CN112779285A - 人源化il-10和il-10ra基因改造动物的构建方法和应用 - Google Patents

人源化il-10和il-10ra基因改造动物的构建方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN112779285A
CN112779285A CN202011257166.3A CN202011257166A CN112779285A CN 112779285 A CN112779285 A CN 112779285A CN 202011257166 A CN202011257166 A CN 202011257166A CN 112779285 A CN112779285 A CN 112779285A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
nucleotide sequence
human
humanized
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011257166.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112779285B (zh
Inventor
沈月雷
郭雅南
白阳
姚佳维
郭朝设
张美玲
黄蕤
赵磊
周小飞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Original Assignee
Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd filed Critical Baccetus Beijing Pharmaceutical Technology Co ltd
Publication of CN112779285A publication Critical patent/CN112779285A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112779285B publication Critical patent/CN112779285B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • A01K67/0278—Humanized animals, e.g. knockin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New breeds of animals
    • A01K67/027—New breeds of vertebrates
    • A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A61K49/0008—Screening agents using (non-human) animal models or transgenic animal models or chimeric hosts, e.g. Alzheimer disease animal model, transgenic model for heart failure
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/5428—IL-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/15—Humanized animals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/07—Animals genetically altered by homologous recombination
    • A01K2217/072—Animals genetically altered by homologous recombination maintaining or altering function, i.e. knock in
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0306—Animal model for genetic diseases
    • A01K2267/0325—Animal model for autoimmune diseases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0362—Animal model for lipid/glucose metabolism, e.g. obesity, type-2 diabetes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0368—Animal model for inflammation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/035—Animal model for multifactorial diseases
    • A01K2267/0387—Animal model for diseases of the immune system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Abstract

本发明涉及人源化基因改造非人动物，特别是基因改造啮齿动物，但尤其是基因改造小鼠，具体涉及表达人源化IL‑10和/或IL‑10RA蛋白的动物模型。本发明还提供了一种人源化IL‑10RA蛋白、一种人源化IL‑10RA基因、一种人源化IL‑10基因、IL‑10基因的靶向载体以及IL‑10RA基因的靶向载体。本发明还提供了一种上述动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。

Description

人源化IL-10和IL-10RA基因改造动物的构建方法和应用
技术领域
本申请涉及人源化基因改造动物模型的建立方法及应用，具体而言，涉及基于一种人源化IL-10和/或IL-10RA基因改造动物模型的构建方法及其在生物医药领域的应用。
背景技术
实验动物疾病模型对于研究人类疾病发生的病因、发病机制、开发防治技术和开发药物是不可缺少的研究工具。但由于动物与人类的生理结构和代谢系统本身的差异，传统的动物模型并不能很好的反映人体的真实状况，在动物体内建立更接近人类的生理特征的疾病模型是生物医药行业的迫切需求。
随着基因工程技术的不断发展和成熟，用人类基因替代或置换动物的同源性基因已经实现，通过这种方式开发人源化实验动物模型(humanized animal model)是动物模型未来的发展方向。其中基因人源化动物模型，即利用基因编辑技术，用人源正常或突变基因替换动物基因组的同源基因，可建立更接近人类生理或疾病特征的正常或突变基因动物模型。基因人源化动物不但本身具有重要应用价值，如通过基因人源化可改进和提升细胞或组织移植人源化动物模型，更重要的是，由于人类基因片段的插入，动物体内可表达或部分表达人源蛋白，可作为仅能识别人蛋白的氨基酸序列的药物的靶点，为在动物水平进行抗人抗体及其它药物的筛选提供了可能。然而，由于动物与人类在生理学及病理学方面存在差异，加上基因(即遗传因子)的复杂性，如何能构建出“有效”的人源化动物模型用于新药研发仍是最大的挑战。
白介素10(Interleukin 10，IL-10)基因定位于染色体1q31-32上，主要由单核细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、巨噬细胞产生，此外DC细胞和肥大细胞也可以产生。IL-10蛋白属于同源二聚体分泌物，由2个亚基组成，分子量大小为18kDa。其生理功能主要分两个方面：①免疫抑制剂，通过下调MHC II类分子和ICAM-1、B7等共刺激分子的表达，抑制单核/巨噬细胞的抗原呈递细胞(APC)功能，抑制炎性细胞因子TNF、IL1、IL6和IL8的分泌；②免疫激动剂，刺激NK细胞活性，增强IL2诱导的NK细胞增殖、细胞毒性和细胞因子的产生，同时也是B淋巴细胞强有力的增殖分化因子，促进IgM、IgG、IgA亚型的合成，促进外周血记忆B细胞浆细胞的生成。IL-10发挥其生物学效应需要与IL-10受体(IL-10R)结合，有功能的IL-10R由两个特殊的亚单位组成：IL-10RA和IL-10RB，其中IL-10RA是一个110kDa的多肽，在介导高亲和力配体结合和信号转导中发挥重要作用；IL-10RB为40kDa的多肽，仅为信号转导所必须。
作为目前公认的炎症与免疫抑制因子，IL-10和IL-10RA在疾病研究方面的应用非常广泛。研究表明，其在肿瘤、感染、器官移植、造血系统及心血管系统中发挥着重要作用，同时也与血液、消化、尤其是心血管系统疾病密切相关。例如，有研究证明哮喘和过敏性鼻炎患者呼吸道中IL-10表达量较健康受试者低；IL-10敲除小鼠可生成慢性结肠炎；结直肠癌和癌旁组织中IL-10表达升高；IL-10RA基因功能缺陷致极早发型炎症性肠病(VEO-IBD)患儿肠道菌群紊乱；IL-10RA多态性与系统性红斑狼疮的发病相关等等。基于IL-10及其受体的重要功能，目前已经有多种靶向药物进入临床。例如Merck的MK-1966与TLR9拮抗剂联合用于恶性肿瘤的治疗(NCT02731742)；Biotest AG的BT-063与PD-1抗体联和用于黑色素瘤的治疗(WO2019072566)等。此外，还有通过腺病毒载体或聚乙二醇化的IL-10药物用于肿瘤治疗，比如ARMO BioSciences和Merck联合开发的Pegilodecakin。
鉴于IL-10信号通路在免疫治疗领域具有巨大应用价值，为了进一步的研究相关的生物学特性，提高临床前期的药效试验的有效性，提高研发成功率，使临床前期的试验更有效并使研发失败最小化，本领域急需开发涉及IL-10信号通路的非人动物模型。此外，本方法得到的非人动物还可与其它基因人源化的非人动物，如与免疫检查点人源化小鼠交配得到多基因人源化的动物模型，用于筛选和评估针对该信号通路的人用药及联合用药的药效研究。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。本发明在学术和临床研究中具有广阔的应用前景。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种人源化IL-10RA蛋白，所述的人源化IL-10RA蛋白包括人IL-10RA蛋白区域。
优选的，包含胞外区的全部、信号肽的全部、跨膜区的全部和胞内区的部分，其中胞内区的部分至少包含胞内区N端1-10个氨基酸。进一步优选的，包含SEQ ID NO：28第1-264位所示氨基酸序列。
优选的，所述的人源化IL-10RA蛋白还包括非人动物IL-10RA蛋白区域。优选的，所述的人IL-10RA蛋白区域包括人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列编码的蛋白的全部或部分。
进一步优选的，所述的第1至6号外显子核苷酸序列编码的蛋白的部分至少包含人IL-10RA蛋白胞外区的全部或部分，所述的胞外区的部分为至少10个或至少20或至少30与人IL-10RA蛋白的胞外区氨基酸序列相同且可以结合靶向人特定抗原的抗体。
优选的，所述的人IL-10RA蛋白区域包括人IL-10RA基因的第1号外显子核苷酸序列、第2号外显子核苷酸序列、第3号外显子核苷酸序列、第4号外显子核苷酸序列、第5号外显子核苷酸序列或第6号外显子核苷酸序列中的任一个或两个或三个以上的组合编码的蛋白的全部或部分。优选的，所述的三个以上可以为三个、四个、五个或六个。
进一步优选的，所述的人IL-10RA蛋白区域包括人IL-10RA基因的第1号外显子核苷酸序列、第2号外显子核苷酸序列、第3号外显子核苷酸序列、第4号外显子核苷酸序列、第5号外显子核苷酸序列或第6号外显子核苷酸序列中的连续两个或连续三个以上外显子核苷酸序列的组合编码的蛋白的全部或部分。优选的，所述的三个以上可以为三个、四个、五个或六个。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人IL-10RA蛋白区域包括人IL-10RA基因的第1号外显子的部分核苷酸序列、第2至5号外显子的全部核苷酸序列和第6号外显子的部分核苷酸序列编码的蛋白的全部或部分。
优选的，所述的人源化IL-10RA蛋白的氨基酸序列包括SEQ ID NO：28第1-264位所示氨基酸序列的全部或部分。
优选的，所述的人源化IL-10RA蛋白的氨基酸序列连续5个氨基酸至连续264个氨基酸与人IL-10RA蛋白的氨基酸序列一致。进一步优选的，所述的人源化IL-10RA蛋白的氨基酸序列连续10、20、30、40、50、70、80、100、150、180个氨基酸至连续200个氨基酸与人IL-10RA蛋白的氨基酸序列一致。
进一步优选的，所述的胞外区来源于人IL-10RA蛋白胞外区的全部或部分，更进一步优选的，所述的胞外区氨基酸序列包含SEQ ID NO：28第22-235位所示氨基酸序列的全部或部分。
优选的，所述的胞外区氨基酸序列至少5、10、50、100或全部与人IL-10RA氨基酸序列相同。进一步优选的，所述的胞外区氨基酸序列至少100个与人IL-10RA氨基酸序列相同。最为优选的，所述的胞外区氨基酸序列与人IL-10RA胞外区氨基酸序列一致。
进一步优选的，所述的跨膜区来源于人IL-10RA蛋白跨膜区的全部或部分，更进一步优选的，所述的跨膜区氨基酸序列包含SEQ ID NO：28第236-256位所示氨基酸序列的全部或部分。
进一步优选的，所述的信号肽来源于人IL-10RA蛋白信号肽的全部或部分，更进一步优选的，所述的信号肽氨基酸序列包含SEQ ID NO：28第1-21位所示氨基酸序列的全部或部分。
进一步优选的，所述的胞内区包括人IL-10RA蛋白胞内区的全部或部分，更进一步优选的，所述的胞内区氨基酸序列包含SEQ ID NO：28第257-264位所示氨基酸序列的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的胞外区、信号肽和跨膜区来源于人IL-10RA蛋白的全部或部分，所述的胞内区包括人IL-10RA蛋白的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL-10RA蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
A)SEQ ID NO：32所述氨基酸序列的部分或全部；
B)与SEQ ID NO：32所示氨基酸的序列同源性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：32所示的氨基酸的序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
D)具有SEQ ID NO：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
优选的，所述的人源化IL-10RA蛋白结合靶向人特定抗原的抗体。
本发明的第二方面，提供了一种人源化IL-10RA基因，所述的人源化IL-10RA基因包括人IL-10RA基因组片段。
优选的，所述的人源化IL-10RA基因包括人IL-10RA基因组的部分。
优选的，包含人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分。进一步优选的，包含人IL-10RA基因的第1号外显子的部分核苷酸序列、第2至5号外显子的全部核苷酸序列和第6号外显子的部分核苷酸序列，优选还包含第1-2号内含子和/或第5-6号内含子。
所述的第1号外显子的部分核苷酸序列至少包含从起始密码子至第1号外显子的最后一个核苷酸序列。
所述的第1号外显子的部分核苷酸序列至少包含从第1号外显子编码的第一个氨基酸至最后一个氨基酸序列的核苷酸。
所述的第1号外显子的部分核苷酸序列至少包含第1号外显子3’-5’的60-70bp的核苷酸序列，具体为第2号外显子中从5’端第78个核苷酸(或3’端第1个核苷酸)开始至长度为60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70bp的核苷酸序列。
所述的第6号外显子的部分核苷酸序列至少包含从第6号外显子的第一个核苷酸序列至6号外显子编码的C端第1-10的氨基酸。
所述的第6号外显子的部分核苷酸序列至少包含从第6号外显子编码的第一个氨基酸序列至编码IL-10RA胞内区N端第1-10个氨基酸。
所述的第6号外显子的部分核苷酸序列至少包含第6号外显子5’-3’的100-110bp的核苷酸序列，具体为第6号外显子中从5’端第1个核苷酸(或3’端第18个核苷酸)开始至长度为100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110bp的核苷酸序列。
优选的，包含编码人IL-10RA蛋白的核苷酸序列。进一步优选的，包含编码SEQ IDNO:28第1-264位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，包含NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL-10RA基因还包括非人动物IL-10RA基因组片段。
优选的，所述的人IL-10RA基因组片段包括人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分。
进一步优选的，所述的第1至6号外显子核苷酸序列的部分至少包含编码人IL-10RA蛋白胞外区的核苷酸序列的全部或部分，所述的胞外区的核苷酸序列的部分为至少30、至少60、至少90个与人IL-10RA蛋白的胞外区的编码序列相同，且人源化IL-10RA基因编码的蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。
优选的，所述的人IL-10RA基因组片段包括人IL-10RA基因的第1号外显子核苷酸序列、第2号外显子核苷酸序列、第3号外显子核苷酸序列、第4号外显子核苷酸序列、第5号外显子核苷酸序列或第6号外显子核苷酸序列中的任一个或两个或三个以上的组合。优选的，所述的三个以上可以为三个、四个、五个或六个。
进一步优选的，所述的人IL-10RA基因组片段包括人IL-10RA基因的第1号外显子核苷酸序列、第2号外显子核苷酸序列、第3号外显子核苷酸序列、第4号外显子核苷酸序列、第5号外显子核苷酸序列或第6号外显子核苷酸序列中的连续两个或连续三个以上的组合。优选的，所述的三个以上可以为三个、四个、五个或六个。
进一步优选的，所述的人IL-10RA基因组片段包括人IL-10RA基因的第1号外显子的部分核苷酸序列、第2至5号外显子的全部核苷酸序列和第6号外显子的部分核苷酸序列。
最为优选的，所述的人源化IL-10RA基因的核苷酸序列包括NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列的全部或部分。
优选的，所述的人源化IL-10RA基因的核苷酸序列包含SEQ ID NO：33、34和/或53所示的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL-10RA基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：
(a)编码上述的人源化IL-10RA蛋白的核苷酸序列；
(b)NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列；
(c)转录的mRNA序列为SEQ ID NO：31所示；
(d)与SEQ ID NO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列的同源性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
(e)在严格条件下，与SEQ ID NO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位所示的核苷酸序列杂交；
(f)与SEQ ID NO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
(g)具有SEQ ID NO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
其中，SEQ ID NO：31所示序列为IL-10RA基因人源化小鼠IL-10RA DNA的非模板链、编码链或有义链。
优选的，所述的人源化IL-10RA基因还可以包括人IL-10RA基因的全部核苷酸序列或全部人IL-10RA蛋白的编码序列。
进一步优选的，所述的人源化IL-10RA基因还包括辅助序列。
更进一步优选的，所述的辅助序列可以为终止密码子。最为优选的，所述的辅助序列为WPRE和/或polyA。
本发明的第三方面，提供了一种人源化IL-10基因，所述的人源化IL-10基因包括人IL-10基因组片段。
优选的，所述的人源化IL-10基因包括人IL-10基因的部分。
优选的，包含人IL-10基因的第1至5号外显子核苷酸序列的全部或部分。进一步优选的，包含人IL-10基因的第1号外显子的部分核苷酸序列、第2至4号外显子的全部核苷酸序列和第5号外显子的部分核苷酸序列，优选还包含第1-2号内含子和/或第4-5号内含子，其中，第1号外显子的部分核苷酸序列至少包含从起始密码子至第1号外显子的最后一个核苷酸，第5号外显子的部分核苷酸序列至少包含从5号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
优选的，包含编码人IL-10蛋白的核苷酸序列。进一步优选的，包含编码SEQ IDNO:4所示氨基酸的核苷酸序列；
优选的，包含NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位的核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL-10基因还包括非人动物IL-10基因组片段。
优选的，所述的人IL-10基因组片段包括人IL-10基因的第1至5号外显子核苷酸序列的全部或部分。
进一步优选的，所述的第1至5号外显子核苷酸序列的部分包含至少30、至少60或至少90个核苷酸序列与人IL-10基因相同，且人源化IL-10基因编码的蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。
优选的，所述的人IL-10基因组片段包括人IL-10基因的第1号外显子核苷酸序列、第2号外显子核苷酸序列、第3号外显子核苷酸序列、第4号外显子核苷酸序列或第5号外显子核苷酸序列中的任一个或两个或三个以上的组合。优选的，所述的三个以上可以为三个、四个或五个。
进一步优选的，所述的人IL-10基因组片段包括人IL-10基因的第1号外显子核苷酸序列、第2号外显子核苷酸序列、第3号外显子核苷酸序列、第4号外显子核苷酸序列或第5号外显子核苷酸序列中的连续两个或连续三个以上的组合。优选的，所述的三个以上可以为三个、四个或五个。
进一步优选的，所述的人IL-10基因组片段包括人IL-10基因的第1号外显子的部分核苷酸序列、第2至4号外显子的全部核苷酸序列和第5号外显子的部分核苷酸序列。
优选的，所述的人源化IL-10基因的核苷酸序列包含SEQ ID NO：8、9和/或52所示的核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL-10基因的核苷酸序列选自下列组中的一种：
a)编码人IL-10蛋白的核苷酸序列；
b)NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列；
c)转录的mRNA序列如SEQ ID NO：7所示；
d)与SEQ ID NO：7或NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列的同源性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
e)在严格条件下，与SEQ ID NO：7或NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位所示的核苷酸序列杂交；
f)与SEQ ID NO：7或NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
g)具有SEQ ID NO：7或NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
其中，SEQ ID NO：7所示序列为IL-10基因人源化小鼠IL-10DNA的非模板链、编码链或有义链。
优选的，所述的人源化IL-10RA基因或人源化IL-10基因均还可以包括特异性诱导物或阻遏物。进一步优选的，所述的特异性诱导物或阻遏物可以为常规可以诱导或阻遏的物质。在本发明的一个具体实施方式中，所述的特异性诱导物选自四环素系统(Tet-OffSystem/Tet-On System)或他莫昔芬系统(Tamoxifen System)。
优选的，所述的人源化IL-10基因还可以包括全部人IL-10蛋白的编码序列或人IL-10基因的全部核苷酸序列。
进一步优选的，所述的人源化IL-10基因还包括辅助序列。
更进一步优选的，所述的辅助序列可以为终止密码子。最为优选的，所述的辅助序列为WPRE和/或polyA。
本发明的第四方面，提供了一种上述的人源化IL-10基因编码的人源化IL-10蛋白。
本发明的第五方面，提供了一种IL-10RA基因的靶向载体，所述的靶向载体包括人IL-10RA基因核苷酸序列的部分。优选的，包含人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分。进一步优选的，包含人IL-10RA基因的第1号外显子的部分核苷酸序列、第2至5号外显子的全部核苷酸序列和第6号外显子的部分核苷酸序列。更进一步优选的，包含NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列或编码SEQ ID NO：28第1-264位所示氨基酸的核苷酸序列。
所述的第1号外显子的部分核苷酸序列至少包含从起始密码子至第1号外显子的最后一个核苷酸序列。
所述的第1号外显子的部分核苷酸序列至少包含从第1号外显子编码的第一个氨基酸至最后一个氨基酸序列的核苷酸。
所述的第1号外显子的部分核苷酸序列至少包含第1号外显子3’-5’的60-70bp的核苷酸序列，具体为第2号外显子中从5’端第78个核苷酸(或3’端第1个核苷酸)开始至长度为60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70bp的核苷酸序列。
所述的第6号外显子的部分核苷酸序列至少包含从第6号外显子的第一个核苷酸序列至6号外显子编码的C端第1-10的氨基酸。
所述的第6号外显子的部分核苷酸序列至少包含从第6号外显子编码的第一个氨基酸序列至编码IL-10RA胞内区N端第1-10个氨基酸。
所述的第6号外显子的部分核苷酸序列至少包含第6号外显子5’-3’的100-110bp的核苷酸序列，具体为第6号外显子中从5’端第1个核苷酸(或3’端第18个核苷酸)开始至长度为100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110bp的核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂。
所述的5’臂选自IL-10RA基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂的核苷酸序列与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示。
所述的3’臂选自IL-10RA基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的3’臂的核苷酸序列与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述3’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体包括插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的插入或替换的供体DNA序列片段为人IL-10RA基因核苷酸序列的全部或部分。
优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自IL-10RA基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述靶向载体中5’臂核苷酸长度为5705bp。优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自IL-10RA基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。更进一步优选的，3’臂核苷酸长度为6647bp。更进一步优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列片段包括人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的部分至少包含编码人IL-10RA蛋白胞外区的核苷酸序列的全部或部分，所述的胞外区的核苷酸序列的部分为至少30、60或至少90个与人IL-10RA蛋白的胞外区的编码序列相同，且供体转换区可以结合靶向人特定抗原的抗体。
更进一步优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列片段包括人IL-10RA基因的第1号外显子核苷酸序列、第2号外显子核苷酸序列、第3号外显子核苷酸序列、第4号外显子核苷酸序列、第5号外显子核苷酸序列或第6号外显子核苷酸序列中的任一个或两个或三个以上的组合。优选的，所述的三个以上可以为三个、四个、五个或六个。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的插入或替换的供体DNA序列片段包括人IL-10RA基因的第1号外显子核苷酸序列、第2号外显子核苷酸序列、第3号外显子核苷酸序列、第4号外显子核苷酸序列、第5号外显子核苷酸序列或第6号外显子核苷酸序列中的连续两个或连续三个以上的组合。优选的，所述的三个以上可以为三个、四个、五个或六个。
最为优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列片段包括人IL-10RA基因的第1号外显子的部分核苷酸序列、第2至5号外显子的全部核苷酸序列和第6号外显子的部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的插入或替换的供体DNA序列片段包括NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的插入或替换的供体DNA序列编码SEQ IDNO：28第1-264位所示氨基酸序列的全部或部分。
优选的，所述的待改变的转换区位于IL-10RA基因的第1号外显子核苷酸序列至第6号外显子核苷酸序列上。
本发明的第六方面，提供了一种IL-10基因的靶向载体，所述的靶向载体包含人IL-10基因的部分。
优选的，包含人IL-10基因的第1至5号外显子核苷酸序列的全部或部分。进一步优选的，包含人IL-10基因的第1号外显子的部分核苷酸序列、第2至4号外显子的全部核苷酸序列和第5号外显子的部分核苷酸序列，优选还包含第1-2号内含子和/或第4-5号内含子，其中，第1号外显子的部分核苷酸序列至少包含从起始密码子至第1号外显子的最后一个核苷酸，第5号外显子的部分核苷酸序列至少包含从5号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
优选的，包含编码人IL-10蛋白的核苷酸序列。进一步优选的，包含编码SEQ IDNO:4所示氨基酸的核苷酸序列。
优选的，包含NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位的核苷酸序列。
优选的，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂。
所述的5’臂选自IL-10基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的5’臂的核苷酸序列与NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示。
所述的3’臂选自IL-10基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。优选的，所述的3’臂的核苷酸序列与NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸。进一步优选的，所述3’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的靶向载体包含插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区，所述的插入或替换的供体DNA序列片段为人IL-10基因核苷酸序列的全部或部分。
优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自IL-10基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。更进一步优选的，所述靶向载体中5’臂核苷酸长度为3903bp。
优选的，所述的靶向载体包含与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自IL-10基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸。更进一步优选的，3’臂的核苷酸长度为4527bp。
优选的，所述的IL-10基因的靶向载体或IL-10RA基因的靶向载体均还可以包括标记基因。进一步优选的，所述标记基因为负筛选标记的编码基因。所述负筛选标记的编码基因为白喉毒素A亚基的编码基因(DTA)。进一步优选的，所述靶向载体还包括阳性克隆筛选的抗性基因。所述阳性克隆筛选的抗性基因为新霉素磷酸转移酶编码序列Neo。进一步优选的，所述靶向载体还包括特异性重组系统。所述特异性重组系统为Frt重组位点(也可选择常规的LoxP重组系统)。所述的特异性重组系统为2个，分别装在抗性基因的两侧。
更进一步优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列片段包括人IL-10基因的第1至5号外显子核苷酸序列的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的第1至5号外显子核苷酸序列的部分包含至少30、60或至少90个核苷酸序列与人IL-10基因相同，且供体转换区可以结合靶向人特定抗原的抗体。
更进一步优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列片段包括人IL-10基因的第1号外显子核苷酸序列、第2号外显子核苷酸序列、第3号外显子核苷酸序列、第4号外显子核苷酸序列或第5号外显子核苷酸序列中的任一个或两个或三个以上的组合。优选的，所述的三个以上可以为三个、四个或五个。
再进一步优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列片段包括人IL-10基因的第1号外显子核苷酸序列、第2号外显子核苷酸序列、第3号外显子核苷酸序列、第4号外显子核苷酸序列或第5号外显子核苷酸序列中的连续两个或连续三个以上的组合。优选的，所述的三个以上可以为三个、四个或五个。
最为优选的，所述的插入或替换的供体DNA序列片段包括人IL-10基因的第1号外显子的部分核苷酸序列、第2至4号外显子的全部核苷酸序列和第5号外显子的部分核苷酸序列。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的插入或替换的供体DNA序列片段包括NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列的全部或部分。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的插入或替换的供体DNA序列编码SEQ IDNO：4所示氨基酸序列的全部或部分。
优选的，所述的待改变的转换区位于IL-10基因的第1号外显子核苷酸序列至第5号外显子核苷酸序列上。
本发明的第七方面，提供了一种包含上述的靶向载体的细胞。
本发明的第八方面，提供了一种上述靶向载体或者上述细胞在构建基因人源化中的应用。
本发明的第九方面，提供了一种包含IL-10RA基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物体内表达人或人源化IL-10RA蛋白。优选的，内源IL-10RA蛋白表达降低或缺失。
优选的，至少一个细胞表达人或人源化IL-10RA蛋白。
优选的，所述的人或人源化IL-10RA蛋白结合靶向人特定抗原的抗体。
优选的，所述的人源化IL-10RA蛋白包含胞外区的全部、信号肽的全部、跨膜区的全部和胞内区的部分，其中胞内区的部分至少包含胞内区N端1-10个氨基酸。进一步优选的，所述的人源化IL-10RA蛋白包含下列组中的一种：
A)SEQ ID NO：32所述氨基酸序列的部分或全部；
B)与SEQ ID NO：32所示氨基酸的序列同源性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
D)具有SEQ ID NO：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
所述的非人动物的基因组中包括人IL-10RA基因的全部或部分。
优选的，包含人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分。进一步优选的，所述的第1至6号外显子核苷酸序列的部分至少包含编码人IL-10RA蛋白胞外区的核苷酸序列的全部或部分，所述的胞外区的核苷酸序列的部分为至少30、60或至少90个与人IL-10RA蛋白的胞外区的编码序列相同，且非人动物体内表达的IL-10RA蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-10RA基因的第1号外显子核苷酸序列、第2号外显子核苷酸序列、第3号外显子核苷酸序列、第4号外显子核苷酸序列、第5号外显子核苷酸序列或第6号外显子核苷酸序列中的一个或两个或三个以上的组合。优选的，所述的三个以上可以为三个、四个、五个或六个。进一步优选的，所述的人源化非人动物的基因组中包括人IL-10RA基因的第1号外显子核苷酸序列、第2号外显子核苷酸序列、第3号外显子核苷酸序列、第4号外显子核苷酸序列、第5号外显子核苷酸序列或第6号外显子核苷酸序列中的连续两个或连续三个以上的组合。优选的，所述的三个以上可以为三个、四个、五个或六个。
进一步优选的，包含人IL-10RA基因的第1号外显子的部分核苷酸序列、第2至5号外显子的全部核苷酸序列和第6号外显子的部分核苷酸序列，优选还包含第1-2号内含子和/或第5-6号内含子。
所述的第1号外显子的部分核苷酸序列至少包含从起始密码子至第1号外显子的最后一个核苷酸序列。
所述的第1号外显子的部分核苷酸序列至少包含从第1号外显子编码的第一个氨基酸至最后一个氨基酸序列的核苷酸。
所述的第1号外显子的部分核苷酸序列至少包含第1号外显子3’-5’的60-70bp的核苷酸序列，具体为第2号外显子中从5’端第78个核苷酸(或3’端第1个核苷酸)开始至长度为60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70bp的核苷酸序列。
所述的第6号外显子的部分核苷酸序列至少包含从第6号外显子编码的第一个氨基酸序列至编码IL-10RA胞内区N端第1-10个氨基酸。
所述的第6号外显子的部分核苷酸序列至少包含第6号外显子5’-3’的100-110bp的核苷酸序列，具体为第6号外显子中从5’端第1个核苷酸(或3’端第18个核苷酸)开始至长度为100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110bp的核苷酸序列。
所述的第6号外显子的部分核苷酸序列至少包含从第6号外显子的第一个核苷酸序列至6号外显子编码的C端第1-10的氨基酸。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的非人动物的基因组中包含NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列。
优选的，包含编码人IL-10RA蛋白的核苷酸序列。进一步优选的，包含编码SEQ IDNO:28第1-264位氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含SEQ ID NO:33、34和/或53所示的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人源化IL-10RA基因。
在本发明的一个具体实施方式中，所述的人源化IL-10RA基因包含下列组中的一种：
(a)NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列；
(b)转录的mRNA序列为SEQ ID NO：31所示；
(c)与SEQ ID NO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列的同源性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
(d)与SEQ ID NO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
(e)具有SEQ ID NO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人IL-10RA基因或人源化IL-10RA通过内源性调控元件调控。所述的内源性调控元件包括启动子，所述的人IL-10RA基因与启动子可操作性的连接在非人动物IL-10RA基因座。
优选的，所述的非人动物的基因组中还包括人IL-10基因的全部或部分。
优选的，所述的非人动物体内可表达人或人源化IL-10蛋白，同时内源IL-10蛋白表达降低或缺失。
优选的，包含人IL-10基因的第1至5号外显子核苷酸序列的全部或部分。进一步优选的，包含人IL-10基因的第1号外显子的部分核苷酸序列、第2至4号外显子的全部核苷酸序列和第5号外显子的部分核苷酸序列，优选还包含第1-2号内含子和/或第4-5号内含子，其中，第1号外显子的部分核苷酸序列至少包含从起始密码子至第1号外显子的最后一个核苷酸，第5号外显子的部分核苷酸序列至少包含从5号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
优选的，包含编码人IL-10蛋白的核苷酸序列。进一步优选的，包含编码SEQ IDNO:4所示氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中的IL-10RA基因为纯合或杂合的。
优选的，使用基因编辑技术进行包含IL-10RA基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
优选的，使用靶向载体将人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分插入或替换至非人动物IL-10RA基因座。
优选的，将包含人IL-10RA基因的第1号外显子的部分核苷酸序列、第2至5号外显子的全部核苷酸序列和第6号外显子的部分核苷酸序列，优选还包含第1-2号内含子和/或5-6号内含子，插入或替换至非人动物IL-10RA基因座。其中，所述的第1号外显子的部分核苷酸序列至少包含从起始密码子至第1号外显子的最后一个核苷酸序列，所述的第6号外显子的部分核苷酸序列至少包含从第6号外显子的第一个核苷酸序列至6号外显子编码的C端第1-10的氨基酸。
优选的，将包含编码人IL-10RA蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物IL-10RA基因座。进一步优选的，将包含编码SEQ ID NO:28第1-264位氨基酸的核苷酸序列插入或替换至非人动物IL-10RA基因座。更进一步优选的，将包含NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列插入或替换至非人动物IL-10RA基因座。
优选的，所述的靶向载体包含人IL-10RA基因核苷酸序列的部分。进一步优选的，包含人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分。更进一步优选的，包含人IL-10RA基因的第1号外显子的部分核苷酸序列、第2至5号外显子的全部核苷酸序列和第6号外显子的部分核苷酸序列，优选还包含第1-2号内含子和/或第5-6号内含子，其中，所述的第1号外显子的部分核苷酸序列至少包含从起始密码子至第1号外显子的最后一个核苷酸序列，所述的第6号外显子的部分核苷酸序列至少包含从第6号外显子的第一个核苷酸序列至6号外显子编码的C端第1-10的氨基酸。再进一步优选的，包含NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列或编码SEQ ID NO：28第1-264位所示氨基酸的核苷酸序列。优选的，可在非人动物IL-10RA基因座上插入含有人IL-10RA的基因核苷酸序列或者人IL-10RA蛋白的编码序列，并可在插入序列后加入辅助序列(例如终止密码子等)或其他方法(例如，翻转或敲除后续序列)使得插入位点后的非人动物内源IL-10RA基因组序列不能正常表达。
进一步优选的，所述的辅助序列为WPRE和/或polyA。
在本发明的一个具体实施方式中，所述构建方法，包括如下制备步骤：
1)将靶向载体注射至非人动物的细胞，所述的细胞为受精卵细胞或者胚胎干细胞；
2)将步骤1)所述的细胞在培养液中进行培养；
3)将培养后的细胞移植至受体雌性非人哺乳动物的输卵管内，允许所述的细胞在所述雌性非人哺乳动物的子宫中发育；其中，所述非人哺乳动物为假孕雌性；
4)鉴定步骤3)的怀孕雌性的后代基因修饰的非人哺乳动物中的种系传递。
优选的，所述受精卵来源于任何非人哺乳动物；进一步优选的，所述受精卵细胞来源于啮齿类动物；更进一步优选的，所述受精卵选自C57BL/6受精卵、FVB/N受精卵、129受精卵、BALB/c受精卵、DBA/1受精卵或DBA/2受精卵。
优选的，所述的胚胎干细胞来源于任何非人哺乳动物。进一步优选的，所述的胚胎干细胞来源于啮齿类动物。更进一步优选的，所述胚胎干细胞选自C57BL/6胚胎干细胞、FVB/N胚胎干细胞、129胚胎干细胞、BALB/c胚胎干细胞、DBA/1胚胎干细胞或DBA/2胚胎干细胞。
本发明的第十方面，提供了一种包含IL-10基因人源化的非人动物的构建方法，所述的非人动物表达人或人源化IL-10蛋白。优选的，内源IL-10蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的人或人源化IL-10蛋白结合靶向人特定抗原的抗体。
优选的，至少一个细胞表达人或人源化IL-10蛋白。
优选的，所述的人源化IL-10蛋白包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
所述的非人动物的基因组中包括人IL-10基因的全部或部分。
优选的，包含人IL-10基因的第1至5号外显子核苷酸序列的全部或部分。进一步优选的，所述的第1至5号外显子核苷酸序列的部分包含至少30、60或至少90个核苷酸序列与人IL-10基因相同，且非人动物体内表达的IL-10蛋白可以结合靶向人特定抗原的抗体。优选的，所述的非人动物的基因组中包括人IL-10基因的第1号外显子核苷酸序列、第2号外显子核苷酸序列、第3号外显子核苷酸序列、第4号外显子核苷酸序列或第5号外显子核苷酸序列中的一个或两个或三个以上的组合。优选的，所述的三个以上可以为三个、四个或五个。进一步优选的，所述的非人动物的基因组中包括人IL-10基因的第1号外显子核苷酸序列、第2号外显子核苷酸序列、第3号外显子核苷酸序列、第4号外显子核苷酸序列或第5号外显子核苷酸序列中的连续两个或连续三个以上的组合。优选的，所述的三个以上可以为三个、四个或五个。
进一步优选的，包含人IL-10基因的第1号外显子的部分核苷酸序列、第2至4号外显子的全部核苷酸序列和第5号外显子的部分核苷酸序列，优选还包含第1-2号内含子和/或第4-5号内含子，其中，第1号外显子的部分核苷酸序列至少包含从起始密码子至第1号外显子的最后一个核苷酸，第5号外显子的部分核苷酸序列至少包含从5号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
优选的，包含编码人IL-10蛋白的核苷酸序列。进一步优选的，包含编码SEQ IDNO:4所示氨基酸的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含SEQ ID NO：8、9和/或52所示的核苷酸序列。
优选的，所述的非人动物的基因组中包含人源化IL-10基因，优选的，所述的人源化IL-10基因包含下列组中的一种：
a)NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列；
b)转录的mRNA序列如SEQ ID NO：7所示；
c)与SEQ ID NO：7或NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列的同源性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
d)与SEQ ID NO：7或NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
e)具有SEQ ID NO：7或NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
优选的，所述的人IL-10基因或人源化IL-10基因通过内源性调控元件调控。所述的内源性调控元件包括启动子，所述的人IL-10基因与启动子可操作性的连接在非人动物IL-10基因座。
优选的，所述的非人动物的基因组中还包括人IL-10RA基因的全部或部分。
优选的，所述的非人动物的基因组中还包括人源化IL-10RA基因。
优选的，所述的非人动物体内可表达人或人源化IL-10RA蛋白，同时内源IL-10RA蛋白表达降低或缺失。
优选的，所述的人源化非人动物的基因组中的IL-10基因为纯合或杂合的。
优选的，使用基因编辑技术进行包含IL-10基因人源化的非人动物的构建，所述的基因编辑技术包括利用胚胎干细胞的基因打靶技术、CRISPR/Cas9技术、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。
优选的，使用靶向载体将人IL-10基因的第1至5号外显子核苷酸序列的全部或部分插入或替换至非人动物IL-10基因座。
优选的，将包含人IL-10基因的第1号外显子的部分核苷酸序列、第2至4号外显子的全部核苷酸序列和第5号外显子的部分核苷酸序列，优选还包含第1-2号内含子和/或第4-5号内含子插入或替换至非人动物IL-10基因座，其中，第1号外显子的部分核苷酸序列至少包含从起始密码子至第1号外显子的最后一个核苷酸，第5号外显子的部分核苷酸序列至少包含从5号外显子的第一个核苷酸至终止密码子。
优选的，将包含编码人IL-10蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物IL-10基因座。进一步优选的，将包含编码SEQ ID NO:4所示氨基酸的核苷酸序列或NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位的核苷酸序列插入或替换至非人动物IL-10基因座。
优选的，可在非人动物IL-10基因座上插入含有人IL-10的基因核苷酸序列或者人IL-10蛋白的编码序列，并可在插入序列后加入辅助序列(例如终止密码子等)或其他方法(例如，翻转或敲除后续序列)使得插入位点后的非人动物内源IL-10基因组序列不能正常表达。
进一步优选的，所述的辅助序列为WPRE和/或polyA。
在本发明的一个具体实施方式中，所述构建方法，包括如下制备步骤：
1)将靶向载体注射至非人动物的细胞，所述的细胞为受精卵细胞或者胚胎干细胞；
2)将步骤1)所述的细胞在培养液中进行培养；
3)将培养后的细胞移植至受体雌性非人哺乳动物的输卵管内，允许所述的细胞在所述雌性非人哺乳动物的子宫中发育；其中，所述非人哺乳动物为假孕雌性；
4)鉴定步骤3)的怀孕雌性的后代基因修饰的非人哺乳动物中的种系传递。
优选的，所述受精卵来源于任何非人哺乳动物；进一步优选的，所述受精卵细胞来源于啮齿类动物；更进一步优选的，所述受精卵选自C57BL/6受精卵、FVB/N受精卵、129受精卵、BALB/c受精卵、DBA/1受精卵或DBA/2受精卵。
优选的，所述的胚胎干细胞来源于任何非人哺乳动物。进一步优选的，所述的胚胎干细胞来源于啮齿类动物。更进一步优选的，所述胚胎干细胞选自C57BL/6胚胎干细胞、FVB/N胚胎干细胞、129胚胎干细胞、BALB/c胚胎干细胞、DBA/1胚胎干细胞或DBA/2胚胎干细胞。
本发明的第十一方面，提供了一种包含IL-10基因人源化的细胞株，所述的细胞株的基因组中包括人IL-10基因的全部或部分，所述的细胞株内可表达人或人源化IL-10蛋白，同时内源IL-10蛋白表达降低或缺失。
本发明的第十二方面，提供了一种包含IL-10RA基因人源化的细胞株，所述的细胞株的基因组中包括人IL-10RA基因的全部或部分，所述的细胞株内可表达人或人源化IL-10RA蛋白，同时内源IL-10RA蛋白表达降低或缺失。
本发明的第十三方面，提供了一种包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的细胞株，所述的细胞株中包括人IL-10基因和人IL-10RA基因，所述的细胞株内可表达人或人源化IL-10RA蛋白、以及人或人源化IL-10蛋白，同时内源IL-10RA和IL-10蛋白表达降低或缺失。
本发明所述的包含IL-10基因人源化的细胞株、包含IL-10RA基因人源化的细胞株或者包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的细胞株均不是动物品种，所述的细胞株不会发育为个体。
本发明的第十四方面，提供了一种包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物的构建方法，所述的构建方法包括将上述的构建方法构建的IL-10RA基因人源化的非人动物或者上述的IL-10RA基因人源化的非人动物，与上述的构建方法构建的IL-10基因人源化非人动物或者上述的IL-10基因人源化的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物。
本发明的第十五方面，提供了一种多基因人源化的非人动物的构建方法，包括如下步骤：
(a)提供上述的构建方法构建的非人动物、上述的非人动物、上述的制备方法制备的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物或者上述的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物；
(b)将步骤(a)提供的非人动物与其他基因人源化的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化的非人动物。
优选的，所述多基因人源化的非人动物为双基因人源化的非人动物、三基因人源化的非人动物、四基因人源化的非人动物、五基因人源化的非人动物、六基因人源化的非人动物、七基因人源化的非人动物、八基因人源化的非人动物或九基因人源化的非人动物。
优选的，所述的其他基因人源化的非人动物选自基因PD-1、PD-L1、CD47、SIRPa、CD40、LAG-3、4-1BB、CD28、TIM3、GITR、IL3、TIGIT、CTLA4人源化的非人动物中的一种或两种以上的组合。
本发明的第十六方面，提供了一种上述的构建方法制备的非人动物或其子代。
本发明的第十七方面，提供了一种荷瘤或免疫系统疾病的动物模型，所述动物模型的制备方法包括通过上述的构建方法构建的非人动物、上述的非人动物、上述的制备方法制备包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的方法制备多基因人源化的非人动物或者上述的多基因人源化的非人动物或其子代的步骤。
本发明的第十八方面，提供了一种荷瘤或免疫系统疾病的动物模型的制备方法，所述动物模型的制备方法包括通过上述的构建方法构建的非人动物、上述的非人动物、上述的制备方法制备包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的方法制备多基因人源化的非人动物或者上述的多基因人源化的非人动物或其子代的步骤。优选的，所述的荷瘤动物模型的制备方法还包括在上述方法制备的非人动物或其后代植入肿瘤细胞的步骤。
本发明的第十九方面，提供了一种上述的构建方法构建的非人动物、上述的非人动物、上述的制备方法制备包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的方法制备多基因人源化的非人动物或者上述的多基因人源化的非人动物或其子代在制备荷瘤或免疫系统疾病的动物模型中的应用。
本发明所述的免疫系统疾病包括但不限于炎症、自身免疫疾病或者过敏。优选的，所述的免疫系统疾病包括但不限于系统性红斑狼疮、哮喘、皮炎、气道炎症、炎症性肠病、多发性硬化、关节炎、I型糖尿病。
进一步优选的，所述免疫系统疾病的动物模型为实验性自身免疫性脑脊髓膜炎模型。
本发明的第二十方面，提供了一种细胞或细胞系或原代细胞培养物，所述细胞或细胞系或原代细胞培养物来源于上述的构建方法构建的非人动物、上述的非人动物、上述的制备方法制备的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物或其子代、上述的多基因人源化的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或免疫系统疾病的动物模型。
本发明的第二十一方面，提供了一种组织或器官或其培养物，所述组织或器官或其培养物来源于上述的构建方法构建的非人动物、上述的非人动物、上述的制备方法制备的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物、上述的多基因人源化的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或免疫系统疾病的动物模型。优选的，所述组织或器官为脾脏、肿瘤或其培养物。
本发明的第二十二方面，提供了一种荷瘤后的瘤组织，所述的瘤组织来源于上述的构建方法构建的非人动物、上述的非人动物、上述的制备方法制备的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物、上述的多基因人源化的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或免疫系统疾病的动物模型。
本发明的第二十三方面，提供了一种表达上述的人源化IL-10RA蛋白的构建体。
本发明的第二十四方面，提供了一种包含上述构建体的细胞。
本发明的第二十五方面，提供了一种包含上述细胞的组织。
本发明的第二十六方面，提供了来源于上述的构建方法构建的非人动物、上述的非人动物、上述的制备方法制备的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物、上述的多基因人源化的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或免疫系统疾病的动物模型在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；或在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究和/或用于开发新的诊断策略和/或治疗策略中的应用；或在筛选、验证、评价或研究IL-10RA和/或IL-10基因功能、IL-10RA和/或IL-10抗体、针对IL-10RA和/或IL-10靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗免疫系统疾病的药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的用途。
本发明的第二十七方面，提供了一种药物筛选或评价的方法，所述的方法包括给予个体候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较，其中，所述的个体选自上述的构建方法构建的非人动物、上述的非人动物、上述的制备方法制备的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物、上述的多基因人源化的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或免疫系统疾病的动物模型。
优选的，所述的方法包括向个体体内移植肿瘤细胞，向移入肿瘤细胞的个体给予候选药物。
优选的，所述候选药物为单抗或双特异性抗体或两种及两种以上药物的联合使用。
优选的，所述检测包括测定肿瘤细胞的大小和/或增殖速率；优选的，所述检测的方法包括游标卡尺测量、流式细胞检测和/或动物活体成像检测。
优选的，所述的检测包括评估个体体重、脂肪量、活化途径、神经保护活性或代谢变化，所述的代谢变化包括食物消耗或水消耗的变化。
优选的，所述药物筛选或评价的方法不是治疗方法。该方法用来筛选药物，对候选药物的药效进行检测和比较，以确定哪些候选药物可以作为药物，哪些不能作为药物，或者，比较不同药物的药效敏感程度，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明的第二十八方面，提供了一种处理方案的评价方法，所述的评价方法包括向个体植入肿瘤细胞，向植入肿瘤细胞的个体施加处理方案，对施加处理方案后的个体进行肿瘤抑制效果检测和评价，其中，所述的个体选自上述的构建方法构建的非人动物、上述的非人动物、上述的制备方法制备的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物、上述的方法制备的多基因人源化的非人动物、上述的多基因人源化的非人动物或其子代或者上述的荷瘤或免疫系统疾病的动物模型。
优选的，所述处理方案是CAR-T。
优选的，所述的评价方法不是治疗方法。该方法对处理方案的效果进行检测和评价，以确定该处理方案是否有治疗效果，即治疗效果不是必然的，只是一种可能性。
本发明所述的非人动物为非人哺乳动物，进一步优选的，所述的非人哺乳动物可以为啮齿类动物、猪、兔子、猴子等任何可以进行基因编辑人源化非人动物的非人哺乳动物，更进一步优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。
在本发明的一个具体实施方式中，所述非人动物为小鼠，所述小鼠IL-10RA的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：25中的全部或部分片段所示，所述小鼠IL-10RA的蛋白的氨基酸序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：26中的全部或部分片段所示。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述人IL-10RA的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：27中的全部或部分片段所示，所述人IL-10RA的蛋白的氨基酸序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：28中的全部或部分片段所示。
在本发明的一个具体实施方式中，所述非人动物为小鼠，所述小鼠IL-10RA的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：25中的全部或部分片段所示，所述小鼠IL-10RA的蛋白的氨基酸序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：26中的全部或部分片段所示。
在本发明的另一个具体实施方式中，所述人IL-10RA的mRNA序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：27中的全部或部分片段所示，所述人IL-10RA的蛋白的氨基酸序列的全部或部分片段如SEQ ID NO：28中的全部或部分片段所示。
本发明所述“全部或部分”，“全部”为整体；“部分”为整体中的局部，或者整体中的个体。例如“第1至6号外显子编码的蛋白的全部或部分”，“第1至6号外显子编码的蛋白的全部”为整体，即第1至6号外显子编码的全部蛋白；“第1至6号外显子编码的蛋白的部分”为整体的局部或整体的个体，即第1至6号外显子编码的蛋白中的一个或两个以上连续或间隔的氨基酸序列。
本发明所述的“包含”或“包括”是开放式的描述，含有所描述的指定成分或步骤，以及不会实质上影响的其他指定成分或步骤。然而在用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本发明所述的“核苷酸序列”包含天然的或经过修饰的核糖核苷酸序列、脱氧核糖核苷酸序列。优选为DNA、cDNA、pre-mRNA、mRNA、rRNA、hnRNA、miRNAs、scRNA、snRNA、siRNA、sgRNA、tRNA。
本发明所述的“基因座”广义上讲代表基因在染色体上所占的位置，狭义上讲代表某一基因上的一段DNA片段，即可以是一个基因也可以是一个基因的一部分。例如所述的“IL-10RA基因座”表示IL-10RA基因1号至7号外显子上的任选一段的DNA片段。在本发明的一个具体实施方式中，被插入或替换的IL-10RA基因座可以是IL-10RA基因1号至6号外显子上的任选一段的DNA片段。优选为1号至6号外显子上的任选一段的DNA序列。
本发明所述的“外显子”又称表达序列，表示真核生物基因的一部分，其在剪接后仍会被保存下来，并可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质，所述的外显子包括UTR区。本发明所述的“第x至xx号外显子”或者“x号至xx号外显子”或“x号至xx号外显子的全部”包含外显子及其期间的内含子的核苷酸序列，例如所述的“第1至6号外显子”包含第1号外显子、第1-2号内含子、第2号外显子、第2-3号内含子、第3号外显子、第3-4号内含子、第4号外显子、第4-5号内含子、第5号外显子、第5-6号内含子和第6号外显子的全部核苷酸序列。
本发明所述的“第x-xx号内含子”表示第x号外显子与第xx号外显子之间的内含子。例如“第4-5号内含子”表示第4号外显子与第5号外显子之间的内含子。
本发明所述的“人源化xx蛋白”即为“嵌合xx蛋白”，所述的“人源化xx基因”即为嵌合xx基因。
本发明所述“治疗(treating)”(或“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”)表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。术语“治疗(treating)”等是指在疾病已开始发展后改善疾病或病理状态的体征、症状等等的治疗干预。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白的氨基酸序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有(包括但不限于)1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，11％，12％，13％，14％，15％，16％，17％，18％，19％，20％，21％，22％，23％，24％，25％，26％，27％，28％，29％，30％，31％，32％，33％，34％，35％，36％，37％，38％，39％，40％，41％，42％，43％，44％，45％，46％，47％，48％，49％，50％，51％，52％，53％，54％，55％，56％，57％，58％，59％，60％，70％，80％，81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，99.1％，99.2％，99.3％，99.4％，99.5％，99.6％，99.7％，99.8％，99.9％的同一性。
本领域的技术人员能够确定并比较序列元件或同一性程度，以区分另外的小鼠和人序列。
在一个方面，所述非人动物是哺乳动物。在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠总科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠总科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺睡鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠总科)、沙鼠、刺毛鼠和冠毛大鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠来自鼠科家族成员。在一个实施方式中，所述动物是啮齿动物。在一个特定实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠和大鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个特定实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其为选自BALB/c、A、A/He、A/J、A/WySN、AKR、AKR/A、AKR/J、AKR/N、TA1、TA2、RF、SWR、C3H、C57BR、SJL、C57L、DBA/2、KM、NIH、ICR、CFW、FACA、C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola的C57BL、C58、CBA/Br、CBA/Ca、CBA/J、CBA/st、CBA/H品系的小鼠。
本发明的技术效果：
1、本发明提供一种制备IL-10和/或IL-10RA基因人源化的方法，成功获得包含IL-10和/或IL-10RA基因人源化小鼠。
2、本发明构建的人源化小鼠可作为标准的模型动物，不仅可以用于靶向人IL-10和/或人IL-10RA基因的药物开发，以及药物药效的评估，还可用于人IL-10/IL-10RA信号通路与其它药物联用的开发、以及联用药物的药效的评估，对临床前药效评价有着深远的指导意义。
除非特别说明，本发明的实践将采取细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术。这些技术在以下文献中进行了详细的解释。例如：Molecular Cloning:A Laboratory Manual，2ndEd.，ed.By Sambrook，FritschandManiatis(Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989)；DNA Cloning，Volumes I and II(D.N.Glovered.，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gaited.，1984)；Mullisetal.U.S.Pat.No.4，683，195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Transcription And Translation(B.D.Hames&S.J.Higginseds.1984)；Culture Of Animal Cells(R.I.Freshney，AlanR.Liss，Inc.，1987)；Immobilized Cells And Enzymes(IRL Press，1986)；B.Perbal，A PracticalGuide To Molecular Cloning(1984)；the series，Methods In Enzymology(J.Abelsonand M.Simon，eds.-in-chief，Academic Press，Inc.，New York)，specifically，Vols.154and 155(Wuetal.eds.)and Vol.185，″Gene Expression Technology″(D.Goeddel，ed.)；Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells(J.H.Miller andM.P.Caloseds.，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Immunochemical Methods InCell And Molecular Biology(Mayer and Walker，eds.，Academic Press，London，1987)；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes V(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.，1986)；and Manipulating the Mouse Embryo，(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1986)。
以上只是概括了本发明的一些方面，不是也不应该认为是在任何方面限制本发明。
本说明书提到的所有专利和出版物都是通过参考文献作为整体而引入本发明的。本领域的技术人员应认识到，对本发明可作某些改变并不偏离本发明的构思或范围。下面的实施例进一步详细说明本发明，不能认为是限制本发明或本发明所说明的具体方法的范围。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：鼠IL-10基因和人IL-10基因对比示意图(非按比例)。
图2：人源化小鼠IL-10基因示意图(非按比例)。
图3：IL-10基因人源化小鼠打靶策略示意图(非按比例)。
图4：IL-10基因人源化小鼠细胞的Southern blot检测结果，其中，WT为野生型对照。
图5：FRT重组过程示意图(非按比例)。
图6：IL-10基因人源化F1代小鼠鼠尾PCR鉴定体细胞基因型，其中，WT为野生型，H2O为水对照，PC为阳性对照，M为Marker。
图7：ELISA检测鼠和人IL-10蛋白表达的结果，其中+/+代表野生型C57BL/6小鼠，H/H代表IL-10基因人源化纯合子小鼠。
图8：鼠IL-10RA基因和人IL-10RA基因对比示意图(非按比例)。
图9：人源化IL-10RA小鼠基因示意图(非按比例)。
图10：IL-10RA基因人源化小鼠打靶策略示意图(非按比例)。
图11：IL-10RA基因人源化小鼠细胞的Southern blot检测结果，其中，WT为野生型对照。
图12：PCR鉴定F1代小鼠细胞的基因型，其中，WT为野生型对照，PC为阳性对照，H2O为水对照。
图13：对比C57BL/6野生型鼠与IL-10基因人源化纯合子小鼠(H/H)脾脏中免疫细胞情况，其中，免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞、CD4+T细胞(CD4)、CD8+T细胞(CD8)、粒细胞(Granulocyte)、DC细胞、巨噬细胞(Macrophage)、单核细胞(Monocyte)。
图14：对比C57BL/6野生型鼠与IL-10基因人源化纯合子小鼠(H/H)外周血中免疫细胞情况，其中，免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞、CD4+T细胞(CD4)、CD8+T细胞(CD8)、粒细胞(Granulocyte)、DC细胞、巨噬细胞(Macrophage)、单核细胞(Monocyte)。
图15：对比C57BL/6野生型鼠与IL-10基因人源化纯合子小鼠(H/H)脾脏中T细胞亚群情况，其中，T细胞亚群包括：CD4+T细胞(CD4)、CD8+T细胞(CD8)、Treg细胞。
图16：对比C57BL/6野生型鼠与IL-10基因人源化纯合子小鼠(H/H)外周血中T细胞亚群情况，其中，T细胞亚群包括：CD4+T细胞(CD4)、CD8+T细胞(CD8)、Treg细胞。
图17：C57BL/6野生型鼠(+/+)与IL-10基因人源化纯合子小鼠(H/H)RT-PCR检测结果，其中，H2O为水对照。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
C57BL/6小鼠和Flp工具鼠均购自中国食品药品检定研究院国家啮齿类实验动物种子中心；
Cas9mRNA来源SIGMA，货号CAS9MRNA-1EA；
UCA试剂盒来源北京百奥赛图基因生物技术有限公司，货号为BCG-DX-001；
MEGAshortscriptTMKit(Ambion体外转录试剂盒)购自Thermo Fisher，货号为AM1354；
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4(LPS)购自Merck，货号为L2630；
SacI、PstI、SpeI、HindIII、XbaI、ScaI、BamHI、SspI酶购自NEB，货号分别为R3156M、R3140M、R3133M、R3104M、R3122M、R3122M、R3136L、R3132L；
ELISA MAXTM Deluxe Set Mouse IL-10(MouseIL-10ELISA Kit)购自Biolegend，货号为431414；
ELISA MAXTM Deluxe Set Human IL-10(HumanIL-10 ELISA Kit)购自Biolegend，货号为430604。
实施例1 IL-10基因人源化小鼠
小鼠IL-10基因(NCBI Gene ID：16153，Primary source：MGI：96537，UniProt ID：P18893，位于1号染色体NC_000067.6的第131019845至131024974位，基于转录本NM_010548.2(SEQ ID NO：1)及其编码蛋白NP_034678.1(SEQ ID NO：2))和人IL-10基因(NCBIGene ID：3586，Primary source：HGNC:5962，UniProt ID：P22301，位于1号染色体NC_000001.11的第206767602至206772494位，基于转录本NM_000572.3(SEQ ID NO：3)及其编码蛋白NP_000563.1(SEQ ID NO：4))对比示意图如图1所示。
为了达到本发明的目的，可在小鼠内源IL-10基因座引入人IL-10的基因序列，使得该小鼠表达人或人源化IL-10蛋白。可以采取在小鼠内源IL-10基因座上直接插入含有人IL-10基因的核苷酸序列或人IL-10蛋白的编码序列的方法，并可在插入序列后加入辅助序列(例如终止密码子等)或其他方法(例如，翻转或敲除序列)使得插入位点后的小鼠内源IL-10蛋白不能正常表达；也可以采取原位替换的策略，即，在小鼠内源IL-10基因座上直接用人IL-10的基因的核苷酸序列进行替换。本实施例将以原位替换的策略来阐述如何对IL-10基因进行人源化改造。
具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源IL-10基因座上用人IL-10基因的核苷酸序列替换小鼠IL-10基因的核苷酸序列，如将小鼠IL-10基因的第1号外显子部分序列至第5号外显子上4357bp序列用对应的人DNA序列替换，得到人源化IL-10基因序列(示意图如图2所示)，实现对小鼠IL-10基因的人源化改造，从而使得该小鼠可转录一种嵌合的IL-10mRNA，且表达人IL-10蛋白。
如图3所示的打靶策略示意图中，显示了靶向载体上含有小鼠IL-10基因的上游和下游的同源臂序列(包含内源IL-10基因5’UTR及其上游的3903bp和3’UTR下游的共4527bp的小鼠DNA)，以及包含人IL-10基因序列的IL-10-A片段。其中，上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：5)与NCBI登录号为NC_000067.6的第131016009-131019911位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：6)与NCBI登录号为NC_000067.6的第131025304-131029830位核苷酸序列相同；靶向载体IL-10-A片段上包含人IL-10基因的第1号外显子部分序列至第5号外显子部分序列的人IL-10DNA片段，该人IL-10DNA片段与NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列相同。其中，人IL-10DNA片段片段上游与5’同源臂直接连接，下游与小鼠基因座的连接设计为
Figure BDA0002773457540000221
Figure BDA0002773457540000222
(SEQ ID NO：52)，其中，其中序列“CTGA”中的A是人的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0002773457540000223
的第一个“A”是小鼠序列的第一个核苷酸。
改造后的人源化小鼠IL-10的mRNA序列如SEQ ID NO：7所示，表达的蛋白的氨基酸序列与SEQ ID NO：4所示的人IL-10蛋白相同。靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒5’端与小鼠基因座的连接设计为
Figure BDA0002773457540000231
Figure BDA0002773457540000232
(SEQ ID NO：8)，其中序列“TGGG”的最后一个“G”是鼠的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0002773457540000233
的第一个“C”是Neo盒的第一个核苷酸。Neo盒3’端与小鼠基因座的接合设计为
Figure BDA0002773457540000234
Figure BDA0002773457540000235
(SEQ ID NO：9)，其中序列“ATCC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0002773457540000236
的“G”是鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。
靶向载体的构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞，经PCR鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot(分别用StuI或BamHI或HindIII消化细胞DNA并使用3个探针进行杂交)检测，结果见如图4所示，检测结果表明6个经PCR验证为阳性的克隆中，1-D3和1-F5为阳性杂合克隆且无随机插入。
其中，PCR测定包括下述引物：
IL-10-F1：5’-TGCCCAGGTCACTAAAGCAGGTTA-3’(SEQ ID NO：10)，
IL-10-R1：5’-GAGCGCCAGCAGGATCTTATAAGTT-3’(SEQ ID NO：11)；
IL-10-F2：5’-CGCATTGTCTGAGTAGGTGTC-3’(SEQ ID NO：12)，
IL-10-R2：5’-GTCTCCAGAGTCACCACATGTGTTG-3’(SEQ ID NO：13)；
Southern Blot检测包括如下探针引物：
IL-10-5’探针(IL-10-5’Probe)：
F：5’-CAAAACGGTTATCTCTGAGTAGCCCGA-3’(SEQ ID NO：14)，
R：5’-GGTGGCTTCTCTGTATCCAACCCC-3’(SEQ ID NO：15)；
IL-10-3’探针(IL-10-3’Probe)：
F：5’-GGGCAGGAGTTCCAGCCTGAATAG-3’(SEQ ID NO：16)，
R：5’-AGCTTCTGGAAATTTAAGCCCACCCAT-3’(SEQ ID NO：17)；
IL-10-Neo探针(IL-10-Neo Probe)：
F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGATGG-3’(SEQ ID NO：18)，
R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCG-3’(SEQ ID NO：19)。
将筛选出的正确阳性克隆按照本领域已知的技术将阳性克隆细胞(黑色鼠)导入已分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因(该过程示意图见图5)后，再通过互相交配即可得到IL-10基因人源化纯合子小鼠。可通过PCR鉴定子代小鼠体细胞的基因型，示例性的F1代小鼠(已去除Neo标记基因)的鉴定结果见图6，其中，编号为F1-1、F1-2、F1-3、F1-4、F1-5的小鼠为阳性杂合小鼠。
PCR测定包括下述引物：
IL-10-WT-F：5’-GGTTTAGAAGAGGGAGGAGGAGCC-3’(SEQ ID NO：20)
IL-10-WT-R：5’-TGCAGTTCCATCAGAATGCATATTTCAG-3’(SEQ ID NO：21)
IL-10-WT-F：(SEQ ID NO：20)
IL-10-Mut-R：5’-AGATCTCGAAGCATGTTAGGCAGG-3’(SEQ ID NO：22)
IL-10-Frt-F：5’-GCTGAAACTCTGAGACGAAATGTT-3’(SEQ ID NO：23)
IL-10-Frt-R：5’-CTTGAAGCAACCACTGACACATTAG-3’(SEQ ID NO：24)
这表明使用本方法能构建出可稳定传代且无随机插入的IL-10人源化基因工程小鼠。可通过常规检测方法确认阳性小鼠体内人IL-10mRNA或蛋白的表达情况，如RT-PCR、ELISA等。使用RT-PCR方法检测阳性小鼠体内人IL-10mRNA情况，结果如图17所示，在野生型C57BL/6小鼠体内仅检测到鼠IL-10mRNA(图17A、17D)，在IL-10人源化纯合子小鼠体内仅能检测到人IL-10mRNA(图17B、17E)。
RT-PCR引物序列包括：
hF3：5’-AGGGCACCCAGTCTGAGAACAG-3’(SEQ ID NO：54)
hR3：5’-GCGCCTTGATGTCTGGGTCTTGG-3’(SEQ ID NO：55)
hF4：5’-CAGCTGGACAACTTGTTGTTAAAGGAG-3’(SEQ ID NO：56)
hR4：5’-ACTCATGGCTTTGTAGATGCCTTTC-3’(SEQ ID NO：57)
mF3：5’-TGACTGGCATGAGGATCAGCAGG-3’(SEQ ID NO：58)
mR3：5’-CTCCTTGATTTCTGGGCCATGC-3’(SEQ ID NO：59)
mF4：5’-GCTGGACAACATACTGCTAACCGAC-3’(SEQ ID NO：60)
mR4：5’-ATTCATGGCCTTGTAGACACCTTGG-3’(SEQ ID NO：61)
GAPDH-F：5’-TCACCATCTTCCAGGAGCGAGA-3’(SEQ ID NO：62)
GAPDH-R：5’-GAAGGCCATGCCAGTGAGCTT-3’(SEQ ID NO：63)
使用ELISA方法检测阳性小鼠体内人IL-10蛋白表达情况。具体来说，选择6-7周龄野生型小鼠和IL-10人源化基因工程纯合子小鼠各3只，先给每只小鼠腹腔注射20μg细菌脂多糖(LPS)，1h后取血清，稀释20倍后使用ELISA试剂盒(MouseIL-10ELISA Kit和HumanIL-10ELISA Kit)检测鼠IL-10和人IL-10蛋白水平，鉴定结果见图7。图7A结果显示，只能在野生型C57BL/6小鼠体内检测到鼠IL-10蛋白的表达，图7B表明只能在IL-10人源化小鼠体内检测到人IL-10蛋白的表达。进一步的，还检测了该小鼠脾脏、外周血等的免疫细胞和T细胞亚群情况，与野生型相比未发现明显差异(图13-16)，表明该小鼠的B细胞、T细胞、NK细胞、CD4+T细胞(CD4)、CD8+T细胞(CD8)、粒细胞(Granulocyte)、DC细胞、巨噬细胞(Macrophage)、单核细胞(Monocyte)的分化未受到影响。
实施例2 IL-10RA基因人源化小鼠
小鼠IL-10RA基因(NCBI Gene ID：16154，Primary source：MGI：96538，UniProtID：Q61727，位于9号染色体NC_000075.6的第45253837至45269149位，基于转录本NM_008348.3(SEQ ID NO：25)及其编码蛋白NP_032374.1(SEQ ID NO：26))和人IL-10RA基因(NCBI Gene ID：3587，Primary source：HGNC:5964，UniProt ID：Q13651，位于11号染色体NC_000011.10的第117986391至118001483位，基于转录本NM_001558.3(SEQ ID NO：27)及其编码蛋白NP_001549.2(SEQ ID NO：28))对比示意图如图8所示。
为了达到本发明的目的，可在内源小鼠IL-10RA基因座引入人IL-10RA的基因序列，使得该小鼠表达人源化IL-10RA蛋白。可以采取在小鼠内源IL-10RA基因座上直接插入含有人IL-10RA基因的核苷酸序列或者人IL-10RA蛋白的编码序列的方法，并可在插入序列后加入辅助序列(例如终止密码子等)或其他方法(例如，翻转或敲除序列)使得插入位点后的小鼠内源IL-10RA基因组序列不能正常表达；也可以采取原位替换的策略，即，在小鼠内源IL-10RA基因座上直接用人IL-10RA的基因序列进行替换。本实施例将以原位替换的策略来阐述如何对IL-10RA基因进行人源化改造。
具体来说，可以通过基因编辑技术在小鼠内源IL-10RA基因座上用人IL-10RA基因序列替换小鼠IL-10RA基因序列，如将至少包含小鼠IL-10RA基因的第1号外显子至第6号外显子的约8702bp序列用对应的人DNA序列替换，得到人源化IL-10RA基因序列(示意图如图9所示)，实现对小鼠IL-10RA基因的人源化改造，从而使得该小鼠可转录一种嵌合的IL-10RAmRNA，且表达人源化IL-10RA蛋白。
如图10所示的打靶策略示意图中，显示了靶向载体上含有小鼠IL-10RA基因的上游和下游的同源臂序列(内源IL-10RA基因第1号外显子部分序列及其上游5705bp和第6号外显子部分序列及其下游共6647bp的小鼠DNA)，以及包含编码人IL-10RA序列的IL-10RA-A片段。其中，上述上游同源臂序列(5’同源臂，SEQ ID NO：29)与NCBI登录号为NC_000075.6的第45274777-45269073位核苷酸序列相同，下游同源臂序列(3’同源臂，SEQ ID NO：30)与NCBI登录号为NC_000075.6的第45260102-45253456位核苷酸序列相同；IL-10RA-A片段含有人IL-10RA DNA片段，所述的人IL-10RA DNA片段含有人IL-10RA的第1号外显子部分序列至第6号外显子部分序列的基因组DNA，与NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列相同。人IL-10RA DNA片段的下游与小鼠基因座的连接设计为
Figure BDA0002773457540000251
Figure BDA0002773457540000252
(SEQ ID NO：53)，其中序列“AAAG”中的G是人的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0002773457540000253
的第一个“A”是小鼠序列的第一个核苷酸。
改造后的人源化小鼠IL-10RA的mRNA序列如SEQ ID NO：31所示，表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：32所示。靶向载体上还包括用于阳性克隆筛选的抗性基因，即新霉素磷酸转移酶编码序列Neo，并在抗性基因的两侧装上两个同向排列的位点特异性重组系统Frt重组位点，组成Neo盒(Neo cassette)。其中Neo盒位于小鼠IL-10RA的第6号外显子和第7号外显子之间，其5’端与小鼠IL-10RA序列的连接设计为
Figure BDA0002773457540000254
Figure BDA0002773457540000255
Figure BDA0002773457540000256
(SEQ ID NO：33)内，其中序列“TGGC”的“C”是鼠的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0002773457540000257
的第一个“C”是Neo盒的第一个核苷酸。Neo盒3’端与鼠IL-10RA序列的接合设计为
Figure BDA0002773457540000261
Figure BDA0002773457540000262
(SEQ ID NO：34)内，其中序列“ATCC”的最后一个“C”是Neo盒的最后一个核苷酸，序列
Figure BDA0002773457540000263
的“C”是小鼠的第一个核苷酸。此外，还在靶向载体3’同源臂下游构建了具有负筛选标记的编码基因(白喉毒素A亚基的编码基因(DTA))。
靶向载体构建可采用常规方法进行，如酶切连接等。构建好的靶向载体通过酶切进行初步验证后，再送测序公司进行测序验证。将测序验证正确的靶向载体电穿孔转染入C57BL/6小鼠的胚胎干细胞中，利用阳性克隆筛选标记基因对得到的细胞进行筛选，并利用PCR和Southern Blot技术进行检测确认外源基因的整合情况，筛选出正确的阳性克隆细胞。
经PCR扩增鉴定为阳性的克隆再进行Southern Blot检测，其中Southern Blot检测分别使用BamHI、SspI、SpeI对阳性克隆细胞及阴性克隆细胞目标区域进行酶切，并使用探针(IL-10RA-5’Probe、IL-10RA-3’Probe、IL-10RA-Neo Probe，见表1)进行杂交，结果如图11所示，检测结果表明三个克隆目的条带大小正确，无杂性克隆且无随机插入，全部为含有目标条带正确重组的阳性克隆。
表1 具体探针及目的片段的长度
限制性内切酶 探针 野生型片段大小 重组序列片段大小
BamHI IL-10RA-3’Probe 17.1kb 14.4kb
SspI IL-10RA-5’Probe 17.1kb 12.2kb
SpeI IL-10RA-Neo Probe -- 10.1kb
WT：野生型，Targetd：成功重组序列
其中，PCR测定包括下述引物：
IL-10RA-F1：5’-GGTCATTCTCCCGTAGGCCATGTTC-3’(SEQ ID NO：35)，
IL-10RA-R1：5’-CCTTACCATGAGCGTCTGAGCCAAG-3’(SEQ ID NO：36)；
IL-10RA-F2：5’-GCTCGACTAGAGCTTGCGGA-3’(SEQ ID NO：37)，
IL-10RA-R2：5’-GGTCTTTCCCCAACAGCCTTTCAGA-3’(SEQ ID NO：38)。
Southern Blot检测包括如下探针引物：
IL-10RA-5’探针(IL-10RA-5’Probe)：
F：5’-AACCCACAACAGGGAACTGCAGAAG-3’(SEQ ID NO：39)，
R：5’-GTTGCTGGGTTTCTAGACCAGAGCC-3’(SEQ ID NO：40)；
IL-10RA-3’探针(IL-10RA-3’Probe)：
F：5’-TGGCCTGCTAGAAATGCTTGTGAGA-3’(SEQ ID NO：41)，
R：5’-GATCCCCAGCTTCCAAGATACTGGC-3’(SEQ ID NO：42)；
IL-10RA-Neo探针(IL-10RA-Neo Probe)：
F：5’-GGATCGGCCATTGAACAAGAT-3’(SEQ ID NO：43)，
R：5’-CAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC-3’(SEQ ID NO：44)。
将上述筛选出的阳性克隆根据本领域技术人员已知的任意方法将阳性克隆细胞(黑色小鼠)导入分离好的囊胚中(白色鼠)，得到的嵌合囊胚转移至培养液中短暂培养后移植至受体母鼠(白色鼠)的输卵管，可生产F0代嵌合体鼠(黑白相间)。将F0代嵌合鼠与野生型鼠回交获得F1代鼠，再将F1代杂合小鼠互相交配即可获得F2代纯合子鼠。还可将阳性鼠与Flp工具鼠交配去除阳性克隆筛选标记基因后(如图10所示)，再通过互相交配即可得到IL-10RA基因人源化F2纯合子小鼠。通过PCR鉴定F1代小鼠细胞的基因型，引物如表2所示。结果如图12所示，编号为IL-10RA1-F1-1、IL-10RA1-F1-2、IL-10RA1-F1-3、IL-10RA1-F1-4、IL-10RA1-F1-5的5只小鼠检测结果与预期相符，均为阳性小鼠(其中编号为PC为阳性质粒)。这表明本方法可以构建出稳定传代且无随机插入的IL-10RA基因人源化工程小鼠。
表2 引物名称及具体序列
Figure BDA0002773457540000271
其中WT：野生型，Mut：目标结果
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 北京百奥赛图基因生物技术有限公司
<120> 人源化IL-10和IL-10RA基因改造动物的构建方法和应用
<130> 1
<160> 63
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1306
<212> DNA/RNA
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 1
acatttagag acttgctctt gcactaccaa agccacaagg cagccttgca gaaaagagag 60
ctccatcatg cctggctcag cactgctatg ctgcctgctc ttactgactg gcatgaggat 120
cagcaggggc cagtacagcc gggaagacaa taactgcacc cacttcccag tcggccagag 180
ccacatgctc ctagagctgc ggactgcctt cagccaggtg aagactttct ttcaaacaaa 240
ggaccagctg gacaacatac tgctaaccga ctccttaatg caggacttta agggttactt 300
gggttgccaa gccttatcgg aaatgatcca gttttacctg gtagaagtga tgccccaggc 360
agagaagcat ggcccagaaa tcaaggagca tttgaattcc ctgggtgaga agctgaagac 420
cctcaggatg cggctgaggc gctgtcatcg atttctcccc tgtgaaaata agagcaaggc 480
agtggagcag gtgaagagtg attttaataa gctccaagac caaggtgtct acaaggccat 540
gaatgaattt gacatcttca tcaactgcat agaagcatac atgatgatca aaatgaaaag 600
ctaaaacacc tgcagtgtgt attgagtctg ctggactcca ggacctagac agagctctct 660
aaatctgatc cagggatctt agctaacgga aacaactcct tggaaaacct cgtttgtacc 720
tctctccgaa atatttatta cctctgatac ctcagttccc attctattta ttcactgagc 780
ttctctgtga actatttaga aagaagccca atattataat tttacagtat ttattatttt 840
taacctgtgt ttaagctgtt tccattgggg acactttata gtatttaaag ggagattata 900
ttatatgatg ggaggggttc ttccttggga agcaattgaa gcttctattc taaggctggc 960
cacacttgag agctgcaggg ccctttgcta tggtgtcctt tcaattgctc tcatccctga 1020
gttcagagct cctaagagag ttgtgaagaa actcatgggt cttgggaaga gaaaccaggg 1080
agatcctttg atgatcattc ctgcagcagc tcagagggtt cccctactgt catcccccag 1140
ccgcttcatc cctgaaaact gtggccagtt tgttatttat aaccacctaa aattagttct 1200
aatagaactc atttttaact agaagtaatg caattcctct gggaatggtg tattgtttgt 1260
ctgcctttgt agcagactct aattttgaat aaatggatct tattcg 1306
<210> 2
<211> 178
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 2
Met Pro Gly Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Leu Leu Leu Thr Gly Met
1 5 10 15
Arg Ile Ser Arg Gly Gln Tyr Ser Arg Glu Asp Asn Asn Cys Thr His
20 25 30
Phe Pro Val Gly Gln Ser His Met Leu Leu Glu Leu Arg Thr Ala Phe
35 40 45
Ser Gln Val Lys Thr Phe Phe Gln Thr Lys Asp Gln Leu Asp Asn Ile
50 55 60
Leu Leu Thr Asp Ser Leu Met Gln Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys
65 70 75 80
Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Val Glu Val Met Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Lys His Gly Pro Glu Ile Lys Glu His Leu Asn Ser Leu
100 105 110
Gly Glu Lys Leu Lys Thr Leu Arg Met Arg Leu Arg Arg Cys His Arg
115 120 125
Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Ser
130 135 140
Asp Phe Asn Lys Leu Gln Asp Gln Gly Val Tyr Lys Ala Met Asn Glu
145 150 155 160
Phe Asp Ile Phe Ile Asn Cys Ile Glu Ala Tyr Met Met Ile Lys Met
165 170 175
Lys Ser
<210> 3
<211> 1630
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 3
acacatcagg ggcttgctct tgcaaaacca aaccacaaga cagacttgca aaagaaggca 60
tgcacagctc agcactgctc tgttgcctgg tcctcctgac tggggtgagg gccagcccag 120
gccagggcac ccagtctgag aacagctgca cccacttccc aggcaacctg cctaacatgc 180
ttcgagatct ccgagatgcc ttcagcagag tgaagacttt ctttcaaatg aaggatcagc 240
tggacaactt gttgttaaag gagtccttgc tggaggactt taagggttac ctgggttgcc 300
aagccttgtc tgagatgatc cagttttacc tggaggaggt gatgccccaa gctgagaacc 360
aagacccaga catcaaggcg catgtgaact ccctggggga gaacctgaag accctcaggc 420
tgaggctacg gcgctgtcat cgatttcttc cctgtgaaaa caagagcaag gccgtggagc 480
aggtgaagaa tgcctttaat aagctccaag agaaaggcat ctacaaagcc atgagtgagt 540
ttgacatctt catcaactac atagaagcct acatgacaat gaagatacga aactgagaca 600
tcagggtggc gactctatag actctaggac ataaattaga ggtctccaaa atcggatctg 660
gggctctggg atagctgacc cagccccttg agaaacctta ttgtacctct cttatagaat 720
atttattacc tctgatacct caacccccat ttctatttat ttactgagct tctctgtgaa 780
cgatttagaa agaagcccaa tattataatt tttttcaata tttattattt tcacctgttt 840
ttaagctgtt tccatagggt gacacactat ggtatttgag tgttttaaga taaattataa 900
gttacataag ggaggaaaaa aaatgttctt tggggagcca acagaagctt ccattccaag 960
cctgaccacg ctttctagct gttgagctgt tttccctgac ctccctctaa tttatcttgt 1020
ctctgggctt ggggcttcct aactgctaca aatactctta ggaagagaaa ccagggagcc 1080
cctttgatga ttaattcacc ttccagtgtc tcggagggat tcccctaacc tcattcccca 1140
accacttcat tcttgaaagc tgtggccagc ttgttattta taacaaccta aatttggttc 1200
taggccgggc gcggtggctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggct gaggcgggtg 1260
gatcacttga ggtcaggagt tcctaaccag cctggtcaac atggtgaaac cccgtctcta 1320
ctaaaaatac aaaaattagc cgggcatggt ggcgcgcacc tgtaatccca gctacttggg 1380
aggctgaggc aagagaattg cttgaaccca ggagatggaa gttgcagtga gctgatatca 1440
tgcccctgta ctccagcctg ggtgacagag caagactctg tctcaaaaaa taaaaataaa 1500
aataaatttg gttctaatag aactcagttt taactagaat ttattcaatt cctctgggaa 1560
tgttacattg tttgtctgtc ttcatagcag attttaattt tgaataaata aatgtatctt 1620
attcacatca 1630
<210> 4
<211> 178
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 4
Met His Ser Ser Ala Leu Leu Cys Cys Leu Val Leu Leu Thr Gly Val
1 5 10 15
Arg Ala Ser Pro Gly Gln Gly Thr Gln Ser Glu Asn Ser Cys Thr His
20 25 30
Phe Pro Gly Asn Leu Pro Asn Met Leu Arg Asp Leu Arg Asp Ala Phe
35 40 45
Ser Arg Val Lys Thr Phe Phe Gln Met Lys Asp Gln Leu Asp Asn Leu
50 55 60
Leu Leu Lys Glu Ser Leu Leu Glu Asp Phe Lys Gly Tyr Leu Gly Cys
65 70 75 80
Gln Ala Leu Ser Glu Met Ile Gln Phe Tyr Leu Glu Glu Val Met Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Asn Gln Asp Pro Asp Ile Lys Ala His Val Asn Ser Leu
100 105 110
Gly Glu Asn Leu Lys Thr Leu Arg Leu Arg Leu Arg Arg Cys His Arg
115 120 125
Phe Leu Pro Cys Glu Asn Lys Ser Lys Ala Val Glu Gln Val Lys Asn
130 135 140
Ala Phe Asn Lys Leu Gln Glu Lys Gly Ile Tyr Lys Ala Met Ser Glu
145 150 155 160
Phe Asp Ile Phe Ile Asn Tyr Ile Glu Ala Tyr Met Thr Met Lys Ile
165 170 175
Arg Asn
<210> 5
<211> 3903
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tggagttgta tggagttgtg gttgggacct ggaaacgaaa ctctagtccg cagaaggagc 60
acaacactct tcaggggtga gccatctctt cagtctccca aaataactac taacaacccc 120
accttctcta tccataccac actcttgccg tgatgactct attgccagac aatctggctg 180
atccctttgc ctttccctgg cagctccggt gtgccactca gagctcccag actgtcccct 240
agaatggcag aaagtcatgg agcaagtaca tcaagaaaga tgtcattttg ttgggcgtga 300
gtagattcct cataagatct tgtacactgt ctataaaact ctaaaattta ctcatatgca 360
cagaagcaca cacacacaca gagagagaca cagacatatg tagacacaca tacttttcta 420
cccagagtct tctgcagcta aaatggtgaa gtttaccaag cattagggtg tcctattcca 480
acgtgccact caacttggac atcttgcaat gaagattgga gaagaagaga gagataatgt 540
agggcttgat aacgtgtgag tgcaataaca gccatggact gctgacccct caagctgggt 600
gtgaagttca cctgtggtcc taggtactcc agaggctaag acaggaagag agtaagttca 660
aggttatcct cagctacagg gggaacttct tccgaatgaa ctaacaacaa atactgcctt 720
ttttgtgtgt gtgtgtgatt tgacagtata tatttatttt ttttccattt ttattaggta 780
tttagctcat ttacatttcc aatgctatac caaaagtccc ccatacccac ccacccccac 840
tcccctaccc acccactccc cctttttggc cctggcgttc ccctgtactg gggcatataa 900
agtttgcatg tccaatgggc ctctctttcc agtgatggcc gactaggcca tcttttgata 960
catatgcagc tagagtcaaa tactgctttt taaagccatg cttaataaaa cttcctttca 1020
ttggcagctg actagaaata ggaaatattt tgaaacgtga gtaatagagg agacattgcc 1080
ctccagatcc ccctccccct gcccacgacc tccatctgat acatacctcc ctgatcctag 1140
ggaaaatgta tttaaacacg acttctggac tgactcaggc catttgtccc caaggaatgc 1200
acagactgat gtgtaacagt catgtcctct tgaatccgca gctccgacag cacccaggct 1260
gttgcccatc ttttccccag acatacgctc tcacttccct gtcatgggca cttcccttgt 1320
cctgaaaccc agctcaaatc tcctgccatg agactcttga catttatgtc aagatatagc 1380
tgtggctttg gggcttttcc cagtgtgcgc caaacacttc tcacagactt gagctctctg 1440
catggtcctt acttggctaa atatggactt gtatcaagga cctcacataa ggttcttgag 1500
ggccatttag agtctgaaat gttgaggaga gagtgagcaa caacttgaag ccaatggggg 1560
aaagaaaagg gcaactagct gacaaatggc tgaggataac tggctatgcg tttcagaaca 1620
aataaaaaat tcagatcata atcataaacc cacttagttg aatatatatt aacaagaaat 1680
ataaatagtt ttcacatatc tctcttcttt ctgtcattgt gggagtgtgg agtatataca 1740
tttataacat taatacagta atacatgaca tagtatattc atgaaactaa ttatatttat 1800
attagtatat gctcagacac tattaaaata ttaatataaa tatgatgtat cattatattg 1860
atataaatta tgtgctataa ttaagtacat gctaatatat taatgtttta tgttaacata 1920
ttatgaaata gttttatgta catgtgtaaa aggatattct agacaaaaaa aaataattac 1980
gggaagatat aagaggtgct gcttctcctg ctgagttctg tgctcacccc tctgcttctc 2040
ctggtgtttc atctcctacc tctggatcaa gctcatagaa ctgtccagtg ccagtcccaa 2100
ggacagctgg taccttctat aggccagatt cagttctggg gggggggggg tcagacacac 2160
aaagctaaac acaatatgtt cagggacctt gtagctgctc agaaataaaa aaaaaaacat 2220
gcaggaaggc agcaaagggg attgtggcta tcaccgtgca gtaagtacag gtcacagtca 2280
ggagagaggg cagtgagggt ccatgctagc tgggtcttga gcctcttctg gggttcagat 2340
ctctgatcta cagcagtgtg tccacaccta aaacatcagc tcagagaggc agttgcttct 2400
gctgttggaa acggacatcc caaaaaaaaa caaaaaacag aaatcaaaag ggaaggagaa 2460
agtgaaaggg atggaggcag cttgtcccct tccctgtgct tgctgctggt agaaaactca 2520
gcctggaact gaccggagca gcagttcttg agtcaattcc attccaactt ctagaagatt 2580
cttttcccgt cgaagagtgt caggaggaga ggccagaccc ccttgatcct gatctgccag 2640
ccactgcatc agataagacg agataacccc gagttcctgt tctaccagcc ctggtgtggt 2700
aaccctctcc aatggggcag gcttggaacc ctgtgccaac gaagatcctc ccccgtactg 2760
atgcaggaag gacagcccgg gagtgtaccc tctacatggg tctactttta tttaagcaaa 2820
cattccctgg tcaacaggac gtgtagcatt gccccccccc cttgggtcac acagaaaaca 2880
ggtaccagga ggacaagtag ttgcttgccc agggtacaga atgaaaggca ataggggact 2940
ctaggcgaat gttcttccca cccaaactga ggtagtagga gaagtcccta ctgaagggaa 3000
ggtccagaca taatcaaagg actaccagag atctcccagg tatctgtaga agtactaaca 3060
tctccatcct tcaacagcta caggttacac gtctccaagg ctgggacatt gtaaaacagg 3120
gccatggtaa ggtctacccg acagcacaga gcaagcctcc cagaagtctg agttccttct 3180
cctaacttct catgctggga tctgagcttc ttcgtgaaac acggggcaga ggaggcacca 3240
gaactctcct ctgaccaact gccccacagc acacatatcc tcaaaggata gtcttgaata 3300
cgtgatggaa gaattaaaga gagtgaggtc tgaagaaaat cagccctctc ggggtttcct 3360
ttgggtaact gagtgctaag gtgacttccg agtcagcaag aaatatcgga cgttcaaccc 3420
aggttgagtg gaggaaacaa ttatttctca atcctaatat gttctggaat agcccattta 3480
tccacgtcat tatgacctgg gagtgcgtga atggaatcca cagatgaggg cctctgtaca 3540
tagaacagct gtctgcctca ggaaatacaa cttttagtat tgagaagcta aaaagaaaaa 3600
aaaattaaaa gagaggtagc ccatactaaa aatagctgta atgcagaagt tcattccgac 3660
cagttcttta gcgcttacaa tgcaaaaaaa agggaaagga aaaaaaaaaa gaaagaaatt 3720
aaactcaaaa attgcatggt ttagaagagg gaggaggagc ctgaataaca aaaacctttg 3780
ccaggaaggc cccactgagc cttcagtata aaagggggac caagaacagg aggtctacat 3840
ttagagactt gctcttgcac taccaaagcc acaaggcagc cttgcagaaa agagagctcc 3900
atc 3903
<210> 6
<211> 4527
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttaaaaatg gaagctaggg gcaggagggt ggggagatgg ctcagcagtt agagtgtgtg 60
ccggcaccag tgagacagga gttcatatcc ttggaatcca accaacacac aaccaacact 120
aggcaagaga tgcctaatgt gtcagtggtt gcttcaagct ccagaggtcc tggggtgaac 180
ttagatctgt cttgggggcg ctctctgggg attaacacaa attcatcact agtttctaga 240
actgggaaat cgtctggata ctactggcaa tcacaattaa aaactcctgc caagcctgcc 300
aaaccctttc acatgctaag caaacatctg ctgctcaact aggtctccag cctcttgaca 360
ctttgagata aggcctcaag gcagttcagt atggccttga actcagctct tcctgcctcc 420
gctgcccaag tactgggact cttcttcaaa ctgaggtcac aggcagcaga gttgagccat 480
tagggttgga tagaggtaaa caaacctact cagctcccaa aggatgcaac cactcttcct 540
gccccctccc tgagccacca gatagatatt agactgactt ctgcctgggg tagggggagt 600
ggctggggaa gccctactaa atgtctcgtg actttgagga taaggggaaa taatgagctg 660
agtaacccta acaccacata cacacacaca cacacacaca cacacacaca cacacacacg 720
tgctggccag gcagcccggg acagggtggg tgggagctga caagctgtgg tcattttttc 780
agtaagacct gactcacttc agttaaagta accatcggaa ggaagtggga agcaccaaag 840
ctgaaactgt gagatgaaag gttagggtta agaatggaag ctgggggggg gggggggggg 900
cgggggcaga gagtgggatg gctcagtagt ttgagtgctt gcgggcacca gtgagacagg 960
agttcatatc cttgaaatcc aagcaaatgc tagtgtgcat ggtggcctga gaaggcacag 1020
acaggggatt ccaagagcaa agtggctatc tattaagttc caaaccctgg ctaagcagct 1080
gaggtgtcta tttaacatat caaagcagaa ccggcctcca ggttctccca gcatccctca 1140
gtccctacct gttaaggttt atggctggca taccctgccc tctatcctga actctctagc 1200
ccagaggttc ttccttatat aattcagaca ttttggttaa ctgcccttgg ccattttgga 1260
gagctctgga ttcgagtcta cctcagtgag aagatggaag aggaattgag ggtgattccg 1320
cacgtcaatg tcaggcttgc atgtggacat gtgtaaccac ccatgtatgc acccatacac 1380
atacaaagag tgcatgcaca catccatgat gaagaaatga agaagaacaa gaagaaaaag 1440
aacaagaaga ggaggaagaa ggaggaggag gcgccggctg gtgactaagc tctcagcctg 1500
atccagagaa gctctaagcc ctgatctaga aaaatcccaa cagctcgggc tcagtggcag 1560
ccagcacatg ataactagtc agaaatggtc tctcactcaa gagactgggc attggaaatg 1620
atagaagcag gtctagaaag gccgcataac tgatctcaac agtagctaca atttgactgg 1680
aacatcttct gggtgtgtca gcaccacact tattgctcta tgaagcacac tatattgctt 1740
ttaggcttgc tatttcctgt agattcagaa gtgtgagctt tttcactatt cagtttgctg 1800
cactatacag ttcagtaatt caacattctg caaattgtgt cagaaattca atttttaaat 1860
tactttatta attctcaacc atgtgttgat cataaattaa tcttcaaaaa tacctaggct 1920
ctctgtttgc tggttaaact ctgtgtgtat ctatctctgg acttttatac ctaatattta 1980
cattaataat aatgtgaaca ctaattaaag ccatttgctg actactttac tatgcactac 2040
atatatacta acttatgatc atgtaacatt atgaggcact attaaattga tatttcaaaa 2100
ttttttgaga cagagtttta ctgtatatcc ctaactagct tgtaactcac tatgaagact 2160
aggtggcctt gaactcacaa agagccacct gcctctgcct cccaaatgct gggattaaag 2220
gtgtgtgcca tcacatctag ccaacatctc aatttcttac acatgaagat gagattcagt 2280
taaaacatct accttaggtc aaccaactac taatggcaga gttcatgatc ttaatgatta 2340
tatcaaaccc ttatatatca ttttcaaacc taaattactg aaaatttctc tttttcctgt 2400
attgttctgc ctccttaaga gttacagata tttttccagc tggtagtgtg cacctataat 2460
gctaggattg aaaagctgaa acacagaaat taagaatatg aagactgcct gggctacact 2520
gccagaccct gcctcagaaa caatcataaa atactataca ctcactccca tatgctcaag 2580
aggctgaaga aggaaggtca ctgaatccag gagttcgagg ccagcctctg aaccctgtaa 2640
caaaaataat aatatacact ttagtattat gtgtctccat tcctatttgt ctcaaaatat 2700
ttttatttct cttctaatta ctctttgact atctggttct tcaagagcag gagaactgtt 2760
cacatgccta atatagctca tcacacagct ctttgaagat gtctgcatga gtgtccacag 2820
cacaggatat atacagcttg ccatgagtca ctgatctggg agagaagtaa gaggaaggta 2880
ggtacagcat gatttctggc ctattccagg aactctcaca accactggtc ctaccacatt 2940
ctacctgtta gaaggggtaa agtacagacc acgtacaagt gaggagcagt tgggcttcac 3000
cttttgaagg aagaaatcaa aagaatctgt gtacctgttt gtcttagtta aggctttact 3060
gctgtgaaca gacaccatga ccaaggcaac tcttataaag gacagcattt aattgaggct 3120
ggcttacagg ttcagaggtt cagtccatta tcatcaaggc aggaacatgg cagcatccag 3180
gcagccatgg tacaagagga gtagagagtt ctacatcttc atctgaaggc tgctagcaga 3240
gtactgactt ccaggcatcg aggatgaggg tcttaaagcc cacacccaca atgacacacc 3300
tactccaaca aggccacacc tcctaatagt accactccct gggtcaagca tatacaaacc 3360
atgacactat tttaacattt ctctgccctt taagctctgt gttcttggca agtggatgga 3420
aggaagagct ggctgagaac agtccgaaag gctgggccat caacacagac attgtcattt 3480
acgtccccct cttgtagact tagcctccat ttctcctttg gaaatttgaa aaatcttggc 3540
ctgcatgcta ggtattgaat gtttgtgtcc cacttctccc aaccccaacc aaattcatac 3600
tgactcccaa agcaatgaca tttgaagata gggtctttgg gagatgacca aggttagatg 3660
ggacaacaag aatagaacct tcatggtgga cttagcacta ggagagaccc tgaagagttt 3720
gttctatttc cctatcatct tttaggaata ctcaaagaaa agattttaca agcactcaat 3780
gagataggac ctccattgaa gcaagagcag aggtctcagg atgcaaactg ccttgctggc 3840
accttgaatg tctcagcctc cagagctgta agaagataag ttcctgcagg gcaagctaag 3900
ctgcctgcag tgtcttctga ctacaggtca agctctcacg gacacatgaa gtctggcatg 3960
aaggcatcac gtgtgtgaaa atatggaggt gttttgaaga ggtgtgttac aattgaggtt 4020
tgagtgaggg tttggaaaga gagttaagac tttccgctct aagaccagct atctcatctc 4080
cccagttgta ccaggtctag ggtgacagga gatagtgaga atttgcattc atctgtggtc 4140
ctggctacta agatgtggag ggtgagcagc agtgagagaa cttcctggaa tctagataac 4200
aaagtgattg ctttacatag atcttggcag aaattaggta aaaatgaaaa gcaaacagcc 4260
ccccctccca ttctaggagg aaggtgccag tgccagatga gaaggaggac ataggcaggc 4320
actggctcga tggcagaagc cgtccattct gcaccatgtt tctccttcaa acatactttt 4380
gcatttaatt gtggtaatat ttagggaacg tataaatgaa aactgagtca tgaaaacata 4440
aaactagatt ttaaaatgag aggaagatcc ttgccttccc tctgtgagcc acagaacctc 4500
ctcaggaatg aaccagttga ctccact 4527
<210> 7
<211> 1306
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
acatttagag acttgctctt gcactaccaa agccacaagg cagccttgca gaaaagagag 60
ctccatcatg cacagctcag cactgctctg ttgcctggtc ctcctgactg gggtgagggc 120
cagcccaggc cagggcaccc agtctgagaa cagctgcacc cacttcccag gcaacctgcc 180
taacatgctt cgagatctcc gagatgcctt cagcagagtg aagactttct ttcaaatgaa 240
ggatcagctg gacaacttgt tgttaaagga gtccttgctg gaggacttta agggttacct 300
gggttgccaa gccttgtctg agatgatcca gttttacctg gaggaggtga tgccccaagc 360
tgagaaccaa gacccagaca tcaaggcgca tgtgaactcc ctgggggaga acctgaagac 420
cctcaggctg aggctacggc gctgtcatcg atttcttccc tgtgaaaaca agagcaaggc 480
cgtggagcag gtgaagaatg cctttaataa gctccaagag aaaggcatct acaaagccat 540
gagtgagttt gacatcttca tcaactacat agaagcctac atgacaatga agatacgaaa 600
ctgaaacacc tgcagtgtgt attgagtctg ctggactcca ggacctagac agagctctct 660
aaatctgatc cagggatctt agctaacgga aacaactcct tggaaaacct cgtttgtacc 720
tctctccgaa atatttatta cctctgatac ctcagttccc attctattta ttcactgagc 780
ttctctgtga actatttaga aagaagccca atattataat tttacagtat ttattatttt 840
taacctgtgt ttaagctgtt tccattgggg acactttata gtatttaaag ggagattata 900
ttatatgatg ggaggggttc ttccttggga agcaattgaa gcttctattc taaggctggc 960
cacacttgag agctgcaggg ccctttgcta tggtgtcctt tcaattgctc tcatccctga 1020
gttcagagct cctaagagag ttgtgaagaa actcatgggt cttgggaaga gaaaccaggg 1080
agatcctttg atgatcattc ctgcagcagc tcagagggtt cccctactgt catcccccag 1140
ccgcttcatc cctgaaaact gtggccagtt tgttatttat aaccacctaa aattagttct 1200
aatagaactc atttttaact agaagtaatg caattcctct gggaatggtg tattgtttgt 1260
ctgcctttgt agcagactct aattttgaat aaatggatct tattcg 1306
<210> 8
<211> 75
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aactctgaga cgaaatgttg ggctcgaggt cgacggtatc gataagcttg atatcgaatt 60
ccgaagttcc tattc 75
<210> 9
<211> 77
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tattctctag aaagtatagg aacttcatca gtcaggtaca taatggtgga tccgttaaaa 60
atggaagcta ggggcag 77
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tgcccaggtc actaaagcag gtta 24
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gagcgccagc aggatcttat aagtt 25
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cgcattgtct gagtaggtgt c 21
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gtctccagag tcaccacatg tgttg 25
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caaaacggtt atctctgagt agcccga 27
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggtggcttct ctgtatccaa cccc 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gggcaggagt tccagcctga atag 24
<210> 17
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agcttctgga aatttaagcc cacccat 27
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggatcggcca ttgaacaaga tgg 23
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cagaagaact cgtcaagaag gcg 23
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggtttagaag agggaggagg agcc 24
<210> 21
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
tgcagttcca tcagaatgca tatttcag 28
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agatctcgaa gcatgttagg cagg 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gctgaaactc tgagacgaaa tgtt 24
<210> 24
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cttgaagcaa ccactgacac attag 25
<210> 25
<211> 3509
<212> DNA/RNA
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 25
agtcttcagt tctcaggacg ccgccggccg gaggcgtaaa ggccggctcc agtggacgat 60
gccgctgtgc gcccaggatg ttgtcgcgtt tgctcccatt cctcgtcacg atctccagcc 120
tgagcctaga attcattgca tacgggacag aactgccaag cccttcctat gtgtggtttg 180
aagccagatt tttccagcac atcctccact ggaaacctat cccaaaccag tctgagagca 240
cctactatga agtggccctc aaacagtacg gaaactcaac ctggaatgac atccatatct 300
gtagaaaggc tcaggcattg tcctgtgatc tcacaacgtt caccctggat ctgtatcacc 360
gaagctatgg ctaccgggcc agagtccggg cagtggacaa cagtcagtac tccaactgga 420
ccaccactga gactcgcttc acagtggatg aagtgattct gacagtggat agcgtgactc 480
tgaaagcaat ggacggcatc atctatggga caatccatcc ccccaggccc acgataaccc 540
ctgcagggga tgagtacgaa caagtcttca aggatctccg agtttacaag atttccatcc 600
ggaagttctc agaactaaag aatgcaacca agagagtgaa acaggaaacc ttcaccctca 660
cggtccccat aggggtgaga aagttttgtg tcaaggtgct gccccgcttg gaatcccgaa 720
ttaacaaggc agagtggtcg gaggagcagt gtttacttat cacgacggag cagtatttca 780
ctgtgaccaa cctgagcatc ttagtcatat ctatgctgct attctgtgga atcctggtct 840
gtctggttct ccagtggtac atccggcacc cggggaagtt gcctacagtc ctggtcttca 900
agaagcctca cgacttcttc ccagccaacc ctctctgccc agaaactccc gatgccattc 960
acatcgtgga cctggaggtt ttcccaaagg tgtcactaga gctgagagac tcagtcctgc 1020
atggcagcac cgacagtggc tttggcagtg gtaaaccatc acttcagact gaagagtccc 1080
aattcctcct ccctggctcc cacccccaga tacaggggac tctgggaaaa gaagagtctc 1140
cagggctaca ggccacctgt ggggacaaca cggacagtgg gatctgcctg caggagcccg 1200
gcttacactc cagcatgggg cccgcctgga agcagcagct tggatatacc catcaggacc 1260
aggatgacag tgacgttaac ctagtccaga actctccagg gcagcctaag tacacacagg 1320
atgcatctgc cttgggccat gtctgtctcc tagaacctaa agcccctgag gagaaagacc 1380
aagtcatggt gacattccag ggctaccaga aacagaccag atggaaggca gaggcagcag 1440
gcccagcaga atgcttggac gaagagattc ccttgacaga tgcctttgat cctgaacttg 1500
gggtacacct gcaggatgat ttggcttggc ctccaccagc tctggccgca ggttatttga 1560
aacaggagtc tcaagggatg gcttctgctc caccagggac accaagtaga cagtggaatc 1620
aactgaccga agagtggtca ctcctgggtg tggttagctg tgaagatcta agcatagaaa 1680
gttggaggtt tgcccataaa cttgaccctc tggactgtgg ggcagcccct ggtggcctcc 1740
tggatagcct tggctctaac ctggtcaccc tgccgttgat ctccagcctg caggtagaag 1800
aatgacagcg gctaagagtt atttgtattc cagccatgcc tgctcccctc cctgtacctg 1860
ggaggctcag gagtcaaaga aatatgtggg tccttttctg cagacctact gtgaccagct 1920
agccaggctc cacggggcaa ggaaaggcca tcttgataca cgagtgtcag gtacatgaga 1980
ggttgtggct agtctgctga gtgagggtct gtagatacca gcagagctga gcaggattga 2040
cagagacctc ctcatgcctc agggctggct cctacactgg aaggacctgt gtttgggtgt 2100
aacctcaggg ctttctggat gtggtaagac tgtaggtctg aagtcagctg agcctggatg 2160
tctgcggagg tgttggagtg gctagcctgc tacaggataa agggaaggct caagagatag 2220
aagggcagag catgagccag gtttaatttt gtcctgtaga gatggtcccc agccaggatg 2280
ggttacttgt ggctgggaga tcttggggta tacaccaccc tgaatgatca gccagtcaat 2340
tcagagctgt gtggcaaaag ggactgagac ccagaatttc tgttcctctt gtgaggtgtc 2400
tctgctaccc atctgcagac agacatcttc atctttttac tatggctgtg tcccctgaat 2460
taccagcagt ggccaagcca ttactccctg ctgctcactg ttgtgacgtc agaccagacc 2520
agacgctgtc tgtctgtgtt agtacactac cctttaggtg gcctttgggc ttgagcactg 2580
gcccaggctt aggacttatg tctgcttttg ctgctaatct ctaactgcag acccagagaa 2640
cagggtgctg ggctgacacc tccgtgttca gctgtgtgac ctccgaccag cagcttcctc 2700
aggggactaa aataatgact aggtcattca gaagtccctc atgctgaatg ttaaccaagg 2760
tgcccctggg gtgatagttt aggtcctgcc aacctctggg ttggaaggaa gtggactacg 2820
gaagccatct gtccccctgg ggagcttcca cctcatgcca gtgtttcaga gatcttgtgg 2880
gagcctaggg ccttgtgcca agggagctgc tagtccctgg ggtctagggc tggtccctgc 2940
ctccctatac tgcgtttgag acctgtcttc aaatggaggc agtttgcagc ccctaagcaa 3000
ggatgctgag agaagcagca aggctgctga tccctgagcc cagagtttct ctgaagcttt 3060
ccaaatacag actgtgtgac ggggtgaggc cagccatgaa ctttggcatc ctgccgagaa 3120
ggtcatgacc ctaatctggt acgagagctc cttctggaac tgggcaagct ctttgagacc 3180
cccctgggaa cctttattta tttatttgct cacttattta ttgaggaagc agcgtggcac 3240
aggcgcaagg ctctgggtct ctcaggaggt ctagatttgc ctgccctgtt tctagctgtg 3300
tgaccttggg caagtcacgt ttcctcgtgg agcctcagtt ttcctgtctg tatgcaaagc 3360
ttggaaattg aaatgtacct gacgtgctcc atccctagga gtgctgagtc ccactgagaa 3420
agcgggcaca gacgcctcaa atggaaccac aagtggtgtg tgttttcatc ctaataaaaa 3480
gtcaggtgtt ttgtggaaaa aaaaaaaaa 3509
<210> 26
<211> 575
<212> PRT
<213> 小鼠(Mouse)
<400> 26
Met Leu Ser Arg Leu Leu Pro Phe Leu Val Thr Ile Ser Ser Leu Ser
1 5 10 15
Leu Glu Phe Ile Ala Tyr Gly Thr Glu Leu Pro Ser Pro Ser Tyr Val
20 25 30
Trp Phe Glu Ala Arg Phe Phe Gln His Ile Leu His Trp Lys Pro Ile
35 40 45
Pro Asn Gln Ser Glu Ser Thr Tyr Tyr Glu Val Ala Leu Lys Gln Tyr
50 55 60
Gly Asn Ser Thr Trp Asn Asp Ile His Ile Cys Arg Lys Ala Gln Ala
65 70 75 80
Leu Ser Cys Asp Leu Thr Thr Phe Thr Leu Asp Leu Tyr His Arg Ser
85 90 95
Tyr Gly Tyr Arg Ala Arg Val Arg Ala Val Asp Asn Ser Gln Tyr Ser
100 105 110
Asn Trp Thr Thr Thr Glu Thr Arg Phe Thr Val Asp Glu Val Ile Leu
115 120 125
Thr Val Asp Ser Val Thr Leu Lys Ala Met Asp Gly Ile Ile Tyr Gly
130 135 140
Thr Ile His Pro Pro Arg Pro Thr Ile Thr Pro Ala Gly Asp Glu Tyr
145 150 155 160
Glu Gln Val Phe Lys Asp Leu Arg Val Tyr Lys Ile Ser Ile Arg Lys
165 170 175
Phe Ser Glu Leu Lys Asn Ala Thr Lys Arg Val Lys Gln Glu Thr Phe
180 185 190
Thr Leu Thr Val Pro Ile Gly Val Arg Lys Phe Cys Val Lys Val Leu
195 200 205
Pro Arg Leu Glu Ser Arg Ile Asn Lys Ala Glu Trp Ser Glu Glu Gln
210 215 220
Cys Leu Leu Ile Thr Thr Glu Gln Tyr Phe Thr Val Thr Asn Leu Ser
225 230 235 240
Ile Leu Val Ile Ser Met Leu Leu Phe Cys Gly Ile Leu Val Cys Leu
245 250 255
Val Leu Gln Trp Tyr Ile Arg His Pro Gly Lys Leu Pro Thr Val Leu
260 265 270
Val Phe Lys Lys Pro His Asp Phe Phe Pro Ala Asn Pro Leu Cys Pro
275 280 285
Glu Thr Pro Asp Ala Ile His Ile Val Asp Leu Glu Val Phe Pro Lys
290 295 300
Val Ser Leu Glu Leu Arg Asp Ser Val Leu His Gly Ser Thr Asp Ser
305 310 315 320
Gly Phe Gly Ser Gly Lys Pro Ser Leu Gln Thr Glu Glu Ser Gln Phe
325 330 335
Leu Leu Pro Gly Ser His Pro Gln Ile Gln Gly Thr Leu Gly Lys Glu
340 345 350
Glu Ser Pro Gly Leu Gln Ala Thr Cys Gly Asp Asn Thr Asp Ser Gly
355 360 365
Ile Cys Leu Gln Glu Pro Gly Leu His Ser Ser Met Gly Pro Ala Trp
370 375 380
Lys Gln Gln Leu Gly Tyr Thr His Gln Asp Gln Asp Asp Ser Asp Val
385 390 395 400
Asn Leu Val Gln Asn Ser Pro Gly Gln Pro Lys Tyr Thr Gln Asp Ala
405 410 415
Ser Ala Leu Gly His Val Cys Leu Leu Glu Pro Lys Ala Pro Glu Glu
420 425 430
Lys Asp Gln Val Met Val Thr Phe Gln Gly Tyr Gln Lys Gln Thr Arg
435 440 445
Trp Lys Ala Glu Ala Ala Gly Pro Ala Glu Cys Leu Asp Glu Glu Ile
450 455 460
Pro Leu Thr Asp Ala Phe Asp Pro Glu Leu Gly Val His Leu Gln Asp
465 470 475 480
Asp Leu Ala Trp Pro Pro Pro Ala Leu Ala Ala Gly Tyr Leu Lys Gln
485 490 495
Glu Ser Gln Gly Met Ala Ser Ala Pro Pro Gly Thr Pro Ser Arg Gln
500 505 510
Trp Asn Gln Leu Thr Glu Glu Trp Ser Leu Leu Gly Val Val Ser Cys
515 520 525
Glu Asp Leu Ser Ile Glu Ser Trp Arg Phe Ala His Lys Leu Asp Pro
530 535 540
Leu Asp Cys Gly Ala Ala Pro Gly Gly Leu Leu Asp Ser Leu Gly Ser
545 550 555 560
Asn Leu Val Thr Leu Pro Leu Ile Ser Ser Leu Gln Val Glu Glu
565 570 575
<210> 27
<211> 3672
<212> DNA/RNA
<213> 人(human)
<400> 27
gtcagtccca gcccaagggt agctggaggc gcgcaggccg gctccgctcc ggccccggac 60
gatgcggcgc gcccaggatg ctgccgtgcc tcgtagtgct gctggcggcg ctcctcagcc 120
tccgtcttgg ctcagacgct catgggacag agctgcccag ccctccgtct gtgtggtttg 180
aagcagaatt tttccaccac atcctccact ggacacccat cccaaatcag tctgaaagta 240
cctgctatga agtggcgctc ctgaggtatg gaatagagtc ctggaactcc atctccaact 300
gtagccagac cctgtcctat gaccttaccg cagtgacctt ggacctgtac cacagcaatg 360
gctaccgggc cagagtgcgg gctgtggacg gcagccggca ctccaactgg accgtcacca 420
acacccgctt ctctgtggat gaagtgactc tgacagttgg cagtgtgaac ctagagatcc 480
acaatggctt catcctcggg aagattcagc tacccaggcc caagatggcc cccgcaaatg 540
acacatatga aagcatcttc agtcacttcc gagagtatga gattgccatt cgcaaggtgc 600
cgggaaactt cacgttcaca cacaagaaag taaaacatga aaacttcagc ctcctaacct 660
ctggagaagt gggagagttc tgtgtccagg tgaaaccatc tgtcgcttcc cgaagtaaca 720
aggggatgtg gtctaaagag gagtgcatct ccctcaccag gcagtatttc accgtgacca 780
acgtcatcat cttctttgcc tttgtcctgc tgctctccgg agccctcgcc tactgcctgg 840
ccctccagct gtatgtgcgg cgccgaaaga agctacccag tgtcctgctc ttcaagaagc 900
ccagcccctt catcttcatc agccagcgtc cctccccaga gacccaagac accatccacc 960
cgcttgatga ggaggccttt ttgaaggtgt ccccagagct gaagaacttg gacctgcacg 1020
gcagcacaga cagtggcttt ggcagcacca agccatccct gcagactgaa gagccccagt 1080
tcctcctccc tgaccctcac ccccaggctg acagaacgct gggaaacagg gagccccctg 1140
tgctggggga cagctgcagt agtggcagca gcaatagcac agacagcggg atctgcctgc 1200
aggagcccag cctgagcccc agcacagggc ccacctggga gcaacaggtg gggagcaaca 1260
gcaggggcca ggatgacagt ggcattgact tagttcaaaa ctctgagggc cgggctgggg 1320
acacacaggg tggctcggcc ttgggccacc acagtccccc ggagcctgag gtgcctgggg 1380
aagaagaccc agctgctgtg gcattccagg gttacctgag gcagaccaga tgtgctgaag 1440
agaaggcaac caagacaggc tgcctggagg aagaatcgcc cttgacagat ggccttggcc 1500
ccaaattcgg gagatgcctg gttgatgagg caggcttgca tccaccagcc ctggccaagg 1560
gctatttgaa acaggatcct ctagaaatga ctctggcttc ctcaggggcc ccaacgggac 1620
agtggaacca gcccactgag gaatggtcac tcctggcctt gagcagctgc agtgacctgg 1680
gaatatctga ctggagcttt gcccatgacc ttgcccctct aggctgtgtg gcagccccag 1740
gtggtctcct gggcagcttt aactcagacc tggtcaccct gcccctcatc tctagcctgc 1800
agtcaagtga gtgactcggg ctgagaggct gcttttgatt ttagccatgc ctgctcctct 1860
gcctggacca ggaggagggc ccctggggca gaagttaggc acgaggcagt ctgggcactt 1920
ttctgcaagt ccactggggc tggccccagc caggccctgc agggctggtc agggtgtctg 1980
gggcaggagg aggccaactc actgaactag tgcagggtat gtgggtggca ctgacctgtt 2040
ctgttgactg gggccctgca gactctggca gagctgagaa gggcagggac cttctccctc 2100
ctaggaactc tttcctgtat cataaaggat tatttgctca ggggaaccat ggggctttct 2160
ggagttgtgg tgaggccacc aggctgaagt cagctcagac ccagacctcc ctgcttaggc 2220
cactcgagca tcagagcttc cagcaggagg aagggctgta ggaatggaag cttcagggcc 2280
ttgctgctgg ggtcattttt aggggaaaaa ggaggatatg atggtcacat ggggaacctc 2340
ccctcatcgg gcctctgggg caggaagctt gtcactggaa gatcttaagg tatatatttt 2400
ctggacactc aaacacatca taatggattc actgagggga gacaaaggga gccgagaccc 2460
tggatggggc ttccagctca gaacccatcc ctctggtggg tacctctggc acccatctgc 2520
aaatatctcc ctctctccaa caaatggagt agcatccccc tggggcactt gctgaggcca 2580
agccactcac atcctcactt tgctgcccca ccatcttgct gacaacttcc agagaagcca 2640
tggttttttg tattggtcat aactcagccc tttgggcggc ctctgggctt gggcaccagc 2700
tcatgccagc cccagagggt cagggttgga ggcctgtgct tgtgtttgct gctaatgtcc 2760
agctacagac ccagaggata agccactggg cactgggctg gggtccctgc cttgttggtg 2820
ttcagctgtg tgattttgga ctagccactt gtcagagggc ctcaatctcc catctgtgaa 2880
ataaggactc cacctttagg ggaccctcca tgtttgctgg gtattagcca agctggtcct 2940
gggagaatgc agatactgtc cgtggactac caagctggct tgtttcttat gccagaggct 3000
aacagatcca atgggagtcc atggtgtcat gccaagacag tatcagacac agccccagaa 3060
gggggcatta tgggccctgc ctccccatag gccatttgga ctctgccttc aaacaaaggc 3120
agttcagtcc acaggcatgg aagctgtgag gggacaggcc tgtgcgtgcc atccagagtc 3180
atctcagccc tgcctttctc tggagcattc tgaaaacaga tattctggcc cagggaatcc 3240
agccatgacc cccacccctc tgccaaagta ctcttaggtg ccagtctggt aactgaactc 3300
cctctggagg caggcttgag ggaggattcc tcagggttcc cttgaaagct ttatttattt 3360
attttgttca tttatttatt ggagaggcag cattgcacag tgaaagaatt ctggatatct 3420
caggagcccc gaaattctag ctctgacttt gctgtttcca gtggtatgac cttggagaag 3480
tcacttatcc tcttggagcc tcagtttcct catctgcaga ataatgactg acttgtctaa 3540
ttcgtaggga tgtgaggttc tgctgaggaa atgggtatga atgtgccttg aacacaaagc 3600
tctgtcaata agtgatacat gttttttatt ccaataaatt gtcaagacca caggaaaaaa 3660
aaaaaaaaaa aa 3672
<210> 28
<211> 578
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 28
Met Leu Pro Cys Leu Val Val Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ser Leu Arg
1 5 10 15
Leu Gly Ser Asp Ala His Gly Thr Glu Leu Pro Ser Pro Pro Ser Val
20 25 30
Trp Phe Glu Ala Glu Phe Phe His His Ile Leu His Trp Thr Pro Ile
35 40 45
Pro Asn Gln Ser Glu Ser Thr Cys Tyr Glu Val Ala Leu Leu Arg Tyr
50 55 60
Gly Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Ser Asn Cys Ser Gln Thr Leu Ser
65 70 75 80
Tyr Asp Leu Thr Ala Val Thr Leu Asp Leu Tyr His Ser Asn Gly Tyr
85 90 95
Arg Ala Arg Val Arg Ala Val Asp Gly Ser Arg His Ser Asn Trp Thr
100 105 110
Val Thr Asn Thr Arg Phe Ser Val Asp Glu Val Thr Leu Thr Val Gly
115 120 125
Ser Val Asn Leu Glu Ile His Asn Gly Phe Ile Leu Gly Lys Ile Gln
130 135 140
Leu Pro Arg Pro Lys Met Ala Pro Ala Asn Asp Thr Tyr Glu Ser Ile
145 150 155 160
Phe Ser His Phe Arg Glu Tyr Glu Ile Ala Ile Arg Lys Val Pro Gly
165 170 175
Asn Phe Thr Phe Thr His Lys Lys Val Lys His Glu Asn Phe Ser Leu
180 185 190
Leu Thr Ser Gly Glu Val Gly Glu Phe Cys Val Gln Val Lys Pro Ser
195 200 205
Val Ala Ser Arg Ser Asn Lys Gly Met Trp Ser Lys Glu Glu Cys Ile
210 215 220
Ser Leu Thr Arg Gln Tyr Phe Thr Val Thr Asn Val Ile Ile Phe Phe
225 230 235 240
Ala Phe Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ala Tyr Cys Leu Ala Leu
245 250 255
Gln Leu Tyr Val Arg Arg Arg Lys Lys Leu Pro Ser Val Leu Leu Phe
260 265 270
Lys Lys Pro Ser Pro Phe Ile Phe Ile Ser Gln Arg Pro Ser Pro Glu
275 280 285
Thr Gln Asp Thr Ile His Pro Leu Asp Glu Glu Ala Phe Leu Lys Val
290 295 300
Ser Pro Glu Leu Lys Asn Leu Asp Leu His Gly Ser Thr Asp Ser Gly
305 310 315 320
Phe Gly Ser Thr Lys Pro Ser Leu Gln Thr Glu Glu Pro Gln Phe Leu
325 330 335
Leu Pro Asp Pro His Pro Gln Ala Asp Arg Thr Leu Gly Asn Arg Glu
340 345 350
Pro Pro Val Leu Gly Asp Ser Cys Ser Ser Gly Ser Ser Asn Ser Thr
355 360 365
Asp Ser Gly Ile Cys Leu Gln Glu Pro Ser Leu Ser Pro Ser Thr Gly
370 375 380
Pro Thr Trp Glu Gln Gln Val Gly Ser Asn Ser Arg Gly Gln Asp Asp
385 390 395 400
Ser Gly Ile Asp Leu Val Gln Asn Ser Glu Gly Arg Ala Gly Asp Thr
405 410 415
Gln Gly Gly Ser Ala Leu Gly His His Ser Pro Pro Glu Pro Glu Val
420 425 430
Pro Gly Glu Glu Asp Pro Ala Ala Val Ala Phe Gln Gly Tyr Leu Arg
435 440 445
Gln Thr Arg Cys Ala Glu Glu Lys Ala Thr Lys Thr Gly Cys Leu Glu
450 455 460
Glu Glu Ser Pro Leu Thr Asp Gly Leu Gly Pro Lys Phe Gly Arg Cys
465 470 475 480
Leu Val Asp Glu Ala Gly Leu His Pro Pro Ala Leu Ala Lys Gly Tyr
485 490 495
Leu Lys Gln Asp Pro Leu Glu Met Thr Leu Ala Ser Ser Gly Ala Pro
500 505 510
Thr Gly Gln Trp Asn Gln Pro Thr Glu Glu Trp Ser Leu Leu Ala Leu
515 520 525
Ser Ser Cys Ser Asp Leu Gly Ile Ser Asp Trp Ser Phe Ala His Asp
530 535 540
Leu Ala Pro Leu Gly Cys Val Ala Ala Pro Gly Gly Leu Leu Gly Ser
545 550 555 560
Phe Asn Ser Asp Leu Val Thr Leu Pro Leu Ile Ser Ser Leu Gln Ser
565 570 575
Ser Glu
<210> 29
<211> 5705
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gaagaatgag gaaatggccc cctcagaaac aggagaggtc agggccattt ggggggtaga 60
aggaagacac aacacttctt tgaaatgact ggggatattt ttgtgtgtgg tctgtatgcc 120
atctcttaca tttgagttca caaggcaagg agaacagata ggcccatacc ctttcctgct 180
tagatggtgt ttccaaaaac cactcagatg aagatgggta gaagagaggt gtgctgtcat 240
gcatagcacg taccacagct ggagagaagc caaacaaatc caggctgaga gaccaggctc 300
tattagtaca gcaggtggca tgttgtagat tatttctact aaccacatct actaaccaca 360
tcttccccac tggggaaggc tctatctgta ggctccacat tttttctgtg tgtgtttcaa 420
ttaagcaatg gctagtggag gcccagggcc tgggctaagg gcacacggct ggcagtggat 480
aagctagaat gcggcttcct gttttcaagg cccatgagtt ccattttgag attcgatcaa 540
gagcagggtc ctaggtgcat cctgcaaaac tctacaggac tggagaggct ctgagcctgc 600
gtctgctgct tcaaggcgtc agcaggggca atctttctcc ttcacttggg agatcagcaa 660
ttctcccttt ccctccaagc cgccaggcag gacaagctac atagctacct ggaggcaggg 720
gagaacttag ctgtggaaag catggtttga attctgaaga gtgagtgagt caccaattac 780
ttacctgcag gctccgggtt ctgagtctat ttaaatgcaa atctgttccc cagctatctc 840
ctatctataa attcgaggtt gtgtgtaaga accaagttga ttgtttatgg gatggatccc 900
caggtagggc agtttctgga tggtcattcc ttcagtctct gctccgaact ttgtctctgt 960
agctcctcct gtgggtattt tgtttccctt tctaaggagg atcgaagtgt ccatactttg 1020
gtcttccttc ttcttgactt tcatgtgttt tgcaaattgt atcttgggta ttccaagctt 1080
ctgggctaat atacacttat cagtgagtgc atttcatgtg tgtccttttg tgattgggtt 1140
acctcacttg ggatgatatc ctccagatcc atccaattgt cttagaattt catgaattca 1200
ttgtttttaa tagctgagta gtactccatt gtgtaaatgt accacatttt tctgtatcca 1260
ttcctctgtt gagagacatc tggattcttt ccagcttctt gctataaata aggctgttat 1320
gaacatagtg gagcatgtgt ccttattaca tgttggagca tcttctgggt atatacccag 1380
gagtggtatt gctggatctt ctgttagaac tatgtctagt tttctgagga acagccaaac 1440
tgatttccag agtggttgta ccagcttgca atcccactag ttatggagga gtgttcctct 1500
ttctccacat ccttgccagt gatccatccc ataaacaacc accaaaccca gactctgttg 1560
cagatgccag caagagcttg ctgacaggag cctgatatag ctatctcctg agaggctctg 1620
ccagtgcctg actaatacag aagtggatgc tcatagtcat ccattagaca gagcacaggg 1680
tccccaatga aggagctaga gaaagtaccc aaaggagctt cagggtttgc agccccatag 1740
gaggaacaac aatatgaact aaccagtaag cccagagctc cctaggagta aaccaccaat 1800
caaagaaaac acacggaggg attcatgact ctagctgcat atgtatcata ggatggccta 1860
gtcggtcatc aacgggagga gaggcccttc gttctgtgaa ggttctatgc cccagtatag 1920
gggaatgtct gggccaggaa gcgggagtgg gtgggttggg ggacagggtg agaggagaga 1980
ggatagggga ttttcggagg ggaaactagg aaaggggata acatttgaaa tgtaaataaa 2040
gaaaatatct aataagacta aaaagttaga gttaaaaaca aaaacaaaac cagaacccag 2100
ctgaagtgca tacagcacct tactccggcc tgagctgctg ctcagagggc gcctcttcgg 2160
agccctgcca tactgagcat tagtattggg cagagagtga aagggagcgg gcatgaatta 2220
gattctacag acacatttaa aagtttctcc tgggacaggg gctggactga gcatgcccag 2280
agcactggtt acgccttggc agtccccata ccttgcactt gaaatccttt tcactgcaag 2340
gactgcccag tttcaccagg cagcttcctc ctttctgtct ccatctcaga gccggtgcct 2400
ctgggtttca ctgttttgtg ctgccctgac agagtgattg taatcactgt agggcagccc 2460
gggacttccc aaacactcgt ctggagacca gctgtgtgcc tgcagaactc agtttcctgc 2520
agtgctcaga tgccctggga agtttatgta agagtgtcat gaaagggaga cagtgactcc 2580
atcagacttc aattgtgccc taagaaagag agagctgcct caagatcaag ctatctacct 2640
ggccgggtcc atcggcttcc tgggctcacc acggtaccat catcctccca gccccaagtt 2700
gccctcctcc tcctcctcct gaacattctc attctctctc aactcacttg gtattgtgct 2760
ttgcaaaaaa tcttccaaag ttcgaagtca ccattgccaa aataggaaat acagaagttc 2820
aaggaccaac tgagccctgc ccgccaacta aagtctctgc cctctgccac cgtgtcccca 2880
tttgcaaaac actgacagct gcaccacctc cccacccccc agtggattct gttaaggact 2940
ggatgaggct gtgtttgcag atgaatcagg actggccatc atggctgtca ggaaagccct 3000
gaatctctgt ggtgtaatac agggatccag tttaatgttt catccttcct tcagagttct 3060
ccaagaagtg attcggggca cccaggtctt ttgcattccc tggaagtcct cggctggggc 3120
cctctggatg gctgacagga tagcacaaga ggcagggcct gggtgtacca ctctctgctg 3180
cagcttcaca cgggtttaaa cccggtcata ttttccagcc acacaccgga aaacagttgt 3240
cccatgttcc caggaaaagg acagggattt gtttgttcag tacctggctg gtgtctgcta 3300
tgcagtgtaa agtgttttat ggagtccttg acacacctta agagtccgag catatgaaaa 3360
tcctgttatt taccatctgt tccaatatgg atgctcacaa aagaacccct gaagaacaag 3420
ctactcaaca caaaacagca tgcatgtggg cttcttctaa ttttttttct ttcctcgggt 3480
atgataatta tgtgcctaat gcagcttctc cctgggtgct atgcaggaag cagggagtgt 3540
agcaggaagc ccacactcaa tgctggttct gccccgagca agggccaaat tatgtcagcc 3600
ctaggatgtg tgcccacttt acagacttct ctaaaactgc tgtatcccct catctccaat 3660
gtcccaatcc cctccctatc catccatcaa cttgcctatt acaacgcagc gctcaagtct 3720
cagataaccg gccacctctg ccatggaacc ttccttgttc tcagccctgt gtccccttgt 3780
tagtctgtac tttccttccc agaaactgtt aaaatctccg ctcactttct gtctctggca 3840
aggtggtttc tagaggaagg ggcctggttt tggccagcat cagcttgtga ctgtaaattc 3900
tggtatgtgg aagaaccatc tcgatcgtcc cttaaaacag ccaaggtgca aggctttaaa 3960
attcttataa ctcaaccaaa aactaaaagg aagacaactg aggaagaaac accgcagtgt 4020
cctctttttt aagaggtaaa cggggactaa gaagtcatgc ccgggtactt gcgtcacgcc 4080
tgggtacttg tgtcacgcca agcagtatat gtgctttacc agcggaagga tgggcagtgc 4140
agaacagcaa ttaaaacaaa gtcctcccac attaagaagt ctgaagtttt ccaacatggc 4200
tgacatgagg gtattcacag tgacgagggt atccctgagt gtggttctca ctgattgtgt 4260
gtgtgtgcgt gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt gctcgatgct atggttcaca gatattactt 4320
ccaactagct gaatagctag ggcagcccag tcctcacaga caagcacctt tcccagtgag 4380
ttccctcggc acagaacatg atcccactcc acttggcatc ctctgtctag gccactggac 4440
atagcactat ccactcccac ggtgtttaga caaagcttgt gtctccacaa gccaaggggg 4500
tggtgtgcat cactagctct caggtcacga cggcagtgct cgtgtctgac acccccaagt 4560
tggagggtcc ttctccaggt tcagaggttg cccaaatctt tgacatagta acagtacttt 4620
gtcatctacg aacttcacac cggagaacca tccaatccaa tttccaggaa gaaaaagaaa 4680
aatttaacaa atacctcata ctgttttcag tcagtttcta atttgatggg aggcaggatt 4740
ggtattggca ctgagaatca tgcaatttgc agaccgatgg ctggccaagc cttctcaagg 4800
cagtagtgtc ttccgtgtga caggtaggct ctgaggggaa tagaaagtga cttcttgaga 4860
gcaagggcat cctagtgact ccagcccttc cttggcttct gtgcctcctc agaacaaaaa 4920
cagggcttcc aggatagcat gaatatgtac ctggcagatg accccacggg cgctgtacac 4980
ctcacaatta gatccctgaa aatcatgtaa gtgacatact cacagtatca gcgccacctg 5040
ccaataagtc aggtggacaa agcttggtct ctcacacaat taacatcttt ggtgacactg 5100
gagggcagac agatgtcctg gtcactgaag aggcatctga gtgataccag gtccctcaag 5160
gcgcctattg acacttctaa cctgcagatt tagggcaaga acaacctaaa gggcctgggg 5220
gtgtcatgga ctcccaccaa gagtcaggta gggacgttcc ctcactgttg gcttagcaga 5280
gggccctgca tagaggtccc aggactttca cacatgtacc tgcacgcttg tgctttgctc 5340
ctggcccagt cagtaattcc aattgctaca acagagaggg gaagggggca aggggaaggg 5400
gagggggagg gagaggggag acaggctgtc cagtcggtgt gagagttaag agcccagcca 5460
cagaaagcct cagctgctct ttcaccttga gacaaatgcc ccagaactag ctagacttcg 5520
ctgcctgctg aggttcctgc ggaggttccc aagctccgtg ggctgagggc ggagcaacga 5580
ggctccgcct tcaggttgat gtcaagctgg ccctgtggat ccagcggcag tcttcagttc 5640
tcaggacgcc gccggccgga ggcgtaaagg ccggctccag tggacgatgc cgctgtgcgc 5700
ccagg 5705
<210> 30
<211> 6647
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ctgtgaaccg gccactgtgt atcatgaatt ggtcctggtc attatcctca tttcacaagt 60
gaggacagag gggttgcttc cactcacagg atcacacagc taggaggagt actaggggag 120
gctttgcagc atcccatcct ggtgctgctg agggaataga ctcagaaaga cagaagagat 180
ggagtggtca cagagggaag ggaacagtgg agagctgacc tagagaggag aggacaggat 240
ctctgtcccc tctcagatgg aggcatgtgt ggcaagtcag cctcttgagg ccatcctaca 300
agaacaagta gaagtcccca aacctctggt tgtctctgac ctagtctcag actgtgtcag 360
aagtggacag ccacagactc tggaccctga gtaatgtctt ctaatattaa tacataatag 420
atggttacag gatatatata tatgcaagta tatatatatc ctgtaaccat ctattataac 480
acacacatat atatgtgtgt gtgtgtgtgt atgtgtatat gtgtgtgtgt atatatataa 540
atatatatat gtacactcat acacacacac acacacacac acacaccctg gcctaatcag 600
ggcctttgcc tagacaagag tctgttctca cccagccctt aaagctctca agggtttaat 660
agttcttcct tgcatctcgc tgaagtaggt cctcatcgtc tttctttgcg ctcctgggag 720
attcagtgcc ccgtccctgc ctcccctgat ctgttccacg ggcactttag ctcatgctcc 780
ttgcagggcc taggaccctg gtgctcggtg acttggggat gaatgagccg cagatcgagc 840
ctggccctgt ggagaccagg agccaggaag tgtgggaggg tagcctggag catctctgag 900
tgcatgagtg cgctgatctg atcgaactaa gtggcttttg agctagctac agagcatcct 960
acctagttgt acgtgcagtg gggcaggaaa ctgagtcgtg tggcctcgag aggtccccag 1020
ggcttgatgc cagccagtgc tagccaggtg tcaaaggcta gctttaaagc catgggacag 1080
gcagagatca gagattaaat gtccaggaac ggcaggtagc acttgtttcc ttgtggacct 1140
gtgggtcata gcatcgctgc tcctttggag cttgtcttct cagattgaaa caacccagtt 1200
ccatttatca ggtgctgctt gctgtctgtg gggttaacca gtatgagagc gccagccctg 1260
gcactttaat taactctcag ctatctgctg atttgagctg accatccaac gggccactga 1320
cgtcagtttt attaagcaag ctggggacct cgaatccaga tagctgtgta taattccagg 1380
tttgtccttc attgctggtg tcttgaggca catcgtttaa cctctctgag ctttggattc 1440
ctcctgtagg acacaggggt aatgtatacc tacagaatta ccagggagta caattcagct 1500
cagcatatat ttattgagtg tcttctatgt aacccgaatg atccaagcac ggtacaagcg 1560
ccaccatgag aaagcacatg ctgccattaa tcctatctat ggatgagaaa ctaaagaaca 1620
gaaagaacaa ggatactggc tcagcagcaa gttgctaaca gatacatctt tcatcactat 1680
atcattatgg tggtaagggg gccacaagca ggaggatttg tatgggaggc cttaagtgct 1740
gagaaaatga aggtaggggt gcagcatggt cagccagtca gtcagtctga aggtctgtcc 1800
gtcagtcaac aaacctgagt tcctactaat tcaaattcag ctaagagtga atctaggctc 1860
ttagagtggt gaataagact ggacagttac tgcctttaga attcatatca tagtgtctgt 1920
cttagtcagg gtttctattg ctgcaatgaa acaccataaa caaaaagcaa gcttggaaga 1980
aaggatttat tcagctcaca tttcatatca ctattcatca ctgaaggaag ccagaccagg 2040
aactcacaca gggcaggaac ctggaggcag gagctgatgc agagcctgtg aggagtgcta 2100
cttactggct tgctcaccct gttttcttat agaacccagg accttcagcc ctgaagtgat 2160
agcacccaca atagcctggg ccttcccaca ttgatcacta atgaagaaaa tgccttacag 2220
ctggatctta tggaggagtc tcttcaatta aggttccccc ctttcaaata gatgtagttt 2280
gtatgtcaag tcgacataag accagccagc acattacaag aactaagttt aaaaagaagc 2340
aaggaaggag atatggagac aatggctgaa gcagtggttt gatctggtct tgcacagtct 2400
ctctgaggag gtagcatctg agctgaacaa ggggcaggaa acagccatat ggaatgccaa 2460
gaatgtccca agctgagggg tcggcctgtg caaaagtcct gtgacagggc tgctgttgct 2520
gcgttcagga cgggaagaat accactgtgg ctagaacaga ggaacaaagt acaaagggtt 2580
acatggcttc tcctggacaa ccaaggagag caagcccttg gctgcaagct acaaaatgca 2640
aagaagggca ggagagagat agatggggtg gaatggggtg agaatgcact gtggcctgta 2700
gatgctgttc ccttgtaact ctagtttcag tgactcccag gagctgcaca cacaggtgcc 2760
tacttagcat ctatttctta cttggagtcg ttgtcagaat agtttacaca cactcctgga 2820
tggacctggc ttttccagcc tcttccaggc tgcagagagc tttccaagtg gagggtctga 2880
gtgtattccc cagtcttagc aagatcctgt gaaatctggc cctggaaaca ccagcttcct 2940
atgtgtctgc ccggggacaa accatgaagt gcctttgggg gaaaattgta aaattttaat 3000
gccagtacaa accagggagc tcagtgcagg ctgcccaggc tctgcacctc ctctatgcct 3060
cctccacagt tcctccgctg gtacctggga gggtccttgc aggcagccac acttctctcg 3120
ctgtattagt tttctcagtg ctgtgacaaa acacccagga gagacaactt gaggaggatt 3180
ttactttggc tcatggcttg atgaagaagt ccattatggg agggaaggcg caacagctgg 3240
agcgtgcgtg gcgcagctgg agcgtgcgtg gcgcagctgg agcgtgcgtg gcgcagctgg 3300
agcgtgcgtg gcgcagctgg agcgtgcgtg gcgcagctgg agcgtgcgtg gcgcagctgg 3360
agcgtgcgtg gcgcagctgg agcgtgcgtg gcgcagctgg agcgtgcgtg gcgcagctgg 3420
agcgtgcgtg gcgcagctgg tcgcgtcgca cccactgtct tgaagtagag actttctcat 3480
ctttatgcat cccaggactc cggcccatgg ggtagcatca cattcacagt aaggcttccc 3540
agctcagctt aacctttctc aaaacagccc tatgggcata ctctatagaa ccacgtggtg 3600
gttctcaata ccatcaaatt gactacaaca atcatcatgc tattcctgcc tctcctccca 3660
ggtcttcaag aagcctcacg acttcttccc agccaaccct ctctgcccag aaactcccga 3720
tgccattcac atcgtggacc tggaggtttt cccaaaggtg tcactagagc tgagagactc 3780
agtcctgcat ggcagcaccg acagtggctt tggcagtggt aaaccatcac ttcagactga 3840
agagtcccaa ttcctcctcc ctggctccca cccccagata caggggactc tgggaaaaga 3900
agagtctcca gggctacagg ccacctgtgg ggacaacacg gacagtggga tctgcctgca 3960
ggagcccggc ttacactcca gcatggggcc cgcctggaag cagcagcttg gatataccca 4020
tcaggaccag gatgacagtg acgttaacct agtccagaac tctccagggc agcctaagta 4080
cacacaggat gcatctgcct tgggccatgt ctgtctccta gaacctaaag cccctgagga 4140
gaaagaccaa gtcatggtga cattccaggg ctaccagaaa cagaccagat ggaaggcaga 4200
ggcagcaggc ccagcagaat gcttggacga agagattccc ttgacagatg cctttgatcc 4260
tgaacttggg gtacacctgc aggatgattt ggcttggcct ccaccagctc tggccgcagg 4320
ttatttgaaa caggagtctc aagggatggc ttctgctcca ccagggacac caagtagaca 4380
gtggaatcaa ctgaccgaag agtggtcact cctgggtgtg gttagctgtg aagatctaag 4440
catagaaagt tggaggtttg cccataaact tgaccctctg gactgtgggg cagcccctgg 4500
tggcctcctg gatagccttg gctctaacct ggtcaccctg ccgttgatct ccagcctgca 4560
ggtagaagaa tgacagcggc taagagttat ttgtattcca gccatgcctg ctcccctccc 4620
tgtacctggg aggctcagga gtcaaagaaa tatgtgggtc cttttctgca gacctactgt 4680
gaccagctag ccaggctcca cggggcaagg aaaggccatc ttgatacacg agtgtcaggt 4740
acatgagagg ttgtggctag tctgctgagt gagggtctgt agataccagc agagctgagc 4800
aggattgaca gagacctcct catgcctcag ggctggctcc tacactggaa ggacctgtgt 4860
ttgggtgtaa cctcagggct ttctggatgt ggtaagactg taggtctgaa gtcagctgag 4920
cctggatgtc tgcggaggtg ttggagtggc tagcctgcta caggataaag ggaaggctca 4980
agagatagaa gggcagagca tgagccaggt ttaattttgt cctgtagaga tggtccccag 5040
ccaggatggg ttacttgtgg ctgggagatc ttggggtata caccaccctg aatgatcagc 5100
cagtcaattc agagctgtgt ggcaaaaggg actgagaccc agaatttctg ttcctcttgt 5160
gaggtgtctc tgctacccat ctgcagacag acatcttcat ctttttacta tggctgtgtc 5220
ccctgaatta ccagcagtgg ccaagccatt actccctgct gctcactgtt gtgacgtcag 5280
accagaccag acgctgtctg tctgtgttag tacactaccc tttaggtggc ctttgggctt 5340
gagcactggc ccaggcttag gacttatgtc tgcttttgct gctaatctct aactgcagac 5400
ccagagaaca gggtgctggg ctgacacctc cgtgttcagc tgtgtgacct ccgaccagca 5460
gcttcctcag gggactaaaa taatgactag gtcattcaga agtccctcat gctgaatgtt 5520
aaccaaggtg cccctggggt gatagtttag gtcctgccaa cctctgggtt ggaaggaagt 5580
ggactacgga agccatctgt ccccctgggg agcttccacc tcatgccagt gtttcagaga 5640
tcttgtggga gcctagggcc ttgtgccaag ggagctgcta gtccctgggg tctagggctg 5700
gtccctgcct ccctatactg cgtttgagac ctgtcttcaa atggaggcag tttgcagccc 5760
ctaagcaagg atgctgagag aagcagcaag gctgctgatc cctgagccca gagtttctct 5820
gaagctttcc aaatacagac tgtgtgacgg ggtgaggcca gccatgaact ttggcatcct 5880
gccgagaagg tcatgaccct aatctggtac gagagctcct tctggaactg ggcaagctct 5940
ttgagacccc cctgggaacc tttatttatt tatttgctca cttatttatt gaggaagcag 6000
cgtggcacag gcgcaaggct ctgggtctct caggaggtct agatttgcct gccctgtttc 6060
tagctgtgtg accttgggca agtcacgttt cctcgtggag cctcagtttt cctgtctgta 6120
tgcaaagctt ggaaattgaa atgtacctga cgtgctccat ccctaggagt gctgagtccc 6180
actgagaaag cgggcacaga cgcctcaaat ggaaccacaa gtggtgtgtg ttttcatcct 6240
aataaaaagt caggtgtttt gtggaagcga ttggatttct catggtaact gggagtgatg 6300
gatgatgggt gttaacaagg gccgaggact tgggccacag actcagcttc aacatgaatg 6360
gtgactttgg ggaaggcgca tattctctca cagtttctga ttccccccat ggtggatgac 6420
atgggatgac agttgccatg gtgatgtcat gaggttgact tcggtgtggt gccctgcatc 6480
tggcattcca ggtgtaaaca gctgtcaagg gcggttagag ctggaaaggg atataggctt 6540
tctcttggaa acaggtgcga atgagaaagg tgcctgggtg ttctttcaga aaactaaaca 6600
acagaaagtg cagcccaata tttaggatgt ttgttctgac agtgagg 6647
<210> 31
<211> 3503
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
agtcttcagt tctcaggacg ccgccggccg gaggcgtaaa ggccggctcc agtggacgat 60
gccgctgtgc gcccaggatg ctgccgtgcc tcgtagtgct gctggcggcg ctcctcagcc 120
tccgtcttgg ctcagacgct catgggacag agctgcccag ccctccgtct gtgtggtttg 180
aagcagaatt tttccaccac atcctccact ggacacccat cccaaatcag tctgaaagta 240
cctgctatga agtggcgctc ctgaggtatg gaatagagtc ctggaactcc atctccaact 300
gtagccagac cctgtcctat gaccttaccg cagtgacctt ggacctgtac cacagcaatg 360
gctaccgggc cagagtgcgg gctgtggacg gcagccggca ctccaactgg accgtcacca 420
acacccgctt ctctgtggat gaagtgactc tgacagttgg cagtgtgaac ctagagatcc 480
acaatggctt catcctcggg aagattcagc tacccaggcc caagatggcc cccgcaaatg 540
acacatatga aagcatcttc agtcacttcc gagagtatga gattgccatt cgcaaggtgc 600
cgggaaactt cacgttcaca cacaagaaag taaaacatga aaacttcagc ctcctaacct 660
ctggagaagt gggagagttc tgtgtccagg tgaaaccatc tgtcgcttcc cgaagtaaca 720
aggggatgtg gtctaaagag gagtgcatct ccctcaccag gcagtatttc accgtgacca 780
acgtcatcat cttctttgcc tttgtcctgc tgctctccgg agccctcgcc tactgcctgg 840
ccctccagct gtatgtgcgg cgccgaaaga agttgcctac agtcctggtc ttcaagaagc 900
ctcacgactt cttcccagcc aaccctctct gcccagaaac tcccgatgcc attcacatcg 960
tggacctgga ggttttccca aaggtgtcac tagagctgag agactcagtc ctgcatggca 1020
gcaccgacag tggctttggc agtggtaaac catcacttca gactgaagag tcccaattcc 1080
tcctccctgg ctcccacccc cagatacagg ggactctggg aaaagaagag tctccagggc 1140
tacaggccac ctgtggggac aacacggaca gtgggatctg cctgcaggag cccggcttac 1200
actccagcat ggggcccgcc tggaagcagc agcttggata tacccatcag gaccaggatg 1260
acagtgacgt taacctagtc cagaactctc cagggcagcc taagtacaca caggatgcat 1320
ctgccttggg ccatgtctgt ctcctagaac ctaaagcccc tgaggagaaa gaccaagtca 1380
tggtgacatt ccagggctac cagaaacaga ccagatggaa ggcagaggca gcaggcccag 1440
cagaatgctt ggacgaagag attcccttga cagatgcctt tgatcctgaa cttggggtac 1500
acctgcagga tgatttggct tggcctccac cagctctggc cgcaggttat ttgaaacagg 1560
agtctcaagg gatggcttct gctccaccag ggacaccaag tagacagtgg aatcaactga 1620
ccgaagagtg gtcactcctg ggtgtggtta gctgtgaaga tctaagcata gaaagttgga 1680
ggtttgccca taaacttgac cctctggact gtggggcagc ccctggtggc ctcctggata 1740
gccttggctc taacctggtc accctgccgt tgatctccag cctgcaggta gaagaatgac 1800
agcggctaag agttatttgt attccagcca tgcctgctcc cctccctgta cctgggaggc 1860
tcaggagtca aagaaatatg tgggtccttt tctgcagacc tactgtgacc agctagccag 1920
gctccacggg gcaaggaaag gccatcttga tacacgagtg tcaggtacat gagaggttgt 1980
ggctagtctg ctgagtgagg gtctgtagat accagcagag ctgagcagga ttgacagaga 2040
cctcctcatg cctcagggct ggctcctaca ctggaaggac ctgtgtttgg gtgtaacctc 2100
agggctttct ggatgtggta agactgtagg tctgaagtca gctgagcctg gatgtctgcg 2160
gaggtgttgg agtggctagc ctgctacagg ataaagggaa ggctcaagag atagaagggc 2220
agagcatgag ccaggtttaa ttttgtcctg tagagatggt ccccagccag gatgggttac 2280
ttgtggctgg gagatcttgg ggtatacacc accctgaatg atcagccagt caattcagag 2340
ctgtgtggca aaagggactg agacccagaa tttctgttcc tcttgtgagg tgtctctgct 2400
acccatctgc agacagacat cttcatcttt ttactatggc tgtgtcccct gaattaccag 2460
cagtggccaa gccattactc cctgctgctc actgttgtga cgtcagacca gaccagacgc 2520
tgtctgtctg tgttagtaca ctacccttta ggtggccttt gggcttgagc actggcccag 2580
gcttaggact tatgtctgct tttgctgcta atctctaact gcagacccag agaacagggt 2640
gctgggctga cacctccgtg ttcagctgtg tgacctccga ccagcagctt cctcagggga 2700
ctaaaataat gactaggtca ttcagaagtc cctcatgctg aatgttaacc aaggtgcccc 2760
tggggtgata gtttaggtcc tgccaacctc tgggttggaa ggaagtggac tacggaagcc 2820
atctgtcccc ctggggagct tccacctcat gccagtgttt cagagatctt gtgggagcct 2880
agggccttgt gccaagggag ctgctagtcc ctggggtcta gggctggtcc ctgcctccct 2940
atactgcgtt tgagacctgt cttcaaatgg aggcagtttg cagcccctaa gcaaggatgc 3000
tgagagaagc agcaaggctg ctgatccctg agcccagagt ttctctgaag ctttccaaat 3060
acagactgtg tgacggggtg aggccagcca tgaactttgg catcctgccg agaaggtcat 3120
gaccctaatc tggtacgaga gctccttctg gaactgggca agctctttga gacccccctg 3180
ggaaccttta tttatttatt tgctcactta tttattgagg aagcagcgtg gcacaggcgc 3240
aaggctctgg gtctctcagg aggtctagat ttgcctgccc tgtttctagc tgtgtgacct 3300
tgggcaagtc acgtttcctc gtggagcctc agttttcctg tctgtatgca aagcttggaa 3360
attgaaatgt acctgacgtg ctccatccct aggagtgctg agtcccactg agaaagcggg 3420
cacagacgcc tcaaatggaa ccacaagtgg tgtgtgtttt catcctaata aaaagtcagg 3480
tgttttgtgg aaaaaaaaaa aaa 3503
<210> 32
<211> 573
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Met Leu Pro Cys Leu Val Val Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ser Leu Arg
1 5 10 15
Leu Gly Ser Asp Ala His Gly Thr Glu Leu Pro Ser Pro Pro Ser Val
20 25 30
Trp Phe Glu Ala Glu Phe Phe His His Ile Leu His Trp Thr Pro Ile
35 40 45
Pro Asn Gln Ser Glu Ser Thr Cys Tyr Glu Val Ala Leu Leu Arg Tyr
50 55 60
Gly Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Ser Asn Cys Ser Gln Thr Leu Ser
65 70 75 80
Tyr Asp Leu Thr Ala Val Thr Leu Asp Leu Tyr His Ser Asn Gly Tyr
85 90 95
Arg Ala Arg Val Arg Ala Val Asp Gly Ser Arg His Ser Asn Trp Thr
100 105 110
Val Thr Asn Thr Arg Phe Ser Val Asp Glu Val Thr Leu Thr Val Gly
115 120 125
Ser Val Asn Leu Glu Ile His Asn Gly Phe Ile Leu Gly Lys Ile Gln
130 135 140
Leu Pro Arg Pro Lys Met Ala Pro Ala Asn Asp Thr Tyr Glu Ser Ile
145 150 155 160
Phe Ser His Phe Arg Glu Tyr Glu Ile Ala Ile Arg Lys Val Pro Gly
165 170 175
Asn Phe Thr Phe Thr His Lys Lys Val Lys His Glu Asn Phe Ser Leu
180 185 190
Leu Thr Ser Gly Glu Val Gly Glu Phe Cys Val Gln Val Lys Pro Ser
195 200 205
Val Ala Ser Arg Ser Asn Lys Gly Met Trp Ser Lys Glu Glu Cys Ile
210 215 220
Ser Leu Thr Arg Gln Tyr Phe Thr Val Thr Asn Val Ile Ile Phe Phe
225 230 235 240
Ala Phe Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ala Tyr Cys Leu Ala Leu
245 250 255
Gln Leu Tyr Val Arg Arg Arg Lys Lys Leu Pro Thr Val Leu Val Phe
260 265 270
Lys Lys Pro His Asp Phe Phe Pro Ala Asn Pro Leu Cys Pro Glu Thr
275 280 285
Pro Asp Ala Ile His Ile Val Asp Leu Glu Val Phe Pro Lys Val Ser
290 295 300
Leu Glu Leu Arg Asp Ser Val Leu His Gly Ser Thr Asp Ser Gly Phe
305 310 315 320
Gly Ser Gly Lys Pro Ser Leu Gln Thr Glu Glu Ser Gln Phe Leu Leu
325 330 335
Pro Gly Ser His Pro Gln Ile Gln Gly Thr Leu Gly Lys Glu Glu Ser
340 345 350
Pro Gly Leu Gln Ala Thr Cys Gly Asp Asn Thr Asp Ser Gly Ile Cys
355 360 365
Leu Gln Glu Pro Gly Leu His Ser Ser Met Gly Pro Ala Trp Lys Gln
370 375 380
Gln Leu Gly Tyr Thr His Gln Asp Gln Asp Asp Ser Asp Val Asn Leu
385 390 395 400
Val Gln Asn Ser Pro Gly Gln Pro Lys Tyr Thr Gln Asp Ala Ser Ala
405 410 415
Leu Gly His Val Cys Leu Leu Glu Pro Lys Ala Pro Glu Glu Lys Asp
420 425 430
Gln Val Met Val Thr Phe Gln Gly Tyr Gln Lys Gln Thr Arg Trp Lys
435 440 445
Ala Glu Ala Ala Gly Pro Ala Glu Cys Leu Asp Glu Glu Ile Pro Leu
450 455 460
Thr Asp Ala Phe Asp Pro Glu Leu Gly Val His Leu Gln Asp Asp Leu
465 470 475 480
Ala Trp Pro Pro Pro Ala Leu Ala Ala Gly Tyr Leu Lys Gln Glu Ser
485 490 495
Gln Gly Met Ala Ser Ala Pro Pro Gly Thr Pro Ser Arg Gln Trp Asn
500 505 510
Gln Leu Thr Glu Glu Trp Ser Leu Leu Gly Val Val Ser Cys Glu Asp
515 520 525
Leu Ser Ile Glu Ser Trp Arg Phe Ala His Lys Leu Asp Pro Leu Asp
530 535 540
Cys Gly Ala Ala Pro Gly Gly Leu Leu Asp Ser Leu Gly Ser Asn Leu
545 550 555 560
Val Thr Leu Pro Leu Ile Ser Ser Leu Gln Val Glu Glu
565 570
<210> 33
<211> 90
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gtaatcatag tttcatcatc tacacaatgg cctcgaggtc gacggtatcg ataagcttga 60
tatcgaattc cgaagttcct attctctaga 90
<210> 34
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aagtatagga acttcatcag tcaggtacat aatggtggat ccctgtgaac cggccactgt 60
gtatcatgaa ttggtcctgg 80
<210> 35
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggtcattctc ccgtaggcca tgttc 25
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ccttaccatg agcgtctgag ccaag 25
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gctcgactag agcttgcgga 20
<210> 38
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
ggtctttccc caacagcctt tcaga 25
<210> 39
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
aacccacaac agggaactgc agaag 25
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gttgctgggt ttctagacca gagcc 25
<210> 41
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tggcctgcta gaaatgcttg tgaga 25
<210> 42
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
gatccccagc ttccaagata ctggc 25
<210> 43
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ggatcggcca ttgaacaaga t 21
<210> 44
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
cagaagaact cgtcaagaag gc 22
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
cccagaacta gctagacttc gctgc 25
<210> 46
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
cagattctcc cgcgaatgtg aactt 25
<210> 47
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
ccttaccatg agcgtctgag ccaag 25
<210> 48
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
gtcctggtga gtgctctgtc cttc 24
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
gtgtgatcct gtgagtggaa gcaacc 26
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
gacaagcgtt agtaggcaca tatac 25
<210> 51
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gctccaattt cccacaacat tagt 24
<210> 52
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
catcaactac atagaagcct acatgacaat gaagatacga aactgaaaca cctgcagtgt 60
gtattgagtc tgctggactc caggacctag acagag 96
<210> 53
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ccctcgccta ctgcctggcc ctccagctgt atgtgcggcg ccgaaagaag ttgcctacag 60
tcctggtgag tgctctgtcc ttcctggatt ccc 93
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
agggcaccca gtctgagaac ag 22
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
gcgccttgat gtctgggtct tgg 23
<210> 56
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
cagctggaca acttgttgtt aaaggag 27
<210> 57
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
actcatggct ttgtagatgc ctttc 25
<210> 58
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
tgactggcat gaggatcagc agg 23
<210> 59
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
ctccttgatt tctgggccat gc 22
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gctggacaac atactgctaa ccgac 25
<210> 61
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
attcatggcc ttgtagacac cttgg 25
<210> 62
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
tcaccatctt ccaggagcga ga 22
<210> 63
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
gaaggccatg ccagtgagct t 21

Claims (30)

1.一种包含IL-10RA基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物体内表达人或人源化IL-10RA蛋白，同时内源IL-10RA蛋白表达降低或缺失。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述的人源化IL-10RA蛋白包含人IL-10RA蛋白的胞外区的全部、信号肽的全部、跨膜区的全部和胞内区的部分，其中胞内区的部分至少包含胞内区N端1-10个氨基酸，优选的，所述的人源化IL-10RA蛋白包含下列组中的一种：
A)SEQ ID NO：32所述氨基酸序列的部分或全部；
B)与SEQ ID NO：32所示氨基酸的序列同源性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
D)具有SEQ ID NO：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包括人IL-10RA基因的部分，优选的，包含人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分，优选的，包含编码人IL-10RA蛋白的核苷酸序列，进一步优选的，包含编码SEQ IDNO:28第1-264位氨基酸的核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含人源化IL-10RA基因，优选的，所述的人源化IL-10RA基因包含下列组中的一种：
(a)NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列；
(b)转录的mRNA序列为SEQ ID NO：31所示；
(c)与SEQ ID NO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列的同源性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
(d)与SEQ ID NO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
(e)具有SEQ ID NO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
5.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于，所述的人IL-10RA基因或人源化IL-10RA基因通过内源性调控元件调控。
6.根据权利要求1-5任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中还包括人IL-10基因的部分，优选的，包含人IL-10基因的第1至5号外显子核苷酸序列的全部或部分，优选的，包含编码人IL-10蛋白的核苷酸序列，进一步优选的，包含编码SEQ ID NO:4所示氨基酸的核苷酸序列；优选的，所述的人源化非人动物体内表达人或人源化IL-10蛋白，同时内源IL-10蛋白表达降低或缺失。
7.根据权利要求1-6任一所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体将人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分插入或替换至非人动物IL-10RA基因座，
优选的，将包含编码人IL-10RA蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物IL-10RA基因座，进一步优选的，将包含编码SEQ ID NO:28第1-264位氨基酸的核苷酸序列插入或替换至非人动物IL-10RA基因座；更进一步优选的，将包含NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列插入或替换至非人动物IL-10RA基因座；
优选的，所述的靶向载体包含人IL-10RA基因核苷酸序列的部分，优选的，包含人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列或编码SEQ ID NO：28第1-264位所示氨基酸的核苷酸序列。
8.一种人源化IL-10RA蛋白，其特征在于，所述的人源化IL-10RA蛋白包括人IL-10RA蛋白区域，优选的，包含胞外区的全部、信号肽的全部、跨膜区的全部和胞内区的部分，其中胞内区的部分至少包含胞内区N端1-10个氨基酸，进一步优选的，包含SEQ ID NO：28第1-264位所示氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的人源化IL-10RA蛋白，其特征在于，所述的人源化IL-10RA蛋白的氨基酸序列包含下列组中的一种：
A)SEQ ID NO：32所述氨基酸序列的部分或全部；
B)与SEQ ID NO：32所示氨基酸的序列同源性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
C)与SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个氨基酸；或，
D)具有SEQ ID NO：32所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个氨基酸残基的氨基酸序列。
10.一种人源化IL-10RA基因，其特征在于，所述的人源化IL-10RA基因包括人IL-10RA基因组的部分，优选的，包含人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分，优选的，包含编码人IL-10RA蛋白的核苷酸序列，进一步优选的，包含编码SEQ ID NO:28第1-264位氨基酸的核苷酸序列；优选的，包含NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列。
11.根据权利要求10所述的人源化IL-10RA基因，其特征在于，所述的人源化IL-10RA基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：
(a)编码权利要求8-9任一所述的人源化IL-10RA蛋白的核苷酸序列；
(b)NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列；
(c)转录的mRNA序列为SEQ ID NO：31所示；
(d)与SEQ ID NO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列的同源性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
(e)与SEQ ID NO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
(f)具有SEQ ID NO：31或NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列所示的，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
12.一种IL-10RA基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包括人IL-10RA基因核苷酸序列的部分，优选的，包含人IL-10RA基因的第1至6号外显子核苷酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含NCBI登录号为NC_000011.10的第117986468-117995692位核苷酸序列或编码SEQ ID NO：28第1-264位所示氨基酸的核苷酸序列。
13.根据权利要求12所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂，
所述的5’臂选自IL-10RA基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂的核苷酸序列与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选的，所述5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：29所示；
所述的3’臂选自IL-10RA基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂的核苷酸序列与NCBI登录号为NC_000075.6至少具有90％同源性的核苷酸；进一步优选的，所述3’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：30所示。
14.一种包含IL-10基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的非人动物表达人或人源化IL-10蛋白，同时内源IL-10蛋白表达降低或缺失。
15.根据权利要求14所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包括人IL-10基因的部分，优选的，包含人IL-10基因的第1至5号外显子核苷酸序列的全部或部分，优选的，包含编码人IL-10蛋白的核苷酸序列，进一步优选的，包含编码SEQ ID NO:4所示氨基酸的核苷酸序列。
16.根据权利要求14或15所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中包含人源化IL-10基因，优选的，所述的人源化IL-10基因包含下列组中的一种：
a)NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列；
b)转录的mRNA序列如SEQ ID NO：7所示；
c)与SEQ ID NO：7或NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列的同源性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
d)与SEQ ID NO：7或NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
e)具有SEQ ID NO：7或NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
17.根据权利要求15或16所述的构建方法，其特征在于，所述的人IL-10基因或人源化IL-10基因通过内源性调控元件调控。
18.根据权利要求14-17任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物的基因组中还包括人IL-10RA基因的部分，优选的，包含权利要求10-11任一所述的人源化IL-10RA基因；优选的，所述的非人动物体内表达人或人源化IL-10RA蛋白，同时内源IL-10RA蛋白表达降低或缺失。
19.根据权利要求14-18任一所述的构建方法，其特征在于，使用靶向载体将人IL-10基因的第1至5号外显子核苷酸序列的全部或部分插入或替换至非人动物IL-10基因座，优选的，将包含编码人IL-10蛋白的核苷酸序列插入或替换至非人动物IL-10基因座，进一步优选的，将包含编码SEQ ID NO:4所示氨基酸的核苷酸序列或NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位的核苷酸序列插入或替换至非人动物IL-10基因座。
20.一种人源化IL-10基因，其特征在于，所述人源化IL-10基因包括人IL-10基因的部分，优选的，包含人IL-10基因的第1至5号外显子核苷酸序列的全部或部分，优选的，包含编码人IL-10蛋白的核苷酸序列，进一步优选的，包含编码SEQ ID NO:4所示氨基酸的核苷酸序列；优选的，包含NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位的核苷酸序列。
21.根据权利要求20所述的人源化IL-10基因，其特征在于，所述的人源化IL-10基因的核苷酸序列包含下列组中的一种：
a)NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列；
b)转录的mRNA序列如SEQ ID NO：7所示；
c)与SEQ ID NO：7或NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列的同源性至少为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少99％；
d)与SEQ ID NO：7或NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个核苷酸；或，
e)具有SEQ ID NO：7或NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位核苷酸序列，包括取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸的核苷酸序列。
22.一种IL-10基因的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体包含人IL-10基因的部分；
优选的，包含人IL-10基因的第1至5号外显子核苷酸序列的全部或部分，进一步优选的，包含编码人IL-10蛋白的核苷酸序列，进一步优选的，包含编码SEQ ID NO:4所示氨基酸的核苷酸序列；
优选的，包含NCBI登录号为NC_000001.11的第206772435-206768636位的核苷酸序列。
23.根据权利要求22所述的靶向载体，其特征在于，所述的靶向载体还包含5’臂和/或3’臂；
所述的5’臂选自IL-10基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的5’臂的核苷酸序列与NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选的，所述5’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；
所述的3’臂选自IL-10基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；优选的，所述的3’臂的核苷酸序列与NCBI登录号为NC_000067.6至少具有90％同源性的核苷酸，进一步优选的，所述3’臂的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。
24.根据权利要求1-7和14-19任一所述的构建方法，其特征在于，所述的非人动物为非人哺乳动物，优选的，所述的非人哺乳动物为啮齿类动物，更优选的，所述的啮齿类动物为小鼠或大鼠。
25.一种包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，所述的构建方法包括将权利要求1-5和7任一所述的构建方法构建的IL-10RA基因人源化的非人动物，与权利要求14-17和19任一所述的构建方法构建的IL-10基因人源化的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到包含IL-10基因人源化和IL-10RA基因人源化的非人动物。
26.一种制备多基因人源化的非人动物的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)提供权利要求1-7、14-19和25任一所述的构建方法构建的非人动物；
(b)将步骤(a)提供的非人动物与其他基因人源化的非人动物交配、体外授精或直接进行基因编辑，并进行筛选，得到多基因人源化的非人动物。
27.根据权利要求26所述的构建方法，其特征在于，所述的其他基因人源化的非人动物选自基因PD-1、PD-L1、CD47、SIRPa、CD40、LAG-3、4-1BB、CD28、TIM3、GITR、IL3、TIGIT、CTLA4人源化的非人动物中的一种或两种以上的组合。
28.一种IL-10RA基因和/或IL-10基因人源化的细胞、组织或器官，其特征在于，所述的细胞、组织或者器官的基因组中包含权利要求10-11任一所述的人源化IL-10RA基因和/或权利要求20-21任一所述的人源化IL-10基因。
29.来源于权利要求1-7、14-19和25-27任一所述的构建方法构建的非人动物、在需要涉及人类细胞的免疫过程的产品开发，制造人类抗体，或者作为药理学、免疫学、微生物学和医学研究的模型系统中的应用；或在生产和利用动物实验疾病模型，用于病原学研究中的应用；或在筛选、验证、评价或研究IL-10RA和/或IL-10基因功能、IL-10RA和/或IL-10抗体、针对IL-10RA和/或IL-10靶位点的药物、药效研究，免疫相关疾病药物以及抗肿瘤或抗免疫系统疾病的药物，筛选和评估人用药及药效研究方面的用途。
30.一种药物筛选或评价的方法，其特征在于，所述的方法包括给予个体候选药物，对给予候选药物的个体进行药效检测和/或比较，其中，所述的个体选自权利要求1-7、14-19和25-27任一所述的构建方法构建的非人动物。
CN202011257166.3A 2019-11-11 2020-11-11 人源化il-10和il-10ra基因改造动物的构建方法和应用 Active CN112779285B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2019110958202 2019-11-11
CN201911095820 2019-11-11

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112779285A true CN112779285A (zh) 2021-05-11
CN112779285B CN112779285B (zh) 2023-01-06

Family

ID=75750522

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011257166.3A Active CN112779285B (zh) 2019-11-11 2020-11-11 人源化il-10和il-10ra基因改造动物的构建方法和应用

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20220378025A1 (zh)
EP (1) EP4057807A4 (zh)
CN (1) CN112779285B (zh)
WO (1) WO2021093790A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116125074A (zh) * 2022-12-13 2023-05-16 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种IL-10-Fc融合蛋白与其受体结合活性的检测方法

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114835799A (zh) * 2021-05-28 2022-08-02 百奥赛图江苏基因生物技术有限公司 Il1rap基因人源化非人动物的构建方法及应用
WO2022253219A1 (en) * 2021-05-31 2022-12-08 Biocytogen Pharmaceuticals (Beijing) Co., Ltd. Genetically modified non-human animal with human or chimeric cd70
CN116063450A (zh) * 2021-09-18 2023-05-05 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 Il12基因人源化非人动物及其构建方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106470545A (zh) * 2014-05-07 2017-03-01 瑞泽恩制药公司 人源化IL‑4和IL‑4Rα动物
CN109477085A (zh) * 2016-04-22 2019-03-15 萨鲁德医疗公司 增强白细胞介素10的抗炎作用的方法和组合物

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60142836D1 (de) * 2000-06-27 2010-09-30 Novartis Vaccines & Diagnostic Nicht menschliche tiermodelle die toleranz gegenüber hepatitis c virus immunogene aufweisen
EP1344824A1 (en) * 2002-03-11 2003-09-17 Institut de la Santé et de la Recherche Médicale Mutated gene coding for a LAT protein and the biological applications thereof
AUPS057102A0 (en) * 2002-02-15 2002-03-07 Vri Biomedical Ltd Compositions and methods for treatment of skin disorders
JP2015536950A (ja) * 2012-11-02 2015-12-24 ファーマサイクリックス，インク． Ｔｅｃファミリーキナーゼ阻害剤アジュバント療法
WO2014089021A1 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 The Johns Hopkins University Humanized transgenic single nucleotide polymorphism animal systems
CN109666701B (zh) * 2017-10-13 2021-08-24 百奥赛图(北京)医药科技股份有限公司 一种pd-1基因修饰人源化动物模型的构建方法及其应用
WO2019114768A1 (en) * 2017-12-12 2019-06-20 Biocytogen Jiangsu Co., Ltd. GENETICALLY MODIFIED NON-HUMAN ANIMAL WITH HUMAN OR CHIMERIC CD3e

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106470545A (zh) * 2014-05-07 2017-03-01 瑞泽恩制药公司 人源化IL‑4和IL‑4Rα动物
CN109477085A (zh) * 2016-04-22 2019-03-15 萨鲁德医疗公司 增强白细胞介素10的抗炎作用的方法和组合物

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MARK R WALTER: "The molecular basis of IL-10 function: from receptor structure to the onset of signaling", 《CURR TOP MICROBIOL IMMUNOL.》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116125074A (zh) * 2022-12-13 2023-05-16 北京东方百泰生物科技股份有限公司 一种IL-10-Fc融合蛋白与其受体结合活性的检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP4057807A4 (en) 2023-12-27
CN112779285B (zh) 2023-01-06
WO2021093790A1 (en) 2021-05-20
EP4057807A1 (en) 2022-09-21
US20220378025A1 (en) 2022-12-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112779285B (zh) 人源化il-10和il-10ra基因改造动物的构建方法和应用
CN111057721B (zh) 人源化IL-4和/或IL-4Rα改造动物模型的制备方法及应用
CN111304246B (zh) 一种人源化细胞因子动物模型、制备方法及应用
CN109913493B (zh) 人源化cd3基因改造动物模型的制备方法及应用
CN112430621B (zh) Il2ra基因人源化的非人动物的构建方法及应用
CN111218425B (zh) 人源化转基因动物
CN111793646B (zh) Il1r1基因人源化改造的非人动物的构建方法及其应用
CN114277055A (zh) Il1b和il1a基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
CN113429486A (zh) 基因修饰非人动物的构建方法及应用
CN112501205B (zh) Ceacam1基因人源化非人动物的构建方法及应用
CN113881681B (zh) Ccr8基因人源化非人动物及其构建方法和应用
CN112553252B (zh) Tnfr2基因人源化的非人动物的构建方法和应用
CN113355355B (zh) Il23a和/或il12b基因人源化非人动物的构建方法及应用
CN111304247B (zh) 人源化lag-3基因改造动物模型的制备方法及应用
CN113264996A (zh) 一种人源化的非人动物及其制备方法和应用
CN113046390A (zh) Csf1r基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
CN112553213A (zh) Cx3cr1基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
CN114853871B (zh) Csf1和/或csf1r基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
CN112501204B (zh) Il21r基因人源化非人动物及其构建方法和应用
CN113388640B (zh) Ccr4基因人源化的非人动物及其构建方法和应用
CN113817770B (zh) Cd73基因人源化的非人动物的构建方法及应用
CN111926038B (zh) Csf2rb基因人源化改造的非人动物的构建方法及其应用
CN112481303B (zh) Il15ra基因人源化非人动物及其构建方法和应用
CN113831403A (zh) Sting基因人源化非人动物的构建方法及应用
CN114276433A (zh) Cd38基因人源化的非人动物及其构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant