CN114853871A - Csf1和/或csf1r基因人源化的非人动物及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种CSF1和/或CSF1R基因人源化的非人动物及其构建方法，一种人源化CSF1和/或CSF1R蛋白、人源化CSF1和/或CSF1R基因、CSF1和/或CSF1R基因的靶向载体，以及上述构建方法获得的非人动物及其在生物医药领域的应用，利用同源重组的方式将人CSF1和/或CSF1R基因的全部或部分核苷酸序列导入非人动物基因组中，该动物体内能正常表达人或人源化CSF1和/或CSF1R蛋白，可以作为人CSF1和/或CSF1R信号机理研究、肿瘤及免疫相关疾病药物筛选的动物模型，对免疫靶点的新药研发具有重要的应用价值。

Description

CSF1和/或CSF1R基因人源化的非人动物及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于动物基因工程和基因遗传修饰领域，具体地说，涉及一种CSF1和/或CSF1R基因人源化的非人动物及其构建方法和在生物医药领域的应用。

背景技术

细胞的分化、发育、增殖乃至活化，均受到多个细胞因子信号的协同作用，其中巨噬细胞集落刺激因子M-CSF(Macrophage-colony stimulating factor，又称colony-stimulating factor 1，CSF1)是骨髓祖细胞分化为单核细胞谱系细胞(monocyte lineagecells)，如巨噬细胞，破骨细胞和小胶质细胞所必须的细胞因子，在单核巨噬细胞的存活、增殖、分化及维持活性促进造血功能中具有重要作用。除了此之外，已有研究表明CSF1在破骨细胞的分化、雌性生殖道细胞的分化、胎盘的形成及血管和淋巴的发育过程也有重要作用，并做为促炎因子参与炎性反应，是肿瘤和炎症的有效标志。

CSF1R(Colony Stimulating Factor 1Receptor)，又称CD115、C-FMS、FIM2，是一种单链酪氨酸激酶跨膜受体，属于Ⅲ型蛋白酪氨酸激酶受体家族(RTKⅢ)，由巨噬细胞、成纤维细胞、上皮细胞和肿瘤细胞产生，能调节巨噬细胞的形态和运动、促进单核吞噬细胞的增殖和分化，而且还是炎症病灶的趋化因子，在免疫应答中发挥重要作用。CSF1R被CSF1激活后会形成同源二聚体，导致其激酶活性的活化，进而激活包括MAPK/ERK在内的许多细胞内信号通路。当ERK磷酸化时，Elk1(ETS转录因子家族成员)与血清应答元件(SRF)形成复合物，导致大量有丝分裂诱导基因的表达。这种相互作用可以被许多癌症类型所利用以逃避免疫系统监控，例如弥漫型腱鞘膜巨细胞瘤(dt-GCT)，通过过度表达细胞因子CSF1，驱动肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)的发育和存活，进而抑制肿瘤的局部免疫反应。目前已在乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌等多种恶性肿瘤中检测到CSF1R的异常表达。此外，CSF1R信号通路激活的巨噬细胞群还与炎症和骨病等多种疾病的病理学相关。Xu-Ming Dai等人研究发现CSF1R基因敲除可导致小鼠发生骨质疏松(Xu-Ming Dai et al.Blood.2002,99(1):111-120.)；X.Hu等人报道CSF1R在类风湿性关节炎的组织和细胞中高表达，可促进类风湿关节炎滑膜细胞(RA-FLS)增殖，抑制细胞凋亡并加速细胞周期(X.Hu.etal.Clinical&ExperimentalImmunology.2019,195(2):237-250.)。

随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型(humanized animal model)是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型。更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源化蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战(Scheer N.et al.Drug Discov Today；18(23-24):1200-11,2013)。

鉴于CSF1/CSF1R信号通路在免疫治疗领域具有巨大应用价值，为进一步的研究相关的生物学特性，提高临床前期的药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发涉及CSF1/CSF1R信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化非人动物交配得到多基因人源化动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。

发明内容

本发明利用基因编辑技术，用人的正常或突变基因替换非人动物基因组的同源基因，建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因的非人动物。通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。

本发明的第一方面，提供了一种人源化CSF1蛋白，所述的人源化CSF1蛋白包含人CSF1蛋白的全部或部分和非人动物CSF1蛋白的部分。

优选的，所述的人源化CSF1蛋白包含人CSF1蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化CSF1蛋白包含人CSF1蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。

优选的，所述的非人动物CSF1蛋白的部分为非人动物CSF1蛋白的信号肽和/或胞外区。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1蛋白包含人CSF1蛋白胞外区的全部或部分，优选的，包含至少50个连续氨基酸的人CSF1蛋白胞外区，例如包含至少50、100、200、300、400、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、464个连续氨基酸的人CSF1蛋白胞外区，进一步优选的，包含459个连续氨基酸的人CSF1蛋白胞外区；优选的，包含N端去除0-5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的人CSF1蛋白胞外区，进一步优选的，包含N端去除5个氨基酸的人CSF1蛋白胞外区；更优选的，包含与SEQ ID NO:2的第38-496位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第38-496位所示的氨基酸序列；所述的人源化CSF1蛋白还包含人CSF1蛋白跨膜区的全部或部分，优选的，所述的跨膜区包含与SEQ ID NO:2的第497-517位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第497-517位所示氨基酸序列；所述的人源化CSF1蛋白还包含人CSF1蛋白胞质区的全部或部分，优选的，所述的胞质区包含与SEQ ID NO:2的第518-554位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第518-554位所示氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CSF1蛋白包含人CSF1基因的1号至9号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的，包含1号至9号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分。更进一步优选的，包含2号至8号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分编码的氨基酸序列的全部或部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、70、80、90、100、110、120、123bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含51bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含编码胞外区去除N端1-5优选1、2、3、4、5更优选为编码胞外区去除N端5个氨基酸的2号外显子的核苷酸序列，8号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、56bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含43bp的核苷酸序列；优选的，8号外显子的部分包含从8号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。最为优选的，所述的人源化CSF1蛋白包含与SEQ ID NO：5具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列或者SEQ ID NO：5编码的氨基酸序列。

优选的，所述人源化CSF1蛋白的信号肽来源于非人动物，所述人源化CSF1蛋白的胞外区至多0-5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸序列来源于非人动物，其中，所述的人源化CSF1蛋白的胞外区包含非人动物CSF1蛋白胞外区N端0-5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸序列，进一步优选的，包含非人动物CSF1蛋白胞外区N端5个氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CSF1蛋白还包含非人动物CSF1基因编码的氨基酸序列的全部或部分，优选为非人动物CSF1基因的1号和/或9号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选还包含2号外显子的部分和/或8号外显子的部分编码的氨基酸序列的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

A)为SEQ ID NO：2的第38-554位氨基酸序列的全部或部分；

B)与SEQ ID NO：2的第38-554位氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：2的第38-554位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

D)与SEQ ID NO：2的第38-554位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：

I)为SEQ ID NO：10氨基酸序列的全部或部分；

II)与SEQ ID NO：10氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％的氨基酸序列；

III)与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

IV)与SEQ ID NO：10所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第二方面，提供了一种人源化CSF1基因，所述的人源化CSF1基因包含人CSF1基因的部分和非人动物CSF1基因的部分。

优选的，所述的人源化CSF1基因包含编码人CSF1蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列，其中，所述的胞外区包含人CSF1蛋白胞外区的全部或部分，优选的，包含至少50个连续氨基酸的人CSF1蛋白胞外区，例如包含至少50、100、200、300、400、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、464个连续氨基酸的人CSF1蛋白胞外区，进一步优选的，包含459个连续氨基酸的人CSF1蛋白胞外区；优选的，包含N端去除0-5(例如0、1、2、3、4、5)个氨基酸的人CSF1蛋白胞外区，进一步优选的，包含N端去除5个氨基酸的人CSF1蛋白胞外区；更优选的，包含与SEQ ID NO:2的第38-496位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第38-496位所示的氨基酸序列；所述的跨膜区包含人CSF1蛋白跨膜区的全部或部分，优选的，所述的跨膜区包含与SEQ ID NO:2的第497-517位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第497-517位所示氨基酸序列；所述的胞质区包含人CSF1蛋白胞质区的全部或部分，优选的，所述的胞质区包含与SEQ ID NO:2的第518-554位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第518-554位所示氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CSF1基因编码上述的人源化CSF1蛋白。

优选的，所述的人源化CSF1基因包含人CSF1基因的1号至9号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至9号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含2号至8号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或7-8号内含子，更优选的包含2-8号外显子之间的任一内含子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、70、80、90、100、110、120、123bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含51bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含编码胞外区去除N端1-5优选1、2、3、4、5，更优选为编码胞外区去除N端5个氨基酸的2号外显子的核苷酸序列，8号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、56bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含43bp的核苷酸序列；优选的，8号外显子的部分包含从8号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。

优选的，所述的非人动物CSF1基因的部分为非人动物CSF1基因的1号和/或9号外显子；进一步优选还包含非人动物2号外显子的部分和/或8号外显子的部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1基因包含与SEQ ID NO：6、7和/或8具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：6、7和/或8所示的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1基因包含下列组中的一种：

(A)为SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(C)与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(D)具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1基因转录的mRNA选自下列组中的一种：

(i)为SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的全部或部分；

(ii)与SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(iii)与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(iv)与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CSF1基因还包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-Off System/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第三方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含人CSF1基因的部分。

优选的，所述的人CSF1基因的部分包含人CSF1基因的1号至9号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至9号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合。再进一步优选的，包含2号至8号外显子的全部或部分。更进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或7-8号内含子，更优选的包含2-8号外显子之间的任一内含子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、70、80、90、100、110、120、123bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含51bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含编码胞外区去除N端1-5优选1、2、3、4、5，更优选为编码胞外区去除N端5个氨基酸的2号外显子的核苷酸序列，8号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、56bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含43bp的核苷酸序列；优选的，8号外显子的部分包含从8号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。最为优选的，所述的靶向载体包含与SEQ IDNO：5具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列一致。

优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物CSF1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000069.7至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：3至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：3所示。和/或，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物CSF1基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000069.7至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：4至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：4所示。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物CSF1基因座上。进一步优选的，位于CSF1基因的1号至9号外显子上。更进一步优选的，位于2号至8号外显子上。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为具有两个Frt重组位点，分别同向连接在抗性基因的两侧。

本发明的第四方面，提供了一种包含上述靶向载体的细胞。

本发明的第五方面，提供了上述靶向载体，或者上述的细胞在CSF1基因修饰中的应用，优选的，所述的应用包括但不限于敲除、插入或替换。

本发明的第六方面，提供了一种CSF1基因人源化的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括用包含人CSF1基因的部分核苷酸序列导入非人动物CSF1基因座，所述的非人动物体内表达人或人源化CSF1蛋白。

优选的，所述的人源化CSF1蛋白包括上述的人源化CSF1蛋白。

优选的，所述的非人动物的基因组中还包含人源化CSF1基因，所述的人源化CSF1基因包括上述的人源化CSF1基因。

优选的，所述的人CSF1基因的部分核苷酸序列包含人CSF1基因的1号至9号外显子的全部或部分核苷酸序列，进一步优选的，包含1号至9号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分核苷酸序列，再进一步优选的，包含2号至8号外显子的全部或部分核苷酸序列。最为优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还包含2-3号内含子和/或7-8号内含子，更优选的包含2-8号外显子之间的任一内含子，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、60、70、80、90、100、110、120、123bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含51bp的核苷酸序列；优选的，2号外显子的部分包含编码胞外区去除N端1-5优选1、2、3、4、5，更优选为5个氨基酸的2号外显子的核苷酸序列，8号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、56bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含43bp的核苷酸序列；优选的，8号外显子的部分包含从8号外显子第一个核苷酸开始至终止密码子。在本发明的一个具体实施方式中，包含与SEQ ID NO：5具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码人CSF1蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CSF1基因座。进一步优选的，所述的构建方法包括用包含编码人CSF1蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CSF1基因座；优选的，用包含编码人CSF1蛋白的跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CSF1基因座，其中，所述的胞外区包含人CSF1蛋白胞外区的全部或部分，优选的，包含至少50个连续氨基酸的人CSF1蛋白胞外区，例如包含至少50、100、200、300、400、450、451、452、453、454、455、456、457、458、459、460、464个连续氨基酸的人CSF1蛋白胞外区，进一步优选的，包含459个连续氨基酸的人CSF1蛋白胞外区；优选的，包含N端去除0-5(例如0、1、2、3、4、5)个连续氨基酸的人CSF1蛋白胞外区，进一步优选的，包含N端去除5个连续氨基酸的人CSF1蛋白胞外区；更优选的，包含与SEQ ID NO:2的第38-496位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第38-496位所示的氨基酸序列；所述的跨膜区包含人CSF1蛋白跨膜区的全部或部分，优选的，所述的跨膜区包含与SEQ ID NO:2的第497-517位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第497-517位所示氨基酸序列；所述的胞质区包含人CSF1蛋白胞质区的全部或部分，优选的，所述的胞质区包含与SEQ ID NO:2的第518-554位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第518-554位所示氨基酸序列，更进一步优选的，用包含与编码SEQID NO:2的第38-554位的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者用包含编码SEQ ID NO:2的第38-554位的核苷酸序列导入非人动物CSF1基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人CSF1蛋白的cDNA序列导入非人动物CSF1基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人源化CSF1蛋白的核苷酸序列导入非人动物CSF1基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，用包含人源化CSF1基因的核苷酸序列导入非人动物CSF1基因座。

优选的，本申请中所述的导入包括但不限于插入、替换或转基因，所述的替换优选为原位替换。

优选的，所述的插入或替换的位点为CSF1基因的内源调控元件之后。

优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源CSF1基因的编码框或者破坏插入序列之后的内源CSF1基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源CSF1基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。

进一步优选的，可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子或含有终止功能的序列等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源CSF1蛋白不能正常表达。

优选的，所述的导入为替换或插入，在本发明的一个具体实施方式中，所述的导入非人动物CSF1基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的，非人动物CSF1基因的2号至8号外显子的全部或部分被替换，更进一步优选的，非人动物CSF1基因的2号外显子的部分、3号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分被替换。

优选的，编码SEQ ID NO：1的第38-552位所示氨基酸的核苷酸序列被替换。

优选的，所述的非人动物是纯合或者杂合的。

优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化CSF1基因。

优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化CSF1蛋白。

优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、规律成簇间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。

优选的，使用上述的靶向载体进行非人动物的构建。

根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将CSF1基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因为CSF1R、PD-1、PD-L1、IL6、IL3、IL15、CSF2、TPO和CD40中的至少一种基因修饰的非人动物。

优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的CSF1R、PD-1、PD-L1、IL6、IL3、IL15、CSF2、TPO和CD40蛋白中的至少一种。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被替换基因座为纯合或杂合的。

优选的，所述其他基因为CSF1R基因，所述的CSF1R基因为人源化CSF1R基因。

优选的，所述的非人动物包含人或人源化CSF1R基因，所述的构建方法包括用包含人CSF1R基因的部分核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座，所述的非人动物表达人或人源化CSF1R蛋白。

优选的，所述的人源化CSF1R蛋白包含人CSF1R蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人源化CSF1R蛋白包含人CSF1R蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化CSF1R蛋白包含人CSF1R蛋白的胞外区的全部或部分。

优选的，所述的人源化CSF1R蛋白还包含非人动物CSF1R蛋白的部分，更优选为非人动物CSF1R蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞质区。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1R蛋白包含的人CSF1R蛋白的胞外区的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：35的第20-517位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：35的第20-517位所示氨基酸序列一致；信号肽、跨膜区和胞质区来源于非人动物。

优选的，所述的人源化CSF1R蛋白包含人CSF1R基因的1号至22号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的，包含1号至22号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分。更进一步优选的，包含3号至11号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。再进一步优选的，包含3号外显子的部分、4号外显子至10号外显子的全部和11号外显子的部分，其中，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、210、220、230、240、250、251、252、253、254、255、256、258bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含250bp的核苷酸序列；3号外显子的部分包含编码胞外区的3号外显子的核苷酸序列，11号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、41、42、43、44、45、50、60、70、80、90、100、110、116bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含41bp的核苷酸序列；11号外显子的部分包含编码胞外区的11号外显子的核苷酸序列。最为优选的，所述的人源化CSF1R蛋白包含与SEQ IDNO：38具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列或者SEQ ID NO：38编码的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CSF1R蛋白还包含非人动物CSF1R基因编码的氨基酸序列的全部或部分，优选为非人动物CSF1R基因的1号至2号外显子和/或12号至22号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选还包含3号外显子的部分和/或11号外显子的部分编码的氨基酸序列的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1R蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

A)为SEQ ID NO：35的第20-517位氨基酸序列的全部或部分；

B)与SEQ ID NO：35的第20-517位氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：35的第20-517位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

D)与SEQ ID NO：35的第20-517位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1R蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：

I)为SEQ ID NO：43氨基酸序列的全部或部分；

II)与SEQ ID NO：43氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

III)与SEQ ID NO：43所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

IV)与SEQ ID NO：43所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CSF1R基因包含编码人CSF1R蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，包含编码人CSF1R蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列。更进一步优选的包含与编码SEQ ID NO：35的第20-517位的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含编码SEQ ID NO：35的第20-517位的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CSF1R基因编码上述的人源化CSF1R蛋白。

优选的，所述的人源化CSF1R基因包含人CSF1R基因的1号至22号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至22号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含3号至11号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含3号外显子的部分、4号外显子至10号外显子的全部和11号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或10-11号内含子，更优选的包含3-11号外显子之间的任一内含子，其中，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、210、220、230、240、250、251、252、253、254、255、256、258bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含250bp的核苷酸序列；3号外显子的部分包含编码胞外区的3号外显子的核苷酸序列，11号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、41、42、43、44、45、50、60、70、80、90、100、110、116bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含41bp的核苷酸序列；11号外显子的部分包含编码胞外区的11号外显子的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CSF1R基因还包含非人动物CSF1R基因的部分；优选为非人动物CSF1R基因的1号至2号外显子和/或12号至22号外显子，进一步优选还包含3号外显子的部分和/或11号外显子的部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1R基因包含与SEQ ID NO：39、40和/或41具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：39、40和/或41所示的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1R基因包含下列组中的一种：

(A)为SEQ ID NO：38所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)与SEQ ID NO：38所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(C)与SEQ ID NO：38所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(D)具有SEQ ID NO：38所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1R基因转录的mRNA选自下列组中的一种：

(i)为SEQ ID NO：42所示核苷酸序列的全部或部分；

(ii)与SEQ ID NO：42所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(iii)与SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(iv)与SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码人CSF1R蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。进一步优选的，用包含编码人CSF1R蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。更进一步优选的，用包含与编码SEQ ID NO：35的第20-517位的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者用包含编码SEQ ID NO：35的第20-517位的核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。

优选的，所述的构建方法包括用包含人CSF1R基因的部分核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。进一步优选的，用包含人CSF1R基因的1号至22号外显子的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。更进一步优选的，用包含1号至22号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。再进一步优选的，用包含3号至11号外显子的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。最为优选的，用包含3号外显子的部分、4号外显子至10号外显子的全部和11号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或10-11号内含子核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座，其中，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、210、220、230、240、250、251、252、253、254、255、256、257bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含250bp的核苷酸序列；3号外显子的部分包含编码胞外区的3号外显子的核苷酸序列，11号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、41、42、43、44、45、50、60、70、80、90、100、110、115bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含41bp的核苷酸序列；11号外显子的部分包含编码胞外区的11号外显子的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，用包含与SEQ ID NO：38具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者用包含SEQ ID NO：38所示核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人CSF1R蛋白的cDNA序列导入非人动物CSF1R基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人源化CSF1R蛋白的核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，用包含人源化CSF1R基因的核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。

优选的，所述的插入或替换的位点为CSF1R基因的内源调控元件之后。

优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源CSF1R基因的编码框或者破坏插入序列之后的内源CSF1R基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源CSF1R基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。

进一步优选的，可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子或含有终止功能的序列等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源CSF1R蛋白不能正常表达。

优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化CSF1R基因。

优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化CSF1R蛋白。

优选的，使用靶向载体进行非人动物的构建，其中，所述的靶向载体包含人CSF1R基因的部分。进一步优选的，包含人CSF1R基因的1号至22号外显子的全部或部分。更进一步优选的，包含1号至22号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合。再进一步优选的，包含3号至11号外显子的全部或部分。更进一步优选的，包含3号外显子的部分、4号外显子至10号外显子的全部和11号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或10-11号内含子核苷酸序列，其中，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、210、220、230、240、250、251、252、253、254、255、256、258bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含250bp的核苷酸序列；3号外显子的部分包含编码胞外区的3号外显子的核苷酸序列，11号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、41、42、43、44、45、50、60、70、80、90、100、110、116bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含41bp的核苷酸序列；11号外显子的部分包含编码胞外区的11号外显子的核苷酸序列。最为优选的，包含与SEQ ID NO：38具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者与SEQ ID NO：38所示核苷酸序列一致。

优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自非人动物CSF1R基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000084.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：36至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：36所示。和/或，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物CSF1R基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000084.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：37至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：37所示。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物CSF1R基因座上。进一步优选的，位于CSF1R基因的1号至22号外显子上。更进一步优选的，位于3号至11号外显子上。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得CSF1和/或CSF1R基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第七方面，提供了一种CSF1基因人源化的非人动物，所述的非人动物为上述的构建方法获得的非人动物。

本发明的第八方面，提供了一种人源化CSF1R蛋白，所述的人源化CSF1R蛋白包含人CSF1R蛋白的全部或部分。

优选的，所述的人源化CSF1R蛋白包含人CSF1R蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分。进一步优选的，所述的人源化CSF1R蛋白包含人CSF1R蛋白的胞外区的全部或部分。

优选的，所述的人源化CSF1R蛋白还包含非人动物CSF1R蛋白的部分，更优选为非人动物CSF1R蛋白的信号肽、跨膜区和/或胞质区。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1R蛋白包含人CSF1R蛋白的胞外区的全部或部分，优选的，所述的人源化CSF1R蛋白包含的人CSF1R蛋白的胞外区的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：35的第20-517位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：35的第20-517位所示氨基酸序列一致；信号肽、跨膜区和胞质区来源于非人动物。

优选的，所述的人源化CSF1R蛋白包含人CSF1R基因的1号至22号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。进一步优选的，包含1号至22号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合编码的氨基酸序列的全部或部分。更进一步优选的，包含3号至11号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分。再进一步优选的，包含3号外显子的部分、4号外显子至10号外显子的全部和11号外显子的部分，其中，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、210、220、230、240、250、251、252、253、254、255、256、258bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含250bp的核苷酸序列；3号外显子的部分包含编码胞外区的3号外显子的核苷酸序列，11号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、41、42、43、44、45、50、60、70、80、90、100、110、116bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含41bp的核苷酸序列；11号外显子的部分包含编码胞外区的11号外显子的核苷酸序列。最为优选的，包含与SEQ ID NO：38具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列编码的氨基酸序列或者SEQID NO：38编码的氨基酸序列。

优选的，所述的人源化CSF1R蛋白还包含非人动物CSF1R基因编码的氨基酸序列的全部或部分，优选为非人动物CSF1R基因的1号至2号外显子和/或12号至22号外显子编码的氨基酸序列的全部或部分，进一步优选还包含3号外显子的部分和/或11号外显子的部分编码的氨基酸序列的全部或部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1R蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

A)为SEQ ID NO：35的第20-517位氨基酸序列的全部或部分；

B)与SEQ ID NO：35的第20-517位氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：35的第20-517位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

D)与SEQ ID NO：35的第20-517位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1R蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：

I)为SEQ ID NO：43氨基酸序列的全部或部分；

II)与SEQ ID NO：43氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

III)与SEQ ID NO：43所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

IV)与SEQ ID NO：43所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第九方面，提供了一种人源化CSF1R基因，所述的人源化CSF1R基因包含人CSF1R基因的部分。

优选的，所述的人源化CSF1R基因包含编码人CSF1R蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分核苷酸序列。进一步优选的，包含编码人CSF1R蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列。更进一步优选的包含与编码SEQ ID NO：35的第20-517位的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者编码SEQ ID NO：35的第20-517位的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CSF1R基因编码上述的人源化CSF1R蛋白。

优选的，所述的人源化CSF1R基因包含人CSF1R基因的1号至22号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至22号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分。更进一步优选的，包含3号至11号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含3号外显子的部分、4号外显子至10号外显子的全部和11号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或10-11号内含子，更优选的包含3-11号外显子之间的任一内含子，其中，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、210、220、230、240、250、251、252、253、254、255、256、258bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含250bp的核苷酸序列；3号外显子的部分包含编码胞外区的3号外显子的核苷酸序列，11号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、41、42、43、44、45、50、60、70、80、90、100、110、116bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含41bp的核苷酸序列；11号外显子的部分包含编码胞外区的11号外显子的核苷酸序列。

优选的，所述的人源化CSF1R基因还包含非人动物CSF1R基因的部分；优选为非人动物CSF1R基因的1号至2号外显子和/或12号至22号外显子，进一步优选还包含3号外显子的部分和/或11号外显子的部分。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1R基因包含与SEQ ID NO：39、40和/或41具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列，或者包含SEQ ID NO：39、40和/或41所示的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1R基因包含下列组中的一种：

(A)为SEQ ID NO：38所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)与SEQ ID NO：38所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(C)与SEQ ID NO：38所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(D)具有SEQ ID NO：38所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化CSF1R基因转录的mRNA选自下列组中的一种：

(i)为SEQ ID NO：42所示核苷酸序列的全部或部分；

(ii)与SEQ ID NO：42所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(iii)与SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(iv)与SEQ ID NO：42所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第十方面，提供了一种靶向载体，所述的靶向载体包含人CSF1R基因的部分。

优选的，所述的人CSF1R基因的部分包含人CSF1R基因的1号至22号外显子的全部或部分。进一步优选的，包含1号至22号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合。更进一步优选的，包含3号至11号外显子的全部或部分。再进一步优选的，包含3号外显子的部分、4号外显子至10号外显子的全部和11号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或10-11号内含子核苷酸序列，其中，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、210、220、230、240、250、251、252、253、254、255、256、258bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含250bp的核苷酸序列；3号外显子的部分包含编码胞外区的3号外显子的核苷酸序列，11号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、41、42、43、44、45、50、60、70、80、90、100、110、116bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含41bp的核苷酸序列；11号外显子的部分包含编码胞外区的11号外显子的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，包含与SEQ ID NO：38具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者与SEQ ID NO：38所示核苷酸序列一致。

优选的，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’

臂，其选自非人动物CSF1R基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000084.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：36至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：36所示。和/或，所述的靶向载体还包含与待改变的转换区3’端同源的DNA片段，即3’臂，其选自非人动物CSF1R基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。进一步优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000084.6至少具有90％同源性的核苷酸。更进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：37至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：37所示。

优选的，所述的待改变的转换区位于非人动物CSF1R基因座上。进一步优选的，位于CSF1R基因的1号至22号外显子上。更进一步优选的，位于3号至11号外显子上。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

优选的，所述的靶向载体还包含标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。更进一步优选的，所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括阳性克隆筛选的抗性基因。进一步优选的，所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体中还包括特异性重组系统。进一步优选的，所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为具有两个Frt重组位点，分别同向连接在抗性基因的两侧。

本发明的第十一方面，提供了一种CSF1R基因人源化的非人动物，所述的非人动物体内表达人或人源化CSF1R蛋白。

优选的，所述的非人动物的内源CSF1R蛋白表达降低或缺失。

优选的，所述的非人动物体内表达上述的人源化CSF1R蛋白。

优选的，人CSF1R基因的部分或者人源化CSF1R基因的核苷酸序列可操作的连接至非人动物内源调控元件。

优选的，所述的非人动物体内包含人CSF1R基因的部分，更优选包含上述的人源化CSF1R基因。

根据本发明的一些实施例，所述的非人动物进一步包含其他基因修饰，所述其他基因选自CSF1、PD-1、PD-L1、IL6、IL3、IL15、CSF2、TPO和CD40中的至少一种。

优选的，所述其他基因为CSF1基因，所述的CSF1基因为人源化CSF1基因，所述的人源化CSF1基因如上述的人源化CSF1基因。

根据本发明的一些实施例，所述人或人源化CSF1R基因和/或所述其他基因对于内源被修饰基因座为纯合或杂合。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第十二方面，提供了一种CSF1R基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化CSF1R蛋白。

优选的，所述的非人动物选自上述的非人动物。

优选的，所述的构建方法包括用包含编码人CSF1R蛋白的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。进一步优选的，用包含编码人CSF1R蛋白胞外区的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。更进一步优选的，用包含与编码SEQ ID NO：35的第20-517位的核苷酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者用包含编码SEQ ID NO：35的第20-517位的核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。

优选的，所述的构建方法包括用包含人CSF1R基因的部分核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座上。进一步优选的，用包含人CSF1R基因的1号至22号外显子的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。更进一步优选的，用包含1号至22号外显子中的任一种、两种、三种以上、连续两种或连续三种以上外显子的组合的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。再进一步优选的，用包含3号至11号外显子的全部或部分核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。最为优选的，用包含3号外显子的部分、4号外显子至10号外显子的全部和11号外显子的部分，优选还包含3-4号内含子和/或10-11号内含子核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座，其中，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，例如至少包含100、150、200、210、220、230、240、250、251、252、253、254、255、256、258bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含250bp的核苷酸序列；3号外显子的部分包含编码胞外区的3号外显子的核苷酸序列，11号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，例如至少包含20、30、40、41、42、43、44、45、50、60、70、80、90、100、110、116bp的核苷酸序列，进一步优选的，包含41bp的核苷酸序列；11号外显子的部分包含编码胞外区的11号外显子的核苷酸序列。在本发明的一个具体实施方式中，用包含与SEQ ID NO：38具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者用包含SEQ ID NO：38所示核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人CSF1R蛋白的cDNA序列导入非人动物CSF1R基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，用包含编码人源化CSF1R蛋白的核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。

在本发明的一个具体实施方式中，用包含人源化CSF1R基因的核苷酸序列导入非人动物CSF1R基因座。

优选的，所述的插入或替换的位点为CSF1R基因的内源调控元件之后。

优选的，所述的插入为首先破坏非人动物内源CSF1R基因的编码框或者破坏插入序列之后的内源CSF1R基因的编码框，随后进行插入操作。或者所述的插入步骤即可给内源CSF1R基因造成移码突变又可以实现插入人源序列的步骤。

进一步优选的，可在插入序列中加入辅助序列(例如终止密码子或含有终止功能的序列等)或其他方法(例如，翻转序列，或敲除序列)使得插入位点后的非人动物内源CSF1R蛋白不能正常表达。

优选的，所述的导入为替换或插入，在本发明的一个具体实施方式中，所述的导入非人动物CSF1R基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的，非人动物CSF1R基因的3号至11号外显子的全部或部分被替换，更进一步优选的，非人动物CSF1R基因的3号外显子的部分、4号外显子至10号外显子的全部和11号外显子的部分被替换。

优选的，编码SEQ ID NO：34的第20-515位所示氨基酸的核苷酸序列被替换。

优选的，所述的非人动物是纯合或者杂合的。

优选的，所述非人动物的基因组中至少一个染色体上包含人源化CSF1R基因。

优选的，所述的非人动物中至少一个细胞表达人或人源化CSF1R蛋白。

优选的，使用基因编辑技术进行非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、规律成簇间隔短回文重复(CRISPR/Cas9)技术、锌指核酸酶(ZFN)技术、转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)技术、归巢核酸内切酶(兆碱基大范围核酶)或其他分子生物学技术。

优选的，使用上述的靶向载体进行非人动物的构建。

根据本发明的一些实施例，该构建方法进一步包括：将CSF1R基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外受精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因为CSF1、PD-1、PD-L1、IL6、IL3、IL15、CSF2、TPO和CD40中的至少一种基因。

优选的，所述的非人动物还表达人或人源化的CSF1、PD-1、PD-L1、IL6、IL3、IL15、CSF2、TPO和CD40蛋白中的至少一种。

优选的，所述其他基因为CSF1基因，所述的CSF1基因为人源化CSF1基因，所述的人源化CSF1基因如上述的人源化CSF1基因。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中修饰的多个基因中的每一个基因均对于内源被修饰基因座为纯合或杂合的。

在本发明的一个具体实施方式中，所述的构建方法包括将上述靶向载体导入非人动物细胞中，培养该细胞(优选为胚胎干细胞)，然后将培养后的细胞移植至雌性非人动物输卵管内，允许其发育，鉴定筛选获得CSF1R基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物可以选自啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑制备基因人源化的非人动物。

优选的，所述的非人动物为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物。更进一步优选的，所述的啮齿类动物为大鼠或小鼠。

优选的，所述的非人动物是免疫缺陷的非人哺乳动物。进一步优选的，所述的免疫缺陷的非人哺乳动物为免疫缺陷的啮齿类动物、免疫缺陷的猪、免疫缺陷的兔子或免疫缺陷的猴子。更进一步优选的，所述的免疫缺陷的啮齿类动物为免疫缺陷的小鼠或大鼠。最为优选的，所述免疫缺陷鼠是NOD-Prkdc^scid IL-2rγ^null小鼠、NOD-Rag 1^-/--IL2rg^-/-(NRG)小鼠、Rag 2^-/--IL2rg^-/-(RG)小鼠、NOD/SCID小鼠或者裸鼠。

本发明的第十三方面，提供了一种CSF1基因与CSF1R基因人源化的非人动物的构建方法，包括采用上述CSF1基因人源化的非人动物或上述构建方法获得的CSF1基因人源化的非人动物与上述CSF1R基因人源化的非人动物或上述的构建方法获得的CSF1R基因人源化的非人动物交配、体外授精；或者直接对上述CSF1基因人源化的非人动物或上述构建方法获得的CSF1基因人源化的非人动物的CSF1R基因采用上述CSF1R基因人源化的非人动物的构建方法进行基因编辑；或者直接对上述CSF1R基因人源化的非人动物或上述构建方法获得的CSFR1基因人源化的非人动物的CSF1基因采用上述CSF1基因人源化的非人动物的构建方法进行基因编辑。

本发明的第十四方面，提供了一种多基因修饰的非人动物的构建方法，包括如下步骤：

(一)提供上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物；

(二)将步骤(一)提供的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物。

优选的，所述的其他基因修饰的非人动物包括基因PD-1、PD-L1、IL6、IL3、IL15、CSF2、TPO或CD40中的一种或两种以上的组合人源化的非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物为双基因人源化非人动物、三基因人源化非人动物、四基因人源化非人动物、五基因人源化非人动物、六基因人源化非人动物、七基因人源化非人动物、八基因人源化非人动物或九基因人源化非人动物。

优选的，所述的多基因修饰的非人动物的基因组中人源化的多个基因中的每一个基因均可以是纯合或杂合的。

本发明的第十五方面，提供了一种上述的构建方法获得的非人动物或其子代。

本发明的第十六方面，提供了一种CSF1基因缺失的非人动物，所述的非人动物缺失CSF1基因的全部或部分核苷酸序列。

优选的，所述的非人动物缺失CSF1基因的1号至9号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失CSF1基因的2号至8号外显子的全部或部分。更进一步优选的，缺失2号外显子的部分、3号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还缺失2-3号内含子和/或7-8号内含子核苷酸序列。

本发明的第十七方面，提供了一种动物的荷瘤或炎症模型，所述的荷瘤或炎症模型来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物或者上述的非人动物或其子代。

本发明的第十八方面，提供了一种动物的荷瘤或炎症模型的构建方法，包括上述构建非人动物、非人动物或其子代、基因缺失的动物或者多基因修饰的非人动物的构建方法。

本发明的第十九方面，提供了来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述构建的多基因修饰的非人动物在制备动物的荷瘤或炎症模型中的应用。

本发明的第二十方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症模型。优选的，所述的细胞或细胞系或原代细胞培养物不能发育为动物个体。

本发明的第二十一方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症模型。优选的，所述的组织或器官或其培养物不能发育为动物个体。

本发明的第二十二方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症模型。优选的，所述的荷瘤后的瘤组织不能发育为动物个体。

本发明的第二十三方面，提供了一种CSF1基因人源化的细胞，所述的细胞表达人或人源化CSF1蛋白。

优选的，所述的细胞表达上述的人源化CSF1蛋白。

优选的，所述的细胞的基因组中包含人CSF1基因的部分。更优选的，所述的细胞包含上述的人源化CSF1基因。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。

本发明的第二十四方面，提供了一种CSF1基因缺失的细胞，所述的细胞缺失CSF1基因的全部或部分核苷酸序列。

优选的，所述的细胞缺失CSF1基因的1号至9号外显子的全部或部分。进一步优选的，缺失CSF1基因的2号至8号外显子的全部或部分。更进一步优选的，缺失2号外显子的部分、3号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分，优选还缺失2-3号内含子和/或7-8号内含子核苷酸序列。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。

本发明的第二十五方面，提供了一种表达上述的人源化CSF1蛋白或包含上述人源化CSF1基因的构建体。

本发明的第二十六方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。优选的，所述的细胞不能发育为动物个体。

本发明的第二十七方面，提供了一种包含上述细胞的组织。优选的，所述的组织不能发育为动物个体。

本发明的第二十八方面，提供了来源于上述的人源化CSF1蛋白、上述的人源化CSF1基因、上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎症模型、上述的细胞或细胞系或原代细胞培养物、上述的组织或器官或其培养物、上述的荷瘤后的瘤组织、上述的细胞、上述的构建体、上述的细胞或上述的组织的应用，所述应用包括：

在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；

在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；

或者，

在筛选、验证、评价或研究CSF1和/或CSF1R通路功能、人CSF1和/或CSF1R通路信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。优选的，所述应用不是疾病的治疗和/或诊断方法。

本发明的第二十九方面，提供了一种人CSF1和/或CSF1R特异性调节剂的筛选方法，所述的筛选方法包括向植入肿瘤细胞的个体施加调节剂，检测肿瘤抑制性；其中，所述的个体选自上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或炎症模型。

优选的，所述的调节剂选自CAR-T、药物；优选的，所述的药物为抗体。

优选的，所述的调节剂为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。

优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率。

优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。

优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述人CSF1和/或CSF1R特异性调节剂的筛选方法不是治疗方法。该方法用来筛选或评价药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第三十方面，提供了一种干预方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加干预方案，对施加干预方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价；其中，所述的个体选自上述的非人动物，上述的构建方法获得的非人动物，上述的非人动物或其子代，或者上述的荷瘤或炎症模型。

优选的，所述的干预方案选自CAR-T、药物治疗。进一步优选的，所述的药物为抗原结合蛋白。所述的抗体结合蛋白为抗体。

优选的，所述的肿瘤细胞来源于人或非人动物。

优选的，所述干预方案的评价方法不是治疗方法。该评价方法对干预方案的效果进行检测和评价，以确定该干预方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。

本发明的第三十一方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎症模型在制备人CSF1和/或CSF1R特异性调节剂中的用途。

本发明的第三十二方面，提供了一种来源于上述的非人动物、上述的构建方法获得的非人动物、上述的非人动物或其子代、上述的荷瘤或炎症模型在制备治疗肿瘤或免疫相关疾病的药物中的用途。

本发明所述的CSF1和/或CSF1R基因人源化的非人动物，其体内可正常表达人或人源化CSF1和/或CSF1R蛋白，可用于针对人CSF1和/或CSF1R通路靶位点的药物筛选、药效评估、免疫相关疾病和肿瘤治疗，可以加快新药研发过程、节约时间和成本。

本发明所述的“免疫相关疾病”包括但不限于过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、疼痛或神经障碍等。

本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、非小细胞肺癌、宫颈癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、脑胶质瘤、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性(成淋巴细胞性)白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、以及软骨肉瘤。在本发明的一个具体实施方式中，所述的肿瘤为乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑色素瘤、肾癌、肺癌、肝癌。

本发明所述的“全部或部分”，“全部”为整体，“部分”为整体中的局部，或者组成整体的个体。

本发明所述的“人源化CSF1蛋白”，包含来源于人CSF1蛋白的部分和非人CSF1蛋白的部分。

本发明所述的“人源化CSF1R蛋白”，包含来源于人CSF1R蛋白的部分和非人CSF1R蛋白的部分。

本发明所述的“人源化CSF1蛋白”，包含来源于人CSF1蛋白的部分。其中，所述的“人CSF1蛋白”同“人CSF1蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人CSF1蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人CSF1蛋白的部分”，为连续或间隔的5-554个(优选为10-517个)氨基酸序列与人CSF1蛋白的氨基酸序列一致或与人CSF1蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。

本发明所述的“人源化CSF1R蛋白”，包含来源于人CSF1R蛋白的部分。其中，所述的“人CSF1R蛋白”同“人CSF1R蛋白的全部”，即其氨基酸序列与人CSF1R蛋白的全长氨基酸序列一致。所述的“人CSF1R蛋白的部分”，为连续或间隔的5-972个(优选为10-498个)氨基酸序列与人CSF1R蛋白的氨基酸序列一致或与人CSF1R蛋白的氨基酸序列具有70％以上同源性。

本发明所述的“人源化CSF1基因”，包含来源于人CSF1基因的部分和非人CSF1基因的部分。其中，所述的“人CSF1基因”同“人CSF1基因的全部”，即其核苷酸序列与人CSF1基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人CSF1基因的部分”为连续或间隔的20-20487bp(优选为20-3994bp或20-1554bp)个核苷酸序列与人CSF1核苷酸序列一致或与人CSF1核苷酸序列具有70％以上同源性。

本发明所述的“人源化CSF1R基因”，包含来源于人CSF1R基因的部分和非人CSF1R基因的部分。其中，所述的“人CSF1R基因”同“人CSF1基因的全部”，即其核苷酸序列与人CSF1R基因的全长核苷酸序列一致。所述的“人CSF1R基因的部分”为连续或间隔的20-60082bp(优选为20-4006bp或20-1494bp)个核苷酸序列与人CSF1核苷酸序列一致或与人CSF1R核苷酸序列具有70％以上同源性。

本发明所述的“xx号至xxx号外显子”或“xx号至xxx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“2号至3号外显子”包含2号外显子、2-3号内含子、3号外显子的全部核苷酸序列。

本发明所述的“x-xx号内含子”表示x号外显子与xx号外显子之间的内含子。例如“2-3号内含子”表示2号外显子与3号外显子之间的内含子。

本发明所述的“外显子的部分”表示连续或间隔几个、几十个或几百个核苷酸序列与全部的外显子核苷酸序列一致。例如人CSF1基因的2号外显子的部分，包含连续或间隔的5-123bp个，优选10-51bp个核苷酸序列与人CSF1基因的2号外显子核苷酸序列一致。在本发明的一个具体实施方式中，所述的“人源化CSF1基因”中包含的“2号外显子的部分”至少包括编码胞外区去除N端1-5个氨基酸的2号外显子的核苷酸序列。

本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“CSF1基因座”表示CSF1基因1号至9号外显子上的任选一段的DNA片段。优选为1号外显子、2号外显子、3号外显子、4号外显子、5号外显子、6号外显子、7号外显子、8号外显子、9号外显子或其期间的内含子中的任一个或两个或多个的组合，或一个或两个或多个的全部或部分，更优选为CSF1基因的2号至8号外显子上。

本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。

本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。

本发明所述“同源性”，是指在使用氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员在保证与已知序列相似结构或功能的前提下，可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。

本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。

在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科。在一个实施方式中，所述基因人源化的非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。

在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。

除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes Iand II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In ENZYMOLOGY(J.Abelsonand M.Simon，eds.inchief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。

以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。

本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。

下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1：小鼠CSF1基因和人CSF1基因座对比示意图(非按比例)；

图2：小鼠CSF1基因人源化改造示意图(非按比例)；

图3：CSF1基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；

图4：CSF1重组后细胞Southern blot结果，其中WT为野生型对照；

图5：人源化CSF1小鼠FRT重组过程示意图(非按比例)；

图6：CSF1人源化F1代小鼠鼠尾PCR鉴定体细胞基因型，其中，WT为野生型，H₂O为水对照，PC为阳性对照；

图7：野生型C57BL/6小鼠(WT)和CSF1基因人源化杂合子小鼠(H/+)脾脏组织RT-PCR检测结果，其中M为Marker，H₂O为水对照，GAPGH为内参；

图8：野生型C57BL/6小鼠(WT)和CSF1基因人源化杂合子小鼠(H/+)脾脏组织ELISA检测结果；

图9：小鼠CSF1R基因和人CSF1R基因座对比示意图(非按比例)；

图10：小鼠CSF1R基因人源化改造示意图(非按比例)；

图11：CSF1R基因打靶策略及靶向载体设计示意图(非按比例)；

图12：CSF1R人源化F1代小鼠流式分析结果，其中，图(A)、(C)为野生型C57BL6(WT)对照，图(B)、(D)为CSF1R人源化杂合子小鼠(H/+)检测结果图；

图13：ELISA检测结果，其中WT为野生型C57BL/6小鼠，H/H为CSF1/CSF1R双基因人源化纯合子小鼠，mCSF1为鼠CSF1蛋白，hCSF1为人源化CSF1蛋白，ND为Not Detected；

图14：流式细胞术检测结果，其中WT为野生型C57BL/6小鼠，H/H为CSF1/CSF1R双基因人源化纯合子小鼠；

图15：将小鼠结肠癌细胞MC38植入人源化CSF1/CSF1R小鼠体内，进行抗肿瘤药效试验后小鼠的体重结果示意图；

图16：将小鼠结肠癌细胞MC38植入人源化CSF1/CSF1R小鼠体内，进行抗肿瘤药效试验后小鼠的体重变化结果示意图；

图17：将小鼠结肠癌细胞MC38植入人源化CSF1/CSF1R小鼠体内，进行抗肿瘤药效试验后小鼠体内肿瘤体积结果示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：

Heraeus^TM Fresco^TM 21Microcentrifuge购自Thermo Fisher Scientific，型号Fresco 21；

Mouse M-CSF ELISA Kit购自RayBio，货号ELH-MCSF；

Human M-CSF ELISA Kit购自RayBio，货号ELM-MCSF；

APC anti-mouse CD115(CSF-1R)Antibody(mCSF1R-APC)购自Biolegend，货号135509；

PE anti-human CD115(CSF-1R)Antibody(hCSF1R-PE)购自Biolegend，货号347303；

V450 Rat Anti-CD11b Antibody(mCD11b-V450)购自BD Horizon，货号560455；

BclI、DraIII、HindIII酶购自NEB，货号分别为R0160S、R0510、R0104M；

Attune Nxt Acoustic Focusing Cytometer购自Thermo Fisher，型号AttuneNxt；

PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit购自TAKARA，型号6110A；

Heraeus^TM Fresco^TM 21Microcentrifuge购自Thermo Fisher，型号Fresco 21；

Mouse M-CSF ELISA Kit购自RayBio，货号ELH-MCSF；

Human M-CSF ELISA Kit购自RayBio，货号ELM-MCSF。

实施例1CSF1基因人源化小鼠

本实施例对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人CSF1蛋白的核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物体内可表达人或人源化CSF1蛋白。小鼠CSF1基因(NCBI Gene ID：12977，Primary source：MGI：1339753，UniProt ID：P07141，位于3号染色体NC_000069.7的第107648364至107668048位，基于转录本NM_007778.4及其编码蛋白NP_031804.3(SEQ ID NO：1))和人CSF1基因(NCBI Gene ID：1435，Primary source：HGNC:2432，UniProt ID：P09603，位于1号染色体NC_000001.11的第109910506至109930992位，基于转录本NM_000757.6及其编码蛋白NP_000748.4(SEQ ID NO：2))对比示意图如图1所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源CSF1基因座引入编码人CSF1蛋白的全部或部分核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化CSF1蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源CSF1基因座上用人CSF1基因核苷酸序列替换小鼠CSF1基因，如将小鼠CSF1基因的2号外显子部分序列至8号外显子部分序列的9929bp长度的序列用对应的人DNA序列替换，得到人源化CSF1基因序列(示意图如图2所示)，实现对小鼠CSF1基因的人源化改造。

如图3所示的打靶策略示意图中，显示了靶向载体上含有小鼠CSF1基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人CSF1 DNA序列的A1片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：3)与NCBI登录号为NC_000069.7的第107667454至107663984位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：4)与NCBI登录号为NC_000069.7的第107653604至107649963位核苷酸序列相同；A1片段上包含人CSF1基因的2号外显子部分序列至8号外显子部分序列的基因组DNA序列(SEQ ID NO：5)，该DNA序列与NCBI登录号为NC_000001.11的第109914331至109925189位核苷酸序列相同；A1片段中人CSF1 DNA片段3’端与小鼠CSF1基因的连接设计为

(SEQ ID NO：6)，其中序列“TGTAG”的最后一个“G”是人的最后一个核苷酸，序列“

”的第一个“A”是小鼠的第一个核苷酸。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与小鼠基因的连接设计为

其中序列“CAAAT”的最后一个“T”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“

”的第一个“C”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与小鼠基因的连接设计为

其中序列“GATCC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“

”的第一个“T”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠CSF1的mRNA序列如SEQ ID NO：9所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：10所示。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(分别用BclI、DraIII或HindIII消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交，探针及目的片段长度如表1所示)检测，结果见如图4所示，检测结果表明12个经PCR验证为阳性的克隆，经测序发现除3-G07外，其余11个均为阳性克隆且无随机插入，具体编号为1-A02、1-B08、1-E05、2-A04、2-A12、2-D06、3-C08、3-D06、3-D09、3-E05、3-G02。

表1：具体探针及目的片段长度

限制性内切酶	探针	野生型片段大小	重组序列片段大小
				BclI	5’Probe	8.9kb	11.9kb
DraIII	3’Probe	13kb	9.2kb
				HindIII	Neo Probe	—	6.2kb

其中，PCR测定包括下述引物：

F1：5’-GAGCCAGGGTGATTTCCCATAAA-3’(SEQ ID NO：11)，

R1：5’-CAGAGGTCCTAACTTTGGGAAGG-3’(SEQ ID NO：12)；

F2：5’-GCTCGACTAGAGCTTGCGGA-3’(SEQ ID NO：13)，

R2：5’-AGAGGGCACTTAAGCAAGTTGAG-3’(SEQ ID NO：14)；

Southern Blot检测包括如下探针引物：

5’探针(5’Probe)：

5’Probe-F：5’-TTGAACAATGCATAGGAGGGAGC-3’(SEQ ID NO：15)，

5’Probe-R：5’-GCTAGCTCTCTTCCCCGTCG-3’(SEQ ID NO：16)；

3’探针(3’Probe)：

3’Probe-F：5’-TTCCCGTAAAGGCATAAAGGCA-3’(SEQ ID NO：17)，

3’Probe-R：5’-GAGGAGAGGCTGAAGGAAGTG-3’(SEQ ID NO：18)；

Neo探针(Neo Probe)：

Neo Probe-F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’(SEQ ID NO：19)，

Neo Probe-R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：20)。

将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到人源化CSF1基因纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型(引物如表2所示)，示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-01、F1-02的2只小鼠均为阳性杂合小鼠。

表2：引物名称及具体序列

这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的CSF1基因人源化小鼠。可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人源化CSF1 mRNA及蛋白表达情况，例如RT-PCR、ELISA方法等。具体来说，分别取9周龄C57BL/6野生型小鼠和CSF1基因人源化杂合子小鼠各3只，腹腔注射LPS(200ug/200ul)刺激处理，3小时后分别取脾脏组织进行RT-PCR和ELISA检测。RT-PCR检测所用引物如表3所示，检测结果如图7所示，从图中可以看出，在C57BL/6野生型小鼠脾脏中检测到鼠CSF1 mRNA(图7A)，未检测到人源化CSF1 mRNA(图7B)，而在CSF1基因人源化杂合子小鼠脾脏中检测到鼠CSF1 mRNA(图7A)，也检测到人源化CSF1 mRNA(图7B)。

表3：RT-PCR检测引物序列

ELISA检测结果如图8所示，从图中可以看出，在C57BL/6野生型小鼠脾脏中检测到鼠CSF1蛋白的表达(图8A)，未检测到人源化CSF1蛋白的表达(图8B)，而在CSF1基因人源化杂合子小鼠脾脏中既检测到鼠CSF1蛋白的表达(图8A)，也检测到人源化CSF1蛋白的表达(图8B)。

实施例2 CSF1R基因人源化小鼠

本实施例对非人动物(如小鼠)进行改造，使该非人动物体内包含编码人CSF1R蛋白的全部或部分核苷酸序列，得到经遗传修饰的非人动物，其体内可表达人或人源化CSF1R蛋白。小鼠CSF1R基因(NCBI Gene ID：12978，Primary source：MGI：1339758，UniProt ID：P09581，位于18号染色体NC_000084.6的第61105572至61131139位，基于转录本NM_001037859.2及其编码蛋白NP_001032948.2(SEQ ID NO：34))和人CSF1R基因(NCBI GeneID：1436，Primary source：HGNC:2433，UniProt ID：P07333，位于5号染色体NC_000005.10的第150053291至150113372位，基于转录本NM_005211.3及其编码蛋白NP_005202.2(SEQID NO：35))对比示意图如图9所示。

为了达到本发明的目的，可在小鼠内源CSF1R基因座引入编码人CSF1R蛋白的全部或部分核苷酸序列，使得该小鼠表达人或人源化CSF1R蛋白。具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源CSF1R基因座上用人CSF1R基因核苷酸序列替换小鼠CSF1R基因，如将小鼠CSF1R基因的3号外显子部分序列至11号外显子部分序列的9369bp长度的序列用对应的人DNA序列替换，得到人源化CSF1R基因序列(示意图如图10所示)，实现对小鼠CSF1R基因的人源化改造。

如图11所示的打靶策略示意图中，显示了靶向载体上含有小鼠CSF1R基因上游和下游的同源臂序列，以及包含人CSF1R基因部分序列的A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：36)与NCBI登录号为NC_000084.6的第61104995至61109623位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：37)与NCBI登录号为NC_000084.6的第61119606至61124121位核苷酸序列相同；A片段上包含人CSF1R基因的3号外显子部分序列至11号外显子部分序列的基因组DNA序列(SEQ ID NO：38)，该DNA序列与NCBI登录号为NC_000005.10的第150068290至150081016位核苷酸序列相同；A片段中人CSF1R 3’端与小鼠CSF1R基因的连接设计为

其中序列“CACCA”的最后一个“A”是人的最后一个核苷酸，序列“

”的第一个“G”是小鼠的第一个核苷酸。

靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与小鼠基因的连接设计为

其中序列“ACTAC”的最后一个“C”是小鼠的最后一个核苷酸，序列“

”的“G”是Neo盒的第一个核苷酸；Neo盒3’端与小鼠基因的连接设计为

其中序列“ATATT”的最后一个“T”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列“

”的第一个“C”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。改造后的人源化小鼠CSF1R的mRNA序列如SEQ ID NO：42所示，表达的蛋白序列如SEQ ID NO：43所示。

靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，将筛选出的正确阳性克隆细胞(黑色鼠)按照本领域已知的技术导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后，再通过互相交配即可得到人源化CSF1R基因纯合子小鼠。

可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人源化CSF1R蛋白的表达情况，例如使用流式细胞术等。具体来说，分别取6周龄野生型C57BL/6小鼠和CSF1R人源化小鼠的血液，用抗鼠CSF1R抗体mCSF1R-APC或抗人CSF1R抗体hCSF1R-PE和mCD11b-V450识别染色后进行流式检测，检测结果见图12。如图12所示，在CSF1R人源化杂合子小鼠体内检测到鼠CSF1R蛋白(图12B)和人源化CSF1R蛋白(图12D)；而在野生型C57BL/6小鼠体内只能检测到鼠CSF1R蛋白(图12A)，未检测到人源化CSF1R蛋白(图12C)。

实施例3 CSF1/CSF1R双基因人源化小鼠制备

将实施例1获得的CSF1基因人源化小鼠和实施例2获得的CSF1R基因人源化小鼠交配，并对其后代进行筛选，获得CSF1/CSF1R双基因人源化纯合子小鼠，分别采用ELISA方法和流式细胞术检测该纯合子小鼠体内人源化人源化CSF1蛋白和CSF1R蛋白的表达情况。具体来说，分别选取7周龄雌性野生型C57BL/6小鼠和本实施例获得的CSF1/CSF1R双基因人源化纯合子小鼠各3只，经腹腔注射浓度为200μg/200μL的脂多糖(LPS)刺激处理，3小时后收集脾脏细胞，并分别使用

Mouse M-CSF ELISA Kit和

Human M-CSF ELISAKit检测CSF1表达情况，检测结果如图13所示。从图中可以看出，在野生型C57BL/6小鼠体内仅检测到鼠CSF1蛋白(图13A)，未检测出人源化CSF1蛋白的表达(图13B)；在CSF1/CSF1R双基因人源化纯合子小鼠体内仅检测到人源化CSF1蛋白(图13B)，未检测到鼠CSF1蛋白的表达(图13A)。

采用流式细胞术检测小鼠体内CSF1R蛋白的表达情况。具体来说，分别选取7周龄雌性野生型C57BL/6小鼠和CSF1/CSF1R双基因人源化纯合子小鼠各1只，采集外周血后分别使用抗鼠CD45抗体Brilliant Violet 510^TM anti-mouse CD45 Antibody、抗鼠CD11b抗体V450 Rat Anti-mouse CD11b(mCD11b-V450)、抗鼠CD155抗体APC anti-mouse CD115(CSF-1R)Antibody(mCSF1R-APC)或抗人CD155抗体PE anti-human CD115(CSF-1R)Antibody(hCSF1R-PE)识别染色后进行检测，检测结果如图14所示。从图中可以看出，在野生型C57BL/6小鼠体内仅检测到鼠CSF1R蛋白(图14C)，未检测出人源化CSF1R蛋白的表达(图14A)；在CSF1/CSF1R双基因人源化纯合子小鼠体内仅检测到人源化CSF1R蛋白(图14B)，未检测到鼠CSF1R蛋白的表达(图14D)。

实施例4双重人源化或多重人源化小鼠的制备

利用本方法或制得的CSF1和/或CSF1R基因人源化小鼠还可以制备双人源化或多人源化小鼠模型。如，前述实施例1或实施例2中，囊胚显微注射使用的胚胎干细胞可选择来源于含有PD-1、PD-L1、IL6、IL3、IL15、CSF2、TPO、CD40等其它基因修饰的小鼠，或者，也可在CSF1和/或CSF1R基因人源化小鼠的基础上，利用分离小鼠ES胚胎干细胞和基因重组打靶技术，获得CSF1和/或CSF1R与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的小鼠模型。也可将本方法得到的CSF1和/或CSF1R小鼠纯合子或杂合子与其它基因修饰的纯合或杂合小鼠交配，对其后代进行筛选，根据孟德尔遗传规律，可有一定机率得到人源化CSF1和/或CSF1R与其它基因修饰的双基因或多基因修饰的杂合小鼠，再将杂合子相互交配可以得到双基因或多基因修饰的纯合子，利用这些双基因或多基因修饰的小鼠可以进行靶向人CSF1和/或CSF1R和其它基因调节剂的体内药效验证等。

实施例5体内药效验证

AMG-820(药物信息参考专利：CN101802008B)是一种针对CSF1R的全人源单克隆IgG2抗体，由AmMax Bio公司开发，目前处于临床II期，作为膝关节腱鞘巨细胞瘤的关节内治疗。

axatilimab(重链全长(HC)序列为SEQ ID NO：44，轻链全长(LC)序列为SEQ IDNO：45)是一种针对CSF1R的人源化单克隆抗体，由Syndax Pharmaceuticals公司开发，目前处于临床II期，用于治疗因新型冠状病毒病继发呼吸道体征和症状的住院患者并用于治疗患有活动性慢性移植物抗宿主病的患者。

cabiralizumab(重链全长(HC)序列为SEQ ID NO：46，轻链全长(LC)序列为SEQ IDNO：47)是一种靶向CSF1R的人源化单克隆抗体，由Amgen公司、百时美施贵宝和小野制药开发，目前处于临床I/II期，用于治疗肿瘤适应症。

emactuzumab(重链全长(HC)序列为SEQ ID NO：48，轻链全长(LC)序列为SEQ IDNO：49)是一种人源化抗CSF1R单克隆抗体，由罗氏公司开发，目前处于临床I期，用于治疗实体瘤。

IMC-CS4(重链可变区(VH)序列为SEQ ID NO：50，轻链可变区(VL)序列为SEQ IDNO：51)是一种靶向CSF1R的人单克隆抗体，由礼来公司开发，用于治疗晚期实体瘤。

利用本发明制备的CSF1/CSF1R双基因人源化纯合子小鼠构建肿瘤模型，可用于测试靶向人CSF1R的药物的药效。具体来说，选取实施例3制备的CSF1/CSF1R双基因人源化纯合子小鼠(8-9周龄、雌性)，皮下接种小鼠结肠癌细胞MC38(5×10⁵个)，待肿瘤体积约100mm³后，按瘤体积分为对照组或治疗组(n＝6/组)。对照组注射PBS，治疗组使用抗人CSF1R抗体AMG-820analog、axatilimab analog、cabiralizumab analog、ema ctuzumab analog、IMC-CS4 analog。给药方式：腹腔注射(i.p.)，分组当天开始给药，每周给药2次，共给药6次。每周测量肿瘤体积2次，接种后单只小鼠肿瘤体积达到3000mm³时执行安乐死。具体分组和给药情况见表4。实验周期内小鼠体重情况和肿瘤体积测量结果分别如图15-17所示。

表4：分组及给药情况

表5中列出了各个实验的主要数据和分析结果，具体包括分组时、分组后14天、分组后第21天时的肿瘤体积、小鼠存活情况、无肿瘤小鼠情况、肿瘤(体积)抑制率(TumorGrowth Inhibition value，TGI_TV)以及治疗组与对照组小鼠肿瘤体积的统计学差异(P值)。

表5：肿瘤体积、存活情况及肿瘤抑制率

如图15、16和表5所示，整体来看，各组实验过程中，动物健康状态良好，在第21天时，所有治疗组(G2、G3、G4、G5、G6)与对照组(G1)相比，动物体重呈增长趋势(图15和16)，均无明显差异(P>0.05)，表明动物对抗人CSF1R抗体AMG-820analog、axatilimab analog、cabiralizumab analog、emactuzumab analog、IMC-CS4 analog的耐受性良好，未对动物产生明显毒性作用，安全性较好。如图17和表5所示，从肿瘤体积结果上看，在各个时期，治疗组肿瘤体积均小于对照组，且在第21天，G2、G3、G4、G5和G6组小鼠肿瘤体积分别为935±193mm³、526±114mm³、648±150mm³、808±181mm³和794±145mm³，均小于对照组1031±126mm³，不同治疗组表现不同的治疗结果，尤其是G3组与对照组相比具有显著差异(P<0.05)。在实验结果表明本发明实施例的方法制备的CSF1/CSF1R双基因人源化纯合子小鼠可用于靶向人CSF1R的药物(如，抗体药物)研发及筛选。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

序列表

<110> 百奥赛图（北京）医药科技股份有限公司

<120> CSF1和/或CSF1R基因人源化的非人动物及其构建方法和应用

<130> 1

<150> CN202110425356.X

<151> 2021-04-20

<150> CN202210185622.0

<151> 2022-02-28

<160> 51

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 552

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 1

Met Thr Ala Arg Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Ser Ser Thr Trp Leu

1 5 10 15

Gly Ser Arg Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Met Ser Arg Ser Ile Ala

20 25 30

Lys Glu Val Ser Glu His Cys Ser His Met Ile Gly Asn Gly His Leu

35 40 45

Lys Val Leu Gln Gln Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln

50 55 60

Ile Ala Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Asp Asp Pro Val Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Phe Leu Val Gln Asp Ile Ile Asp Glu Thr

85 90 95

Met Arg Phe Lys Asp Asn Thr Pro Asn Ala Asn Ala Thr Glu Arg Leu

100 105 110

Gln Glu Leu Ser Asn Asn Leu Asn Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu

115 120 125

Glu Gln Asn Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe His Glu Thr Pro Leu Gln

130 135 140

Leu Leu Glu Lys Ile Lys Asn Phe Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu

145 150 155 160

Glu Lys Asp Trp Asn Ile Phe Thr Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala

165 170 175

Lys Cys Ser Ser Arg Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu

180 185 190

Tyr Pro Lys Ala Thr Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Ala Ser Pro His

195 200 205

Gln Pro Pro Ala Pro Ser Met Ala Pro Leu Ala Gly Leu Ala Trp Asp

210 215 220

Asp Ser Gln Arg Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Ser Glu Leu Pro

225 230 235 240

Leu Arg Ile Glu Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser

245 250 255

Thr Cys Gln Thr Leu Glu Ser Thr Glu Gln Pro Asn His Gly Asp Arg

260 265 270

Leu Thr Glu Asp Ser Gln Pro His Pro Ser Ala Gly Gly Pro Val Pro

275 280 285

Gly Val Glu Asp Ile Leu Glu Ser Ser Leu Gly Thr Asn Trp Val Leu

290 295 300

Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Gly Phe Leu Thr Gln Glu Ala

305 310 315 320

Lys Phe Ser Pro Ser Thr Pro Val Gly Gly Ser Ile Gln Ala Glu Thr

325 330 335

Asp Arg Pro Arg Ala Leu Ser Ala Ser Pro Phe Pro Lys Ser Thr Glu

340 345 350

Asp Gln Lys Pro Val Asp Ile Thr Asp Arg Pro Leu Thr Glu Val Asn

355 360 365

Pro Met Arg Pro Ile Gly Gln Thr Gln Asn Asn Thr Pro Glu Lys Thr

370 375 380

Asp Gly Thr Ser Thr Leu Arg Glu Asp His Gln Glu Pro Gly Ser Pro

385 390 395 400

His Ile Ala Thr Pro Asn Pro Gln Arg Val Ser Asn Ser Ala Thr Pro

405 410 415

Val Ala Gln Leu Leu Leu Pro Lys Ser His Ser Trp Gly Ile Val Leu

420 425 430

Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Lys Arg Ser Thr Arg Asp Arg Arg Ser

435 440 445

Pro Ala Glu Leu Glu Gly Gly Ser Ala Ser Glu Gly Ala Ala Arg Pro

450 455 460

Val Ala Arg Phe Asn Ser Ile Pro Leu Thr Asp Thr Gly His Val Glu

465 470 475 480

Gln His Glu Gly Ser Ser Asp Pro Gln Ile Pro Glu Ser Val Phe His

485 490 495

Leu Leu Val Pro Gly Ile Ile Leu Val Leu Leu Thr Val Gly Gly Leu

500 505 510

Leu Phe Tyr Lys Trp Lys Trp Arg Ser His Arg Asp Pro Gln Thr Leu

515 520 525

Asp Ser Ser Val Gly Arg Pro Glu Asp Ser Ser Leu Thr Gln Asp Glu

530 535 540

Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val

545 550

<210> 2

<211> 554

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 2

Met Thr Ala Pro Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Pro Thr Thr Trp Leu

1 5 10 15

Gly Ser Leu Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Ala Ser Arg Ser Ile Thr

20 25 30

Glu Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu

35 40 45

Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln

50 55 60

Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr

85 90 95

Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu

100 105 110

Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu

115 120 125

Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln

130 135 140

Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu

145 150 155 160

Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala

165 170 175

Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu

180 185 190

Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His

195 200 205

Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu

210 215 220

Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln Pro

225 230 235 240

Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser

245 250 255

Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser

260 265 270

Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn

275 280 285

Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val

290 295 300

Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly

305 310 315 320

Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu

325 330 335

Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala

340 345 350

Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu Pro

355 360 365

Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gln Asp Trp Asn His Thr Pro

370 375 380

Gln Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu Pro

385 390 395 400

Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ser Asn Pro

405 410 415

Ser Thr Leu Ser Ala Gln Pro Gln Leu Ser Arg Ser His Ser Ser Gly

420 425 430

Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg Asp

435 440 445

Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly Ala

450 455 460

Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr Gly

465 470 475 480

His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Phe Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser

485 490 495

Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val

500 505 510

Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro

515 520 525

Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr

530 535 540

Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val

545 550

<210> 3

<211> 3471

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcttcagcca ctagcgagca agggagcgag cgaaccaggg cggccaacac gccgtgccgg 60

gacccagctg cccgtatgac cgcgcggggc gccgcggggc gctgcccttc ttcggtaagc 120

tgcaaccgtg gcgcgcgggg cccgggccgg gctggggcag gagctctgca gcaagcagca 180

ggcggctctg cggggccact tggagcggac agccccttct cgccagctgc ccaggcttct 240

cggccctggg ttctggcttc cttactgctt ctaagctacg gctgaggccc gcggtatttc 300

aatagctgct cctggggctg cagcgctttg cgaggtaaag agaaggctgc tcatcccatt 360

gcacggagga gaacactgag ctacccacag gctggagaga gagatggggg tctggggggg 420

gggggtatcg cagggattgg cacaggccca atgtctgcca gaatggtcaa ccaggtctcc 480

aggttccgag tgacacaaga tccgagtgtg gcatcatccc cagtagatat ctttctttgg 540

ttgttgcaca tgttttaggc cccagttggg agtgggcctt cagggtaggg aaaattcagg 600

ctcactcagc tttacaccag gacctgtgct gagcaacctg ttggcagaga gagagagaga 660

gagagagaga gagagagaga gatgggcatg ctgctacttg ttcaatggat gtgtaggaac 720

tattagggac ttgggtggct ctttgagggg agctggaccc gaatcttttc ttgaagaaaa 780

tgagatgggg ctattctaga ctctgcggct gactgaggaa agaaagtgca aggagagttc 840

agagctgcag ctgataatgg gctgctcaga agctgtctcc agtaatggca gcagatgata 900

gcatggctct tacagagtga aggatggtac tttcaatcca cagcaagtgg gtttgcttca 960

gaagagaatg agagggaaaa cctggagggt aggaaccgaa cttgtgatgg gcagcgcgtt 1020

gcaggtgtct gggaggagag aaaagtagaa cagcagagag aggggctcag tgagaggcag 1080

aaggtggggt taggaggagg ggaagggagg aagttatccc acatgcaaca agcataaaga 1140

gagaagaggg aagaaaagaa agactacaag gagacataag aggaaagaga ggaggccgag 1200

gttcagccag gcagtcaggc cgggtctctg tctgcagact gtactgattg gaaaatggaa 1260

catgatgtct tgaagtgctc agagactgcc gcagtttcca ggctgctctc atagtcagag 1320

gctgaggcag tgggtgggag gaagaagcaa gccaggaaga gcctgtccag ccagatgcag 1380

gctagagtat taacccttgg gtgtccatct gtatccctgt ctatggcagc attggggtta 1440

cagagccaga tccaggagtg gctggtcatc tttgaagcca gcagctgtgc attatttctg 1500

tgcatgcttg aaatgccacc aaaagccagg tagccctgaa gtaatgtctt tatcttgcta 1560

tctccaaaca tcaatggctt gaaattcctg ggttgagata tttctgaaca tctccattcc 1620

cgggtccttt ccttcatacc atacacacat ggactgacag gctgagtgat accagcctgg 1680

gccagagtca tcttctgcag tcatttcctt taacaggttc tgagactggg gttcaggaga 1740

cccgggctgc cactcccact caggactaac tttccaattg cccaaccatg cccaatgcag 1800

tttatcaacc catagctggc tgcaccctct cccccacctc tttctccctg tctctctgtg 1860

tctgtcactc tgtgtctctg actgtctgtc tctgactgtc tgtctctgac tctctgtctc 1920

tctctctctc taaggtcagg caaggaacct aacaggtcct gtgcgtaatg gcattaggca 1980

accctgtgcc ttaacaccca tcagcatctt ccacccttta aggcctcact cttccctccg 2040

catggcccag ccaaagctgc ctttcctccc tggtactcac tggcaaggct ttgggctttt 2100

agatgtaacc cagtgttgtt atggactgtt tcatagcctc cctgtgtttt tccaatgcgc 2160

tcctatttgc aacatttgtc tcatcatctg gactattggg gcagagccag atccaagaag 2220

gtgccagtca tcactccacc ctgccagcat ttccctgaat tgggggatat cagcagccag 2280

aatgctcaga atggcagcat caggccaggg aaagaaagcc caagagtccc tctgccccag 2340

gctggcatct cccgggatac cctattggag cccgaaggga tggaaggatt ttagagtaga 2400

ggaggaggaa ggaagaaagg agaaaggaag gacccagtca ggtgtcagga gccagaccta 2460

ggactctagg gatgagcagc tgcagggcca ggtgggtgct gacggaaagg agagaacttt 2520

cttgctgtgg caagagtttg ctgactagat gaagggcctg atgggtctca gataaacaga 2580

tgccagcagg gaaacacagc attgtccttg attagtcagc tggactcctc ttgaaatgca 2640

agtccaaggc tctaggaggt ctcccactgg agctgagttc ccagtgttgc atcctggtat 2700

tttcccctgt agaaccagac ctgtgtaacc aggtgggaag gaaggaatga aggaaggaag 2760

gaaggtgcca ggggtaatga gtgtttctgg cttgcaatct gaaagctagt gactgaccac 2820

aagtttgaag gcagcttaca aggtatctat ttgtctcagt gttaaaagtt aaaaggatag 2880

aaaatcttac ccttgagtct ctcagtcact aaaacttata ctggttggca caccaccagt 2940

attatcatta gacattctct gtaagatgga aaggtggctc atcatttaaa aacacttgtt 3000

gctcttgcag tggatccagg ttcaaatccc agaatctaga tgatggttca caaccattca 3060

tacctccagg tccaggagat tccaagaagg aagcacatag agtgtgtgca tgcaagcagg 3120

caaaatattc ataaacacaa aacaaaaaca gtaagccttt taaaattgtc ttttaaagta 3180

ctctgtattg ttgagctgct ctgggttaac ctcagaagag ttcttggaga agatggcatt 3240

tgggctatta ccaagggaag agtgaggtgg tgccctggct gataagaatc taatggtgct 3300

gcagcatggg aatggggcgt tgtttctttg cccttagtgg gacatggggg tagctaggga 3360

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<211> 3642

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

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gggacaccat cagcagagag acctcacaaa tctcccttgg gcctctggct gatccccact 10320

tttgggaagt tgggaggact cttgcaactc tctcataaat acctggggca gcccttactg 10380

gggatgggcc accgcccccc cacactcccc cagctcctca gtgagatgct ctttcctgtc 10440

ctcagagcca tcaagagcct cagagagcgg attctccctt ggagcaacca gagggcaggt 10500

gagagcttga ggtggggctc tgggaggcac tgggggcctg gcttgggatc tgtttcccct 10560

cttcgtggtg gtggggctct cctgcttgct ctgaggaaat ggagctgcag aacaggatgg 10620

gggagagaag aagggcctct gtcctttccc agatatctgg gctttttcct gatttctccg 10680

tagagttaga cagttctggg tcttttcaat ctgagagggc ctagagcatg tctggggctt 10740

aggggtaaac ttacggagtc cccttattcc cctgctcctg ctgatgtcta ataccagccc 10800

tgtgctctgc ctgcagcccc ctgactcagg atgacagaca ggtggaactg ccagtgtag 10859

<210> 6

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cctgactcag gatgacagac aggtggaact gccagtgtag aaaggattct atggtaaggt 60

tctgattttg atatctctct 80

<210> 7

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccagcttggt gctgagccct gacctcctca gcatcctctt cttgccaaat caccttgtga 60

agcttgatat cgaattccga agttcctatt ctctagaaag 100

<210> 8

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tctctagaaa gtataggaac ttcatcagtc aggtacataa tggtggatcc tgtgccttat 60

ctggtcctac tcccaagcca aggttattgc tgcctccctg 100

<210> 9

<211> 4198

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acagagcgac ggggaagaga gctagcgggg acgaccaggc ggcccgcttg ggggaaggga 60

gtcggcggct cagtgggcct ctggggtgta gtatgtgtca gtgcctgtga gtgtgtttgt 120

gtgtgtgtat gtctgtgtgt gtctggcgga gagccagggt gatttcccat aaaccacatg 180

ccccgccagc ccgcccgctt aaaaggctgt gccgagggct ggccagcgaa gctcggccag 240

gggaaagtga aagtttgcct cggtgctctc ggtgtcgctg cggctctctg catcccagga 300

cagcggcgtg gccctcgacc ggggcgcggg ctcttcagcc actagcgagc aagggagcga 360

gcgaaccagg gcggccaaca cgccgtgccg ggacccagct gcccgtatga ccgcgcgggg 420

cgccgcgggg cgctgccctt cttcgacatg gctgggctcc cggctgctgc tggtctgtct 480

cctcatgagc aggagtattg ccaaggaggt gtcagaatac tgtagccaca tgattgggag 540

tggacacctg cagtctctgc agcggctgat tgacagtcag atggagacct cgtgccaaat 600

tacatttgag tttgtagacc aggaacagtt gaaagatcca gtgtgctacc ttaagaaggc 660

atttctcctg gtacaagaca taatggagga caccatgcgc ttcagagata acacccccaa 720

tgccatcgcc attgtgcagc tgcaggaact ctctttgagg ctgaagagct gcttcaccaa 780

ggattatgaa gagcatgaca aggcctgcgt ccgaactttc tatgagacac ctctccagtt 840

gctggagaag gtcaagaatg tctttaatga aacaaagaat ctccttgaca aggactggaa 900

tattttcagc aagaactgca acaacagctt tgctgaatgc tccagccaag atgtggtgac 960

caagcctgat tgcaactgcc tgtaccccaa agccatccct agcagtgacc cggcctctgt 1020

ctcccctcat cagcccctcg ccccctccat ggcccctgtg gctggcttga cctgggagga 1080

ctctgaggga actgagggca gctccctctt gcctggtgag cagcccctgc acacagtgga 1140

tccaggcagt gccaagcagc ggccacccag gagcacctgc cagagctttg agccgccaga 1200

gaccccagtt gtcaaggaca gcaccatcgg tggctcacca cagcctcgcc cctctgtcgg 1260

ggccttcaac cccgggatgg aggatattct tgactctgca atgggcacta attgggtccc 1320

agaagaagcc tctggagagg ccagtgagat tcccgtaccc caagggacag agctttcccc 1380

ctccaggcca ggagggggca gcatgcagac agagcccgcc agacccagca acttcctctc 1440

agcatcttct ccactccctg catcagcaaa gggccaacag ccggcagatg taactggtac 1500

cgccttgccc agggtgggcc ccgtgaggcc cactggccag gactggaatc acacccccca 1560

gaagacagac catccatctg ccctgctcag agaccccccg gagccaggct ctcccaggat 1620

ctcatcactg cgcccccagg gcctcagcaa cccctccacc ctctctgctc agccacagct 1680

ttccagaagc cactcctcgg gcagcgtgct gccccttggg gagctggagg gcaggaggag 1740

caccagggat cggaggagcc ccgcagagcc agaaggagga ccagcaagtg aaggggcagc 1800

caggcccctg ccccgtttta actccgttcc tttgactgac acaggccatg agaggcagtc 1860

cgagggatcc ttcagcccgc agctccagga gtctgtcttc cacctgctgg tgcccagtgt 1920

catcctggtc ttgctggccg tcggaggcct cttgttctac aggtggaggc ggcggagcca 1980

tcaagagcct cagagagcgg attctccctt ggagcaacca gagggcagcc ccctgactca 2040

ggatgacaga caggtggaac tgccagtgta gaaaggattc tatgctgggc acacaggact 2100

atctctttat ggaaggagac atatgggaac atccaccact accctctcct accatcttcc 2160

tgggaatgtg gcctaccact accagagctc ctgcctacca agactggatg aaagaagcag 2220

ctttgatggg gtctttccat cctcaccctt agactctcaa ccaaagagaa agggctggag 2280

gatgcccccc acatactgcc actatttatt gtgggccctg gaggctccct gcattggagg 2340

aagggcagct cagcagctca ggaccctttc ccttaggggc tgcttcctcc cctcaaaacc 2400

agaacctggc aagggactca ctagcctgga tggcccatgg gagaccagga cagatgagaa 2460

ggagcagaag agccctgtgc ccagaagacc caactggtgc caaggaatcc cagcatggac 2520

aggcagggac ctgtttccca agaagagagc ctgatattca aagggtggga cagcatctgc 2580

ccgacttccc gtaaaggcat aaaggcacgc agcccaaaag acgggaagag gaggcctttg 2640

gctgcttgtg ttgacagctt aaaggggtct acaccctcaa cttgcttaag tgccctctgc 2700

tgatagccag gaaggaggga gaccagccct gcccctcagg acctgacctg gctcatgatg 2760

ccaagaggaa gacagagctc tagcctcgtc ttctcctgcc cacagcccct gccagagttc 2820

ttttgcccag cagaggcacc cctcatgaag gaagccattg cactgtgaat actgaacctg 2880

cctgctgaac agcctgtccc atccatccct atgagtgacc atccgtccga atgttctccc 2940

acttccttca gcctctcctc ggcttcttgc actgagctgg cctcacgtgt tgactgaggg 3000

agcccctgag ccccaacctt cccctgcctc agcctttgat tgtccagggt gaagctgtgg 3060

gagaaccgcc tgggctacca gtcagagctg gtctttgggc tgtgttcctt gcccaggttt 3120

ctgcatcttg cactttgaca ttcccaggag ggaagtgact agtggaaggg agagaggaag 3180

gggaggcaga gacaaaggcc acaggcagag ctatgaatga gaatgggtct tgaaaatatg 3240

tgtgcacccc taagcttgaa attgatctct atactctagc ccctcagcca gcctccttcc 3300

tgttgtctga aacctggagc taagcaggtt gtcctgtcac aagctctggg gactgagctc 3360

catgctccaa ccccaccctc ttctgacctt tgttctccag acctgaccca ggtaggcaag 3420

ggtaccctcc cagtctcacc taccatactg tgccatctct agccaagcaa gccaggttta 3480

gagaagggtc aaaaaaaaaa aaaagggttg tttacttcca acttgttctg atgccctctg 3540

tttcccaggc caggcttgtc tgtggtgacc tgggcatggg tgacagggct ctcatttgcc 3600

ccttggtctc tttatgctgc tgagtccccc tttcctgccc tccctggcta ctgggtcaat 3660

aatctttcag gccatgaatc tgggaggaga gtggtctgta agctccatca gccctgtcct 3720

gagacagcag gggggaagga cactggagac tttcttgtgg ggcttactta gccttctggt 3780

tacagactat ttccatgcta gaaaatacat attttaaaat agaaggaaaa acacagaaac 3840

aaaacaaaac aaggcattct ctacccctcc accttaaaca tatattatta aagacagaag 3900

agaaaatcca acccattgca agaagctctt tgtgggtgcc tggttacatc ggagcagggg 3960

agcctcaaat ccacctttgg agccgcccct gtgtgcatta ggaacccttc tctcctctga 4020

gaaagctcag agggagcact gcctcacaaa ctgtgagact gcgtttttta tacttggaag 4080

tggtgaatta ttttatataa ggtcatttaa atatctattt aaaaaatagg aagctgcttt 4140

tatatttaat aataaaagaa gtgcacaagc tgccacgtgt gaaaaaaaaa aaaaaaaa 4198

<210> 10

<211> 554

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Thr Ala Arg Gly Ala Ala Gly Arg Cys Pro Ser Ser Thr Trp Leu

1 5 10 15

Gly Ser Arg Leu Leu Leu Val Cys Leu Leu Met Ser Arg Ser Ile Ala

20 25 30

Lys Glu Val Ser Glu Tyr Cys Ser His Met Ile Gly Ser Gly His Leu

35 40 45

Gln Ser Leu Gln Arg Leu Ile Asp Ser Gln Met Glu Thr Ser Cys Gln

50 55 60

Ile Thr Phe Glu Phe Val Asp Gln Glu Gln Leu Lys Asp Pro Val Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Lys Lys Ala Phe Leu Leu Val Gln Asp Ile Met Glu Asp Thr

85 90 95

Met Arg Phe Arg Asp Asn Thr Pro Asn Ala Ile Ala Ile Val Gln Leu

100 105 110

Gln Glu Leu Ser Leu Arg Leu Lys Ser Cys Phe Thr Lys Asp Tyr Glu

115 120 125

Glu His Asp Lys Ala Cys Val Arg Thr Phe Tyr Glu Thr Pro Leu Gln

130 135 140

Leu Leu Glu Lys Val Lys Asn Val Phe Asn Glu Thr Lys Asn Leu Leu

145 150 155 160

Asp Lys Asp Trp Asn Ile Phe Ser Lys Asn Cys Asn Asn Ser Phe Ala

165 170 175

Glu Cys Ser Ser Gln Asp Val Val Thr Lys Pro Asp Cys Asn Cys Leu

180 185 190

Tyr Pro Lys Ala Ile Pro Ser Ser Asp Pro Ala Ser Val Ser Pro His

195 200 205

Gln Pro Leu Ala Pro Ser Met Ala Pro Val Ala Gly Leu Thr Trp Glu

210 215 220

Asp Ser Glu Gly Thr Glu Gly Ser Ser Leu Leu Pro Gly Glu Gln Pro

225 230 235 240

Leu His Thr Val Asp Pro Gly Ser Ala Lys Gln Arg Pro Pro Arg Ser

245 250 255

Thr Cys Gln Ser Phe Glu Pro Pro Glu Thr Pro Val Val Lys Asp Ser

260 265 270

Thr Ile Gly Gly Ser Pro Gln Pro Arg Pro Ser Val Gly Ala Phe Asn

275 280 285

Pro Gly Met Glu Asp Ile Leu Asp Ser Ala Met Gly Thr Asn Trp Val

290 295 300

Pro Glu Glu Ala Ser Gly Glu Ala Ser Glu Ile Pro Val Pro Gln Gly

305 310 315 320

Thr Glu Leu Ser Pro Ser Arg Pro Gly Gly Gly Ser Met Gln Thr Glu

325 330 335

Pro Ala Arg Pro Ser Asn Phe Leu Ser Ala Ser Ser Pro Leu Pro Ala

340 345 350

Ser Ala Lys Gly Gln Gln Pro Ala Asp Val Thr Gly Thr Ala Leu Pro

355 360 365

Arg Val Gly Pro Val Arg Pro Thr Gly Gln Asp Trp Asn His Thr Pro

370 375 380

Gln Lys Thr Asp His Pro Ser Ala Leu Leu Arg Asp Pro Pro Glu Pro

385 390 395 400

Gly Ser Pro Arg Ile Ser Ser Leu Arg Pro Gln Gly Leu Ser Asn Pro

405 410 415

Ser Thr Leu Ser Ala Gln Pro Gln Leu Ser Arg Ser His Ser Ser Gly

420 425 430

Ser Val Leu Pro Leu Gly Glu Leu Glu Gly Arg Arg Ser Thr Arg Asp

435 440 445

Arg Arg Ser Pro Ala Glu Pro Glu Gly Gly Pro Ala Ser Glu Gly Ala

450 455 460

Ala Arg Pro Leu Pro Arg Phe Asn Ser Val Pro Leu Thr Asp Thr Gly

465 470 475 480

His Glu Arg Gln Ser Glu Gly Ser Phe Ser Pro Gln Leu Gln Glu Ser

485 490 495

Val Phe His Leu Leu Val Pro Ser Val Ile Leu Val Leu Leu Ala Val

500 505 510

Gly Gly Leu Leu Phe Tyr Arg Trp Arg Arg Arg Ser His Gln Glu Pro

515 520 525

Gln Arg Ala Asp Ser Pro Leu Glu Gln Pro Glu Gly Ser Pro Leu Thr

530 535 540

Gln Asp Asp Arg Gln Val Glu Leu Pro Val

545 550

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gagccagggt gatttcccat aaa 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cagaggtcct aactttggga agg 23

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

gctcgactag agcttgcgga 20

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

agagggcact taagcaagtt gag 23

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ttgaacaatg cataggaggg agc 23

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gctagctctc ttccccgtcg 20

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttcccgtaaa ggcataaagg ca 22

<210> 18

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gaggagaggc tgaaggaagt g 21

<210> 19

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ggatcggcca ttgaacaaga t 21

<210> 20

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

cagaagaact cgtcaagaag gc 22

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcgttgtttc tttgccctta gt 22

<210> 22

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gtaccaggag agccattatc cac 23

<210> 23

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

cagaggtcct aactttggga agg 23

<210> 24

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

tacatctgat cccaaagcaa cca 23

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggggatgcag agtaaccctt tta 23

<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gacaagcgtt agtaggcaca tatac 25

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gctccaattt cccacaacat tagt 24

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

aaggcctgtg tccgaacttt 20

<210> 29

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

tggaggggga aaactttgct 20

<210> 30

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

tctgtctccc ctcatcagcc 20

<210> 31

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cttgctggtc ctccttctgg 20

<210> 32

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

accacagtcc atgccatcac 20

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gcctgcttca ccaccttctt 20

<210> 34

<211> 977

<212> PRT

<213> 小鼠(Mouse)

<400> 34

Met Glu Leu Gly Pro Pro Leu Val Leu Leu Leu Ala Thr Val Trp His

1 5 10 15

Gly Gln Gly Ala Pro Val Ile Glu Pro Ser Gly Pro Glu Leu Val Val

20 25 30

Glu Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Ser Asn Gly Ser Val

35 40 45

Glu Trp Asp Gly Pro Ile Ser Pro Tyr Trp Thr Leu Asp Pro Glu Ser

50 55 60

Pro Gly Ser Thr Leu Thr Thr Arg Asn Ala Thr Phe Lys Asn Thr Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Leu Glu Asp Pro Met Ala Gly Ser Thr Thr

85 90 95

Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala His Ser Trp Asn Leu Leu Ala

100 105 110

Gln Glu Val Thr Val Val Glu Gly Gln Glu Ala Val Leu Pro Cys Leu

115 120 125

Ile Thr Asp Pro Ala Leu Lys Asp Ser Val Ser Leu Met Arg Glu Gly

130 135 140

Gly Arg Gln Val Leu Arg Lys Thr Val Tyr Phe Phe Ser Pro Trp Arg

145 150 155 160

Gly Phe Ile Ile Arg Lys Ala Lys Val Leu Asp Ser Asn Thr Tyr Val

165 170 175

Cys Lys Thr Met Val Asn Gly Arg Glu Ser Thr Ser Thr Gly Ile Trp

180 185 190

Leu Lys Val Asn Arg Val His Pro Glu Pro Pro Gln Ile Lys Leu Glu

195 200 205

Pro Ser Lys Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys

210 215 220

Ser Ala Thr Asn Ala Glu Val Gly Phe Asn Val Ile Leu Lys Arg Gly

225 230 235 240

Asp Thr Lys Leu Glu Ile Pro Leu Asn Ser Asp Phe Gln Asp Asn Tyr

245 250 255

Tyr Lys Lys Val Arg Ala Leu Ser Leu Asn Ala Val Asp Phe Gln Asp

260 265 270

Ala Gly Ile Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Asp Val Gly Thr Arg Thr

275 280 285

Ala Thr Met Asn Phe Gln Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Thr

290 295 300

Ser Glu Gln Ser Leu Leu Gln Glu Val Ser Val Gly Asp Ser Leu Ile

305 310 315 320

Leu Thr Val His Ala Asp Ala Tyr Pro Ser Ile Gln His Tyr Asn Trp

325 330 335

Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Phe Glu Asp Gln Arg Lys Leu Glu Phe Ile

340 345 350

Thr Gln Arg Ala Ile Tyr Arg Tyr Thr Phe Lys Leu Phe Leu Asn Arg

355 360 365

Val Lys Ala Ser Glu Ala Gly Gln Tyr Phe Leu Met Ala Gln Asn Lys

370 375 380

Ala Gly Trp Asn Asn Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr Pro Pro

385 390 395 400

Glu Val Ser Val Thr Trp Met Pro Val Asn Gly Ser Asp Val Leu Phe

405 410 415

Cys Asp Val Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Ser Val Thr Trp Met Glu Cys

420 425 430

Arg Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Ala Leu Gln Val Trp

435 440 445

Asn Asp Thr His Pro Glu Val Leu Ser Gln Lys Pro Phe Asp Lys Val

450 455 460

Ile Ile Gln Ser Gln Leu Pro Ile Gly Thr Leu Lys His Asn Met Thr

465 470 475 480

Tyr Phe Cys Lys Thr His Asn Ser Val Gly Asn Ser Ser Gln Tyr Phe

485 490 495

Arg Ala Val Ser Leu Gly Gln Ser Lys Gln Leu Pro Asp Glu Ser Leu

500 505 510

Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Val Met Ser Leu Leu Val

515 520 525

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro Lys Tyr

530 535 540

Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Arg Tyr Glu Gly Asn Ser Tyr Thr

545 550 555 560

Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu Phe Pro

565 570 575

Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala Phe Gly

580 585 590

Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp Ala Val

595 600 605

Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala Asp Glu

610 615 620

Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu Gly Gln

625 630 635 640

His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly Gly Pro

645 650 655

Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu Asn Phe

660 665 670

Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser Pro Gly

675 680 685

Gln Asp Ser Glu Gly Asp Ser Ser Tyr Lys Asn Ile His Leu Glu Lys

690 695 700

Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val Asp Thr

705 710 715 720

Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Ser Asp Ser Phe Phe

725 730 735

Lys Gln Asp Leu Asp Lys Glu Ala Ser Arg Pro Leu Glu Leu Trp Asp

740 745 750

Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe Leu Ala

755 760 765

Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu

770 775 780

Thr Ser Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp

785 790 795 800

Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Val Val Lys Gly Asn Ala Arg Leu Pro

805 810 815

Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr Thr Val

820 825 830

Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile Phe Ser

835 840 845

Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Asn Lys Phe Tyr

850 855 860

Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Val Phe Ala Pro

865 870 875 880

Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ser Cys Trp Asp Leu Glu Pro Thr

885 890 895

Arg Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Phe Leu Leu Gln Glu Gln Ala

900 905 910

Arg Leu Glu Arg Arg Asp Gln Asp Tyr Ala Asn Leu Pro Ser Ser Gly

915 920 925

Gly Ser Ser Gly Ser Asp Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Ser Ser

930 935 940

Ser Glu Pro Glu Glu Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Ala Cys Cys Glu

945 950 955 960

Pro Gly Asp Ile Ala Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe

965 970 975

Cys

<210> 35

<211> 972

<212> PRT

<213> 人(human)

<400> 35

Met Gly Pro Gly Val Leu Leu Leu Leu Leu Val Ala Thr Ala Trp His

1 5 10 15

Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val

35 40 45

Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly

50 55 60

Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala

85 90 95

Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala

100 105 110

Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu

115 120 125

Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg

130 135 140

Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His

145 150 155 160

Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln

165 170 175

Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg

180 185 190

Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val

195 200 205

Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys

210 215 220

Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn

225 230 235 240

Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg

245 250 255

Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His

260 265 270

Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser

275 280 285

Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser

290 295 300

Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn

305 310 315 320

Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp

325 330 335

Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala

340 345 350

Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu

355 360 365

Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg

370 375 380

Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr

385 390 395 400

Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr

405 410 415

Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu

420 425 430

Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln

435 440 445

Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His

450 455 460

Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn

465 470 475 480

Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp

485 490 495

Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu

500 505 510

Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Ile Met Ala Leu

515 520 525

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro

530 535 540

Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Ser Tyr Glu Gly Asn Ser

545 550 555 560

Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu

565 570 575

Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala

580 585 590

Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp

595 600 605

Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala

610 615 620

Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu

625 630 635 640

Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly

645 650 655

Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu

660 665 670

Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser

675 680 685

Pro Gly Gln Asp Pro Glu Gly Gly Val Asp Tyr Lys Asn Ile His Leu

690 695 700

Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val

705 710 715 720

Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Asn Asp Ser

725 730 735

Phe Ser Glu Gln Asp Leu Asp Lys Glu Asp Gly Arg Pro Leu Glu Leu

740 745 750

Arg Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe

755 760 765

Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val

770 775 780

Leu Leu Thr Asn Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala

785 790 795 800

Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Ile Val Lys Gly Asn Ala Arg

805 810 815

Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr

820 825 830

Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile

835 840 845

Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Ser Lys

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Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Ala Phe

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Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ala Cys Trp Ala Leu Glu

885 890 895

Pro Thr His Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Ser Phe Leu Gln Glu

900 905 910

Gln Ala Gln Glu Asp Arg Arg Glu Arg Asp Tyr Thr Asn Leu Pro Ser

915 920 925

Ser Ser Arg Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser Ser Glu Leu Glu Glu

930 935 940

Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Thr Cys Cys Glu Gln Gly Asp Ile Ala

945 950 955 960

Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr Gln Phe Cys

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<210> 36

<211> 4629

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cagcaagtca gggtctgacc acttgcccta gaaatcaact atgaaaagtg attgctagag 60

gcaggaacag acttgaagcg tccaaggccc tgtctctggg gaagagttca ggtttaacta 120

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ccagttggtc ccagaggagt tattcctggc tttcatggct tgaggaaaca gtttggtccc 240

catggctcat atttaggggt aacttcattt cttctcatgg ggtgaccgct ctcacctagg 300

gggataatgt catcatggag tgatttgtct acaggacttg ttatttttgg aacctagaat 360

aagtttggtt taggacaatt agtggagact tccagttgct gctataggag gctcattact 420

gtcaaagtcc aaatctccag ttaccttgag gccttctgcc ttaagggcag atgagaaagg 480

tatgaagaat gtaggataac ctgacctctc tcagccaggc tcactgctca tctgggagac 540

tcttatttat gctcctgact cagaggctgc tgctcttggg tatgactcct ctcctaagtg 600

tccttagagg tggtttccta agtctctcaa actccatcat ctcccttcag gatcagttga 660

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tgtgtgtgtg tgtatgtgtg tgtgctttgt tttcttctag agacccaata tttccaaatt 780

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gtgcaacaga caggaacgtg ttcatctgtt cccgtcctca cagaactagc agctgggagc 900

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<210> 37

<211> 4516

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gactctctta taccattctc tgccctgtca ccctgcttcg taggcttcat gaccttattt 2220

tttttttcaa atgttttaaa acatttgttt ctggggctgg gaatatgact cagaggttaa 2280

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aaaatgatct gtaagcccag ttctagggga tccaaccttc tcttctgacc ccgttggata 2400

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aataaaaaat taaaatagca tttgttagta tgtattgatt atatactata ctataatata 2520

taatgatgaa tttcttgtga catcttcaaa catgtaccta atgtatattg atgatattgt 2580

tcacattcac ctcccattac cctcgtcccc cgctcatatc tgctgttccc ctttctgtcc 2640

ccaaactcct ctttcacttt aatttgtgta tgtgtgtgtg aatatgtgtg tgcttgctcg 2700

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agtgtaggtg agttatttat agagattaag ctatacaatt gaagaaaaca tctctcccac 2880

caccagtaat cactaactgc ctgcagatat tcagggtggg gagcacttgt gagcctctcc 2940

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cgagaacagc actatctatg gggacaggca gacttattta gaaagttagt tgacaggcac 3300

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tgtcaatcag aaagcataca gacactccaa tagcagaccc gactttattt gcacgtcttt 3480

tgaggcatta tctgactgtt ccctatttat ttatttaagt tgaatgtctc ttttagccat 3540

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tgctcaagag gcaggcagat ttctgagttc gaggtcagcc tggtctacag agtaagttcc 3660

aggacagcca aggctacaca gagaaaaacc ctgtctcgaa aaaacaaaaa caaacaaaca 3720

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tcagcctgga gaagagagca aagtttgact tcagtgtagt tgagatgatg agatgatgct 3840

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cagagtcatc aagggagaac tttgggaatc atctgagtct ttgagtgaac agttttaaat 4380

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<210> 38

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

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tatgagcaag gacctggaag agctgctaat gtaatgcagt cctcacaaca accctgcaag 420

tcgggtctat gatgatgcat tttctagaag tgcagggagg ttatccaagg tcacacagcc 480

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ccaagaggca gggaggagat ggtgggtgcg tgtgatggct ctcgcggtgg ccaggtaaca 1560

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taaacctgcc cagggggtca aaggacccca gctgtgtggg cagaggaggc cattagggct 1800

ctttcctggc atttcatcct gcagagccct gggctggcca agagccaaag gtcctgggcc 1860

ctagttctgc cttgacaccc cctcagggac cttgggtgag tcctttcatg tccctgggcc 1920

ttaggaatct ggattagatt atctttcaac agcagcaatg ggcataaata tgaattcaag 1980

gcctactgtg catcaggcat cttgctggct gctggaatat tcctgtcacg gatttgacat 2040

tcgactagag tctaactatt aaatagaaag taaatacaaa tgtgatgagc aagaaaccaa 2100

gctggggagt ggcgggcatg gaggtgctgg ggaggctaat tcatatcagc tggtcacaga 2160

agccttgctg aggaattttt gagctaaaga tctgaaggat gagaacagcc tcccatttga 2220

agtgtgggag gaaaggcatt ccaggaggga aaggtgggtg caaaggccct gtggtaggaa 2280

agaggtccag cgggctgcag tgcagtgaac aaggggtggg gttatcaggg cggtcagaaa 2340

caggttgggc tgtggaagga ctttgacttc ttttctgaga gtaatgggaa gccccaaatg 2400

tttacagagg agagaggcat ggtcccattt atatttgtaa gaggtcactt tagtgaagaa 2460

tctaggtgtg gggggcttgg agggaggcag ggaggtctct gaggaggctg gtgcagaagt 2520

ccagagtgga gaatggtgac gggactgggg aggggtagag gtgatggaga aagtagactt 2580

tccaaggtct ctttaggaca ggccttgcag tggggggact gggagcatca aggctgcctc 2640

ccaggatttg ggatggggca gtgatgggga ccctggcctg tgtgtcctgg cccatggcag 2700

ggaggagagc aatatctcta tcatgttcag ggagcctggg tgttcagggg tctctccccc 2760

ggtctcagtc atcccagggc ccccagcctt gacactggtg cctgcagagc tggtgcggat 2820

tcgaggggag gctgcccaga tcgtgtgctc agccagcagc gttgatgtta actttgatgt 2880

cttcctccaa cacaacaaca ccaaggtcag tccctgcaga tcacaaggtg aagtctggcc 2940

atcctcccag cacaccaggt ttcccatggt ggagtcctgg gcccccaact ccaaactggc 3000

tgtcttagct gaaggcacag ctcagactcc agagaggggt gcagactcac ccgagatctc 3060

actcccagtc agtagctgac acagaatcag gactcatgct tgtgccgctg aactttgtgg 3120

gggtgggtgg ggggaggtgg ttctctgtca ccttgacaca tggcctttgc cccagccttt 3180

agacaaaagc cagaggtgag ctcacttctg atttagcaag ggtttcctag gccaccattg 3240

aagcccagga atataacagc tatttcagaa agacattggg agagagggag gaggagggag 3300

gattccagga gggactcacg ttgggctgcc tctaagagcc ccctcccttc ccactgcacc 3360

tgccgtgttc cagacacagc cctaagccac ttgcatgcat atctcattta ctcctcacta 3420

cagtcttggg gcagggagcc agtattagcc ccattttaca agtgaagcaa caggctcaga 3480

ggaaaggcag atagtaatcc ttaaaggctg aggattggaa cccagatctt tctaatccct 3540

aaactacctt ggtataacat ctccattcct tctggctgca gctcgcaatc cctcaacaat 3600

ctgactttca taataaccgt taccaaaaag tcctgaccct caacctcgat caagtagatt 3660

tccaacatgc cggcaactac tcctgcgtgg ccagcaacgt gcagggcaag cactccacct 3720

ccatgttctt ccgggtggta ggtaagcatc agggtggtgg tggacagtcg gtagggatcc 3780

tgcaggagtg tgagcagaag ggttttgagg aggaagctga tgtcagggaa ggagacctgc 3840

tgaggatatc tctgctggag tttgtttatc caaggcctgg ctaaggagcc actctccagg 3900

agctttccct taccctctcc tgggatctct ctcccatctt ggagctctta cagtgcatgg 3960

ctgcattggg tgcaccttag tgccattttt tgtttatttg gggattgggg tccagtagct 4020

ccctactgga cttcatttgt tcattctttc atgcattcct ttatggaaac atgaaaagac 4080

aatgatcacc cagtgattat gggggaagca caaggtgtcc tgggaacact gaagagtccc 4140

cccaacccag gcttcgagaa ggtggcctct aaactgggat gggaagaatg aaggtgagtt 4200

ggccgggcag aagggtggga aaggaagggg aacagcgctt ctggcagagg gaggaacata 4260

tgcaaggctc aaaggcaaag agaacataga tcatttggaa cactgaaaga acttgacaac 4320

agctgggatg tggagtggtg tgaggagtgg ccacagggga gcagaggagg tggcagaagc 4380

cggaggtaaa ggtgtcttaa agtgagaaag aataactgca tcttaaccta ttgggaggtc 4440

attgtaaaga ggagagtgat ggggtcagat tgtacagagg aggcacttcg tggtggtcag 4500

gagcacacac tccagggcag tgttccaacc tgagtctgcc aaggactagc aggttgctaa 4560

ccaccctgtg tctcagtttt cctacctgta aaatgaagat attaacagta actgccttca 4620

tagatagaag atagatagat tagatagata gatagataga tagatagata gatagataga 4680

tagatagata gataggaagt acttagaaca gggtctgaca caggaaatgc tgtccaagtg 4740

tgcaccagga gatagtatct gagaaggctc agtctggcac catgtgggtt gggtgggaac 4800

ctggaggctg gagaatgggc tgaagatggc cagtggtgtg tggaagagtc tgagatgcag 4860

ggatgaggaa gagaaaggag ataaggatga cctccaggtc tctggctatg gtgattgggt 4920

gcaggcagtg gcagtcactg gactcagacc ctgaagcaag gcagcagctc atcggagtgg 4980

gagcaggctc tgagacattt aggtctggcc gtgcctcatg tgttgaatgt tatgggagat 5040

ggaggtggcg aggagcatga gaatcatgag catcactgcc cctagagtat gtgcaaggca 5100

ctggacttgc agcagattgt gagctctgct gtggacccca atctgcactg ggagctttgg 5160

cagggtaaag gggaagaaga gcaaaagcac aagaattcag ttacggcttc taatcctgtc 5220

tgctttctag tacaggcata cagtcatcac tcaagaaatg tttatgttca ttcacacttt 5280

gggccagaca ctgttctaga catcgaggat acagctgcaa gtgaaacaga tacaacaacc 5340

cccgactcat gaagtgtgtg ctctagctgg gagtgggcaa gcaatgagcc aagtaaatta 5400

ttaaaaaaac aaattatata gcatttgcag cttcagatag ggtgttcacc aaggaagatc 5460

tcactagaaa gctgatattt gagcaaaggc ttaaattgct gaaggagcaa gccatgcggc 5520

cattttggag aagggagctc catcctgcag cgggactgtg cttgccatgt tcaggggaca 5580

agtgggccag tgtggctgcg gggagagagt gagaaaaaaa gtggtctcag atgaggtcag 5640

agagctaaag tgggaaggtg agatgaaagg aggctaccgc agtggtccag gctggagctg 5700

atggtgggtg gactagagtg gtaatggtga aggcagcagg aagttgttgg tgtttggatg 5760

gatgaatgga ctaatggatg gatgaataat agatagatgg attgttgaga gagacagaga 5820

agagaaaagc cttgccccca aaagctcaca gactacttgg agagagaaga aagctacctg 5880

gagggagaac cagatgcatg aagcagtgca gatgtggtgc ctaatgagtg tgtagtctgg 5940

aagggcagca aaagtcgagt ggagtgagag gttcctgtgt cctggagcac tgagtagaga 6000

ctccctcatg ggggtgaatc ttaaaggata aaggggcctc tataatgaaa aggaggagga 6060

tgggatttct ggtagaggaa attgcttgag caaaacctcc aaggttggaa tgactatggt 6120

gtgttcaggg atgttaggag acccagatgg gtggagcgtt gagtgtgtgt gtgtaggaag 6180

gaagagggga ggtggctgga tgagcacagt gagacctgat ttgattgaga gccttgaacg 6240

ccacgctgaa taatggaggc aatgggactc catagagggc ttttgagtag acatatatca 6300

gtgtagaagg gtgaatttca gatttttaga cagaatagag taaggagagg agctcttaga 6360

aatcatctag tccagggctt gtggcagagc cctgaggttt taagaaggca tgtcaggggc 6420

taccatgaca ggcacggaga ggctgagtga attggggttc ttgccacaat tcccttgcct 6480

gagattcaac aagagcagct gtattacaat ctgtgcaaaa tgtcattagg agaaactagt 6540

tagtagctgg gcgtggtggc atgcaactgt tgtcccagct actcgggagg ctgaggccgg 6600

agaatcgctt gaacctggga ggcggaggtt gcagtgagca gagactgtgc cactgcactc 6660

cagcctggat gacagagcaa gactctgttt caaaaaaaaa aaaaaaaaaa actagtcagg 6720

actctttcag atacaagtaa tagaaaccaa ctcaaactgg cctaattaaa aggatttttt 6780

tccttatagc taaaaagctc atggatatca gcttcaggaa cacttggatc caggtgttca 6840

gctgatgctg gaaagaatct atgactcccc aactctcagc cctgccagga aggctttccc 6900

cttgtaggac tccgactatc cgccttgtag tatctgatcc agcaacacca gtaaaatgag 6960

ggcttctctt ttcccagagt cttaacaaaa atcatggaat tgagtgttat ggactcatgg 7020

attcatggta acccaaacca atcaccgggc cagaggggac agagtaccct cactggttgg 7080

cctgggttac acacctactc cagagctata tttggaagcc gcattgacta atttatgacc 7140

agaagaaagg gaaatggatg aggacacgtg aaattgtgtg tgtatgtgtg tgtgtgtttt 7200

cttgctgcca aaaatttttc aaaaacttgg aaaatcacag atatattcaa tctcttcatt 7260

acacaaataa ggagatggag gcacaaatgg ggatagggat ttgcccaggt tctcctaggg 7320

cttcagtgag aaaagttttg atccagggat tctgaagggg gtggtgagaa gaggggtgtc 7380

agaggacctg tcttgggtgg tggggactat gtacctgtga catagctgct cagggactgg 7440

atcaatgggt ggatgacaaa atggacaaat aaacaaggac atcttcccac taatgccaga 7500

tgcttgtgtg ttctgctttc cagagagtgc ctacttgaac ttgagctctg agcagaacct 7560

catccaggag gtgaccgtgg gggaggggct caacctcaaa gtcatggtgg aggcctaccc 7620

aggcctgcaa ggttttaact ggacctacct gggacccttt tctgaccacc agcctgagcc 7680

caagcttgct aatgctacca ccaaggacac atacaggtac cacttatcag ctcccgtcta 7740

cacagcccga caaccagatg gggtatgctt cagcaagcat caggacgctt ggctcatgtc 7800

ccaaccttgg tgtatgacct tgagcaagtc cctgcccctt tctgggcttc gctttccctg 7860

acttcatgga atcccaatat tggtcatctg tgtttgagat ctagatgaaa ttgacctacc 7920

tctccatccc acatccttgg gatagtcaat gccccaccca aggattctac catttcttgg 7980

gagtgtgcat tctcattggt ccctcaagaa ccctcagcct cattcatttt cctctcttgg 8040

ggccaatcca aatgcagaaa acagccccac tcatagacac actcctgata atgactgcac 8100

aagttatctg ctacatacaa aagcttggag ggaggggaag agggaattaa gatcacacaa 8160

tcacagatac atgaaatgtt ctttaaagga ttgtgatcac ccagccccaa gaatttctca 8220

ctggctgctc ttctctgtaa gctcaaaact cttcccatga agtgcaatct ataataactc 8280

cacacccctc ttcttccgtc tctccactcc cacaatcctg tgtattccac acacatttta 8340

gaaatctttt tcctgtctgc ttgtgaactg tgttcttggg gtcttgcttt ctcatccaaa 8400

gtggcttaag caggtaggtt ctaaataaga aagctttgtg cctaagagga acactcatac 8460

caggtatatc aggtattaac tcaggtatta aaatagttcc ttcttttctt tctttttatt 8520

atttttttta gatggagttt tgctcttgtt gctggagtgc aatggcacaa tctcggctca 8580

ctgcaaactc ggcctcccgg gttcaagtga ttctcctgcc tcagcctccc gagtagctgg 8640

gattacagat gcccaccacc acacccagct aatttttgta tttttagtag agacagagtt 8700

tcaccatgtt ggccaggctg gtctcgaact cctgacctca ggtgatctgc ctgcctcggc 8760

ctcccaaggt gctaggatta caggtgtgag ccatcgtgcc tggcctgaaa taatcattca 8820

taccctgccc tttcagaggg agacagtaca gcttaagggc agcgaatacg tggtgtgcat 8880

gccacactca ctctcattct tgtttctgca actctgttct gcagagtgta gatgcggcct 8940

cagagtcctc ctcaacacag gtcccaggca gtatttccag catagttggc tcatgagaga 9000

tctgtttgtc atccctgtgt ggatccctta gacaacttca aaactctttg ggattctcgt 9060

tctagctctg gaagcccaaa cctcattgat tcccacaatc ttgcttgtca attgtcagaa 9120

gcaacaagga tgttttcttg tcctcatctt cctcctctca gttcccttct ggtcctttct 9180

ggccaggtct ctgtcttcct ctcatttaaa gcagaagttc tgaatctgga atgtgtaggc 9240

cctttggagg gggctggtcc atggatcggt ttaatgggtc cataagccac agagacattg 9300

aggaaaggaa cacgagatcc cctaaaacac agtagtctgg gcccattcag cacaaggcag 9360

acaagcctgg acaccaaaca gccacagaat tttagttcat gtgatgggtt gttcataatg 9420

gtgactttca attatccaaa aaagtcaaat tatttttagt taaaggggtt agttatctca 9480

agaagtgacc tgggcagagg ccttgtatat gcccagggtc tggctggatg agactgctct 9540

ctgaatacca tagattttag tctagtagta gctgcagaca tttcccaagc aagaactggc 9600

catttgctat aatttttaaa attttattta ttttgacagt gaactggggg actttttaaa 9660

aaatgtattt attacctaaa caacacatgt tcattatgga caaattgtaa aatagagatt 9720

aaagaaagaa taaaacaaaa aatttcccag aatcagccaa agatgatttt tattgttagt 9780

ttttgctcca gggccttttc tgtaataaag ggtaccattg aattgagtgc ccacaaagat 9840

tcaacttctg tgtcaagcac cctaaaaagg tcctttaatc ctcaagccaa gcctgtgaat 9900

taataaccat cgatatcact ctcacagcaa aggaagtgag ggatcagaga ggttaagtac 9960

ttgtctaaga tcacacagcc aagaaacagc agcaccagga cttgaacccc agtctctgca 10020

gcaacatggc tcagaaccca gggccctaca tcctgcctct tgtctctttc tcagtccctc 10080

ttggcaaggt tggcacttca gggatttgta gcagggattg cagctttcat gaaagcttag 10140

tccagtgaca gtggtcaacg taggcgacct gtgataggcc tcccagcacc ttgaagacat 10200

cacctctatt aaacctcggg aaaaaaacac tttcagataa gaaaaccaac taaggaaatg 10260

ggattggtgg tttttgcatg tctcaatggc accctgtctg agtatctggc ttacccaagg 10320

ccgttgggcc ctgaatattt taccaaaaat aaaataaacc cctttaaggc tgttatctga 10380

ctgcaatcct ggcaggggcc atactaggct ggggctcacc aacaccacct gattctctcc 10440

tgcaggcaca ccttcaccct ctctctgccc cgcctgaagc cctctgaggc tggccgctac 10500

tccttcctgg ccagaaaccc aggaggctgg agagctctga cgtttgagct cacccttcga 10560

tgtgagtgct ggggccgagc gccacctggg gcggaggccc tgggactgcc tggagggatg 10620

gggttgactg gggcagggca cagggaagta ggtactggga gattgggagg tggcggggaa 10680

agtgtgactt ggggcctcct cctttcttcc tcagaccccc cagaggtaag cgtcatatgg 10740

acattcatca acggctctgg cacccttttg tgtgctgcct ctgggtaccc ccagcccaac 10800

gtgacatggc tgcagtgcag tggccacact gataggtaag tgggctccac tcacctccct 10860

cacctgggct caggggctgg gcaccctgtg agtgggaggg acatgctggc gctgggaacc 10920

ctgaagctct gagccacatt ctgcttttgc caggtgtgat gaggcccaag tgctgcaggt 10980

ctgggatgac ccataccctg aggtcctgag ccaggagccc ttccacaagg tgacggtgca 11040

gagcctgctg actgttgaga ccttagagca caaccaaacc tacgagtgca gggcccacaa 11100

cagcgtgggg agtggctcct gggccttcat acccatctct gcaggtgaga gggagccttc 11160

gcacccgcac cgcccccccg cccgcccccc gcccctgctc ctttaggcgg ctcctccccc 11220

accccccacc gagggagctg gggttggctc cacctttgga gcagatccta gcagtaccaa 11280

ggtccacctc tctgggccag tccaagcccc tcctgcctgg caggtccccc gaagcagtag 11340

gacggggtag tctctgagaa agcagagaga aagcagcctg aagaaactgg cccccactct 11400

tgtccctgca ctctaactca tgcatctatt cacaagtatg tgcaggcatt atgcaccgtg 11460

tgccagggac gtgccctatg cagggaagca gtgcctcccc agagctcaga ggctgatgag 11520

ggaggcaggc aatgagcaag gaaacagtcc atctccagct cggggccagc taaggacggc 11580

cttctccaac tctcccctct tgctccagac acagtctatc catttgaggt tgctgtgcaa 11640

gaggctgccc cgggggatga tgcccggccc tgtgcacaac acaggctgcc tctctgcttt 11700

acacaaaggc tccttaccag ctagttctgt gattctcaga ggcccacagc atcctcaggc 11760

ttttgacaac caggctctgg cacccactgt gtgccagacc ctggcatctg cctggctcag 11820

gggtggtcac tcacgtcccc agctgctggc cttggagcaa ctgctaccag ggtccagctg 11880

caagcaggag cctgcggccg cgctgggcct cactgctgga ggttgtatat tataataaag 11940

ccaacatttt gttgaaggct tctgctgcgc caggcactgt gttaagctct ttgtggggat 12000

tatctcgatt aactcctaca aacctaggaa ataaatagaa ttttccctag gctcaatgtc 12060

acacagctcc caagtggcac aggtgaaact tgactgcaga tctaagttac tgatctgagc 12120

aaggaagtgg aaattatgtt ctccaaaaca tcactagaac tagtagtata gattctggga 12180

agaggagact caggggccac aagcctggct tgctagaccc tcagaagggc tgtatgattc 12240

caaaggcatg tggagaagct gcaggggaaa tgcaggagag gaaggttgca gtgtgacctc 12300

cagaaggcct ttctgaacga gcttcctgga ggtgtagtgc atgcaagcca tggctgggca 12360

ccaggccagg ccgctgcaga gaggtttctt gcactggcag agggtgagac tgcatgaccc 12420

cagaggctcc ctacccccag ccacaggagg ctgtgactct ggacagggtt tggggctggg 12480

catgagcaga gctgaagagg ccgtcctctc tgcctttctc ggggagggtg tgcaggagag 12540

gctccagagg cttccagtgg aggatgcttc attcagtcaa caagcattta ttgagcaccc 12600

actgtgttcc aggcagtgtg caggcctgac ctcagggggc tcggaggcac ccctgcctgc 12660

tcactgcttt gcttcatgcc ttccaggagc ccacacgcat cccccggatg agttcctctt 12720

cacacca 12727

<210> 39

<211> 80

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

agcccacacg catcccccgg atgagttcct cttcacacca gtggtggtgg cctgtatgtc 60

tgtcatgtct ctgctggtgc 80

<210> 40

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

ctggttgcta cttaaccact cagacatagc ttagtcacta ccgtgactac gaattccgaa 60

gttcctattc tctagaaagt ataggaactt caggtctgaa 100

<210> 41

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

gaaagtatag gaacttcatc agtcaggtac ataatggtgg atccaatatt ctgtccttgg 60

agaaacacaa aacccttcct catacggaac taaaagctgt 100

<210> 42

<211> 3881

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

gggtatgact cctctcctaa gtgtccttag aggtggtttc ctaagtctct caaactccat 60

catctccctt caggatcagt tgagcctggc cccagattct gcctcttcct ctgttccctt 120

tcaggcaacc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaggggaaga ggagccagtg caacagacag 180

gaacgtgttc atctgttccc gtcctcacag aactagcagc tgggagcccc gtgcccagcc 240

gactctccaa cctgcatcgg ctcacgctat cccctggagg ctatggagtt ggggcctcct 300

ctggtcctgc tgctggccac agtttggcat ggtcagggga tcccagtgat agagcccagt 360

gtccctgagc tggtcgtgaa gccaggagca acggtgacct tgcgatgtgt gggcaatggc 420

agcgtggaat gggatggccc cccatcacct cactggaccc tgtactctga tggctccagc 480

agcatcctca gcaccaacaa cgctaccttc caaaacacgg ggacctatcg ctgcactgag 540

cctggagacc ccctgggagg cagcgccgcc atccacctct atgtcaaaga ccctgcccgg 600

ccctggaacg tgctagcaca ggaggtggtc gtgttcgagg accaggacgc actactgccc 660

tgtctgctca cagacccggt gctggaagca ggcgtctcgc tggtgcgtgt gcgtggccgg 720

cccctcatgc gccacaccaa ctactccttc tcgccctggc atggcttcac catccacagg 780

gccaagttca ttcagagcca ggactatcaa tgcagtgccc tgatgggtgg caggaaggtg 840

atgtccatca gcatccggct gaaagtgcag aaagtcatcc cagggccccc agccttgaca 900

ctggtgcctg cagagctggt gcggattcga ggggaggctg cccagatcgt gtgctcagcc 960

agcagcgttg atgttaactt tgatgtcttc ctccaacaca acaacaccaa gctcgcaatc 1020

cctcaacaat ctgactttca taataaccgt taccaaaaag tcctgaccct caacctcgat 1080

caagtagatt tccaacatgc cggcaactac tcctgcgtgg ccagcaacgt gcagggcaag 1140

cactccacct ccatgttctt ccgggtggta gagagtgcct acttgaactt gagctctgag 1200

cagaacctca tccaggaggt gaccgtgggg gaggggctca acctcaaagt catggtggag 1260

gcctacccag gcctgcaagg ttttaactgg acctacctgg gacccttttc tgaccaccag 1320

cctgagccca agcttgctaa tgctaccacc aaggacacat acaggcacac cttcaccctc 1380

tctctgcccc gcctgaagcc ctctgaggct ggccgctact ccttcctggc cagaaaccca 1440

ggaggctgga gagctctgac gtttgagctc acccttcgat accccccaga ggtaagcgtc 1500

atatggacat tcatcaacgg ctctggcacc cttttgtgtg ctgcctctgg gtacccccag 1560

cccaacgtga catggctgca gtgcagtggc cacactgata ggtgtgatga ggcccaagtg 1620

ctgcaggtct gggatgaccc ataccctgag gtcctgagcc aggagccctt ccacaaggtg 1680

acggtgcaga gcctgctgac tgttgagacc ttagagcaca accaaaccta cgagtgcagg 1740

gcccacaaca gcgtggggag tggctcctgg gccttcatac ccatctctgc aggagcccac 1800

acgcatcccc cggatgagtt cctcttcaca ccagtggtgg tggcctgtat gtctgtcatg 1860

tctctgctgg tgctactgct gttgctgctc ttgtacaagt acaagcagaa gccgaagtac 1920

caggtgcgct ggaagatcat cgagagatac gaaggcaata gctacacctt cattgaccct 1980

actcagttgc cctacaatga gaagtgggag ttccctcgga acaacctgca gtttggtaag 2040

actctaggag ccggtgcctt tgggaaggtg gtggaggcta cagcctttgg tctgggcaaa 2100

gaagatgcag tgctgaaggt ggctgtgaag atgctaaagt ccacggctca tgctgatgag 2160

aaggaggccc tgatgtcaga gctgaagatc atgagtcacc tgggacagca cgagaatata 2220

gtcaacctct tgggagcctg tactcacgga ggacctgtcc tggtcatcac tgaatactgc 2280

tgctatggag acctactcaa ctttctccga aggaaggccg aggctatgct aggacccagc 2340

ctgagtcctg gtcaggactc cgagggagac tccagctaca agaacatcca cctggagaag 2400

aaatatgtgc gcagggacag tggcttctcc agtcagggtg tagacaccta cgtggagatg 2460

aggcctgtct cgacttcttc aagtgactcc ttctttaagc aagatctgga caaagaggcc 2520

agccggcccc tggagctctg ggacctgctc cacttctcca gccaagtggc tcagggcatg 2580

gccttccttg cttctaaaaa ctgcatccac cgggacgtag cagctcgaaa cgtgctgttg 2640

accagcggac atgtggccaa gattggggac tttggactgg ctagggacat catgaatgac 2700

tccaactatg ttgtcaaggg caatgcccgc ctgcctgtaa agtggatggc cccagagagc 2760

atctttgact gcgtctacac agttcagagt gatgtgtggt cctacggcat cctcctctgg 2820

gagatcttct cgcttggtct gaacccctac cccggcatcc tagtgaacaa caagttctac 2880

aaactggtga aggatggata ccaaatggcc cagcctgtat ttgcaccgaa gaacatatac 2940

agcatcatgc agtcctgctg ggacctggag cctaccagaa gacccacctt ccaacagatc 3000

tgcttcctcc tccaggagca ggcccgactg gagaggagag accaggacta tgctaacctg 3060

ccaagcagcg gtggcagcag cggcagtgac agtggtggtg gcagcagcgg tggcagcagc 3120

agtgagccag aagaggagag ctccagtgaa cacctggcct gctgtgagcc aggggacatc 3180

gcccagcccc tgctgcagcc taacaactac cagttctgct gaagtgggag ggagagccga 3240

gtcctgccgc tctctacgtc ccagcttggc ctcctccatg gcacgggcga catggggaga 3300

acatatggac ttcgccctca gcttggccca gctctgacac ttcagaacat gaggggtctg 3360

gggaggtcag aggccccgtt tgttcccaga gcctgggcca tcactgccag tggggttctc 3420

acagtgctag cctctatatt tactatgcca actggtgcac ccctagttct ctttctccat 3480

cctattccca ttttaaaaaa cccgtcccaa actctcgtgt ttcaatggaa agactgattt 3540

atgtctcaaa agacaagagt ctcaaaggct gtgggtaagc tgaaggcttg cctccctgac 3600

agatgcttag actacaggct tcttgggaca ggtggcccct tcctaagctc acaggagtgg 3660

ccaccactct tgaccttcac tctgtctata gtcccgcctc atcctggatc ttgtactgag 3720

cggcagctaa aagtgttcta cccagtgccc tgtcactcta gactggaagg tatggggcct 3780

gatgcaaggc tgaccacacc aacaaacacc gtgtgctcct ctccaagctg actcgtcctc 3840

attaactgtc aacattaaac taacagcatt aacacagcca g 3881

<210> 43

<211> 979

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

Met Glu Leu Gly Pro Pro Leu Val Leu Leu Leu Ala Thr Val Trp His

1 5 10 15

Gly Gln Gly Ile Pro Val Ile Glu Pro Ser Val Pro Glu Leu Val Val

20 25 30

Lys Pro Gly Ala Thr Val Thr Leu Arg Cys Val Gly Asn Gly Ser Val

35 40 45

Glu Trp Asp Gly Pro Pro Ser Pro His Trp Thr Leu Tyr Ser Asp Gly

50 55 60

Ser Ser Ser Ile Leu Ser Thr Asn Asn Ala Thr Phe Gln Asn Thr Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Cys Thr Glu Pro Gly Asp Pro Leu Gly Gly Ser Ala Ala

85 90 95

Ile His Leu Tyr Val Lys Asp Pro Ala Arg Pro Trp Asn Val Leu Ala

100 105 110

Gln Glu Val Val Val Phe Glu Asp Gln Asp Ala Leu Leu Pro Cys Leu

115 120 125

Leu Thr Asp Pro Val Leu Glu Ala Gly Val Ser Leu Val Arg Val Arg

130 135 140

Gly Arg Pro Leu Met Arg His Thr Asn Tyr Ser Phe Ser Pro Trp His

145 150 155 160

Gly Phe Thr Ile His Arg Ala Lys Phe Ile Gln Ser Gln Asp Tyr Gln

165 170 175

Cys Ser Ala Leu Met Gly Gly Arg Lys Val Met Ser Ile Ser Ile Arg

180 185 190

Leu Lys Val Gln Lys Val Ile Pro Gly Pro Pro Ala Leu Thr Leu Val

195 200 205

Pro Ala Glu Leu Val Arg Ile Arg Gly Glu Ala Ala Gln Ile Val Cys

210 215 220

Ser Ala Ser Ser Val Asp Val Asn Phe Asp Val Phe Leu Gln His Asn

225 230 235 240

Asn Thr Lys Leu Ala Ile Pro Gln Gln Ser Asp Phe His Asn Asn Arg

245 250 255

Tyr Gln Lys Val Leu Thr Leu Asn Leu Asp Gln Val Asp Phe Gln His

260 265 270

Ala Gly Asn Tyr Ser Cys Val Ala Ser Asn Val Gln Gly Lys His Ser

275 280 285

Thr Ser Met Phe Phe Arg Val Val Glu Ser Ala Tyr Leu Asn Leu Ser

290 295 300

Ser Glu Gln Asn Leu Ile Gln Glu Val Thr Val Gly Glu Gly Leu Asn

305 310 315 320

Leu Lys Val Met Val Glu Ala Tyr Pro Gly Leu Gln Gly Phe Asn Trp

325 330 335

Thr Tyr Leu Gly Pro Phe Ser Asp His Gln Pro Glu Pro Lys Leu Ala

340 345 350

Asn Ala Thr Thr Lys Asp Thr Tyr Arg His Thr Phe Thr Leu Ser Leu

355 360 365

Pro Arg Leu Lys Pro Ser Glu Ala Gly Arg Tyr Ser Phe Leu Ala Arg

370 375 380

Asn Pro Gly Gly Trp Arg Ala Leu Thr Phe Glu Leu Thr Leu Arg Tyr

385 390 395 400

Pro Pro Glu Val Ser Val Ile Trp Thr Phe Ile Asn Gly Ser Gly Thr

405 410 415

Leu Leu Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Pro Gln Pro Asn Val Thr Trp Leu

420 425 430

Gln Cys Ser Gly His Thr Asp Arg Cys Asp Glu Ala Gln Val Leu Gln

435 440 445

Val Trp Asp Asp Pro Tyr Pro Glu Val Leu Ser Gln Glu Pro Phe His

450 455 460

Lys Val Thr Val Gln Ser Leu Leu Thr Val Glu Thr Leu Glu His Asn

465 470 475 480

Gln Thr Tyr Glu Cys Arg Ala His Asn Ser Val Gly Ser Gly Ser Trp

485 490 495

Ala Phe Ile Pro Ile Ser Ala Gly Ala His Thr His Pro Pro Asp Glu

500 505 510

Phe Leu Phe Thr Pro Val Val Val Ala Cys Met Ser Val Met Ser Leu

515 520 525

Leu Val Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Tyr Lys Tyr Lys Gln Lys Pro

530 535 540

Lys Tyr Gln Val Arg Trp Lys Ile Ile Glu Arg Tyr Glu Gly Asn Ser

545 550 555 560

Tyr Thr Phe Ile Asp Pro Thr Gln Leu Pro Tyr Asn Glu Lys Trp Glu

565 570 575

Phe Pro Arg Asn Asn Leu Gln Phe Gly Lys Thr Leu Gly Ala Gly Ala

580 585 590

Phe Gly Lys Val Val Glu Ala Thr Ala Phe Gly Leu Gly Lys Glu Asp

595 600 605

Ala Val Leu Lys Val Ala Val Lys Met Leu Lys Ser Thr Ala His Ala

610 615 620

Asp Glu Lys Glu Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys Ile Met Ser His Leu

625 630 635 640

Gly Gln His Glu Asn Ile Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr His Gly

645 650 655

Gly Pro Val Leu Val Ile Thr Glu Tyr Cys Cys Tyr Gly Asp Leu Leu

660 665 670

Asn Phe Leu Arg Arg Lys Ala Glu Ala Met Leu Gly Pro Ser Leu Ser

675 680 685

Pro Gly Gln Asp Ser Glu Gly Asp Ser Ser Tyr Lys Asn Ile His Leu

690 695 700

Glu Lys Lys Tyr Val Arg Arg Asp Ser Gly Phe Ser Ser Gln Gly Val

705 710 715 720

Asp Thr Tyr Val Glu Met Arg Pro Val Ser Thr Ser Ser Ser Asp Ser

725 730 735

Phe Phe Lys Gln Asp Leu Asp Lys Glu Ala Ser Arg Pro Leu Glu Leu

740 745 750

Trp Asp Leu Leu His Phe Ser Ser Gln Val Ala Gln Gly Met Ala Phe

755 760 765

Leu Ala Ser Lys Asn Cys Ile His Arg Asp Val Ala Ala Arg Asn Val

770 775 780

Leu Leu Thr Ser Gly His Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Leu Ala

785 790 795 800

Arg Asp Ile Met Asn Asp Ser Asn Tyr Val Val Lys Gly Asn Ala Arg

805 810 815

Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser Ile Phe Asp Cys Val Tyr

820 825 830

Thr Val Gln Ser Asp Val Trp Ser Tyr Gly Ile Leu Leu Trp Glu Ile

835 840 845

Phe Ser Leu Gly Leu Asn Pro Tyr Pro Gly Ile Leu Val Asn Asn Lys

850 855 860

Phe Tyr Lys Leu Val Lys Asp Gly Tyr Gln Met Ala Gln Pro Val Phe

865 870 875 880

Ala Pro Lys Asn Ile Tyr Ser Ile Met Gln Ser Cys Trp Asp Leu Glu

885 890 895

Pro Thr Arg Arg Pro Thr Phe Gln Gln Ile Cys Phe Leu Leu Gln Glu

900 905 910

Gln Ala Arg Leu Glu Arg Arg Asp Gln Asp Tyr Ala Asn Leu Pro Ser

915 920 925

Ser Gly Gly Ser Ser Gly Ser Asp Ser Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly

930 935 940

Ser Ser Ser Glu Pro Glu Glu Glu Ser Ser Ser Glu His Leu Ala Cys

945 950 955 960

Cys Glu Pro Gly Asp Ile Ala Gln Pro Leu Leu Gln Pro Asn Asn Tyr

965 970 975

Gln Phe Cys

<210> 44

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala Asn Ile Trp Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Asn Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val

65 70 75 80

Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ile Gly Pro Ile Lys Tyr Pro Thr Ala Pro Tyr Arg Tyr

100 105 110

Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr

130 135 140

Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr

195 200 205

Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

210 215 220

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

225 230 235 240

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

245 250 255

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

260 265 270

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

275 280 285

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

290 295 300

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

305 310 315 320

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

325 330 335

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

340 345 350

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

355 360 365

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

370 375 380

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

385 390 395 400

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

405 410 415

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

420 425 430

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

435 440 445

Leu Ser Leu Gly Lys

450

<210> 45

<211> 169

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg

1 5 10 15

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser

20 25 30

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asp Ser Glu

35 40 45

Tyr Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

50 55 60

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

65 70 75 80

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

85 90 95

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

100 105 110

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

115 120 125

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

130 135 140

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

145 150 155 160

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

165

<210> 46

<211> 449

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Asn

20 25 30

Tyr Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Thr Phe Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Ser Pro Tyr Phe Ser Asn Leu Tyr Val Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr

210 215 220

Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly

435 440 445

Lys

<210> 47

<211> 218

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 47

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Asn Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Leu Ser Asn

85 90 95

Glu Asp Leu Ser Thr Glu Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 48

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 48

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asp Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Trp Thr Asp Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu Gln

50 55 60

Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met

65 70 75 80

Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Asp Gln Arg Leu Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 49

<211> 213

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 49

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Val Asn Thr Tyr

20 25 30

Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Phe Ser Tyr Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 50

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 50

Gln Asp Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Glu Val Asp Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ala Ser

115 120

<210> 51

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 51

Ala Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Ala

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims (24)

1.一种人源化CSF1蛋白，其特征在于，所述的人源化CSF1蛋白包含人CSF1蛋白的部分。

2.根据权利要求1所述的人源化CSF1蛋白，其特征在于，所述的人源化CSF1蛋白包含人CSF1蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分，优选的，所述的人源化CSF1蛋白包含人CSF1蛋白胞外区的全部或部分，进一步优选的，包含至少200个连续氨基酸的人CSF1蛋白胞外区，更优选的，包含与SEQ ID NO:2的第38-496位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第38-496位所示的氨基酸序列；所述的人源化CSF1蛋白还包含人CSF1蛋白跨膜区的全部或部分，优选的，所述的跨膜区包含与SEQ ID NO:2的第497-517位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第497-517位所示氨基酸序列；所述的人源化CSF1蛋白还包含包含人CSF1蛋白胞质区的全部或部分，优选的，所述的胞质区包含与SEQ ID NO:2的第518-554位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者包含SEQ ID NO:2的第518-554位所示氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的人源化CSF1蛋白，其特征在于，所述的人源化CSF1蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：

A)为SEQ ID NO：2的第38-554位氨基酸序列的全部或部分；

B)与SEQ ID NO：2的第38-554位氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

C)与SEQ ID NO：2的第38-554位所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

D)与SEQ ID NO：2的第38-554位所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

4.根据权利要求1-3任一所述的人源化CSF1蛋白，其特征在于，所述的人源化CSF1蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：

I)为SEQ ID NO：10氨基酸序列的全部或部分；

II)与SEQ ID NO：10氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

III)与SEQ ID NO：10所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

IV)与SEQ ID NO：10所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

5.一种人源化CSF1基因，其特征在于，所述的人源化CSF1基因包含人CSF1基因的部分。

6.根据权利要求5所述的人源化CSF1基因，其特征在于，所述的人源化CSF1基因编码权利要求1-4任一所述的人源化CSF1蛋白。

7.根据权利要求5或6所述的人源化CSF1基因，其特征在于，所述的人源化CSF1基因包含人CSF1基因的1号至9号外显子的部分；优选的，包含2号至8号外显子的全部或部分；进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列；8号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列。

8.根据权利要求5-7任一所述的人源化CSF1基因，其特征在于，所述的人源化CSF1基因包含非人动物CSF1基因的1号和/或9号外显子；优选还包括非人动物2号外显子的部分和/或8号外显子的部分。

9.根据权利要求5-8任一所述的人源化CSF1基因，其特征在于，所述的人源化CSF1基因包含下列组中的一种：

(A)为SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的全部或部分；

(B)与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(C)与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(D)具有SEQ ID NO：5所示核苷酸序列的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

10.根据权利要求5-9任一所述的人源化CSF1基因，其特征在于，所述的人源化CSF1基因转录的mRNA选自下列组中的一种：

(i)为SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的全部或部分；

(ii)与SEQ ID NO：9所示核苷酸序列的同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

(iii)与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或

(iv)与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。

11.一种靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含人CSF1基因的部分，优选的，所述的人CSF1基因的部分包含人CSF1基因的1号至9号外显子的部分，进一步优选的，包含2号至8号外显子的全部或部分，更优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列；8号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，更进一步优选的，所述的靶向载体包含与SEQ ID NO：5具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者与SEQ ID NO：5所示核苷酸序列一致，

优选的，所述的靶向载体还包含5’臂，优选的，所述的5’臂与NCBI登录号为NC_000069.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述5’臂序列与SEQ ID NO：3至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：3所示；和/或，所述的靶向载体还包含3’臂，优选的，所述的3’臂与NCBI登录号为NC_000069.7至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述的3’臂序列与SEQ ID NO：4至少具有90％同源性，或者如SEQ ID NO：4所示。

12.一种CSF1基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括用包含人CSF1基因的部分核苷酸序列导入非人动物CSF1基因座，所述的非人动物体内表达人源化CSF1蛋白。

13.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CSF1蛋白包括权利要求1-4任一所述的人源化CSF1蛋白，优选的，所述的非人动物的基因组中还包含人源化CSF1基因，所述的人源化CSF1基因包括权利要求5-10任一所述的人源化CSF1基因。

14.根据权利要求12-13任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人CSF1基因的部分核苷酸序列包含人CSF1基因的1号至9号外显子的部分核苷酸序列，优选的，包含2号至8号外显子的全部或部分核苷酸序列，进一步优选的，包含2号外显子的部分、3号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分，其中，2号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，8号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，更优选的，所述的人CSF1基因的部分核苷酸序列包含与SEQ ID NO：5具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。

15.根据权利要求12-14任一所述的构建方法，其特征在于，所述的导入为替换或插入，优选的，所述的导入非人动物CSF1基因座为替换非人动物相应区域，进一步优选的，非人动物CSF1基因的2号至8号外显子的全部或部分被替换，更进一步优选的，非人动物CSF1基因的2号外显子的部分、3号外显子至7号外显子的全部和8号外显子的部分被替换。

16.根据权利要求12-15任一所述的构建方法，其特征在于，使用权利要求11所述的靶向载体进行非人动物的构建。

17.根据权利要求12-16任一所述的构建方法，其特征在于，所述的构建方法还包括将CSF1基因人源化的非人动物与其他基因修饰的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因修饰的非人动物，优选的，所述的其他基因选自CSF1R、PD-1、PD-L1、IL6、IL3、IL15、CSF2、TPO和CD40中的至少一种。

18.根据权利要求17所述的构建方法，其特征在于，所述其他基因为CSF1R基因，所述的CSF1R基因为人源化CSF1R基因，所述的非人动物体内表达人或人源化CSF1R蛋白。

19.根据权利要求18所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CSF1R蛋白包含人CSF1R蛋白的信号肽、跨膜区、胞质区和/或胞外区的全部或部分，优选的，所述的人源化CSF1R蛋白包含人CSF1R蛋白的胞外区的全部或部分，进一步优选的，所述的人源化CSF1R蛋白包含的人CSF1R蛋白的胞外区的氨基酸序列包含与SEQ ID NO：35的第20-517位具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的氨基酸序列或者与SEQ ID NO：35的第20-517位所示氨基酸序列一致。

20.根据权利要求18或19所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CSF1R蛋白的氨基酸序列选自下列组中的一种：

I)为SEQ ID NO：43氨基酸序列的全部或部分；

II)与SEQ ID NO：43氨基酸序列同一性至少为70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；

III)与SEQ ID NO：43所示氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或

IV)与SEQ ID NO：43所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。

21.根据权利要求18-20任一所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化CSF1R基因包含人CSF1R基因的1号至22号外显子的全部或部分，优选的，包含3号至11号外显子的全部或部分，进一步优选的，包含3号外显子的部分、4号外显子至10号外显子的全部和11号外显子的部分，其中，3号外显子的部分至少包含100bp的核苷酸序列，11号外显子的部分至少包含20bp的核苷酸序列，优选的，所述的人源化CSF1R基因包含与SEQ ID NO：38具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少99％同一性的核苷酸序列或者包含SEQ ID NO：38所示的核苷酸序列。

22.一种细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或者器官表达权利要求1-4任一所述的人源化CSF1蛋白，所述的细胞、组织或者器官包含权利要求5-10任一所述的人源化CSF1基因，或者所述细胞、组织或者器官来源于权利要求12-21任一所述的构建方法获得的非人动物。

23.根据权利要求12-21任一所述的构建方法或者权利要求22所述的细胞、组织或器官，其特征在于，所述的非人动物为非人哺乳动物；优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物；进一步优选的，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。

24.来源于权利要求1-4任一所述的人源化CSF1蛋白、权利要求5-10任一所述的人源化CSF1基因、权利要求12-21、23任一所述的构建方法获得的非人动物或权利要求22-23所述的细胞、组织或器官的应用，所述应用包括：

在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学、医学研究的模型系统中的应用；

在生产和利用动物实验疾病模型，用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；

或者，

在筛选、验证、评价或研究CSF1和/或CSF1R通路功能、人CSF1和/或CSF1R通路信号机理、靶向人的抗体、靶向人的药物、药效，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的应用。

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