CN111154809A - 利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法和应用 - Google Patents

利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法和应用，涉及生物技术领域。本发明公开的利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法包括利用基因操作技术使Tmem30a基因在目标动物的足细胞中不表达或表达受到抑制。构建方法可以构建出肾小球疾病模型，该模型具有肾小球疾病的特征，可以为肾小球疾病的研究和治疗以及药物筛选提供模型保障。

Description

利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法和应用。
背景技术
肾脏病是一种严重危害人类健康的疾病，主要包括不同类型的肾炎和急性肾衰竭等。有资料显示，我国人群中慢性肾脏病的发生率为11-13％。
肾脏病的表型有：按解剖结构来分，肾脏病分为肾小球疾病、肾小管疾病、肾间质疾病和肾血管疾病；按发病机制分为原发性肾脏疾病、继发性肾脏疾病、遗传性肾脏疾病和感染性肾脏疾病；按病程可分为急性肾脏疾病和慢性肾脏疾病。在我国，肾小球疾病是引起肾衰竭的最主要原因。肾小球疾病共同的表现为(可不同时出现)：蛋白尿、水肿、血尿、尿量减少或无尿、肾功能正常或下降。肾小球疾病是一组疾病，病因各不相同，可能与遗传、免疫、代谢、感染和肿瘤等因素相关。不同种类肾小球疾病的治疗方法也不尽相同，但目的都是防止和延缓病程进展，改善临床症状及防止并发症(包括高血压脑病、心力衰竭和尿毒症等)。临床上对患者的治疗包括一般治疗，即多休息、限盐、限水和限制食物中的蛋白；强化治疗，例如糖皮质激素和抗血小板药物等；替代治疗，血尿透析甚至肾脏移植。但是，现有的肾小球疾病治疗方法以经验为主，通常效果不理想、预后差并且难以避免药物的对肝肾的毒副作用。
为了更好地研究和治疗肾脏病，以及筛选出可有效治疗肾脏病的药物，本领域需要能够模拟出肾脏病特征的疾病模型，而目前，缺乏这样疾病模型。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法和应用。本发明提供的构建方法可以构建出具有肾小球疾病的动物模型，该模型具有肾小球疾病的特征，可以为肾小球疾病甚至是肾脏病的研究和治疗以及药物筛选提供模型保障。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法，所述肾小球疾病模型具有肾小球硬化表型，所述构建方法包括：利用基因操作技术使Tmem30a基因在目标动物的足细胞中不表达或表达受到抑制。
本发明的研究首次发现，在足细胞中敲除Tmem30a基因，可使动物体表型出肾脏病的典型特征即肾小球硬化。因此，通过利用基因操作技术使Tmem30a基因在目标动物的足细胞中不表达或表达受到抑制，构建出具有肾小球硬化表型的肾脏病动物模型，为本领域研究人员深入研究肾脏病尤其是具有肾小球硬化表型的肾脏病的发病机制，以及筛选出可有效治疗肾脏病的药物提供的模型基础。
在本发明揭示了敲除了足细胞中Tmem30a基因可导致肾小球硬化的基础上，本领域技术人员容易想到采用任何适宜的基因操作技术操作Tmem30a基因使其在目标动物的足细胞不表达或表达受到抑制即不发挥正常的功能。基因操作技术可以是本领域已知的如基因编辑技术、基因敲除技术或RNA干扰技术等技术。在已知目标动物的Tmem30a基因序列的基础上，本领域技术人员可以利用基因编辑技术、基因敲除技术或RNA干扰技术对Tmem30a基因操作，使其在足细胞不发挥正常的功能，以得到肾脏病动物模型。
在可选的实施方式中，所述基因操作技术选自基因编辑技术、基因敲除技术和RNA干扰技术中的任意一种或几种的组合。
在可选的实施方式中，所述基因编辑技术选自CRISPR/Cas9技术、ZFN技术和TALEN技术中的任意一种或几种的组合。
在可选的实施方式中，所述基因操作技术为Cre-loxp基因敲除技术。
在可选的实施方式中，所述目标动物为非人哺乳动物。
在可选的实施方式中，所述非人哺乳动物选自小鼠、大鼠、马、猪、猴、狗和猿中的任意一种。
对于任何非人哺乳动物，只要其具有Tmem30a基因既可以通过本发明的方法构建出相应的肾脏病模型。无论选用何种非人哺乳动物，构建肾脏病模型，均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述非人哺乳动物为小鼠。
在可选的实施方式中，利用Cre-loxp基因敲除技术使Tmem30a基因在目标动物的足细胞中不表达或表达受到抑制：将Tmem30a基因条件性敲除纯合子小鼠与转NPHS2-Cre基因小鼠交配，以得到在足细胞中敲除了Tmem30a基因的纯合子小鼠。
在可选的实施方式中，所述肾脏病选自膜性肾小球肾炎、微小病变性肾小球肾炎、局灶性节段性肾小球肾炎中的任意一种。
第二方面，实施例提供由前述实施方式中任一项所述的利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法所得到的肾小球疾病模型在肾小球疾病研究中的应用。
在可选的实施方式中，所述研究示意非疾病的诊断或治疗为目的。
第三方面，实施例提供由前述实施方式中任一项所述的利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法所得到的肾小球疾病模型在筛选用于预防或治疗肾脏病药物中的应用。
在可选的实施方式中，所述应用包括：给予上述肾小球疾病模型施用候选药物；
观察被施用所述候选药物后的肾小球疾病模型是否出现以下变化，如果出现以下变化中的任意一种或几种，则指示所施用的候选药物可以作为治疗肾脏病的药物：
(1)施用候选药物后，肾小球疾病模型的肾小球硬化程度较施用候选药物前得到抑制或减轻。
(2)施用候选药物后，肾小球疾病模型的蛋白尿较施用候选药物前得控制或改善，例如未出现蛋白尿或尿液中白蛋白和肌酐含量降低。
(3)施用候选药物后，肾小球疾病模型的足细胞的细胞质中自噬小体数量较施用候选药物前减少。
当然，需要说明的是，上述的变化仅仅是示例性的说明，本领域技术人员可以根据实际情况，以本发明方法构建出的肾小球疾病模型作物研究对象，选择合适的观察指标，观察施用候选药物前后的这些指标的变化，根据指标的变化情况作出合理的判断，以指示所施用的候选药物是否可以作为治疗肾脏病的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为Tmem30a基因敲除小鼠构建示意图。
图2为tdTomato报告基因构建示意图。
图3为小鼠基因型鉴定图。
图4为IHC染色结果，表明NPHS2-Cre酶在足细胞中特异性表达，Cre酶存在时，Tmem30a在小鼠足细胞中被敲除；图中：WT-野生型小鼠，KO-Tmem30a基因敲除小鼠。
图5为尿蛋白定量结果；Tmem30a基因敲除小鼠出现蛋白尿。
图6过碘酸雪夫染色结果；Tmem30a基因敲除小鼠出现肾小球硬化和蛋白管型。
图7为肾脏石蜡切片的免疫染色结果；Tmem30a基因敲除小鼠成熟足细胞减少。
图8为肾脏石蜡切片的免疫染色结果；Tmem30a基因敲除小鼠足细胞特异性突触连接蛋白减少。
图9为肾皮质透射电镜(TEM)结果，图中：CL：capillary lumen(毛细血管腔)；GBM：glomerular basement membrane(基底膜)；Endo：endothelium(内皮细胞)；RBC：red bloodcell(红细胞)；Podo：podocyte(足细胞)；SD：slit diaphragm(裂孔隔膜)；fp：footprocesses(足突)。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
Tmem30a在肾脏足细胞中特异性敲除小鼠模型的构建
本实施例利用Loxp-Cre条件敲除技术，构建了在肾小球足细胞中特异性敲除Tmem30a的肾小球硬化小鼠模型。
(1)参照申请号为2017103803265、名称为胰岛β细胞条件性敲除Tmem30a基因小鼠模型的构建方法及应用的中国专利申请的方法得到Tmem30a基因条件性敲除纯合子小鼠(Tmem30a loxp/loxp小鼠)；
(2)将NPHS2-Cre-Tmem30a+/+小鼠(为肾脏肾小球特异表达的Cre酶的Tmem30a基因正常的小鼠，购买自美国杰克森实验室)和Tmem30aloxp/loxp小鼠交配(参考图1，Tmem30a基因的第3外显子两端具有loxp序列)，根据孟德尔遗传定律，后代中有一半小鼠基因型为NPHS2-Cre-Tmem30aloxp/+。
(3)将NPHS2-Cre-Tmem30a loxp/+小鼠和Tmem30aloxp/loxp小鼠交配，得到足细胞中特异性敲除Tmem30a基因(第3外显子)的小鼠(NPHS2-Cre-Tmem30aloxp/loxp)(图1和图2)，该Tmem30a基因敲除小鼠即可作为具有肾小球硬化特征的肾小球疾病模型(后文也叫作Tmem30a基因敲除小鼠)，其可用于肾小球疾病研究以及肾脏病药物的筛选领域等。
利用碱裂解法提取小鼠尾巴基因组DNA。利用引物Tmem30a-loxp-F:5’-ATTCCCCTTCAAGATAGCTAC-3’和Tmem30a-loxp-F:5’-AATGATCAACTGTAATTCCCC-3’，对小鼠尾巴基因组DNA进行PCR扩增进行基因分型，纯合子条件敲除小鼠产生214bp，野生型小鼠产生179bp，在杂合子小鼠中扩增出两种产物。用通用Cre引物对NPHS2-Cre进行基因分型：Cre-F:5’-GAACGCACTGATTTCGACCA-3’和Cre-F:5’-GCTAACCAGCGTTTTCGTTC-3’。
图2中Tmem30aloxp/loxp PCR扩增出一个214bp的条带，Tmem30aloxp/+扩增出两个条带，分别是179和214bp，Tmem30a+/+扩增出一个179bp的条带，NPHS2-Cre阳性的小鼠扩增出350bp的条带。
实施例2
为监测Cre介导的loxp位点重组效率。本实施例构建了在足细胞中特异性表达tdTomato报告基因的小鼠模型(参考图3)。tdTomato是一个转基因红色荧光蛋白Tomato报告基因。TdTomato报告基因的起始密码子前有STOP基因盒，防止下游tdTomato报告基因的表达。STOP基因盒两端带有同向排列的Loxp位点，当Cre存在时，STOP基因盒被移除，tdTomato表达。因此，通过观察tdTomato表达产生的荧光确定Cre重组酶的表达位置和效率。
实验例1
鉴定实施例1的肾脏病小鼠模型的足细胞中Tmem30a基因被敲除
采用免疫组织化学(Immunohistochemistry)鉴定Tmem30a基因是否在肾脏病小鼠模型被成功敲除。结果见图4，图4上部为野生型小鼠Rosa和Nephrin共定位的免疫荧光染色。Rosa和Nephrin(肾脏肾小球特异表达的蛋白)共定位表明NPHS2-Cre酶表达位置的正确性。图4下部分别为野生型小鼠和Tmem30a基因敲除小鼠Rosa和TMEM30A共定位的免疫荧光染色。TMEM30A在肾小球中广泛表达，野生型小鼠肾小球中Rosa和TMEM30A有共定位，而Tmem30a基因敲除小鼠中Rosa和TMEM30A没有共定位，表明TMEM30A被敲除。图4表明了TMEM30A在肾小球足细胞中被特异性敲除。
由此说明在实施例1得到的Tmem30a基因敲除小鼠的足细胞中，Cre酶正确表达，Tmem30a基因被成功敲除。
实验例2
对实施例1的肾脏病小鼠模型的表型鉴定
(1)Tmem30a基因敲除小鼠出现蛋白尿
利用代谢笼收集野生型和实施例1Tmem30a基因敲除小鼠的24小时尿。尿液以500g离心5分钟，收集上清对白蛋白和尿肌酐进行定量分析。利用罗氏(Roche)小鼠特异性白蛋白酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒和肌酸酐测定试剂盒(酶法)分别测定尿白蛋白和尿肌酐的含量。结果见图5。
由图5可以看出，Tmem30a基因敲除小鼠出现蛋白尿。图中WT代表野生型小鼠，KO代表Tmem30a基因敲除小鼠。5M代表出生后5个月，9M代表出生后9个月。Urinary Alb/Cr是尿液白蛋白/尿肌酐比值。可以看出Tmem30a基因敲除小鼠在5个月即出现蛋白尿症状，11个月表型加重。
(2)Tmem30a基因敲除小鼠出现进行性肾小球硬化野生型和Tmem30a基因敲除小鼠肾脏组织石蜡切片脱蜡后至10g/L高碘酸氧化15min。蒸馏水冲洗后至雪夫染液中染色30min.再用蒸馏水冲洗后苏木素染液复染细胞核10min。蒸馏水冲洗后，常规脱水，透明，封固，镜检。
野生型(图中Ctrl)和实施例1Tmem30a基因敲除小鼠(图中cKO)的过碘酸雪夫染色(Periodic acid-Schiff)表明和野生型小鼠相比，Tmem30a基因敲除小鼠肾脏出现进行性肾小球硬化。在出生后两个月，Tmem30a基因敲除小鼠出现轻微的系膜增生。五个月时，整个肾皮质可见明显的肾小球硬化和蛋白管型。九个月时，肾小球硬化程度加重影响多数肾小球(图6，星号指出肾脏出现系膜增生，箭头指出蛋白管型，三角形指出肾小球硬化)。
(3)Tmem30a基因敲除小鼠成熟足细胞减少并且功能发生缺失
对野生型和Tmem30a基因敲除小鼠肾脏组织石蜡切片进行免疫组织染色。石蜡切片脱水封闭后分别用一抗Wilms Tumor-1(WT1)和synaptopodin四度染色过夜。用磷酸盐缓冲液冲洗3次后加入二抗，室温染色1小时。磷酸盐缓冲液冲洗3次后加入DAPI复染一小时。
用投射电镜观察野生型和Tmem30a基因敲除小鼠肾皮质组织。取野生型和Tmem30a基因敲除小鼠肾脏，将皮质部分切成1mmx1mm的小块，置于固定液(含有2.5％戊二醛、1.25％多聚甲醛和0.003％苦味酸的0.1M碳酸钠缓冲液(pH7.4))室温固定2小时用。用磷酸盐缓冲液冲洗固定后的肾皮质，再用含1％四氧化锇的0.1M碳酸钠缓冲液(pH7.4)固定。将固定后的组织经乙醇、丙酮浓度梯度脱水后包埋至环氧树脂中，60℃孵育48小时。超薄切片(60nm)用乙酸铀酰和柠檬酸铅染色。
鉴于实施例1Tmem30a基因敲除小鼠出现蛋白尿和严重的肾小球硬化，这些表型提示其足细胞受到了损伤。通过对肾脏石蜡切片的免疫染色发现，成熟足细胞标志蛋白WilmsTumor-1(WT1)在小鼠出生后第五个月显著减少，表明足细胞的丢失(图7，图中WT代表野生型小鼠，KO代表Tmem30a基因敲除小鼠)。此外，synaptopodin是足细胞的特异性突触连接蛋白，该蛋白的缺失提示足细胞的功能和结构的缺失(图8)。
为了进一步研究Tmem30a在足突形成过程中的作用，我们对9月龄野生型和实施例1Tmem30a基因敲除小鼠的肾皮质超微结构进行透射电镜(TEM)分析。实施例1Tmem30a基因敲除小鼠足细胞细胞质中自噬小体数量增加(井号)；足突融合，裂孔隔膜(slitdiaphragm，SD)消失(三角形)；基底膜(glomerular basement membrane,GBM)增厚(箭头)；内皮脱落(双箭头)；足细胞空泡(星号)(图9，Ctrl代表野生型小鼠，cKO代表Tmem30a基因敲除小鼠)，提示足细胞中的Tmem30a基因的缺陷导致足突形成受损并最终损害肾脏的过滤功能。
综上实验结果，通过Cre-Loxp条件敲除技术，我们首次构建了在肾脏足细胞中特异性敲除Tmem30a基因的小鼠模型，在基因水平探索肾脏疾病的发病机制。该模型小鼠出现进行性肾小球硬化的病症，小鼠出现蛋白尿，足细胞丢失，裂孔隔膜融合等肾脏病的典型特征。说明，足细胞中特异性敲除Tmem30a基因的小鼠可以作为肾脏病模型，用于肾脏病的研究和治疗药物的筛选中。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法，其特征在于，所述肾小球疾病模型具有肾小球硬化表型，所述方法包括：利用基因操作技术使Tmem30a基因在目标动物的足细胞中不表达或表达受到抑制。
2.根据权利要求1所述的利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法，其特征在于，所述基因操作技术选自基因编辑技术、基因敲除技术和RNA干扰技术中的任意一种或几种的组合。
3.根据权利要求2所述的利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法，其特征在于，所述基因编辑技术选自CRISPR/Cas9技术、ZFN技术和TALEN技术中的任意一种或几种的组合。
4.根据权利要求2所述的利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法，其特征在于，所述基因操作技术为Cre-loxp基因敲除技术。
5.根据权利要求4所述的利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法，其特征在于，所述目标动物为非人哺乳动物；
优选地，所述非人哺乳动物选自小鼠、大鼠、马、猪、猴、狗和猿中的任意一种。
6.根据权利要求5所述的利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法，其特征在于，所述非人哺乳动物为小鼠。
7.根据权利要求6所述的利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法，其特征在于，
利用Cre-loxp基因敲除技术使Tmem30a基因在目标动物的足细胞中不表达或表达受到抑制：将Tmem30a基因条件性敲除纯合子小鼠与转NPHS2-Cre基因小鼠交配，以得到在足细胞中敲除了Tmem30a基因的纯合子小鼠。
8.根据权利要求1-7任一项所述的利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法，其特征在于，所述肾小球疾病选自微小病变性肾小球肾炎、局灶性节段性肾小球肾炎的任意一种。
9.由权利要求1-8中任一项所述的利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法所得到的肾小球疾病模型在肾小球疾病研究中的应用。
10.由权利要求1-8中任一项所述的利用基因操作技术构建肾小球疾病模型的方法所得到的肾小球疾病模型在筛选用于预防或治疗肾脏病药物中的应用。
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