891013P 2013-10-15 2013-10-15
EP14790452.8A EP2908626B1 (en) 2013-10-15 2014-10-15 Humanized il-15 animals
PCT/US2014/060568 WO2015057758A1 (en) 2013-10-15 2014-10-15 Humanized il-15 animals

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RS55472B1 true RS55472B1 (sr) 2017-04-28

Family

ID=51830649

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190349A RS58465B1 (sr) 2013-10-15 2014-10-15 Humanizovane il-15 životinje
RS20161140A RS55472B1 (sr) 2013-10-15 2014-10-15 Životinje sa humanizovanim il-15

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RS20190349A RS58465B1 (sr) 2013-10-15 2014-10-15 Humanizovane il-15 životinje

Country Status (27)

Country Link
US (5) US9155290B2 (sr)
EP (3) EP3138397B1 (sr)
JP (3) JP6492095B2 (sr)
KR (1) KR102376041B1 (sr)
CN (2) CN105744829B (sr)
AU (2) AU2014337526B2 (sr)
BR (1) BR112016008175A2 (sr)
CA (1) CA2926090C (sr)
CY (2) CY1118675T1 (sr)
DK (2) DK3138397T3 (sr)
ES (2) ES2613379T3 (sr)
HR (2) HRP20170380T1 (sr)
HU (2) HUE033272T2 (sr)
IL (2) IL244525B (sr)
LT (2) LT2908626T (sr)
MX (1) MX2016004781A (sr)
NZ (1) NZ718655A (sr)
PL (2) PL2908626T3 (sr)
PT (2) PT3138397T (sr)
RS (2) RS58465B1 (sr)
RU (1) RU2674910C2 (sr)
SG (2) SG10201607768YA (sr)
SI (2) SI3138397T1 (sr)
SM (3) SMT201700024T1 (sr)
TR (1) TR201904342T4 (sr)
WO (1) WO2015057758A1 (sr)
ZA (1) ZA201601676B (sr)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES3010323T3 (en) 2009-10-06 2025-04-02 Regeneron Pharma Genetically modified mice and engraftment
KR102714361B1 (ko) 2011-02-15 2024-10-11 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화된 ｍ－ｃｓｆ 마우스
KR102473555B1 (ko) 2012-09-07 2022-12-05 예일 유니버시티 유전적으로 변형된 비-인간 동물 및 이것들의 사용 방법
IL311744B2 (en) 2012-11-05 2025-10-01 Regeneron Pharma Genetically modified non-human animals and methods of using them
EP3138397B1 (en) 2013-10-15 2018-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized il-15 animals
EP3071025B1 (en) 2013-11-19 2018-10-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized a proliferation-inducing ligand gene
MX2016014504A (es) 2014-05-05 2017-05-23 Regeneron Pharma Animales c5 y c3 humanizados.
NO2785538T3 (sr) 2014-05-07 2018-08-04
KR20250096864A (ko) 2014-05-19 2025-06-27 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간 epo를 발현하는 유전자 변형된 비-인간 동물
EP3086637B1 (en) 2014-12-05 2019-01-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals having a humanized cluster of differentiation 47 gene
CN107896479B (zh) 2015-04-13 2021-07-13 再生元制药公司 人源化SIRPα-IL15敲入小鼠及其使用方法
KR102487839B1 (ko) 2016-02-04 2023-01-12 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 조작된 angptl8 유전자를 갖는 비인간 동물
SG10202001578RA (en) 2016-02-29 2020-04-29 Regeneron Pharma Rodents having a humanized tmprss gene
EP3476865B1 (en) 2016-06-28 2023-09-13 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Method for constructing pd-1 gene-modified humanized animal model and use thereof
US11279948B2 (en) 2016-08-31 2022-03-22 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric OX40
WO2018041120A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric tigit
CN107815468B (zh) 2016-08-31 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
WO2018041121A1 (en) 2016-08-31 2018-03-08 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric ctla-4
CN107815467B (zh) 2016-08-31 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
US11317611B2 (en) 2016-08-31 2022-05-03 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric PD-L1
CN108070613B (zh) 2016-11-11 2020-03-13 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
WO2018086594A1 (en) 2016-11-11 2018-05-17 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric tim-3
WO2018102546A1 (en) 2016-11-30 2018-06-07 The Jackson Laboratory Humanized mouse model with improved human innate immune cell development
CN108239659B (zh) 2016-12-23 2020-03-03 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
CN108424928B (zh) 2016-12-30 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化基因改造动物模型的制备方法及应用
US11629340B2 (en) 2017-03-03 2023-04-18 Obsidian Therapeutics, Inc. DHFR tunable protein regulation
CN108467873B (zh) 2017-03-17 2020-03-13 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 一种cd132基因缺失的免疫缺陷动物模型的制备方法及应用
WO2018177441A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Beijing Biocytogen Co., Ltd GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC SIRPα
CN108588126B (zh) 2017-03-31 2020-04-10 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 Cd47基因人源化改造动物模型的制备方法及应用
CN109136275B (zh) 2017-06-19 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化gitr基因改造动物模型的制备方法及应用
CN109136274B (zh) 2017-06-19 2021-04-23 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 人源化cd40基因改造动物模型的制备方法及应用
CN109136261B (zh) 2017-06-19 2021-03-16 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化cd28基因改造动物模型的制备方法及应用
CA3072331A1 (en) * 2017-08-09 2019-02-14 The Jackson Laboratory Immunodeficient mice expressing human interleukin 15
EP3585162B1 (en) 2017-09-29 2023-08-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodents comprising a humanized ttr locus and methods of use
WO2019072241A1 (en) 2017-10-13 2019-04-18 Beijing Biocytogen Co., Ltd NON-HUMAN ANIMAL GENETICALLY MODIFIED WITH PD-1 HUMAN OR CHIMERIC
CN109913493B (zh) 2017-12-12 2021-03-16 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 人源化cd3基因改造动物模型的制备方法及应用
SMT202400300T1 (it) 2018-07-16 2024-09-16 Regeneron Pharma Modelli di roditori della sindrome ditra e loro utilizzo
WO2020074005A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Beijing Biocytogen Co., Ltd Genetically modified non-human animal with human or chimeric genes
WO2020125763A1 (en) 2018-12-20 2020-06-25 Biocytogen Jiangsu Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric lag3
WO2020135518A1 (en) * 2018-12-25 2020-07-02 Biocytogen Jiangsu Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric il15
CN111218425B (zh) * 2019-01-17 2022-02-08 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 人源化转基因动物
CN117178959A (zh) 2019-04-04 2023-12-08 瑞泽恩制药公司 包括人源化凝血因子12基因座的非人动物
AU2020286382A1 (en) 2019-06-04 2021-11-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized TTR locus with a beta-slip mutation and methods of use
MX2021015122A (es) 2019-06-07 2022-04-06 Regeneron Pharma Animales no humanos que comprenden un locus de albumina humanizado.
CN114786479B (zh) * 2019-12-25 2023-12-15 江苏集萃药康生物科技股份有限公司 一种il-15人源化小鼠模型及其用途
WO2021154791A1 (en) * 2020-01-28 2021-08-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animals comprising a humanized pnpla3 locus and methods of use
CN111485001A (zh) * 2020-04-14 2020-08-04 澎立生物医药技术（上海）有限公司 具有nk细胞及adcc能力的人源化免疫系统小鼠的构建方法
CN112481303B (zh) * 2021-02-09 2021-05-25 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Il15ra基因人源化非人动物及其构建方法和应用
WO2025212991A1 (en) 2024-04-05 2025-10-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Rodent models of disease

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001058914A2 (en) * 2000-02-08 2001-08-16 Genaissance Pharmaceuticals, Inc. Haplotypes of the interleukin 15 gene
US7759541B2 (en) * 2004-12-13 2010-07-20 Iti Life Sciences Transgenic animals for assessing drug metabolism and toxicity
MX2007014474A (es) * 2005-05-17 2008-02-07 Univ Connecticut Composiciones y metodos para inmunomodulacion en un organismo.
ES2445193T3 (es) * 2008-06-27 2014-02-28 Merus B.V. Mamíferos no humanos productores de anticuerpos
RU2425880C2 (ru) * 2009-07-30 2011-08-10 Учреждение Российской академии наук Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН Способ получения трансгенных мышей
ES3010323T3 (en) 2009-10-06 2025-04-02 Regeneron Pharma Genetically modified mice and engraftment
JP5595517B2 (ja) * 2009-12-21 2014-09-24 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド ヒト化ＦｃγＲマウス
KR102714361B1 (ko) * 2011-02-15 2024-10-11 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 인간화된 ｍ－ｃｓｆ 마우스
US9043996B2 (en) * 2011-10-28 2015-06-02 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified major histocompatibility complex animals
PL2663575T3 (pl) 2011-10-28 2015-03-31 Regeneron Pharma Humanizowane IL-6 i receptor IL-6
DK2770821T3 (da) 2011-10-28 2017-11-27 Regeneron Pharma Genetisk modificerede major histocompatibility-kompleks-mus
KR101926442B1 (ko) * 2011-10-28 2018-12-12 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 키메라 주요 조직적합성 복합체 （ｍｈｃ） ｉｉ 분자들을 발현하는 유전자 변형된 마우스
US8962913B2 (en) 2012-06-18 2015-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized IL-7 rodents
KR102473555B1 (ko) 2012-09-07 2022-12-05 예일 유니버시티 유전적으로 변형된 비-인간 동물 및 이것들의 사용 방법
IL311744B2 (en) 2012-11-05 2025-10-01 Regeneron Pharma Genetically modified non-human animals and methods of using them
EP2958937B1 (en) 2013-02-22 2018-08-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice expressing humanized major histocompatibility complex
PT4269430T (pt) 2013-09-23 2025-08-06 Regeneron Pharma Animais não-humanos com um gene humanizado de proteína reguladora de sinal
EP3138397B1 (en) 2013-10-15 2018-12-26 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Humanized il-15 animals

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201601676B (en) 2019-12-18
EP2908626B1 (en) 2016-12-07
JP2019022518A (ja) 2019-02-14
SG10201607768YA (en) 2016-11-29
US20180116192A1 (en) 2018-05-03
IL244525B (en) 2019-10-31
US20200178508A1 (en) 2020-06-11
CN109090037B (zh) 2021-05-28
SMT201700024T1 (it) 2017-03-08
US11503813B2 (en) 2022-11-22
AU2014337526A1 (en) 2016-04-28
US12369570B2 (en) 2025-07-29
CA2926090C (en) 2022-07-05
AU2020286186B2 (en) 2024-05-23
DK2908626T3 (en) 2017-03-20
US10561125B2 (en) 2020-02-18
SI2908626T1 (sl) 2017-02-28
US20150366175A1 (en) 2015-12-24
HUE043969T2 (hu) 2019-09-30
KR102376041B1 (ko) 2022-03-18
ES2715949T3 (es) 2019-06-07
JP2019216750A (ja) 2019-12-26
RS58465B1 (sr) 2019-04-30
CA2926090A1 (en) 2015-04-23
BR112016008175A2 (pt) 2017-10-03
WO2015057758A1 (en) 2015-04-23
AU2020286186A1 (en) 2021-01-07
JP2016533192A (ja) 2016-10-27
JP6600061B2 (ja) 2019-10-30
RU2674910C2 (ru) 2018-12-13
RU2016116847A (ru) 2017-11-21
HUE033272T2 (en) 2017-11-28
JP6492095B2 (ja) 2019-03-27
IL244525A0 (en) 2016-04-21
US9155290B2 (en) 2015-10-13
DK3138397T3 (en) 2019-04-15
NZ718655A (en) 2022-08-26
US20230189772A1 (en) 2023-06-22
EP3138397B1 (en) 2018-12-26
HRP20190542T1 (hr) 2019-07-26
AU2014337526B2 (en) 2020-09-10
LT3138397T (lt) 2019-04-10
MX2016004781A (es) 2016-07-26
CN105744829A (zh) 2016-07-06
PL2908626T3 (pl) 2017-05-31
KR20160068774A (ko) 2016-06-15
TR201904342T4 (tr) 2019-05-21
CN109090037A (zh) 2018-12-28
US20150106961A1 (en) 2015-04-16
ES2613379T3 (es) 2017-05-24
SI3138397T1 (sl) 2019-04-30
LT2908626T (lt) 2017-01-25
PL3138397T3 (pl) 2019-06-28
SMT201700024B (it) 2017-03-08
SMT201900177T1 (it) 2019-05-10
CN105744829B (zh) 2018-08-07
PT3138397T (pt) 2019-03-26
CY1118675T1 (el) 2018-03-07
PT2908626T (pt) 2017-01-09
RU2016116847A3 (sr) 2018-06-07
HK1210659A1 (en) 2016-05-06
IL269907B (en) 2020-09-30
EP3138397A1 (en) 2017-03-08
CY1121405T1 (el) 2020-05-29
EP2908626A1 (en) 2015-08-26
EP3461331A1 (en) 2019-04-03
HRP20170380T1 (hr) 2017-05-19
SG11201601828XA (en) 2016-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US12369570B2 (en) Humanized IL-15 animals
WO2021093790A1 (en) Genetically modified non-human animal with human or chimeric genes
US20250134079A1 (en) Genetically modified non-human animal with human or chimeric genes
HK40006180A (en) Humanized il-15 animals
HK1233853A1 (en) Humanized il-15 animals
HK1233853B (en) Humanized il-15 animals
HK1210659B (en) Humanized il-15 animals